Tutaj opisujemy metodę obrazowania w całości w całej skórze ucha dorosłej myszy, która pozwala nam na wizualizację rozgałęzionej morfogenezy i wzoru nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych, a także rozmieszczenia komórek odpornościowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia konfokalna z pełnym mocowaniem dla skóry ucha osoby dorosłej: modelowy system do badania morfogenezy rozgałęzień nerwowo-naczyniowych i dystrybucji komórek odpornościowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tutaj prezentujemy protokół techniki obrazowania skóry ucha dorosłego w celu zbadania kompleksowej trójwymiarowej morfogenezy i wzorców rozgałęzień nerwowo-naczyniowych, a także rozmieszczenia komórek odpornościowych na poziomie komórkowym. Analiza struktur anatomicznych nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych w tkankach dorosłych dostarcza pewnych informacji na temat funkcjonalnego okablowania nerwowo-naczyniowego i zwyrodnienia nerwowo-naczyniowego w stanach patologicznych, takich jak gojenie się ran. Jako wysoce informacyjny system modelowy, skoncentrowaliśmy nasze badania na skórze ucha osoby dorosłej, która jest łatwo dostępna do sekcji. Nasz prosty i powtarzalny protokół zapewnia dokładne zobrazowanie składników komórkowych w całej skórze, takich jak nerwy obwodowe (aksony czuciowe, aksony współczulne i komórki Schwanna), naczynia krwionośne (komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych) oraz komórki zapalne. Wierzymy, że ten protokół utoruje drogę do zbadania nieprawidłowości morfologicznych w nerwach obwodowych i naczyniach krwionośnych, a także stanu zapalnego skóry ucha dorosłego w różnych stanach patologicznych.
Wprowadzenie
Skóra składa się z trzech warstw: naskórka, skóry właściwej i tkanki podskórnej. Został wykorzystany jako system modelowy do badania utrzymania, różnicowania i morfogenezy komórek macierzystych w rozwoju, a także regeneracji, nowotworzenia i stanu zapalnego u dorosłych. Skóra jest bogato unaczyniona i unerwiona, dzięki czemu rozwój obwodowego układu nerwowego i układu naczyniowego jest dobrze skoordynowany.
Wcześniej zademonstrowaliśmy technikę obrazowania skóry embrionalnej z wieloma znakami do badania nienaruszonych nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych, w tym ich składników komórkowych1,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty w tej sekcji zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI).
1. Kolekcja skórek do uszu myszy dla dorosłych
- Poddaj eutanazji dorosłe myszy poprzez ekspozycję na dwutlenek węgla (CO2 ) w zamkniętej komorze, a następnie potwierdź eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy.
UWAGA: Eksperyment jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi metody eutanazji. - Odetnij ucho od podstawy i umieść je na szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm2 zawierającej 2 ml zbilansowanego rozt....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skórę tylnej części ucha (Rysunek 1A) oraz przedniej części ucha (Rysunek 1B) dorosłej myszy poddano immunobarwieniu z użyciem przeciwciał przeciwko αSMA (czerwony), Tuj1 (zielony) i PECAM-1 (niebieski). Skórę tylnej części ucha poddano immunobarwieniu w celu zbadania rozkładu neuroimmunologicznego z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko CD1b (czerwony) i MBP (zielony), wraz z Tuj1 (niebieski) (Rysunek 2A
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje całościowe obrazowanie immunonohistochemiczne skóry ucha dorosłego w celu analizy struktur nerwowo-naczyniowych i rozmieszczenia komórek odpornościowych. Uważamy, że ta metoda ma wiele zalet eksperymentalnych dla naukowców w celu zbadania rozgałęzionej morfogenezy i wzorca nerwów obwodowych i naczyń krwionośnych, a także trójwymiarowej dystrybucji składników skóry, w tym komórek odpornościowych i mieszków włosowych. Wyniki obrazowania można określić ilościowo za pomocą oprogramowania do obrazowania w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy K. Gillowi za zarządzanie laboratorium i wsparcie techniczne, J. Hawkinsowi i personelowi obiektu dla zwierząt National Institutes of Health (NIH) Building 50 za pomoc w opiece nad myszami, oraz R. Reedowi i F. Baldreyowi za pomoc administracyjną. Podziękowania należą się również S. Motegi i M. Udey za podzielenie się protokołem sekcji skóry uszu, N. Burnsowi za pomoc redakcyjną oraz członkom Laboratorium Komórek Macierzystych i Biologii Nerwowo-Naczyniowej za pomoc techniczną i przemyślaną dyskusję. T. Yamazaki był wspierany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) NIH-KAITOKU. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Program Narodowego I....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10 x sól fizjologiczna buforowana fosforanami | KD Medical | RGE-3210 | PBS, bez Ca2+/Mg2+ |
| >Hank' s Zrównoważony roztwór soli | Gibco | 14025-092 | HBSS, z Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15710 | PFA, utrwalacz, rozcieńczony w PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normalna surowica kozia | Gibco | 16210064 | Składnik bufora blokującego/myjącego |
| Normalny surowica osła | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Składnik bufora blokującego/myjącego |
| Zakrzywiona drobna pęseta | Dumont | RS-5047 | |
| Pęseta zakrzywiona | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Jednostka filtrująca 0,45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | Do filtracji |
| 1 mL strzykawka | Coviden | 8881501400 | Do filtracja |
| Filtr strzykawkowy Jednostka 0,22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | Do filtracji |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Środek montażowy zapobiegający blaknięciu |
| Lakier do paznokci | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72180 | Do uszczelniania |
| Mikroskop preparacyjny | Leica | MZ95 | |
| Mikroskop konfokalny | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Oprogramowanie do | edycji Adobe Graphics | |
| Illustrator CC 2017 | Oprogramowanie do edycji Adobe | ||
| Obraz J | NIH | Oprogramowanie do przetwarzania obrazu | |
| Przeciwciało anty-PECAM-1 (CD31) | Millipore | MAB1398Z | Chomik IgG, marker komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, przeciwciało |
| anty-PECAM-1 (CD31) | BD 1:300 Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, marker komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, 1:300 |
| Przeciwciało anty-αSMA sprzężone z cy-3 | Sigma | C6198 | Mysia IgG2a, marker komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, 1:500 |
| Przeciwciało anty-EphB1 | Santa Cruz | sc-9319 | Koza poliklonalny, marker komórek śródbłonka żylnego, 1:100 |
| Anty-specyficzna dla neuronów klasa III β-tubulina (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Królicza poliklonalna IgG, marker panaksonalny, 1:500 |
| Przeciwciało anty-Tuj1 | Covance | MMS-435P | Mysz IgG2a, marker pan-aksonalny, 1:500 |
| Przeciwciało anty-MBP | Abcam | AB40390 | Poliklonalna IgG królika, marker mielinizacji, 1:200 |
| Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozyny | Chemicon | AB152 | Poliklonalny królik, marker neuronu współczulnego, 1:500 |
| Przeciwciało anty-peryferynowe | Chemicon | AB1530 | Królik poliklonalny, marker neuronów obwodowych, 1:1000 |
| Przeciwciało anty-CD11b | Bio-Rad | MCA74G | Szczur IgG2b, marker komórek zapalnych (makrofagi), przeciwciało anty-CD45 1:50 |
| Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, marker komórek pan-hematopoetycznych, 1:500 | |
| przeciwciało anty-CD3 | Bio-Rad | MCA1477T | Szczur IgG1, marker komórek odpornościowych, przeciwciało 1:100 |
| anty-CD45R (B220) | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, marker komórek zapalnych, przeciwciało anty-GFP 1:200 |
| Thermo Fisher Scientific | A11122 | Poliklonalny królik, 1:300 | |
| Przeciwciało anty-GFP | Abcam | Ab13970 | Kurczak poliklonalny, 1:500 |
| Przeciwciało anty-β-gal | Cappel | 55976 | Królik poliklonalny, 1:5000 |
| Przeciwciało anty-RFP | Abcam | Ab62341 | Poliklonalne królika, 1:300 |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Przeciwciało poliklonalne królika, 1:250 |
| Koza anty-chomik IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Badania immunologiczne | 127-605-160 | Przeciwciało wtórne poliklonalne chomika, 1:250 |
| Kozia anty-szczurza IgG (H + L) Alexa 594 | Jackson Badania immunologiczne | 112-585-167 | Szczurze poliklonalne przeciwciało wtórne, 1:250 |
| Kozioł anty-mysie IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mysie przeciwciało wtórne IgG2a, 1:250 |
Bibliografia
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
