Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja przestrzenna leków w zmianach gruźlicy płuc za pomocą mikrodysekcji laserowej Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCM-LC/MS)

DOI:

10.3791/57402

⸱

18 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Public Health Research Institute, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący mikrodysekcję laserową w połączeniu z analizą LC/MS do przestrzennego ilościowego określania dystrybucji leków w ziarniniakach gruźlicy płuc. Podejście to ma szerokie zastosowanie w ilościowym określaniu stężeń leków w tkankach przy dużej szczegółowości przestrzennej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruźlica jest nadal główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Pilnie potrzebne jest udoskonalenie istniejących schematów leczenia oraz opracowanie nowatorskich środków terapeutycznych. Zdolność dawkowanych leków przeciwgruźliczych do docierania i sterylizacji bakterii w słabo unaczynionych obszarach martwiczych (caseum) ziarniniaków płuc ma kluczowe znaczenie dla skutecznej interwencji terapeutycznej. Skuteczne schematy terapeutyczne muszą zatem zawierać leki o korzystnych właściwościach penetracji kazeum. Obecne metody LC/MS do ilościowego określania poziomów leków w tkankach biologicznych mają ograniczone możliwości rozdzielczości przestrzennej, co utrudnia dokładne określenie bezwzględnych stężeń leku w małych przedziałach tkankowych, takich jak te znajdujące się w ziarniniakach martwiczych. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący mikrodysekcję wychwytu laserowego (LCM) patologicznie odrębnych obszarów tkankowych z kwantyfikacją LC/MS. Technika ta zapewnia bezwzględną kwantyfikację leków w ziarniniaku kaziniaku, otaczających zmianach komórkowych i niezaangażowanej tkance płucnej, a tym samym dokładnie określa, czy osiągane są stężenia bakteriobójcze. Oprócz badań nad gruźlicą, technika ta ma wiele potencjalnych zastosowań w przestrzennie rozdzielczej kwantyfikacji leków w chorych tkankach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do przestrzennego rozpoznawania i ilościowego określania poziomów leków jest kluczowym wymogiem dla określenia, czy leki przeciwgruźlicze docierają do subpopulacji bakteryjnych w obrębie zmian płucnych w stężeniach sterylizujących1. Szczególne znaczenie ma określenie przenikania leku do martwiczego rdzenia zmiany (zwanego kazeum), który zazwyczaj zawiera największą liczbę prątków i może być słabo dostępny dla leków ze względu na brak unaczynienia.

Tradycyjne metody oceny penetracji zmian, które polegają na homogenizacji wyciętych zmian płucnych, a następnie ekstrakcji rozpuszczalnikiem i analizie spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej (LC/MS), są bardzo czułe i selektywne dla interesujących leków. Jednak metody te oferują słabą informację przestrzenną, ograniczoną do rozmiaru oryginalnej homogenizowanej tkanki. Metody obrazowania oparte na spektrometrii mas, takie jak jonizacja desorpcyjna wspomagana matrycą laserową (MALDI)2,3, jonizacja elektronopryskowa desorpcyjna (DESI)4 lub ekstrakcja powierzchniowa wzmocniona cieczą5,6 oferują możliwości obrazowania o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, ale bezpośrednia kwantyfikacja może być niezwykle trudna lub niemożliwa ze względu na niejednorodny jon Efekty tłumienia i różna skuteczność ekstrakcji analitu z różnych typów komórek lub tkanek7. Ponadto większość metod bezpośredniego obrazowania tkanki MS jest z natury mniej czuła niż LC/MS ze względu na brak chromatograficznej separacji endogennych gatunków konkurujących o jonizację i niższą skuteczność ekstrakcji rozpuszczalnikowej leku z tkanki.

Laserowe mikrodyparowanie (LCM) w połączeniu z analizą LC/MS było rutynowo stosowane do izolowania i charakteryzowania odrębnych obszarów tkanek do badań proteomicznych8,9 i ostatnio wykorzystywane do ilościowego oznaczania leków w dozowanej tkance zwierzęcej10. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół wykorzystujący LCM w połączeniu z analizą LC/MS (LCM-LC/MS) w celu ilościowego określenia leków anty-gruźliczych w różnych przedziałach ziarniniaka. W procesie mikrodysekcji laserowej laser UV jest ogniskowany przez obiektyw mikroskopu na wycinku tkanki, który wycina i izoluje żądany obszar tkanki, podążając ścieżką zdefiniowaną przez użytkownika. W przypadku LCM wspomaganego grawitacyjnie (technika stosowana w tych badaniach) wycinek tkanki jest montowany na cienkim szkiełku z membraną polimerową (PET lub PEN), a tkanka jest wychwytywana w nasadce probówki zbiorczej umieszczonej poniżej szkiełka. Leki są ekstrahowane z wyciętej tkanki i oznaczane ilościowo przy użyciu standardowych metod LC/MS. Ilość tkanki wymaganej do pobrania jest ostatecznie określana na podstawie oczekiwanego stężenia leku obecnego w tkance i czułości metody LC/MS. W przypadku większości analiz leków podawanych na poziomie terapeutycznym i analizowanych przy użyciu rutynowego spektrometru mas z potrójnym kwadrupolem wystarczające jest 3 miliony μm2 (3 mm2) powierzchni tkanki.

Ten protokół opisuje potężną kombinację profilowania przestrzennego i pełnej kwantyfikacji oferowaną przez LCM-LC/MS, zapewniając bezwzględne stężenia leku we wszystkich przedziałach ziarniniaków gruźlicy. Technika ta może być również stosowana do określania stężeń leków w wielu różnych chorych tkankach, dostarczając istotnych informacji na temat odkrywania i opracowywania leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee of the NIAID (NIH), Bethesda, MD.

1. Eksperymenty na zwierzętach i pobieranie tkanek

Ta sekcja protokołu opisuje procedury na zwierzętach i pobieranie próbek w warunkach 3 poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL3). Szczegółowe protokoły procedury zakażenia aerozolem Mycobacterium tuberculosis oraz protokoły podawania leków u królików zostały opisane wcześniej11,12.

  1. Zarażaj króliki rasy białej nowozelandzkiej (samce i samice w wieku 4-5 miesięcy) M. tuberculosis HN878 za pomocą systemu aerozolowego tylko przez nos, jak opisano wcześniej11.
  2. Podaj wybrane leki (Ethambutol w przedstawionym tutaj przykładzie) preferowaną drogą i poddaj zwierzęta eutanazji po 2, 6 i 24 godzinach po podaniu. Najpierw znieczulij królika przez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy w dawce 35 mg/kg i ksylazyny w dawce 5 mg/kg. Odczekaj dziesięć minut i potwierdź prawidłowe znieczulenie, szczypiąc ogon i delikatnie dotykając oka. Jeśli nie ma reakcji, poddać się eutanazji poprzez dożylne podanie pentobarbitalu i fenytoiny (patrz tabela materiałów) w dawce 1 ml/4,5 kg w 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
    UWAGA: Te punkty czasowe są optymalne do pokrycia profilu farmakokinetycznego etambutolu i mogą wymagać dostosowania/optymalizacji dla innych badanych leków.
  3. Za pomocą kleszczy, nożyczek i/lub skalpela usuń płuca z jamy klatki piersiowej, wytnij biopsje płuc zawierające duże martwicze ziarniniaki osadzone w otaczającej, niezaangażowanej tkance płucnej (jak opisano wcześniej3). Martwicze ziarniniaki mają beżowy kolor i zazwyczaj lekko wystają z otaczającego czerwono-różowego płuca. Aby ułatwić kriosekcję, upewnij się, że biopsje nie są większe niż 2 x 1,5 x 1,5 cm.
  4. Za pomocą kleszczy umieść biopsję na wstępnie oznaczonej tacce Cryomold tak, aby żądana powierzchnia cięcia miała bezpośredni kontakt z podstawą tacki. Po zamrożeniu zapewni to płaską powierzchnię, z której zostaną wycięte kriosekcje.
  5. Zamrozić biopsję w oparach ciekłego azotu. Napełnij pojemnik styropianowy na głębokość 2 cali ciekłym azotem i umieść metalowy stojak na rurki druciane. Stojak powinien wystawać ponad powierzchnię ciekłego azotu, zapewniając płaską powierzchnię, na której umieszcza się tacki na chusteczki. Umieść pokrywkę z powrotem na styropianowym pojemniku i pozostaw chusteczki na 10 minut do całkowitego zamrożenia.
  6. Wyjmij tacki na chusteczki, szybko zawiń w folię aluminiową i umieść w indywidualnie oznakowanych, zamykanych plastikowych torebkach i zamknij. Przenieść do zamrażarki w temperaturze -80 °C w celu przechowywania.
    UWAGA: Kroki 1.1 - 1.6 są wykonywane w warunkach BSL3 (w tym cała praca na zwierzętach i obchodzenie się z zakażonymi narządami i tkankami). Gamma napromieniowuje biopsje płuc na poziomie 3 megaradów, aby umożliwić obsługę poza zabezpieczeniem BSL3. Mikrodysekcja laserowa na niewysterylizowanej tkance może być wykonywana w obiekcie BLS3, jeśli istnieją zatwierdzone protokoły bezpieczeństwa. Jednak pozostała część tego protokołu opisuje dalsze przetwarzanie w obiekcie BSL-2.

2. Sekcja tkanek

  1. Ustaw kriostat na żądaną temperaturę cięcia. Przenieść napromieniowaną promieniami gamma biopsję płuc z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C do kriostatu i pozostawić na 30 minut w celu wyrównania temperatury tkanki. Uwaga: -20 do -22 °C jest optymalna dla biopsji zmian gruźlicy.
  2. Za pomocą pęsety przymocuj biopsję do uchwytu kriostatu, używając niewielkiej ilości kleju o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), aby przykleić podstawę tkanki do uchwytu. Ustaw tkankę tak, aby płaska powierzchnia (która stykała się z podstawą krioformy) była odsłoniętą powierzchnią do cięcia. Upewnij się, że OCT nie zanieczyszcza powierzchni tkanki, ponieważ może to zakłócić późniejszą analizę spektrometrii mas.
  3. Wytnij trzy odcinki tkanki o grubości 25 μm i zamontuj na szkiełkach z membrany PET. Delikatnie przyłóż membranę do części tkanki i usuń. Jeśli zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, cienka membrana może się rozerwać .
    1. Unikaj nadmiernego obchodzenia się ze szkiełkami przed montażem, ponieważ spowoduje to naładowanie membrany PET i słabą przyczepność skrawków tkanki. Upewnij się, że szkiełko membrany jest utrzymywane w temperaturze pokojowej, aby umożliwić montaż na rozmrażaniu i pomyślne przyleganie tkanki do membrany.
  4. Wyjmij szkiełko z kriostatu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 3 minuty. Jeśli LCM-LC/MS/MS nie zostanie wykonany natychmiast, zamknij szkiełko w małej, hermetycznie zamykanej torbie i przenieś do przechowywania w temperaturze -80 °C, aż będzie to wymagane do rozwarstwienia.
  5. Wyciąć sąsiedni odcinek na głębokości 10 - 12 μm i zamontować na rozmrażaniu na standardowym szkiełku podstawowym do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz odniesienia. W tym czasie można wyciąć dodatkowe sekcje dla innych pożądanych barwników histochemicznych (takich jak Ziehl-Niellsen do wizualizacji Mycobacterium tuberculosis (MTB)).

3. Mikrodysekcja

  1. Wyjąć szczelnie zapieczętowaną torbę zawierającą szkiełko z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na 5 minut.
    UWAGA: Jeśli zimny szkiełko zostanie natychmiast wystawiony na działanie atmosfery laboratoryjnej, tkanka zostanie pokryta kondensacją, a integralność przestrzenna leku może być naruszona.
  2. Włącz mikroskop i laser (laser wymaga 5-10 minut rozgrzania przed rozpoczęciem cięcia). Załaduj płaskie probówki PCR o pojemności 0,20 ml do uchwytu.
  3. Wyjąć szkiełko z worka i wykonać obraz optyczny wycinka tkanki na szkiełku PET za pomocą skanera płaskiego.
  4. Umieść szkiełko w uchwycie szkiełka (stroną z tkanką skierowaną w dół) i przypisz oddzielne probówki zbiorcze do określonych obszarów ziarniniaka za pomocą oprogramowania mikroskopu. Zazwyczaj będą to "niezajęte płuca", "ziarniniak komórkowy" i "kazeum" (ośrodek martwiczy), ale mogą się różnić w zależności od konkretnej patologii ziarniniaka/biopsji.
  5. Skoncentruj się na tkance za pomocą obiektywu mikroskopowego 5X. To powiększenie powinno zapewnić dobry przegląd tkanki zawierającej zarówno obszary ziarniniaka, jak i martwicze. W oprogramowaniu wybierz rurkę oznaczoną jako "caseum", aby przesunąć ją na miejsce pod tkanką.
  6. Wprowadź żądane parametry rozwarstwienia. Typowe ustawienia dla sekcji płuc o grubości 25 μm to moc lasera 30, prędkość 15 i apertura 35 (jednostki dowolne). Będą się one jednak różnić w zależności od używanego mikroskopu i potencjalnego spadku mocy ze względu na wiek lasera.
  7. Wybierz narzędzie do rysowania swobodnego i za pomocą myszy lub pióra na ekranie dotykowym obrysuj żądany obszar do sekcji. Powierzchnia regionu zostanie wyświetlona w oprogramowaniu. Utrzymuj wybrane obszary poniżej 500 000μm2 (0,5 mm2), aby ułatwić preparację. Powtarzać preparację, aż do momentu, gdy w nasadce probówki zbierze się łącznie 3 milionyμm2 (3mm2).
    1. Czasami wypreparowany obszar może pozostać przyklejony do otaczającej błony (na przykład z powodu przyciągania statycznego) i nie wpaść do nasadki zbierającej. Usuń te obszary z łącznej całkowitej powierzchni, wybierając i usuwając je ręcznie w oprogramowaniu.
  8. Wybierz nasadkę dla "zmiany komórkowej" i zbierz 3 milionyμm2 tkanki, korzystając z tego samego procesu, który opisano w kroku 3.7.
  9. Wybierz nasadkę dla "niezajętego płuca" i zbierz 3 milionyμm2 tkanki, korzystając z tego samego procesu, który opisano w kroku 3.7. Należy pamiętać, że niezaangażowana tkanka płucna zawiera wiele oskrzelików i przestrzeni pęcherzykowych. Zwróć szczególną uwagę, aby wykluczyć je ze zdefiniowanych obszarów tkanek do rozwarstwienia.
  10. Zdejmij uchwyt nasadki i ostrożnie odepnij, uszczelnij i oznacz każdą tubkę. Chroń wypreparowane tkanki przed otaczającymi zakłóceniami powietrza (takimi jak zakłócenia przepływu powietrza przez otwierane drzwi). Wypreparowane tkanki należy natychmiast przeanalizować lub przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić przed przetwarzaniem i analizą LCMS.

4. Ekstrakcja i analiza LCMS

  1. Przygotować roztwór ekstrakcyjny acetonitrylu/metanolu w stosunku 1:1 zawierającego wzorzec wewnętrzny Ethambutol d-10. Wybierając wzorzec wewnętrzny, należy użyć stabilnej, znakowanej formy leku analitowego (takiej jak EMB znakowany deuterem użyty w tej demonstracji) z wystarczającym przesunięciem masy, aby uniknąć przesłuchu izotopowego między lekiem analitowym a wzorcem (zwykle minimum 4 daltony).
    UWAGA: Tworzenie wzorców w homogenacie dla każdego odpowiedniego typu tkanki jest trudne, ponieważ istnieje bardzo ograniczona tkanka kontrolna, za pomocą której można stworzyć jednorodne wzorce. Jako alternatywę dla tworzenia wzorców z wzbogaconej próbki homogenatu, wzorzec można utworzyć, dodając do siebie czystą tkankę i badany związek i ekstrahując. Objętość tkanki kontrolnej w homogenacie, która odpowiada docelowej objętości skrawków tkanki badanej próbki, jest bezpośrednio łączona z ilością badanego związku, która byłaby obecna przy danym stężeniu.
  2. Obliczyć docelową objętość tkanki na podstawie pola powierzchni i grubości przekroju tkanki i określić niezbędny współczynnik rozcieńczenia dla homogenatu, wykorzystując objętość homogenatu, która zostanie dodana do próbki wzorcowej i próbki kontroli jakości. Obliczenia przedstawiono poniżej dla docelowego obszaru preparowanego o grubości 3 milionówμm2 (3 mm2) o grubości 25 μm i objętości homogenatu 2 μl.
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  3. Zakładając gęstość tkanki 1 g/ml, przygotować jednorodny materiał wyjściowy, ważąc 50 mg tkanki kontrolnej i dodając bufor PBS w celu rozcieńczenia (stosując współczynnik rozcieńczenia homogenatu 26,67 obliczony w kroku 4.2, rozcieńczalnik wynosi 1,283 ml). Homogenizować przez ubijanie kulki w tkankę płucną i bufor PBS przez 5 minut przy 1750 obr./min na homogenizatorze kulkowym.
    figure-protocol-5
    figure-protocol-6
  4. Rozcieńczyć stężenie 1 mg/ml zapasów leku w acetonitrylu w stosunku 1:1 acetonitryl/woda, aby uzyskać roztwory do zwiększania krzywej standardowej. Określ standardowe stężenia skokowe na podstawie objętości kolca i objętości tkanki docelowej. Ilustrowany przykład dotyczy wzorca 100 ng/ml przy użyciu objętości skoku 10 μl.
    figure-protocol-7
    figure-protocol-8
  5. Wyjąć probówki zawierające mikrowycięte tkanki z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na 5 minut.
  6. Dodać 10 μl roztworu acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 oraz 2 μl buforu PBS do probówek zawierających mikrowypreparowaną tkankę.
  7. W przypadku probówek o wzorcowej krzywej i kontroli jakości dodać 10 μl roztworu do mieszania do 2 μl kontrolnego homogenatu płucnego.
  8. Dodać 50 μl roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki.
  9. Wirować każdą probówkę przez 5 minut, sonikować przez 5 minut i wirować z prędkością 5000 obr./min przez 5 minut, aby w każdej probówce uformować osad filmu i tkanki.
  10. Przenieść 50 μl supernatantu na 96-dołkową płytkę głębinową i rozcieńczyć dodatkowymi 50 μl wody dejonizowanej w każdym dołku.
  11. Wykonaj analizę LC/MS/MS przy użyciu zoptymalizowanych parametrów przyrządu dla Ethambutolu i wewnętrznego wzorca Ethambutol-d10 (jak opisano wcześniej szczegółowo12).
  12. Użyj współczynnika rozcieńczenia, aby skorygować dokładną ilość tkanki wypreparowanej dla każdej próbki.
    figure-protocol-9

5. Walidacja metody

  1. Stwórz homogenat w kontrolnej tkance płucnej, łącząc 1 część płuca, 2 części PBS i 3 - 4 stalowe kulki. Ubijaj tkankę płucną i bufor PBS przez 5 minut przy 1750 obr./min za pomocą homogenizatora kulkowego.
  2. Zwiększ homogenat, dodając 10 μl 1 mg / ml bulionu Ethambutol DMSO do 990 μl homogenatu, aby uzyskać końcowe stężenie 10 000 ng / ml (10 mg / mL) i wirować przez 1 minutę.
  3. Stwórz zamrożony blok homogenatu, wlewając homogenat do krioformu i szybko zamrażając na suchym lodzie przez 5 minut.
  4. Przygotować skrawki o grubości 25 μm z bloku homogenatu zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.5.
  5. Wypreparuj obszar tkanki docelowej, jak określono w krokach 3.2 - 3.10.
  6. Dodać 10 μl acetonitrylu 1:1/wodę i 2 μl buforu PBS do probówek zawierających mikrowyciętą tkankę.
  7. Dodać 50 μl roztworu ekstrakcyjnego do każdej probówki. Wykonaj kroki 4.9 - 4.12, aby utworzyć krzywą wzorcową i określić stężenie leku w bloku homogenatu tkankowego.
  8. Oblicz wydajność ekstrakcji, korzystając z poniższego wzoru:
    figure-protocol-10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd podejścia LCM-LC/MS jest pokazany w Rysunek 1. Po wysterylizowaniu tkanki promieniowaniem gamma, wszystkie kolejne etapy (począwszy od przekroju tkanki) odbywają się poza warunkami BSL3. Rysunek 2 pokazuje skrawki biopsji zmiany przed i po izolacji tkanek za pomocą LCM. Martwicze i komórkowe obszary zmian gruźlicy można łatwo zidentyfikować i wyizolować za pomocą oględzin samych obrazów optycznych (bez konieczności odwoływania się...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzennie rozdzielona kwantyfikacja leków w obrębie zmian gruźlicy płuc jest wymagana w celu określenia, czy narażenie na lek osiąga stężenia sterylizujące dla populacji bakterii znajdujących się w różnych przedziałach zmianowych. Opisana tutaj metoda LCM-LC/MS umożliwia bezwzględne określenie ilościowe leków przeciwgruźliczych we wszystkich przedziałach zmian chorobowych, w tym w bogatej w bakterie kazeum, przy użyciu łącznie tylko 1 - 3 odcinków tkanki. Tradycyjna homogenizacja tkanek i podejścia LC/MS do oznaczani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Paulowi O'Brienowi, Marizel Mina i Isabelli Freedman za eksperymenty na zwierzętach, Jacquie Gonzalez i Danielle Weiner z NIH/NIAID za pomoc w napromienianiu promieniami gamma tkanek królika przed mikrodysekcją laserową oraz Jansy Sarathy za przemyślenia i rady dotyczące rękopisu. Prace te były wspierane przez fundusze z Fundacji Billa i Melindy Gatesów (OPP1174780) oraz grantu NIH na wspólne oprzyrządowanie 1S10OD018072. Dziękujemy Eliseo A. Eugeninowi za udostępnienie mikroskopu Leica LMD 6500 oraz podzielenie się wiedzą i poradami. Zakup i bieżące wsparcie LMD 6500 zostało sfinansowane z grantu Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego MH096625, Narodowego Instytutu Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu, NS105584, finansowania PHRI (na rzecz E.A.E) i składek GSK (na rzecz E.A.E.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nowa Zelandia Białe królikiCovanceN/A
HN878 Mycobacterium tuberculosisBEI ResourcesNR-13647
Ketathesia (Ketamina) 100 mg/ml C3NHenry Schein Zdrowie zwierząt56344
Anazed (ksylazyna) 100 mg/mlHenry Schein Zdrowie zwierząt33198
Euthasol (pentobarbital sodu i fenytoina sodu) RozwiązanieVirbac710101
Acetonitryl (klasa LC-MS)FisherA955-212
Metanol (klasa LC-MS)FisherA456-212
Kwas mrówkowy (klasa LC-MS)FisherA117-50
Woda (klasa LC-MS)FisherW6212
0,2 ml płaskie probówki PCRCorning07-200-392
Ramy stalowe, membrana PETLeica
Premium Frosted Fisher12-544-2
96 Płytka głębinowa 2,0 ml PP RBKolumna
Zorbax SB-C8 (4,6 na 50 mm; wielkość cząstek, 3,5 μ m)Agilent820631-001D
"Zamek błyskawiczny" Worki na próbki fokFisher01-816-1B
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
CM1850 kriostatLeicawycofana z produkcjiLeica CM1860 to obecny model
Laserowy system mikrodysekcji 6500Leicawycofana z produkcjiLeica LMD 6 to obecny model
Spektrometr masowy Agilent 1260 Infinity II HPLCAgilent
API 4000 QTRAPSciex
Szkiełka mikroskopowe 11505151 Fisher NC0363259

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
  2. Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
  3. Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
  4. Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
  5. Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
  6. Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
  7. Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
  8. Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
  9. Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
  10. Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
  11. Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016(2011).
  12. Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
  13. Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
  14. Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
  15. Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza LC MS MSoznaczanie ilo ci lekupomiar etambutolusekcjonowanie tkanekcentrum nekrotyczne ziarniniakarozdzielczo przestrzennatkanka p ucna

Powiązane artykuły