Artykuł metodologiczny

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57413

⸱

5 marca 2018

 , 
1Department of Pharmacology, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Streszczenie

Celem tej metody jest dostarczenie elastycznej, szybkiej i ilościowej techniki do badania kinetyki naprawy sieciowania DNA-białko (DPC) w liniach komórkowych ssaków. Zamiast globalnego testu usuwania indukowanego ksenobiotykami lub spontanicznego usuwania chromosomów DPC, test ten bada naprawę jednorodnej, chemicznie zdefiniowanej zmiany specyficznie wprowadzonej w jednym miejscu w substracie plazmidowego DNA. Co ważne, takie podejście pozwala uniknąć stosowania materiałów radioaktywnych i nie jest zależne od drogiej lub wysoce wyspecjalizowanej technologii. Zamiast tego opiera się na standardowych procedurach rekombinacji DNA i szeroko dostępnych, ilościowych instrumentach reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w czasie rzeczywistym. Biorąc pod uwagę nieodłączną elastyczność zastosowanej strategii, wielkość usieciowanego białka, a także charakter wiązania chemicznego i dokładny kontekst sekwencji DNA w miejscu przyłączenia mogą być zróżnicowane, aby uwzględnić odpowiedni wkład tych parametrów w ogólną skuteczność naprawy DPC. Korzystając z tej metody, plazmidy zawierające specyficzny dla miejsca DPC transfekowano do komórek, a DNA o niskiej masie cząsteczkowej odzyskano w różnych momentach po transfekcji. Odzyskane DNA jest następnie poddawane wydłużaniu startera specyficznego dla nici (SSPE) przy użyciu startera komplementarnego do uszkodzonej nici plazmidu. Ponieważ zmiana DPC blokuje polimerazę DNA Taq, stosunek DNA naprawionego do nienaprawionego można ocenić ilościowo za pomocą qPCR. Wartości progu cyklu (CT) są używane do obliczania procentu naprawy w różnych punktach czasowych w odpowiednich liniach komórkowych. Ta metoda SSPE-qPCR może być również stosowana do ilościowej oceny kinetyki naprawy dowolnego adduktu DNA, który blokuje polimerazę Taq.

Wprowadzenie

Opisany tutaj jest test oparty na PCR, określany jako SSPE-qPCR. Celem tej metody jest ilościowe określenie naprawy DPC na plazmidowym DNA transfekowanym do komórek ssaków z niedoborem naprawy i biegłości. Ten test jest szybki, ilościowy, niezwykle elastyczny i bezpośrednio mierzy aktywność naprawczą. Chociaż niniejszy raport koncentruje się na zastosowaniu tej metodologii do badania naprawy DPC, wyniki przedstawione poniżej ilustrują, że naprawa każdej zmiany blokującej polimerazę Taq może być badana przy użyciu tej metodologii.

Uzasadnieniem rozwoju tej metody jest uzyskanie wglądu w mechanizmy, za pomocą których komórki ssaków naprawiają DPC. W przeciwieństwie do innych rodzajów uszkodzeń DNA, DPC są bardzo zróżnicowane1,2. Badania wykazały, że setki białek komórkowych mogą zostać usieciowane z DNA i że dla każdego białka istnieje w zasadzie wiele łańcuchów bocznych aminokwasów, które mogą zostać kowalencyjnie przyłączone do DNA komórkowego3. Ponadto istnieje wiele chemicznych punktów przyłączania białek do szkieletu DNA, w tym kilka pozycji na zasadach nukleotydowych, a także na cukrze rybozy4,5. Ta różnorodność chemiczna stwarza perspektywę, że różne szlaki biochemiczne mogą być wykorzystywane do naprawy różnych typów DPC. Mając na uwadze tę kwestię, opracowano test SSPE-qPCR.

Opracowano kilka technik, aby uzyskać wgląd w biologię molekularną naprawy komórkowego DPC. Poniżej znajduje się przegląd głównych podejść, które zostały opracowane, wraz z podsumowaniem głównych mocnych i słabych stron każdego z nich. Warto podkreślić, że chociaż niniejsze podsumowanie koncentruje się na badaniach naprawy DPC w systemach hodowli komórek ssaków, znaczący wkład w obecny model naprawy DPC został wniesiony przy użyciu systemów mikrobiologicznych i bezkomórkowych, które nie są omawiane w tym manuskrypcie.

Być może najłatwiejszą strategią, którą można podjąć, aby uzyskać wgląd w genetykę naprawy DPC, jest ocena odpowiedniej wrażliwości na śmierć komórkową obserwowaną w komórkach typu dzikiego i zmutowanych, wystawionych na działanie czynników wywołujących DPCs6,7. Strategia ta jest stosunkowo szybka, niedroga i nie wymaga specjalistycznej wiedzy poza umiejętnością wykonywania podstawowych technik hodowli komórkowych. Przeciwwagą dla tych zalet są liczne ograniczenia tego podejścia, w tym następujące. Po pierwsze, test nie mierzy bezpośrednio naprawy DNA. Roboczym założeniem leżącym u podstaw tej strategii jest to, że inaktywacja mutacji w genach kodujących odpowiednie białka naprawy DNA powoduje akumulację uszkodzeń DNA, które wyzwalają zaprogramowaną śmierć komórki. Jednak mutacje w genach kodujących białka nienaprawiające DNA mogą, w zasadzie, zwiększyć (lub zmniejszyć) wrażliwość komórkową na śmierć komórkową wywołaną ksenobiotykami. Po drugie, czynniki tworzące DPC niezmiennie indukują inne rodzaje uszkodzeń DNA (jednym z wyjątków jest 5-aza-2'-deoksycytadyna, ale ten czynnik również wyczerpuje poziomy metylotransferazy komórkowej8). W związku z tym nie można wykluczyć, że zwiększona nadwrażliwość komórkowa na omawiany czynnik może odzwierciedlać defekty w naprawie wiązań międzyniciowych lub inne zmiany chorobowe. Po trzecie, jak wspomniano powyżej, DPC reprezentują bardzo niejednorodną klasę składającą się z różnych typów chemicznych wiązań krzyżowych, obejmujących różnych partnerów białkowych. Możliwe jest, że podczas gdy naprawa jednego lub więcej podtypów tych zmian może być zmieniona w określonym tle genetycznym, różnica ta może nie być wystarczająca do znaczącej zmiany nadwrażliwości komórkowej na śmierć wywołanej przez ten czynnik. Podsumowując, chociaż strategia ta stanowi atrakcyjny punkt wyjścia, ograniczenia przedstawione powyżej podkreślają znaczenie poszukiwania innych, bardziej bezpośrednich metod badania kinetyki naprawy DPC.

Aby osiągnąć ten cel, opracowano wiele powiązanych podejść. Na przykład badacze opracowali metody rozróżniania między "wolnym" DNA a "związanym z białkiem" DNA9,10,11. Korzystając z tych podejść, możliwe jest porównanie poziomów DPC w stanie stacjonarnym lub po ekspozycji na czynnik wytwarzający DPC w różnych tłach genetycznych. Dwie strategie, które były najczęściej stosowane, polegają na oddzieleniu DNA zawierającego DPC od wolnego DNA przy użyciu strategii wiązania błony nitrocelulozowej lub wytrącania KCl/SDS12,13. W pierwszym podejściu komórki są poddawane lizie i przepuszczane przez filtr nitrocelulozowy. Ponieważ nitroceluloza wiąże białko, filtr zachowuje DNA połączone z białkiem, umożliwiając przejście wolnego DNA. W tej ostatniej strategii DNA związane z białkiem jest oddzielane od wolnego DNA w oparciu o fakt, że SDS wiąże się z białkiem, ale nie z DNA, i może być wytrącony przez dodanie KCl. W konsekwencji DNA sprzężone z białkiem staje się nierozpuszczalne, podczas gdy niezwiązane DNA pozostaje w roztworze. DNA zawierające DPC można następnie określić ilościowo za pomocą znakowanej radioaktywnie tymidyny (jeśli komórki były początkowo znakowane metabolicznie) lub za pomocą selektywnego barwnika fluorescencyjnego DNA, takiego jak Hoechst 33258. Metody te są powtarzalne i wymagają niewielkiej liczby kroków. Nie dostarczają jednak informacji na temat charakteru chemicznego wiązania krzyżowego, za pomocą którego białko jest przyłączone do DNA. Ponadto ważne jest, aby zauważyć, że testy te mogą przeszacowywać naprawę DPC poprzez fałszywą ocenę niekompletnej naprawy, tj. przetwarzania proteolitycznego do mniejszych wiązań krzyżowych DNA-peptyd, które mogą nie być tak łatwe do uwięzienia lub wytrącenia, jak naprawa DNA w dobrej wierze.

Testy komety mogą być używane do wizualizacji powstawania DPC w komórkach14. W tych eksperymentach obecność DPC zmniejsza migrację DNA, którą można następnie odwrócić poprzez wstępne traktowanie proteinazą K. W związku z tym długość ogona może być wykorzystana do oszacowania powstawania DPC. Jednak, jak wspomniano powyżej, leki tworzące DPC powodują inne rodzaje uszkodzeń DNA, które mogą zmieniać długość ogona. Protokół ten jest również wysoce techniczny i wymaga specjalistycznej wiedzy oraz szkolenia w zakresie obrazowania konfokalnego.

Spektrometria mas może być używana do badania kinetyki naprawy DPC po leczeniu środkami sieciującymi15,16,17. Eksperymenty te traktują komórki środkami tworzącymi DPC i izolują DPC poprzez wychwytywanie biotyny lub ekstrakcję fenolu:chloroformu (1:1). Spektrometria mas może być następnie wykorzystana do identyfikacji usieciowanych białek lub ilościowego określenia ilości DPC powstających w czasie. Główną zaletą tego podejścia jest charakter tworzonych danych. Możliwe jest precyzyjne skatalogowanie rodzajów białek, które stają się usieciowane po ekspozycji na ksenobiotyk, jednak protokół ten jest kosztowny, czasochłonny i ograniczony rodzajem usieciowania, które można wykryć.

Maizels et al. opracowali czuły test 'RADAR' (szybkie podejście do odzyskiwania adduktów DNA) do ilościowego oznaczania immunodetekcji adduktów DNA-białka, a także test RADAR oparty na ELISA18,19. Testy te są szczególnie przydatne do wychwytywania produktów pośrednich DNA-białko, które przejściowo tworzą się w komórkach i generowania próbek odpowiednich do spektroskopii mas w celu identyfikacji nowych adduktów białkowych. Ten test immunodetekcji opiera się na dostępności przeciwciał w celu wychwycenia wiązania krzyżowego DNA-białko, a zatem może nie być w stanie wykryć zdegradowanych adduktów peptydów DNA, które tworzą się podczas naprawy. Niedawno odkryto specyficzny szlak naprawy DPC związany z replikacją DNA i zależnym od DNA metaloproteazą Spartan, w której DPC są proteolizowane do mniejszych peptydów podczas naprawy20,21. Dziedziczne mutacje w tym genie są związane z zespołem Ruijsa-Aalfsa u ludzi, chorobą charakteryzującą się niestabilnością genomu, przedwczesnym starzeniem się i rakiem wątroby22. Myszy z genetycznie zmodyfikowanymi defektami genu spartańskiego wykazują podobne fenotypy23.

Reaktywacja aktywności transkrypcyjnej komórek gospodarza została wykorzystana do badania naprawy zdefiniowanych zmian obecnych na transfekowanych substratach plazmidowego DNA24,25. W tych eksperymentach plazmid zawierający DPC (lub inne rodzaje uszkodzeń DNA), które blokują transkrypcję reportera, taki jak lucyferaza, są transfekowane do komórek. Pomiary luminescencji wykonane 24 - 72 godziny później są następnie skorelowane z naprawą DPC. Jednak te pośrednie testy naprawy nie są w stanie wykryć zdarzeń naprawczych wcześniej niż 24 godziny po transfekcji i nie są w stanie odróżnić obejścia polimerazy RNA częściowo naprawionych substratów od całkowitej naprawy.

Każda z opisanych powyżej metod ma zalety i przyczyniła się do obecnego modelu naprawy DPC. Jednak test SSPE-qPCR omija kilka ograniczeń związanych z tymi innymi podejściami i w konsekwencji może dostarczyć bardziej szczegółowych informacji na temat mechanizmów naprawy DPC. Na przykład test SSPE-qPCR może bezpośrednio mierzyć naprawę specyficznych dla miejsca DPC na DNA w nienaruszonych komórkach ssaków. Metoda ta jest wszechstronna i została wykorzystana do uzyskania wyników naprawy po transfekcji w liniach komórkowych chomików i ludzi. Transfekcję plazmidu można przeprowadzić za pomocą lipofekcji lub elektroporacji w hodowanych liniach komórkowych ssaków. Zapewnia również, że mierzona jest tylko naprawa zdefiniowanych DPC, a nie inne rodzaje uszkodzeń DNA wywołanych przez większość czynników tworzących DPC. SSPE-qPCR jest łatwy do wykonania, niedrogi i szybki. Wyniki uzyskane za pomocą tego testu wykryły zdarzenia naprawcze już 2 godziny po transfekcji. Za pomocą tej metody zmienne, które mogą wpływać na wyniki naprawy DPC, mogą być badane w sposób, który jest czuły i skuteczny. Na przykład rola transkrypcji w naprawie DPC nie została jeszcze rygorystycznie oceniona. Ze względu na elastyczność testu SSPE-qPCR, miejscem sieciowania DPC można manipulować w celu rozwiązania tego problemu. Ponadto wprowadzenie początku replikacji do plazmidu zawierającego DPC może być wykorzystane do zbadania wpływu replikacji na naprawę DPC. Dodatkowo na plazmidzie można utworzyć wiele wiązań krzyżowych w celu zbadania różnic w naprawie pojedynczego DPC w porównaniu z wieloma sieciami krzyżowymi. Są to pytania, na które trudno byłoby odpowiedzieć za pomocą chromosomalnego DNA, ale można je łatwo rozwiązać za pomocą testu SSPE-qPCR. Ogólnie rzecz biorąc, test SSPE-qPCR wymaga oczyszczonego, plazmidowego DNA w ilościach mikrogramowych zawierających zmianę o znanej lokalizacji. W tym teście można zastosować addukty oprócz DPC, jednak zmiana musi być zdolna do blokowania rozszerzenia przez polimerazę Taq.

Protokół

1. Generowanie plazmidu zawierającego DPC

  1. Połączyć 80 pmol oligonukleotydu zawierającego resztę 8-oksoguaniny (20 µL) z 10 jednostkami kinazy polinukleotydowej T4 (1 µL) w 10-krotnym buforze ligazy (5 µL). Dodać wodę do osiągnięcia całkowitej objętości 50 µL i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min w łaźni wodnej.
    1. Połączyć fosforylowany oligonukleotyd (50 µL), 80 pmol jednoniciowego DNA (80 μL), 100 jednostek polimerazy Taq (20 µL) w 10-krotnym buforze reakcyjnym Taq (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP (20 µL), bufor NEB 2 (25 µL) oraz 8 µg BSA (20 µL) do całkowitej objętości 260 µL. Inkubować próbkę w termocyklerze w temperaturze 75 °C przez 15 min, a następnie w 37 °C przez 5 min. Następnie dodać 60 U polimerazy T4 (20 µL), 8 000 U ligazy T4 (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP (20 µL), bufor NEB 2 (15 µL) oraz 8 µg BSA (20 µL) do całkowitej objętości 375 µL. Reakcję inkubować przez noc w temperaturze 37 °C (Rycina 1A).
  2. Przygotować mieszaninę fenolu i chloroformu nasyconą buforem w stosunku 50:50. Dodać równe objętości każdego składnika, wymieszać i wirować w wirówce laboratoryjnej przy 21 130 x g przez 5 min. Chloroform wypiera wodę z fenolu nasyconego buforem, tworząc dwie warstwy: górną warstwę wodną oraz dolną warstwę organiczną. Dodać 375 µL dolnej warstwy organicznej do reakcji przedłużania primera, wymieszać i wirować w wirówce laboratoryjnej przy 21 130 x g przez 5 min.
    UWAGA: Fenol i chloroform są substancjami niebezpiecznymi; należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu z oczami lub skórą.
    1. Po wirowaniu ostrożnie pobrać górną warstwę i wymieszać z octanem amonu dodanym do stężenia końcowego 0,3 M, a następnie dodać 2 objętości 100% etanolu. Roztwór przechowywać w temperaturze -20 °C przez minimum 30 min lub przez noc.
    2. Wirować próbkę w wirówce laboratoryjnej przy 15 000 x rpm w temperaturze 4 °C przez 10 min. Usunąć nadsącz i przemyć osad w 1 mL 70% etanolu. Wirować próbkę w wirówce laboratoryjnej przy 15 000 x rpm w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć nadsącz i resuspenderować osad w 100 µL wody.
  3. Połączyć 50 µL DNA z poprzedniego kroku z 16 µL 6-krotnego barwnika do ładowania na żel oraz 34 µL wody i poddać elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia zawierającym 0,5 µg/mL bromku etydyny. Prowadzić elektroforezę przy 2 V/cm na żelu o długości 10 cm przez 6 h w 1-krotnym buforze TAE. Wyciąć prążek superzwinięty za pomocą żyletki i zważyć wycinek żelu (Rycina 1A). Przeprowadzić kontrolę pozytywną, aby służyła jako marker migracji kowalencyjnie zamkniętego, superzwiniętego DNA.
    UWAGA: Bromek etydyny jest mutagenem; należy zachować ostrożność, aby uniknąć kontaktu ze skórą. Ważne jest również zminimalizowanie czasu ekspozycji próbki plazmidu na promieniowanie UV, aby ograniczyć powstawanie fotoproduktów UV.
    1. Przetrawić wycinek żelu, dodając 10% buforu reakcyjnego β-agarazy na każdy mg masy żelu. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 min i schłodzić do 42 °C. Dodać 10 U β-agarazy i inkubować w temperaturze 42 °C przez 1 h.
    2. Po inkubacji zmierzyć objętość, dodać octan amonu do stężenia końcowego 0,3 M i schłodzić na lodzie przez 15 min. Wirować przy 15 000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej, zebrać nadsącz i dodać 2 objętości izopropanolu. Schłodzić w temperaturze -20 °C przez noc.
    3. Wyczyścić superzwinięte DNA, wirując przez 10 min przy 15 000 x rpm w wirówce laboratoryjnej w temperaturze 4 °C, a następnie resuspenderować osad w 40 µL wody.
  4. Przeprowadzić sieciowanie 12 pmol (15 µL) DNA z 36 pmol oksoguaninyzylazy (1 µL) w buforze zawierającym 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL) oraz 10 mM cyjanoborowodorku sodu (2 µL) do osiągnięcia objętości końcowej 30 µL w temperaturze 37 °C przez 30 min26. Pobrać 1 µL sieciowanej próbki i rozcieńczyć w 500 µL wody, aby służyła jako punkt pomiarowy dla 0 h, i przeanalizować metodą PCR w kroku 3.

2. Wytrącanie KCl/SDS

  1. Aby zwizualizować wydajność sieciowania, przeprowadź trawienie restrykcyjne 1 µg sieciowanego plazmidu przy użyciu 1 μL BspDI w buforze 10x w temperaturze 37 °C przez 1 h w celu uzyskania dwóch fragmentów DNA o różnych rozmiarach.
    UWAGA: Jeden fragment będzie sieciowany z białkiem (4,4 kb), a drugi nie (2,8 kB) (Rysunek 1B).
    1. Podziel próbki na pół, dodaj do obu SDS do stężenia końcowego 0,5% i inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 min.
    2. Do jednej z próbek dodaj KCl (stężenie końcowe 100 mM) i inkubuj na lodzie przez 5 min.
    3. Odwiruj obie próbki z prędkością 12 000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, a następnie nałóż nadsączone ciecze na żel agarozowy, aby oszacować procent koniugacji białka z DNA12.
      UWAGA: Wytrącanie KCl/SDS służy do kontroli jakości, a nie do przygotowania substratu.

3. Transfekcja komórek ssaków

  1. Na 1 dzień przed transfekcją wysiać 0,5 x 106 komórek/dołek w płytce 6-dołkowej. Następnego dnia zmieszać 1,5 µg (30 µL) plazmidu zawierającego DPC (z kroku 1.6) z 300 µL bezsurowiczego medium hodowlanego. W drugiej probówce zmieszać 12 µL odczynnika do transfekcji i 300 µL bezsurowiczego medium hodowlanego. Połączyć 300 µL rozcieńczonego DNA z 300 µL rozcieńczonego odczynnika do transfekcji i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej. Do każdej z dwóch dołek dodać 250 µL kompleksów i inkubować przez minimum 1 h w temperaturze 37 °C.
  2. Po inkubacji usunąć medium, dodać 1 mL 0,6% SDS/0,01 M EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10–15 min. Zebrać komórki za pomocą gumowego skrobaka (policemana) i przenieść do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Dodać 200 µL 5 M NaCl (stężenie końcowe 1 M), delikatnie odwrócić probówkę 5 razy i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C27.
  3. Próbki wirować przy 21 130 x g w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C przez 30 min, zebrać nadsącz, przeprowadzić wytrącanie etanolem zgodnie z powyższym opisem i resuspender w 50 µL wody.

4. SSPE-qPCR

  1. Wymieszać 1 µL odzyskanego DNA z każdego punktu czasowego (w tym 0 h), 2x SYBR green PCR master mix (30 µL), 27 µL wody oraz 1 µL (100 pMol) startera komplementarnego do uszkodzonej nici plazmidu (Primer R, Rysunek 2). Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z następującymi warunkami: wstępna denaturacja przez 10 min w 90 °C, a następnie 8 cykli: 90 °C przez 15 s, 65 °C przez 1 min. Po zakończeniu 8. cyklu dodać 1 µL (100 pMol) drugiego startera do końcowej objętości 60 µL (Primer L, Rysunek 2)28 (szczegóły dotyczące odczynników znajdują się w Tabeli materiałów).
  2. Wymieszać 1 µL nieamplifikowanego odzyskanego DNA z każdego punktu czasowego (w tym 0 h), 2x master mix (30 µL), 27 µL wody oraz 1 µL każdego startera (100 pMol) do końcowej objętości 60 µL.
  3. Nanieść na 96-dołkową płytkę PCR próbki z kroków 4.1 i 4.2 (20 µL/dołek, w trzech powtórzeniach) i przeprowadzić qPCR przez 30 cykli, stosując warunki opisane powyżej.
  4. Obliczyć średnie wartości CT dla każdego zestawu trzech powtórzeń. Od wartości CT uzyskanych w kroku 4.2 odjąć wartości CT z kroku 4.1, aby otrzymać wartość delta CT dla każdej próbki. Od wartości delta CT odjąć wartość dla punktu czasowego 0 h w celu usunięcia tła (szczegółowy opis znajduje się w sekcji Reprezentatywne wyniki).
  5. Przeliczyć wartość delta CT na procent naprawy, korzystając ze wzoru:
    wzór na procent naprawy, 2^ΔCT/2^3 × 100, równanie do obliczania wydajności naprawy DNA

Wyniki

Aby wykorzystać test SSPE-qPCR do oceny komórkowej naprawy DPC, należy przygotować wystarczającą ilość (w ilościach µg) wysokiej jakości substratu do naprawy DPC. W celu otrzymania tego produktu, oligonukleotyd zawierający resztę 8-oksoguaniny został zhybrydyzowany z komplementarnym jednoniciowym DNA, przedłużony za pomocą primera, a następnie oczyszczony w żelu, aby zapewnić, że do transfekcji wykorzystano wyłącznie kowalencyjnie zamknięty produkt kolisty (Rysunek 1A). Niniejszy raport koncentruje się na substratach, w których wykorzystano pułapkowanie borowodorkiem do stworzenia kowalencyjnego połączenia krzyżowego między rekombinowaną ludzką oksoguaninową glikozylazą a jednostką rybozy w dwuniciowej kolistej cząsteczce plazmidu, choć analogiczne podejścia mogą być stosowane w celu otrzymania chemicznie zróżnicowanych substratów DPC. Strategia pułapkowania oksoguaninowej glikozylazy/borowodorku jest szczególnie atrakcyjna ze względu na niezwykle wysoką wydajność reakcji sieciowania. Jak pokazano na Rysunku 1B, precypitacja KCl/SDS przeprowadzona na substracie DPC, który został strawiony do dwóch fragmentów, selektywnie i niemal ilościowo usunęła fragment DNA zawierający DPC. Wyniki te potwierdzają wniosek, że w zasadzie 100% cząsteczek substratu plazmidowego zawiera połączenie krzyżowe z białkiem.

Analiza SSPE-qPCR opisana w sekcji Protokół wykorzystuje wartości CT generowane przez qPCR do obliczenia procentu naprawy DPC po transfekcji w komórkach ssaków. Jak pokazano na Ryc. 2, wiązanie krzyżowe białka blokuje polimerazę Taq przed przedłużeniem primeru „R” przyłączonego do nici zawierającej DPC. Drugą kluczową cechą tej analizy jest przeprowadzenie ośmiu rund reakcji SSPE (z użyciem primeru R) przed wykonaniem analizy qPCR. Podczas gdy nieuszkodzone (lub naprawione) DNA zostanie przedłużone podczas tych reakcji SSPE, tworząc miejsce wiązania dla późniejszego primeru „L”, DNA uszkodzone (lub niepełnie naprawione) nie zostanie przedłużone. W konsekwencji SSPE zwiększa liczebność każdej nieuszkodzonej (lub naprawionej) nici ośmiokrotnie. Oznacza to, że naprawione próbki, w których etap SSPE został wykonany przed qPCR, wykażą wartość CT o trzy jednostki niższą niż wartość uzyskana dla identycznej próbki, w której SSPE nie było wykonywane przed qPCR (Ryc. 2). Różnica trzech jednostek w wartościach CT zaobserwowana dla dwóch traktowań, określana jako ΔCT, odzwierciedla fakt, że 8 = 23. Tę wartość delta CT można wykorzystać do obliczenia komórkowej aktywności naprawy DNA, stosując wzór: procent naprawy DNA = (2ΔCT/23) x 100. Eksperymenty kontrolne potwierdziły, że wartość delta CT wynosząca około 3 była konsekwentnie obserwowana, gdy nieuszkodzone plazmidy substratowe poddawano analizie SSPE-qPCR (dane nie pokazano).

Tabela 1 przedstawia przykładowe wartości CT wygenerowane z substratów plazmidowych zawierających DPC, które odzyskano z fibroblastów płuc chomika chińskiego 3 h i 8 h po transfekcji (Tabela 1A), a także z próbek z czasu zero, t.j. próbek przygotowanych zgodnie z opisem w sekcji Protokół, ale nie transfekowanych do komórek (Tabela1B). Tabela zawiera również wartości ΔCT oraz procent naprawy (obliczone według wzoru 2ΔCT/23 x 100) uzyskane z tych próbek. Jak pokazano w Tabeli 1A, procent naprawy obliczony z próbek pobranych 3 h i 8 h po transfekcji wyniósł odpowiednio 66% i 93%. Wartości te są następnie odejmowane od wartości uzyskanej z analizy próbki 0 h w celu określenia procentu naprawy. Tabela 1B przedstawia wartości CT dla dwóch różnych próbek 0 h, w których przed transfekcją uzyskano lub nie uzyskano wydajnego sieciowania. Próbka wydajnie sieciowana zaowocowała wartością delta CT wynoszącą 0,8, podczas gdy próbka słabo sieciowana zaowocowała wartością delta CT wynoszącą 2,5. Do tej pory nie udało się precyzyjnie określić źródła sygnału tła o wartości 0,8 w wydajnie sieciowanej próbce 0 h. Jest mało prawdopodobne, aby to tło odzwierciedlało niski poziom samoistnego usuwania DPC lub wynikało z niskiego poziomu syntezy „bypass” polimerazy Taq przez uszkodzenie DPC: rozległe eksperymenty przeprowadzone na wysoko oczyszczonym jednoniciowym substracie M13 konsekwentnie dawały wartość delta CT około 0,8, t.j. w zasadzie identyczną z tym „tłem” elongacji obserwowanym w substratach zawierających DPC. W konsekwencji prawdopodobne jest, że podczas SSPE dochodzi do niewielkiego stopnia błędnego przyłączania startera „R”, co skutkuje powstaniem niewielkiej ilości produktu, który może być następnie amplifikowany po dodaniu startera „L” i przeprowadzeniu qPCR. Próby wyeliminowania tego tła poprzez manipulowanie warunkami PCR do tej pory nie przyniosły poprawy tej wady. Jednak opisana powyżej strategia odejmowania pozwala na dokładną ocenę aktywności naprawy DPC. Warto zauważyć, że niewydajne sieciowanie białka na plazmidzie spowoduje podwyższenie wartości tła. Jest to przedstawione w danych próbnych zawartych w Tabeli 1B, gdzie niewydajne sieciowanie białko-DNA zaowocowało wyższą wartością delta CT dla czasu 0. Dlatego eksperymenty kontrolne są niezmiennie przeprowadzane przed rozpoczęciem transfekcji, a substraty z wartościami delta CT podwyższonymi powyżej poziomu progowego 0,8 są odrzucane. Jak wspomniano w protokole qPCR, każda próbka jest dzielona na 3 dołki w celu zapewnienia spójności pipetowania. Powtórzenia te są następnie uśredniane, aby uzyskać wartość CT dla danej próbki. Powtórzenia, które odbiegają o więcej niż ± 0,1, są usuwane ze zbioru danych. Jeśli wszystkie trzy powtórzenia odbiegają od siebie o więcej niż ± 0,1, test SSPE-qPCR jest powtarzany do momentu uzyskania spójnych wartości. Doświadczenie pokazuje, że należy przeprowadzić co najmniej 3 niezależne transfekcje, aby uzyskać wiarygodne wartości średnie, które mogą być następnie poddane analizie statystycznej w celu określenia wpływu różnych parametrów na wydajność naprawy DPC.

Schemat edycji genów; modyfikacja plazmidu, wyniki elektroforezy, analiza DNA, układ eksperymentalny.
Rycina 1. Generowanie plazmidu zawierającego DPC. (A) Oligonukleotyd zawierający resztę 8-okso-guaniny (kolor czerwony) jest hybrydyzowany z jednoniciowym DNA (grube czarne koło) i przedłużany w celu utworzenia dwuniciowego plazmidu (produkt przedłużania startera zaznaczony linią przerywaną). Po elektroforezie z bromkiem etydyny prążek odpowiadający superzwiniętemu DNA (czerwona ramka) jest wycinany z niskotopliwego żelu agarozowego i trawiony β-agarazą. Ścieżki: (1) marker masy cząsteczkowej, (2) jednoniciowe DNA, (3) dwuniciowe DNA, (4) próbka po przedłużeniu startera. (B) Oksoguaninowa glikozylaza (w skrócie hOGG1, przedstawiona jako pomarańczowe koło) zostaje sieciowana z resztą 8-okso-guaniny za pomocą cyjanoborowodorku sodu, a powstały substrat DPC jest trawiony w celu wygenerowania wolnego fragmentu DNA o długości 2 800 par zasad oraz fragmentu o długości 4 400 par zasad przyłączonego do białka. Do próbki dodaje się SDS, a następnie dzieli ją na dwie porcje, z których jedna jest traktowana KCl i wirowana w celu osadzenia DNA zawierającego DPC (przedstawionego jako pomarańczowy osad). Nadpływ z tej drugiej próbki (przedstawiony jako niebieski płyn w probówce wirówki) oraz próbka niepoddana działaniu KCl są poddawane elektroforezie żelowej. Ścieżki: (1) marker masy cząsteczkowej, (2) -KCl, (3) +KCl. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu uszkadzania i naprawy DNA wraz z wykresem amplifikacji przedstawiającym analizę cyklu CT.
Rycina 2: Ilościowe oznaczenie uszkodzonego plazmidu za pomocą SSPE-qPCR. DNA plazmidowe ulega denaturacji, a następnie następuje przyłączanie i przedłużanie primera komplementarnego do uszkodzonej nici (R). Proces ten powtarza się łącznie przez 8 cykli. W przypadku uszkodzonego substratu (góra), polimeraza Taq jest blokowana przez uszkodzenie typu DPC i nie wytworzy pełnowartościowych nici produktu. Z kolei w przypadku substratu naprawionego (dół), polimeraza Taq wytworzy pełnowartościowe nici produktu zawierające miejsce wiązania dla primera L. Po 8 cyklach dodaje się primer L, a wartości progowe cyklu (CT) są określane za pomocą qPCR. Przykładowe wyniki amplifikacji dla substratów uszkodzonych i nieuszkodzonych przedstawiono po prawej stronie, gdzie linia czerwona reprezentuje DNA, które poddano przedłużaniu primera przed qPCR, a linia niebieska reprezentuje DNA, które nie zostało poddane przedłużaniu primera przed qPCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1A
Czas- Przedłużanie startera+ Wydłużanie starteraΔ CTProcent naprawy
(2ΔCT/23x 100) 
3 h23.521.12.466
8 h29.426.52.993
Tabela 1B
Czas- Przedłużanie startera+ Przedłużanie starteraΔ CTProcent tła
(2ΔCT/23x 100) 
0 h15.414.60.822
0 h15.412.92.571

Tabela 1: Obliczanie procentu naprawy przy użyciu wartości CT uzyskanych z SSPE-qPCR. (A) Naprawa substratu zawierającego DPC transfekowanego do fibroblastów płuc chomika chińskiego V79 3 h i 8 h po transfekcji. (B) SSPE-qPCR próbek z czasu 0 h, które nie zostały transfekowane do komórek. W jednej próbce wydajność reakcji sieciowania między DNA a oksoguaninową glikozylazą była wysoka (próbka ta dała niską wartość delta CT), podczas gdy w drugiej próbce wydajność sieciowania białek była niska (próbka ta dała względnie wysoką wartość delta CT). Szczegóły znajdują się w tekście sekcji Reprezentatywne Wyniki.

Dyskusja

Metoda SSPE-qPCR ma wiele zalet w porównaniu z innymi podejściami poprzez badanie naprawy jednorodnej populacji zawierającej jedną, zdefiniowaną zmianę DPC. Warto zauważyć, że oprócz kontrolowania tożsamości białka i rodzaju chemicznego wiązania krzyżowego używanego do łączenia białka z DNA, możliwe jest łatwe manipulowanie kontekstem sekwencji, do której wprowadzana jest zmiana DPC. Zbadaliśmy wpływ na naprawę DPC wprowadzenia zmiany na matrycę lub nić kodującą plazmidu za aktywnym locus promotora. Podobnie, jesteśmy w trakcie badania wpływu replikacji na naprawę DPC przy użyciu plazmidu M13 zawierającego pochodzenie SV40 replikacji transfekowanej do komórek HEK293T. Opisany tutaj test bezpośrednio mierzy naprawę DPC, w przeciwieństwie do innych strategii, takich jak reaktywacja komórek gospodarza, które pośrednio szacują aktywność naprawczą24,25. Ponadto system jest solidny, czuły i ilościowy. W przeciwieństwie do innych systemów, które mierzą usunięcie DPC, test ten wykrywa tylko pełne zdarzenia naprawcze, tj. wymaga nie tylko usunięcia zmiany DPC, ale także pełnego przywrócenia integralności dupleksowego DNA17. Dzieje się tak, ponieważ apodstawowe miejsca i nacięcia lub pęknięcia w szkielecie fosfodiestrowym blokują test tak skutecznie, jak oryginalna zmiana DPC29.

Chociaż niniejszy raport koncentruje się na szczególnym typie DPC, który został utworzony przez uwięzienie borowodorku w pośredniej reakcji enzymatycznej, obecnie opracowujemy podejścia do badania naprawy DPC obejmujących inne białka i zmiany chorobowe, w których powiązanie białka z DNA zachodzi poprzez zasadę nukleozydową, a nie pozycję rybozy. Za pomocą aminacji redukcyjnej stworzyliśmy wiązania krzyżowe białek i peptydów przyłączone do zasady guaniny lub cytozyny startera DNA30. Te oligonukleotydy oczyszczono do jednorodności i wykorzystano do wytworzenia superskręconych plazmidów zawierających wiązania krzyżowe DNA-białko i DNA-peptyd. Chociaż skuteczność tych reakcji jest nieco zmniejszona w porównaniu z podejściem sieciowania glikozylazy oksoguaninowej opisanym szczegółowo powyżej, były one jednak udane i pozwalają na badanie naprawy tych substratów w liniach komórkowych ssaków z niedoborem naprawy przez wycinanie typu dzikiego i nukleotydów. Wykorzystaliśmy również test SSPE-qPCR do zbadania naprawy zmian oksmoguaninowych i syntetycznego koniugatu rybozy i cholesterolu, który, jak wykazano wcześniej, jest naprawiany przez maszynerię naprawy przez wycinanie nukleotydów komórkowych31. Jak przedstawiono graficznie na rysunku 2 , naprawa każdej zmiany, która blokuje wydłużanie startera przez polimerazę Taq, można w zasadzie zmierzyć za pomocą testu SSPE-qPCR.

Obecne modele naprawy DPC sugerują, że większe DPC (>10 kDa) są poddawane przetwarzaniu proteolitycznemu w celu zmniejszenia uszkodzenia peptydowego przed usunięciem 32,33,34. Najbardziej prawdopodobnymi kandydatami odpowiedzialnymi za tę proteolizę są proteasom lub specyficzna proteaza w komórkach ludzkich o nazwie Spartan 20,21,35,36,37,38. Dalsze badania nad rolą tych proteaz można przeprowadzić za pomocą testu SSPE-qPCR. Inhibitory proteasomów mogą być stosowane do wstępnej obróbki komórek przed transfekcją substratami zawierającymi DPC. Alternatywnie, spartańskie linie komórkowe knockdown mogą być transfekowane uszkodzonymi plazmidami, aby wyjaśnić ich rolę w proteolizie większych DPC.

Niezależnie od metody użytej do wytworzenia sieciowania lub charakteru zmiany DNA, warto podkreślić, że metodologia SSPE-qPCR jest krytycznie uzależniona od zdolności do generowania znacznych ilości jednorodnego substratu plazmidu DPC. Etapy niezbędne do tej analizy obejmują oczyszczanie kowalencyjnego, zamkniętego kolistego plazmidu po rozszerzeniu startera w celu wyeliminowania wszelkich naciętych lub liniowych cząsteczek plazmidu. Zanieczyszczenia te muszą zostać wyeliminowane, aby zapewnić, że jakakolwiek późniejsza zaobserwowana naprawa DPC nie jest spowodowana procesami naprawy skierowanymi w kierunku nacięć lub dwuniciowych. Niepowodzenie w uzyskaniu wystarczających ilości superskręconego DNA w wyniku reakcji wydłużania startera można przezwyciężyć poprzez zmianę stosunku oligonukleotydu do jednoniciowego DNA. Kolejnym ważnym krokiem dla metody SSPE-qPCR jest skuteczność sieciowania białka z plazmidem. W tym badaniu zastosowano wydajną, enzymatyczną reakcję w celu usieciowania białka glikozylazy oksoguaninowej ze zmianą 8-okso-guaniny. Nieoptymalne sieciowanie można poprawić, zmieniając ilość białka dodawanego do reakcji.

Chociaż wyniki opisane w tym raporcie opierały się na lipofekcji w celu wprowadzenia substratów naprawczych DPC do komórek biorcy, nie ma powodu, a priori, dla których nie można by zastosować innych metod transfekcji. Przeprowadziliśmy wstępne badania i zaobserwowaliśmy, że można również zastosować elektroporację39 . Warto jednak zauważyć, że z naszego doświadczenia wynika, że wydajność transfekcji elektroporacyjnej jest zmniejszona w porównaniu z lipofekcją i stwierdziliśmy, że konieczne jest użycie nośnika DNA (do 5 μg) oprócz 1,5 μg substratu DPC w celu uzyskania danych naprawczych. Ogólnie rzecz biorąc, opisana powyżej metoda SSPE-qPCR zapewnia innowacyjny sposób badania wyłącznie naprawy DPC na plazmidowym DNA i generowania nowych informacji na temat odpowiedzi na uszkodzenie DNA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner jest wspierana przez Training Grant 5T32HL007741. Dziękujemy Natalii Tretyakovej (University of Minnesota) i Ashis Basu (University of Connecticut) oraz członkom ich laboratorium za wsparcie i porady techniczne na wczesnych i pośrednich etapach tych prac.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Modyfikowany oligo modyfikowany 8-oksoguaninąMidland Certified Reagent CompanyNASekwencja: 5' AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3'
T4 PNKNEBM0201S
Jednoniciowy M13NEBN4040S
Taq polimerazaNEBM0267L
ATP, 100mMThermo ScientificR0441
dNTP Mix, 10mM każdyThermo ScientificR0192
BSANEBB9001S
T4 polimerazaNEBM0203L
T4 ligazaNEBM0202L
β-agarazaNEBM0392S
Glikozylaza oksoguaninowa 1NEBM0241S
SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4309155zielona mieszanka wzorcowa PCR
Primer RCentrum Genomiczne UMNNA5' CGGCTCGTATGTTGTGTG 3'
Primer LUMN Centrum GenomiczneNA5' GCTGCAAGGCGATTAAGT 3'
lipofekcjonyInvitrogen18324-012 
BspD1NEBR0557S
Bufor NEB 2NEBB7002S
System PCR w czasie rzeczywistym StepOnePlusApplied Biosystems4376600
UltraPure Nasycony buforem fenolInvitrogen15513-047
Chloroform, odczynnik ACS, klasa spektrometrycznaACROS40463-5000
Odczynnik do transfekcji

Bibliografia

  1. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  2. Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences. Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).
  3. At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).
  4. Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation. J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).
  5. Dizdaroglu, M., Gajewski, E. Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).
  6. Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin. Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).
  7. Speit, G., Schutz, P., Merk, O. Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).
  8. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).
  10. Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas. Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).
  11. Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells. Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).
  12. Zhitkovich, A., Costa, M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo. Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).
  13. Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).
  14. Merk, O., Reiser, K., Speit, G. Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay. Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).
  15. Loeber, R. L., et al. Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards. Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).
  16. Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. 1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells. J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).
  17. Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells. Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).
  18. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104(2013).
  19. Kiianitsa, K., Maizels, N. Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay. Nucleic Acids Research. 42 (13), e108(2014).
  20. Stingele, J., et al. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  21. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair. Mol Cell. 64, 704-719 (2016).
  22. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  23. Lessel, D., et al. Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features. Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).
  24. Baker, D. J., et al. Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells. J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).
  25. Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay. Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).
  26. Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).
  27. Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
  28. Lee, H. W., et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells. Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).
  29. Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).
  30. Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy. Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).
  31. George, J. W., et al. Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation. Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).
  32. Minko, I. G., et al. Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease. Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).
  33. Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).
  34. Reardon, J. T., Sancar, A. Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease. PNAS. 103, 4056-4061 (2006).
  35. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491(2016).
  36. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  37. Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis. Cell. 159 (2), 346-357 (2014).
  38. Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).
  39. Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Naprawa wi za krzy owych DNA bia kotransfekcja plazmidowaspecyficzna dla nici elongacja starter wilo ciowe PCRlinie kom rkowe ssak wodpowied na uszkodzenia DNAplazmidy zawieraj ce adduktyqPCR w czasie rzeczywistymanaliza progu cykluoczyszczanie elowe
Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.