Nieinwazyjne, wysokoprzepustowe określanie czasu trwania snu u gryzoni

Sen pełni ważne funkcje dla przywrócenia ciała i mózgu po codziennym obciążeniu czuwaniem¹. Wykazano, że sen odgrywa rolę w zapamiętywaniu i ogólnej plastyczności mózgu¹. EEG jest złotym standardem w wykrywaniu sleep². U gryzoni monitorowanie EEG wymaga chirurgicznego wszczepienia elektrod przymocowanych do mocowania głowy, po czym zwierzę potrzebuje pewnego czasu na powrót do zdrowia². Po powrocie do zdrowia zwierzę jest podłączane do urządzenia rejestrującego i otrzymuje kolejny okres przyzwyczajenia². Ze względu na te niezbędne okresy rekonwalescencji i przyzwyczajenia, EEG jest czasochłonne i pracochłonne i nie może być racjonalnie wykonane na dużą skalę. Ponadto zabieg chirurgiczny polegający na wszczepieniu elektrody niesie ze sobą nieodłączne ryzyko dla zwierzęcia. Wreszcie, analiza danych w celu oceny snu w badaniach EEG jest również bardzo pracochłonna. Alternatywna, nieinwazyjna, wysokoprzepustowa metoda monitorowania snu znacznie pomogłaby w badaniach nad snem gryzoni.

System monitorowania domowej klatki oparty na aktywności, używany do wykrywania snu, rozwiązuje ograniczenia badań EEG. Proste założenie jest takie, że nieaktywne zwierzę jest prawdopodobnie zwierzęciem śpiącym. Wykazano, że 40 s ciągłej bezczynności (połączone w 10 epokach s) jest wiarygodną miarą snu mierzoną za pomocą EEG (wykazano, że ma 88-94% zgodności)³. Systemy monitorowania w klatkach domowych mogą być wykorzystywane do badania dużych grup zwierząt przy minimalnym czasie przygotowania. Wykazaliśmy, że zwierzęta potrzebują około jednego dnia, aby przyzwyczaić się do indywidualnego trzymania w systemie monitorowania w klatce domowej⁴, w przeciwieństwie do tygodni rekonwalescencji potrzebnych do badań EEG². Ponadto niektóre konfiguracje mogą również wykrywać parametry fizjologiczne, takie jak temperatura ciała, tętno, aktywność i karmienie. Temperatura i tętno są określane na podstawie implantacji małego nadajnika. Parametry te mogą dostarczyć więcej informacji o myszy i mogą być używane równolegle z nagrywaniem snu, aby jeszcze bardziej poszerzyć naszą wiedzę na temat snu i tego, jak na niego wpływa.

Chociaż jest to potężne narzędzie, istnieją pewne ograniczenia co do typów danych, które można uzyskać z monitorowania domowego klatki opartej na aktywności. Badania EEG mogą różnicować sen REM i nie-REM, co może być ważne dla głębszego zrozumienia architektury snu. Systemy monitorowania klatki domowej oparte na aktywności mogą dostarczać danych tylko dla całkowitego czasu trwania snu. Ponadto, mimo że dane wyjściowe do monitorowania domowej klatki opartej na aktywności dostarczają informacji o czasie trwania napadu snu, nie możemy dokładnie ocenić czasu trwania ataku ze względu na nieodłączne ograniczenie interwałów 40 s³. Pomimo tych ograniczeń, monitorowanie czasu trwania snu w klatce domowej stanowi ważną miarę biologiczną, która może wpływać na wiele dalszych czynników, w tym zdrowie i zachowanie zwierzęcia⁵.

Monitorowanie domowej klatki opartej na aktywności było używane do wykrywania snu w wielu badaniach, co wskazuje na jego wszechstronność. Przytaczamy próbkę tych badań^{4,6,7,8, class="xref">9,10,11,12}. Oprócz przedstawionej metody istnieją inne metody wykrywania snu za pomocą monitorowania opartego na aktywności, z których każda zawiera własne ograniczenia^13,14. Niektóre z tych badań dotyczą długich okresów nieprzerwanego snu (72 godziny), podczas gdy inne analizują sen w blokach 24 godzin. W tym badaniu przedstawiono analizę snu dla każdego okresu 24 godzin po odpowiedzi na codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe (IP) oraz na okresowe zmiany klatki w mysim modelu zespołu łamliwego chromosomu X (myszy Fmr1 KO). Wybraliśmy myszy Fmr1 KO, ponieważ mają one zmniejszoną senność⁴ i przypuszcza się, że są hiperreaktywne na informacje sensoryczne¹⁵. Nasze dane podkreślają zdolność do wykrywania zmian we wzorcach snu w odpowiedzi na stresujące wydarzenie. Ta metoda jest idealna do uzyskiwania ogólnych informacji na temat snu w dużych kohortach myszy. Metoda może być przydatna do zrozumienia wpływu określonych zmian genetycznych na sen, efektów leczenia farmakologicznego lub reakcji na zdarzenia, takie jak stresor. Ponadto metoda ta zapewnia prosty sposób badania przesiewowego pod kątem odpowiedzi przed rozpoczęciem bardziej zaangażowanych badań.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia Psychicznego i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.

1. Ustawianie jednostek wykrywania snu

1. Kup żądaną liczbę jednostek i oprogramowania.
2. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby skonfigurować systemy monitorowania.
   1. Ustaw detektor naprzeciwko emitera. Upewnij się, że wiązki podczerwieni są skierowane do wewnątrz i są ustawione na tej samej wysokości.
   2. Użyj dostarczonych, aby ustawić detektory i emitery na żądanej wysokości na metalowym stojaku. Wysokość ta powinna być dostosowana tak, aby ściółka klatki znajdowała się poniżej poziomu wiązek podczerwieni, ale wiązka znajdowała się na odpowiedniej wysokości, aby wykryć aktywność zwierzęcia. W ten sposób powstaje powierzchnia wewnętrzna o wymiarach od 27 cm × 32 cm (10,625 cala × 12,75 cala).
      1. Jeśli potrzeba więcej, kup więcej w sklepie z narzędziami (śruba z stożkowym 6-32 1/4 cala).
3. Podłącz każdy detektor do każdego emitera. Podłącz nadajnik do dostarczonego koncentratora połączonego z odbiornikiem. Wykonaj to zarówno dla płaszczyzny x, jak i y. Powtórz ten krok dla wszystkich konfiguracji.
4. Podłącz odbiornik do komputera za pomocą dostarczonego koncentratora USB.

2. Konfiguracja oprogramowania

1. Zainstaluj oprogramowanie analityczne i wybierz dostarczony plik konfiguracji sprzętu jako domyślny. Plik konfiguracji sprzętowej powinien być zmieniany tylko przez firmę.
2. Kliknij pozycję Plik | Otwórz konfigurację eksperymentu. Otwórz domyślną konfigurację eksperymentu.
3. Kliknij Eksperyment | Właściwości.
4. Kliknij kartę Skanowanie. Zmień szybkość skanowania na 10 s.
5. Kliknij kartę Aktywność. Zmień częstotliwość próbkowania aktywności na 10 s.
6. Kliknij pozycję Plik | Zapisz eksperyment jako, aby zapisać te ustawienia konfiguracyjne na potrzeby przyszłych eksperymentów.

3. Konfiguracja zwierząt

1. Pojedynczo trzymaj myszy w czystych klatkach o długości 31 cm (12,25 cala) i szerokości 16,5 cm (6,5 cala). Aby mysz nie gromadziła się na pościeli i nie zasłaniała belek, należy użyć ściółki na głębokości 3 mm. Nie dostarczaj myszom dodatkowego materiału do gniazdowania.
2. Zapewnij myszom dostęp do pożywienia i wody ad libitum za pomocą podajnika drutu, który spoczywa w górnej części klatki, z dala od belek. W razie potrzeby należy uzupełnić karmę i zmienić butelki z wodą, gdy klatki są zmieniane co 3-5 dni przez cały czas trwania badania.
3. Wyrównaj klatkę myszy wewnątrz ustawionej wiązki podczerwieni, upewniając się, że spoczywa mniej więcej pośrodku wiązek, aby zapewnić pełne pokrycie.
4. Upewnij się, że cykl jasnej ciemności w pomieszczeniu jest ustawiony tak, aby odzwierciedlał cykl jasnej ciemności w normalnych warunkach mieszkaniowych myszy lub zmieniał się zgodnie z potrzebami w oparciu o eksperyment.

4. Przygotowanie leków i zastrzyki

1. Zaopatrzyć się w sterylną wodę i sterylną cyklodekstrynę.
2. Do wszystkich wstrzyknięć należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą podskórną o pojemności 25,5-30,5 g. Do każdej myszy należy użyć nowej sterylnej igły i strzykawki.
3. Aby skrócić czas między wstrzyknięciami, należy wcześniej zmontować wszystkie strzykawki.
4. Do wstrzykiwań cyklodekstryny: przygotować roztwór cyklodekstryny, dodając 3 g cyklodekstryny do 10 ml wody, aby uzyskać 30% roztwór cyklodekstryny.
5. Podawać 0,3 ml soli fizjologicznej lub cyklodekstryny we wstrzyknięciu IP.

5. Oprogramowanie do nagrywania snu

1. Otwórz domyślny plik konfiguracji sprzętowej.
2. Kliknij pozycję Plik | Otwórz konfigurację eksperymentu. Otwórz żądaną lub domyślną konfigurację eksperymentu.
3. Kliknij Eksperyment | Konfiguracja.
   1. Wyznacz lokalizację, w której ma zostać zapisany plik danych, a także lokalizację, w której ma zostać zapisany plik kopii zapasowej. Oprogramowanie wymaga, aby plik danych był przechowywany w Program Files w określonym folderze programu.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę, że niektóre komputery postrzegają pliki programów jako poufne, dostęp do pliku danych może nie być możliwy po zakończeniu eksperymentu. Dlatego zaleca się zapisanie pliku kopii zapasowej w innym, niewrażliwym obszarze na komputerze lokalnym.
   2. Wyznacz identyfikator zwierzęcia do każdej komory do spania i wprowadź wagę zwierzęcia, jeśli chcesz. Jeśli komora nie jest używana w eksperymencie, odznaczenie tego pola dezaktywuje tę komorę. Po wprowadzeniu informacji identyfikacyjnych kliknij przycisk Gotowe.
4. Kliknij pozycję Plik | Zapisz eksperyment jako, aby zapisać bieżącą konfigurację eksperymentu pod żądaną nazwą pliku.
5. Kliknij Eksperyment | Uruchom lub naciśnij F5, aby rozpocząć nagrywanie. Poczekaj na 10 sekund epokę, aby upewnić się, że wszystkie komory nabierają aktywności. Ponieważ zwierzętom właśnie wstrzyknięto, jest wysoce prawdopodobne, że będą się poruszać na tyle, aby zostać wykryte przez wiązki podczerwieni.
   1. Jeśli nie zostanie wykryta żadna aktywność, spróbuj ręcznie przesunąć klatkę myszy, aby upewnić się, że wiązki wychwytują ruch. Kontynuuj rozwiązywanie problemów lub przenieś się do komory roboczej, jeśli aktywność nadal nie jest rejestrowana.
      UWAGA: Eksperyment należy przeprowadzić zaraz po zakończeniu wstrzyknięć.
6. Zakryj ekrany komputera nieprzezroczystą osłoną, aby zablokować światło. Zakryj lampki na mierniku aktywności.
7. Uruchom eksperyment dla 24 h.
   UWAGA: Ze względu na czas niezbędny do wykonania iniekcji, nie będzie to pełne 24 godziny. Wstrzyknięcia należy wykonywać codziennie o tej samej porze. Podczas wstrzykiwań nie należy rejestrować snu.
8. Następnego dnia, w momencie wstrzyknięć, kliknij Eksperyment | Zatrzymaj się, aby zakończyć nagrywanie. Kliknij pozycję Plik | Eksport | Wygeneruj pliki CSV tematu, aby zebrać nieprzetworzone dane dla każdej myszy.
   UWAGA: Eksport może zająć trochę czasu, więc zrób to natychmiast, a następnie przejdź do wstrzykiwań, gdy komputer przetwarza.
9. Kliknij pozycję Plik | Eksport | Uśpij, aby wyeksportować plik uśpienia dla każdego eksperymentu, otwierając plik raw . CDTA na dowolnym komputerze, na którym jest zainstalowane oprogramowanie.
   1. W obszarze Detection Parameters Activity Source (Źródło aktywności) upewnij się, że zaznaczone są pola wyboru zarówno oś x, jak i oś y.
   2. W obszarze Epoki progu uśpienia upewnij się, że wybrano 4 epoki.
   3. W obszarze Próg aktywności progu uśpienia upewnij się, że wybrano wartość 0
   .
   4. W obszarze Cykl jasny/ciemny sprawdź odpowiedni czas dla cyklu światła/ciemności.
   5. W oknie analizy wybierz żądany czas analizy. W przypadku badań z wstrzykiwaniami należy pozostawić dzień jako domyślny. Ustaw czas rozpoczęcia jako ExpSTART. Ustaw czas trwania na 24:00 na 24 godziny. Analiza za pomocą oprogramowania może być wykonywana maksymalnie przez 72 godziny.
   6. Zapisz konfigurację, aby zaoszczędzić czas na eksport danych.
   7. Kliknij przycisk Aktualizuj.
   8. Kliknij przycisk Generuj plik CSV i zapisz plik w żądanej lokalizacji.

6. Analiza danych

1. Dla każdej sesji nagraniowej otwórz plik uśpienia. Aby przypisać identyfikator podmiotu, otwórz indywidualny plik CSV dla każdej komory, aby określić identyfikator podmiotu. Zapisz sen TOT hh:mm:ss zarówno dla fazy jasnej, jak i ciemnej dla wszystkich zwierząt.
   1. Sprawdź, czy w pliku CSV z indywidualnym tematem nie ma niespójności wskazujących na niepowodzenie nagrywania. Jeśli w jednej płaszczyźnie zostanie wykryta liczba wiązek drogowych, ale na drugiej nie zostaną zaobserwowane żadne liczby, oznacza to awarię wiązki.
      UWAGA: "% snu" dla fazy jasnej i ciemnej jest obliczany dla całkowitego okresu nagrywania, który obejmuje zarówno fazę jasną, jak i ciemną. W przypadku 12-godzinnych cykli światła/ciemności pomnóż tę liczbę przez 2, aby uzyskać "% snu" w 12-godzinnej fazie światła lub ciemności. Biorąc pod uwagę, że badania z wstrzykiwaniami nie trwały pełnych 24 godzin, obliczony "% snu" nie jest dokładny. Aby wygenerować poprawny "% snu", podziel "TOT sleep hh:mm:ss" przez "Czas, który upłynął w eksperymencie: hh:mm:ss", pomnóż przez 2, a następnie pomnóż przez 100, aby uzyskać procent. Jeśli iniekcja została wykonana w fazie lekkiej, to tylko faza lekka musi być wyregulowana w ten sposób.
2. Ponieważ porównuje się ze sobą różne dni i fazy, przeanalizuj procentowy czas trwania snu dla każdej fazy i każdego dnia.

Aby określić wpływ codziennych zastrzyków na sen i czy zwierzęta przyzwyczajają się do zastrzyków, wykonywaliśmy codzienne zastrzyki IP przez 14 kolejnych dni o godzinie 9:00 (cykl świetlny rozpoczął się o 6:00) i zarejestrowaliśmy czas snu u 12 myszy Fmr1 KO C57Bl/6J. Zastosowaliśmy projekt wewnętrzny, wstrzykując każdemu zwierzęciu normalną sól fizjologiczną przez 4 kolejne dni (dni 1-4), a następnie 30% cyklodekstryny przez następne dziesięć kolejnych dni (dni 5-14). Cyklodekstryna została wybrana, ponieważ może być używana do rozpuszczania związków hydrofobowych do podawania leków i byliśmy zainteresowani tym, jak wstrzyknięcie nośnika może wpływać na sen u myszy. Biorąc pod uwagę długi czas trwania zapisu, zmienialiśmy również klatki dwa razy w tygodniu przez cały czas trwania badania. Zmiany w klatce wykonywano w tym samym czasie, co wstrzyknięcia we wskazanych dniach. Podajemy średni procentowy czas trwania snu dla fazy jasnej i ciemnej w ciągu 14 dni wstrzyknięć i zmian w klatce (Rysunek 1). Zwierzęta nie otrzymały dodatkowego okresu przyzwyczajenia do aparatu snu bez zastrzyków. Znaleźliśmy istotną interakcję fazy x dnia (F = 16,463) (p < 0,001), co wskazuje, że różnice w czasie trwania snu w ciągu czternastu dni różniły się między fazami jasnymi i ciemnymi. Testy przeprowadzone po hoct wykazały, że w fazie lekkiej czas snu w dniu 1 był inny niż w prawie wszystkie inne dni. Jest to zgodne z efektami przyzwyczajenia do ustawień snu nawet bez zastrzyków4. Również w fazie lekkiej czas snu w dniach 6, 9 i 13 (kiedy klatki zostały zmienione po wstrzyknięciach IP) był znacząco różny (p < 0,05) niż czas snu w sąsiednich dniach, co wskazuje, że zmiana klatki zmienia czas trwania snu. Chociaż istnieje niewielka codzienna różnica w czasie trwania snu (co jest normalnym zjawiskiem), znaczne skrócenie czasu trwania snu w fazie światła, gdy klatki zostały zmienione, sugeruje, że zmiany w klatkach wpływają na sen. Nie stwierdzono istotnej różnicy w czasie trwania snu w fazie lekkiej w dniach podawania cyklodekstryny bez zmian w klatce (tj. Dni 5, 7, 8, 10, 11, 12 i 14). Dane te wskazują, że myszy przyzwyczaiły się do wstrzykiwań IP cyklodekstryny w stosunkowo krótkim czasie. W fazie ciemnej czas trwania snu był różny między dniem 2 a 6 (pierwsza zmiana klatki), co sugeruje potencjalną kompensację skrócenia czasu trwania snu w fazie światła, która wystąpiła w dniu 6. Alternatywna prezentacja czasu trwania snu, która dzieli dni od 4 do 6 na przyrosty co 2 godziny, pokazuje natychmiastowy wpływ zastrzyków i zmian w klatce na czas trwania snu (Rysunek 2).

Rysunek 1: Procentowy czas snu w fazie światła (A) i ciemności (B) jest pokazany w czternastodniowym okresie rejestracji. Myszy otrzymywały codzienne zastrzyki IP z soli fizjologicznej (białe strzałki) lub 30% cyklodekstryny (czarne strzałki) o godzinie 9 rano w fazie światła. Pola wokół strzałek wskazują zmianę klatki. Interakcja fazy x doby była istotna statystycznie (p < 0,001). Testy t post hoc sugerują, że czas trwania snu różnił się w fazie światła w dniu 1 od innych dni, co wskazuje na przyzwyczajenie zarówno do konfiguracji snu, jak i zastrzyków IP. Sen został skrócony przez zmiany w klatce w dniach 6, 9 i 13 w porównaniu z innymi dniami (dzień 5, 7, 8, 10, 11, 12 i 14). Czas snu po wstrzyknięciu cyklodekstryny był stosunkowo stabilny w dniach, w których klatki nie były zmieniane, co wskazuje, że myszy przyzwyczaiły się do wstrzyknięć cyklodekstryny IP. Punkty reprezentują średnie ± błędów standardowych średniej (SEM) w 12 myszach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Procent czasu trwania snu w 2-godzinnych ramkach, rozpoczynający się po wstrzyknięciu soli fizjologicznej w dniu 4 i kończący się na końcu dnia 6. Każdy punkt danych jest prezentowany jako średni sen myszy w ciągu następujących 2 godzin. Myszy otrzymywały codzienne zastrzyki IP soli fizjologicznej (biała strzałka) lub 30% cyklodekstryny (czarne strzałki). Zastrzyki podawano o 9 rano, a zapis snu wznowiono po 1-1,5 godzinie. Pola wokół strzałek wskazują zmianę klatki. Klatki zmieniano po wstrzyknięciach o 9 rano, a nagrania snu wznawiano o 11 rano. Szare linie wskazują sen, który wystąpił w cyklu światła, podczas gdy czarne linie wskazują sen, który wystąpił w cyklu ciemnym. Punkty reprezentują średnie ± SEM u 12 myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.