Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjne, wysokoprzepustowe określanie czasu trwania snu u gryzoni

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57420

⸱

18 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Section on Neuroadaptation and Protein Metabolism, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy wysokoprzepustową metodę pomiaru snu za pomocą monitorowania w domowej klatce opartej na aktywności. Ta metoda ma przewagę nad tradycyjnymi metodami opartymi na EEG. Jest dobrze zwalidowany do określania całkowitego czasu trwania snu i może być potężnym narzędziem do monitorowania snu w modelach chorób ludzkich u gryzoni.

Streszczenie

Tradycyjnie, sen jest monitorowany za pomocą elektroencefalogramu (EEG). Badania EEG u gryzoni wymagają chirurgicznego wszczepienia elektrod, po którym następuje długi okres rekonwalescencji. Aby wykonać zapis EEG, zwierzę jest podłączone do odbiornika, tworząc nienaturalne przywiązanie do mocowania głowy. Monitorowanie EEG jest czasochłonne, niesie ze sobą ryzyko dla zwierzęcia i nie jest całkowicie naturalnym miejscem do pomiaru snu. Alternatywne metody wykrywania snu, szczególnie w sposób wysokoprzepustowy, znacznie posunęłyby naprzód dziedzinę badań nad snem. W tym miejscu opisujemy sprawdzoną metodę wykrywania snu za pomocą monitorowania w klatce domowej opartej na aktywności. Wcześniejsze badania wykazały, że sen oceniany za pomocą tej metody ma wysoki stopień zgodności ze snem zdefiniowanym przez tradycyjne pomiary oparte na EEG. Chociaż ta metoda jest zwalidowana dla całkowitego czasu snu, ważne jest, aby pamiętać, że czas trwania snu powinien być oceniany za pomocą EEG, które ma lepszą rozdzielczość czasową. EEG może również różnicować szybkie ruchy gałek ocznych (REM) i sen bez fazy REM, dostarczając więcej szczegółów na temat dokładnej natury snu. Niemniej jednak określanie snu na podstawie aktywności może być wykorzystywane do analizy wielu dni niezakłóconego snu oraz do oceny snu jako odpowiedzi na ostre zdarzenie (takie jak stres). Tutaj pokazujemy moc tego systemu do wykrywania reakcji myszy na codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe.

Wprowadzenie

Sen pełni ważne funkcje dla przywrócenia ciała i mózgu po codziennym obciążeniu czuwaniem1. Wykazano, że sen odgrywa rolę w zapamiętywaniu i ogólnej plastyczności mózgu1. EEG jest złotym standardem w wykrywaniu sleep2. U gryzoni monitorowanie EEG wymaga chirurgicznego wszczepienia elektrod przymocowanych do mocowania głowy, po czym zwierzę potrzebuje pewnego czasu na powrót do zdrowia2. Po powrocie do zdrowia zwierzę jest podłączane do urządzenia rejestrującego i otrzymuje kolejny okres przyzwyczajenia2. Ze względu na te niezbędne okresy rekonwalescencji i przyzwyczajenia, EEG jest czasochłonne i pracochłonne i nie może być racjonalnie wykonane na dużą skalę. Ponadto zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu elektrody niesie ze sobą nieodłączne ryzyko dla zwierzęcia. Wreszcie, analiza danych w celu oceny snu w badaniach EEG jest również bardzo pracochłonna. Alternatywna, nieinwazyjna, wysokoprzepustowa metoda monitorowania snu znacznie pomogłaby w badaniach nad snem gryzoni.

System monitorowania domowej klatki oparty na aktywności, używany do wykrywania snu, rozwiązuje ograniczenia badań EEG. Proste założenie jest takie, że nieaktywne zwierzę jest prawdopodobnie zwierzęciem śpiącym. Wykazano, że 40 s ciągłej bezczynności (połączone w 10 epokach s) jest wiarygodną miarą snu mierzoną za pomocą EEG (wykazano, że ma 88-94% zgodności)3. Systemy monitorowania w klatkach domowych mogą być wykorzystywane do badania dużych grup zwierząt przy minimalnym czasie przygotowania. Wykazaliśmy, że zwierzęta potrzebują około jednego dnia, aby przyzwyczaić się do indywidualnego trzymania w systemie monitorowania w klatce domowej4, w przeciwieństwie do tygodni rekonwalescencji potrzebnych do badań EEG2. Ponadto niektóre konfiguracje mogą również wykrywać parametry fizjologiczne, takie jak temperatura ciała, tętno, aktywność i karmienie. Temperatura i tętno są określane na podstawie implantacji małego nadajnika. Parametry te mogą dostarczyć więcej informacji o myszy i mogą być używane równolegle z nagrywaniem snu, aby jeszcze bardziej poszerzyć naszą wiedzę na temat snu i tego, jak na niego wpływa.

Chociaż jest to potężne narzędzie, istnieją pewne ograniczenia co do typów danych, które można uzyskać z monitorowania domowego klatki opartej na aktywności. Badania EEG mogą różnicować sen REM i nie-REM, co może być ważne dla głębszego zrozumienia architektury snu. Systemy monitorowania klatki domowej oparte na aktywności mogą dostarczać danych tylko dla całkowitego czasu trwania snu. Ponadto, mimo że dane wyjściowe do monitorowania domowej klatki opartej na aktywności dostarczają informacji o czasie trwania napadu snu, nie możemy dokładnie ocenić czasu trwania ataku ze względu na nieodłączne ograniczenie interwałów 40 s3. Pomimo tych ograniczeń, monitorowanie czasu trwania snu w klatce domowej stanowi ważną miarę biologiczną, która może wpływać na wiele dalszych czynników, w tym zdrowie i zachowanie zwierzęcia5.

Monitorowanie domowej klatki opartej na aktywności było używane do wykrywania snu w wielu badaniach, co wskazuje na jego wszechstronność. Przytaczamy próbkę tych badań4,6,7,8, class="xref">9,10,11,12. Oprócz przedstawionej metody istnieją inne metody wykrywania snu za pomocą monitorowania opartego na aktywności, z których każda zawiera własne ograniczenia13,14. Niektóre z tych badań dotyczą długich okresów nieprzerwanego snu (72 godziny), podczas gdy inne analizują sen w blokach 24 godzin. W tym badaniu przedstawiono analizę snu dla każdego okresu 24 godzin po odpowiedzi na codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe (IP) oraz na okresowe zmiany klatki w mysim modelu zespołu łamliwego chromosomu X (myszy Fmr1 KO). Wybraliśmy myszy Fmr1 KO, ponieważ mają one zmniejszoną senność4 i przypuszcza się, że są hiperreaktywne na informacje sensoryczne15. Nasze dane podkreślają zdolność do wykrywania zmian we wzorcach snu w odpowiedzi na stresujące wydarzenie. Ta metoda jest idealna do uzyskiwania ogólnych informacji na temat snu w dużych kohortach myszy. Metoda może być przydatna do zrozumienia wpływu określonych zmian genetycznych na sen, efektów leczenia farmakologicznego lub reakcji na zdarzenia, takie jak stresor. Ponadto metoda ta zapewnia prosty sposób badania przesiewowego pod kątem odpowiedzi przed rozpoczęciem bardziej zaangażowanych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.

1. Ustawianie jednostek wykrywania snu

  1. Kup żądaną liczbę jednostek i oprogramowania.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby skonfigurować systemy monitorowania.
    1. Ustaw detektor naprzeciwko emitera. Upewnij się, że wiązki podczerwieni są skierowane do wewnątrz i są ustawione na tej samej wysokości.
    2. Użyj dostarczonych, aby ustawić detektory i emitery na żądanej wysokości na metalowym stojaku. Wysokość ta powinna być dostosowana tak, aby ściółka klatki znajdowała się poniżej poziomu wiązek podczerwieni, ale wiązka znajdowała się na odpowiedniej wysokości, aby wykryć aktywność zwierzęcia. W ten sposób powstaje powierzchnia wewnętrzna o wymiarach od 27 cm × 32 cm (10,625 cala × 12,75 cala).
      1. Jeśli potrzeba więcej, kup więcej w sklepie z narzędziami (śruba z stożkowym 6-32 1/4 cala).
  3. Podłącz każdy detektor do każdego emitera. Podłącz nadajnik do dostarczonego koncentratora połączonego z odbiornikiem. Wykonaj to zarówno dla płaszczyzny x, jak i y. Powtórz ten krok dla wszystkich konfiguracji.
  4. Podłącz odbiornik do komputera za pomocą dostarczonego koncentratora USB.

2. Konfiguracja oprogramowania

  1. Zainstaluj oprogramowanie analityczne i wybierz dostarczony plik konfiguracji sprzętu jako domyślny. Plik konfiguracji sprzętowej powinien być zmieniany tylko przez firmę.
  2. Kliknij pozycję Plik | Otwórz konfigurację eksperymentu. Otwórz domyślną konfigurację eksperymentu.
  3. Kliknij Eksperyment | Właściwości.
  4. Kliknij kartę Skanowanie. Zmień szybkość skanowania na 10 s.
  5. Kliknij kartę Aktywność. Zmień częstotliwość próbkowania aktywności na 10 s.
  6. Kliknij pozycję Plik | Zapisz eksperyment jako, aby zapisać te ustawienia konfiguracyjne na potrzeby przyszłych eksperymentów.

3. Konfiguracja zwierząt

  1. Pojedynczo trzymaj myszy w czystych klatkach o długości 31 cm (12,25 cala) i szerokości 16,5 cm (6,5 cala). Aby mysz nie gromadziła się na pościeli i nie zasłaniała belek, należy użyć ściółki na głębokości 3 mm. Nie dostarczaj myszom dodatkowego materiału do gniazdowania.
  2. Zapewnij myszom dostęp do pożywienia i wody ad libitum za pomocą podajnika drutu, który spoczywa w górnej części klatki, z dala od belek. W razie potrzeby należy uzupełnić karmę i zmienić butelki z wodą, gdy klatki są zmieniane co 3-5 dni przez cały czas trwania badania.
  3. Wyrównaj klatkę myszy wewnątrz ustawionej wiązki podczerwieni, upewniając się, że spoczywa mniej więcej pośrodku wiązek, aby zapewnić pełne pokrycie.
  4. Upewnij się, że cykl jasnej ciemności w pomieszczeniu jest ustawiony tak, aby odzwierciedlał cykl jasnej ciemności w normalnych warunkach mieszkaniowych myszy lub zmieniał się zgodnie z potrzebami w oparciu o eksperyment.

4. Przygotowanie leków i zastrzyki

  1. Zaopatrzyć się w sterylną wodę i sterylną cyklodekstrynę.
  2. Do wszystkich wstrzyknięć należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą podskórną o pojemności 25,5-30,5 g. Do każdej myszy należy użyć nowej sterylnej igły i strzykawki.
  3. Aby skrócić czas między wstrzyknięciami, należy wcześniej zmontować wszystkie strzykawki.
  4. Do wstrzykiwań cyklodekstryny: przygotować roztwór cyklodekstryny, dodając 3 g cyklodekstryny do 10 ml wody, aby uzyskać 30% roztwór cyklodekstryny.
  5. Podawać 0,3 ml soli fizjologicznej lub cyklodekstryny we wstrzyknięciu IP.

5. Oprogramowanie do nagrywania snu

  1. Otwórz domyślny plik konfiguracji sprzętowej.
  2. Kliknij pozycję Plik | Otwórz konfigurację eksperymentu. Otwórz żądaną lub domyślną konfigurację eksperymentu.
  3. Kliknij Eksperyment | Konfiguracja.
    1. Wyznacz lokalizację, w której ma zostać zapisany plik danych, a także lokalizację, w której ma zostać zapisany plik kopii zapasowej. Oprogramowanie wymaga, aby plik danych był przechowywany w Program Files w określonym folderze programu.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że niektóre komputery postrzegają pliki programów jako poufne, dostęp do pliku danych może nie być możliwy po zakończeniu eksperymentu. Dlatego zaleca się zapisanie pliku kopii zapasowej w innym, niewrażliwym obszarze na komputerze lokalnym.
    2. Wyznacz identyfikator zwierzęcia do każdej komory do spania i wprowadź wagę zwierzęcia, jeśli chcesz. Jeśli komora nie jest używana w eksperymencie, odznaczenie tego pola dezaktywuje tę komorę. Po wprowadzeniu informacji identyfikacyjnych kliknij przycisk Gotowe.
  4. Kliknij pozycję Plik | Zapisz eksperyment jako, aby zapisać bieżącą konfigurację eksperymentu pod żądaną nazwą pliku.
  5. Kliknij Eksperyment | Uruchom lub naciśnij F5, aby rozpocząć nagrywanie. Poczekaj na 10 sekund epokę, aby upewnić się, że wszystkie komory nabierają aktywności. Ponieważ zwierzętom właśnie wstrzyknięto, jest wysoce prawdopodobne, że będą się poruszać na tyle, aby zostać wykryte przez wiązki podczerwieni.
    1. Jeśli nie zostanie wykryta żadna aktywność, spróbuj ręcznie przesunąć klatkę myszy, aby upewnić się, że wiązki wychwytują ruch. Kontynuuj rozwiązywanie problemów lub przenieś się do komory roboczej, jeśli aktywność nadal nie jest rejestrowana.
      UWAGA: Eksperyment należy przeprowadzić zaraz po zakończeniu wstrzyknięć.
  6. Zakryj ekrany komputera nieprzezroczystą osłoną, aby zablokować światło. Zakryj lampki na mierniku aktywności.
  7. Uruchom eksperyment dla 24 h.
    UWAGA: Ze względu na czas niezbędny do wykonania iniekcji, nie będzie to pełne 24 godziny. Wstrzyknięcia należy wykonywać codziennie o tej samej porze. Podczas wstrzykiwań nie należy rejestrować snu.
  8. Następnego dnia, w momencie wstrzyknięć, kliknij Eksperyment | Zatrzymaj się, aby zakończyć nagrywanie. Kliknij pozycję Plik | Eksport | Wygeneruj pliki CSV tematu, aby zebrać nieprzetworzone dane dla każdej myszy.
    UWAGA: Eksport może zająć trochę czasu, więc zrób to natychmiast, a następnie przejdź do wstrzykiwań, gdy komputer przetwarza.
  9. Kliknij pozycję Plik | Eksport | Uśpij, aby wyeksportować plik uśpienia dla każdego eksperymentu, otwierając plik raw . CDTA na dowolnym komputerze, na którym jest zainstalowane oprogramowanie.
    1. W obszarze Detection Parameters Activity Source (Źródło aktywności) upewnij się, że zaznaczone są pola wyboru zarówno oś x, jak i oś y.
    2. W obszarze Epoki progu uśpienia upewnij się, że wybrano 4 epoki.
    3. W obszarze Próg aktywności progu uśpienia upewnij się, że wybrano wartość 0
      4. .
    4. W obszarze Cykl jasny/ciemny sprawdź odpowiedni czas dla cyklu światła/ciemności.
    5. W oknie analizy wybierz żądany czas analizy. W przypadku badań z wstrzykiwaniami należy pozostawić dzień jako domyślny. Ustaw czas rozpoczęcia jako ExpSTART. Ustaw czas trwania na 24:00 na 24 godziny. Analiza za pomocą oprogramowania może być wykonywana maksymalnie przez 72 godziny.
    6. Zapisz konfigurację, aby zaoszczędzić czas na eksport danych.
    7. Kliknij przycisk Aktualizuj.
    8. Kliknij przycisk Generuj plik CSV i zapisz plik w żądanej lokalizacji.

6. Analiza danych

  1. Dla każdej sesji nagraniowej otwórz plik uśpienia. Aby przypisać identyfikator podmiotu, otwórz indywidualny plik CSV dla każdej komory, aby określić identyfikator podmiotu. Zapisz sen TOT hh:mm:ss zarówno dla fazy jasnej, jak i ciemnej dla wszystkich zwierząt.
    1. Sprawdź, czy w pliku CSV z indywidualnym tematem nie ma niespójności wskazujących na niepowodzenie nagrywania. Jeśli w jednej płaszczyźnie zostanie wykryta liczba wiązek drogowych, ale na drugiej nie zostaną zaobserwowane żadne liczby, oznacza to awarię wiązki.
      UWAGA: "% snu" dla fazy jasnej i ciemnej jest obliczany dla całkowitego okresu nagrywania, który obejmuje zarówno fazę jasną, jak i ciemną. W przypadku 12-godzinnych cykli światła/ciemności pomnóż tę liczbę przez 2, aby uzyskać "% snu" w 12-godzinnej fazie światła lub ciemności. Biorąc pod uwagę, że badania z wstrzykiwaniami nie trwały pełnych 24 godzin, obliczony "% snu" nie jest dokładny. Aby wygenerować poprawny "% snu", podziel "TOT sleep hh:mm:ss" przez "Czas, który upłynął w eksperymencie: hh:mm:ss", pomnóż przez 2, a następnie pomnóż przez 100, aby uzyskać procent. Jeśli iniekcja została wykonana w fazie lekkiej, to tylko faza lekka musi być wyregulowana w ten sposób.
  2. Ponieważ porównuje się ze sobą różne dni i fazy, przeanalizuj procentowy czas trwania snu dla każdej fazy i każdego dnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby określić wpływ codziennych iniekcji na sen oraz sprawdzić, czy zwierzęta przyzwyczajają się do iniekcji, wykonywaliśmy codzienne iniekcje IP przez 14 kolejnych dni o godzinie 9:0 (cykl światła rozpoczynał się o godzinie 6:0) i rejestrowaliśmy czas trwania snu u 12 myszy Fmr1 KO C57Bl/6J. Zastosowano schemat wewnątrzobiektowy, w którym każdemu zwierzęciu wstrzykiwano sól fizjologiczną przez 4 kolejne dni (dni 1-4), a następnie 30% cyklodekstrynę przez następne dziesięć kolejny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy nieinwazyjną, wysokoprzepustową metodę wyznaczania czasu trwania snu na podstawie monitorowania aktywności w domowej klatce. Ta metoda oceny całkowitego czasu snu została zwalidowana w badaniach EEG3. Monitorowanie w klatkach domowych na podstawie aktywności jest proste, nieinwazyjne i ma zastosowanie w badaniach populacyjnych na dużej liczbie zwierząt. Jest ograniczony, ponieważ nie może podać szczegółowych informacji o śnie (takich jak czas trwania snu i fazy snu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Radzie Redakcyjnej NIH Fellows za pomoc redakcyjną. Badania te zostały sfinansowane przez Intramural Research Program NIMH (ZIA MH00889). RMS był również wspierany przez stypendium podoktorskie FRAXA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kompleksowy system monitorowania zwierząt laboratoryjnych (CLAMS)Columbus InstrumentsSprzęt i oprogramowanie do analizy czasu trwania snu
Captisol Research GradeCaptisolRC-0C7-100Kaptyzol do rozpuszczania związków hydrofobowych
30 G BD Igła 1/2 calaBD305106Igła do wstrzykiwań
Jednorazowe strzykawki BDFisher14-823-30Strzykawki do wstrzykiwań
B6.129P2-FMR1TM1Cgr/JJackson Labs3025Fmr1 KO
myszy Super Mouse 750 Mouse CageLab Products, Inc. Klatki domowe dla myszy
SANI-Chips ŚciółkaPJ Murphys Ściółkadla myszy

Bibliografia

  1. Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain sciences. 4, 150-201 (2014).
  2. Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in neural sciences. 11, 47-50 (1984).
  3. Pack, A. I., et al. Novel method for high-throughput phenotyping of sleep in mice. Physiological genomics. 28, 232-238 (2007).
  4. Sare, R. M., et al. Deficient Sleep in Mouse Models of Fragile X Syndrome. Front Mol Neurosci. 10, (2017).
  5. Alvarez, G. G., Ayas, N. T. The impact of daily sleep duration on health: a review of the literature. Progress in cardiovascular nursing. 19, 56-59 (2004).
  6. Kincheski, G. C., et al. Chronic sleep restriction promotes brain inflammation and synapse loss, and potentiates memory impairment induced by amyloid-beta oligomers in mice. Brain, behavior, and immunity. 64, 140-151 (2017).
  7. Sare, R. M., Levine, M., Hildreth, C., Picchioni, D., Smith, C. B. Chronic sleep restriction during development can lead to long-lasting behavioral effects. Physiology & behavior. 155, 208-217 (2015).
  8. Moretti, P., Bouwknecht, J. A., Teague, R., Paylor, R., Zoghbi, H. Y. Abnormalities of social interactions and home-cage behavior in a mouse model of Rett syndrome. Human molecular genetics. 14, 205-220 (2005).
  9. Guzman, M. S., et al. Mice with selective elimination of striatal acetylcholine release are lean, show altered energy homeostasis and changed sleep/wake cycle. Journal of neurochemistry. 124, 658-669 (2013).
  10. Vecsey, C. G., et al. Daily acclimation handling does not affect hippocampal long-term potentiation or cause chronic sleep deprivation in mice. Sleep. 36, 601-607 (2013).
  11. Bogdanik, L. P., Chapman, H. D., Miers, K. E., Serreze, D. V., Burgess, R. W. A MusD retrotransposon insertion in the mouse Slc6a5 gene causes alterations in neuromuscular junction maturation and behavioral phenotypes. PloS one. 7, e30217(2012).
  12. Angelakos, C. C., et al. Hyperactivity and male-specific sleep deficits in the 16p11.2 deletion mouse model of autism. Autism research: official journal of the International Society for Autism Research. 10, 572-584 (2017).
  13. Fisher, S. P., et al. Rapid assessment of sleep-wake behavior in mice. Journal of biological rhythms. 27, 48-58 (2012).
  14. Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/ electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37, 1383-1392 (2014).
  15. Chen, L., Toth, M. Fragile X mice develop sensory hyperreactivity to auditory stimuli. Neuroscience. 103, 1043-1050 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Monitorowanie aktywnościwiązki podczerwieniklatka domowametoda nieinwazyjnasen gryzonianaliza snuiniekcje doprzetrzewnikowecykl światło-ciemność
Nieinwazyjne, wysokoprzepustowe określanie czasu trwania snu u gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.