Ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans

Kunal Baxi; Carlos E. de Carvalho

doi:10.3791/57414

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans

5.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57414

⸱

13 kwietnia 2018

Kunal Baxi¹ , Carlos E. de Carvalho¹

¹Department of Biology, University of Saskatchewan

W tym artykule

Podsumowanie

Przewodnik krok po kroku do badania utraty kwasowości lizosomalnej w jelicie C. elegans przy użyciu wrażliwego na pH barwnika witalnego 5(6)-karboksyloksy-2',7'-dichlorofluoresceiny dioctanu (cDCFDA)

Streszczenie

Nicień Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest systemem modelowym, który jest powszechnie używany do badania długowieczności i ścieżek rozwojowych. Takie badania są ułatwione dzięki przezroczystości zwierzęcia, zdolności do wykonywania testów genetycznych do przodu i do tyłu, względnej łatwości generowania białek znakowanych fluorescencyjnie oraz zastosowaniu barwników fluorescencyjnych, które mogą być mikrowstrzykiwane do wczesnego zarodka lub włączane do jego pożywienia (szczep E. coli OP50) do znakowania organelli komórkowych (np. 9-dietyloamino-5H-benzo(a)fenoksazyno-5-on i (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))metylideno]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimetyloamino)etylo]propanamidato)(difluoro)bor). W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na pH, który barwi lizosomy jelitowe, zapewniając wizualny odczyt dynamicznych, fizjologicznych zmian kwasowości lizosomalnej u żywych robaków. Protokół ten nie mierzy lizosomalnego pH, ale ma na celu ustanowienie wiarygodnej metody oceny fizjologicznych istotnych zmian kwasowości lizosomalnej. cDCFDA jest związkiem przenikającym komórkę, który jest przekształcany w fluorescencyjny fluorofor 5-(i-6)-karboksyl-2',7'-dichlorofluoresceinę (cDCF) po hydrolizie przez esterazy wewnątrzkomórkowe. Protonacja wewnątrz lizosomów zatrzymuje cDCF w tych organellach, gdzie się gromadzi. Ze względu na niskie pKa wynoszące 4,8, barwnik ten był używany jako czujnik pH u drożdży. Tutaj opisujemy zastosowanie cDCFDA jako suplementu diety do oceny kwasowości lizosomów jelitowych w C. elegans. Technika ta pozwala na wykrywanie lizosomów alkalizujących u żywych zwierząt i ma szeroki zakres zastosowań eksperymentalnych, w tym badania nad starzeniem się, autofagią i biogenezą lizosomalną.

Wprowadzenie

Powszechnie przyjmuje się, że pojawienie się agregatów białkowych jest cechą charakterystyczną starzenia się komórek eukariotycznych^1,²^,³, a ich powstawanie uważa się za jeden z głównych czynników powodujących starzenie się komórek⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że wraz ze starzeniem się komórek katabolizm białek jest upośledzony, co prowadzi do wzrostu agregacji białek. Załamanie się proteolizy w starzejących się komórkach wiąże się z upośledzeniem autofagii⁸, a także degradacją białek za pośrednictwem proteasomów⁹. Wreszcie, w starych komórkach zwiększa się nieodwracalne utlenianie białek, co dodatkowo upośledza katabolizm białek¹⁰.

Autofagia początkowo uważana była za nieselektywny proces masowej degradacji uszkodzonych białek, ale ostatnie badania wykazały, że autofagia jest wysoce selektywna w stosunku do katabolizmu agregatów białkowych i dysfunkcyjnych organelli, które nie są podatne na degradację przez inne mechanizmy usuwania białek¹¹. Podczas procesu autofagii uszkodzone i zagregowane białka są sekwestrowane do pęcherzyka o podwójnej błonie zwanego autofagosomem. Ten autofagosom następnie łączy się z kwaśnymi organellami zwanymi lizosomami, co prowadzi do degradacji autofagosomu cargo¹². Lizosomy stanowią punkt końcowy szlaku autofagicznego i uczestniczą w różnych procesach komórkowych, takich jak naprawa błony, kontrola transkrypcji i wykrywanie składników odżywczych; podkreślając ich scentralizowaną rolę w homeostazie komórkowej (przegląd w odnośniku 13). Kilka badań wykazało związek między zależnym od wieku spadkiem funkcji lizosomów a różnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi¹³. Konsekwentnie, przywrócenie funkcji lizosomalnej w starszych komórkach może opóźnić pojawienie się fenotypów związanych ze starzeniem się¹⁴^,¹⁵. Badania nad składem środowiska śródświateł sugerują, że załamanie funkcji lizosomalnej w starszych komórkach nie jest spowodowane zmniejszeniem produkcji proteaz lizosomalnych¹⁶. Alternatywnie, zaproponowano, że utrata kwasowości wewnątrzlizosomalnej, krytyczna wymagalność jego aktywności enzymatycznej, może leżeć u podstaw spadku proteolizy, w której pośredniczy lizosom¹⁷. Aby móc zbadać tę hipotezę, konieczne jest opracowanie odczynników i protokołów do badania dynamicznych zmian pH lizosomów w żywych komórkach w powtarzalny i spójny sposób.

Jelito C. elegans jest główną tkanką metaboliczną robaków i jest krytycznym regulatorem homeostazy i długości życia układu. Opracowaliśmy testy do oceny zmian kwasowości światła lizosomów jelitowych robaków, aby określić, w jaki sposób proteoliza za pośrednictwem lizosomów przyczynia się do starzenia. Chociaż fluorofory wrażliwe na pH były wcześniej używane w C. elegans do oznaczania lizosomów jelitowych, nie podjęto jeszcze wysiłku w celu ustanowienia skutecznego protokołu, który mógłby wykryć niewielki wzrost pH lizosomów in vivo¹⁸. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który można wykorzystać do wykrycia utraty kwasowości lizosomalnej w komórkach jelitowych C. elegans przy użyciu prostego i wygodnego protokołu żywienia, który zawiera fluorofor wrażliwy na pH (cDCFDA) do żywności OP50.