Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57450

⸱

10 lipca 2018

 , 
1Communities for Building Active STEM Engagement, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół wystawiania gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczenia w celu zbadania wpływu ekspozycji na szereg wyników fenotypowych w różnych stadiach rozwoju i dla więcej niż jednego pokolenia.

Streszczenie

Właściwości emergentne i czynniki zewnętrzne (w szczególności interakcje na poziomie populacji i ekosystemu) odgrywają ważną rolę w pośredniczeniu w ważnych ekologicznie punktach końcowych, choć rzadko są brane pod uwagę w badaniach toksykologicznych. D. melanogaster wyłania się jako model toksykologiczny dla behawioralnych, neurologicznych i genetycznych skutków substancji toksycznych, by wymienić tylko kilka. Co ważniejsze, gatunki z rodzaju Drosophila mogą być wykorzystane jako system modelowy dla integracyjnego podejścia ramowego w celu uwzględnienia wyłaniających się właściwości i odpowiedzi na ekologicznie istotne pytania w badaniach toksykologicznych. Celem niniejszej pracy jest opracowanie protokołu narażenia gatunków z rodzaju Drosophila na działanie zanieczyszczeń, który zostanie wykorzystany jako system modelowy dla szeregu wyników fenotypowych i pytań istotnych ekologicznie. Mówiąc dokładniej, protokół ten może być wykorzystany do: 1) powiązania wielu biologicznych poziomów organizacji i zrozumienia wpływu substancji toksycznych na przystosowanie zarówno na poziomie indywidualnym, jak i populacyjnym; 2) badanie wpływu substancji toksycznych na różnych etapach narażenia rozwojowego; 3) badanie wielopokoleniowych i ewolucyjnych skutków zanieczyszczeń; oraz 4) testuj wiele zanieczyszczeń i stresorów jednocześnie.

Wprowadzenie

Każdego roku, około 1,000 nowych substancji chemicznych jest wprowadzanych przez przemysł chemiczny1,2; jednak wpływ na środowisko tylko niewielkiego procentu tych chemikaliów jest testowany przed dystrybucją2,3. Chociaż katastrofy na dużą skalę są rzadkie, subletalne i przewlekłe narażenie na wiele różnych zanieczyszczeń jest powszechne zarówno wśród ludzi, jak i dzikich zwierząt4,5. Historyczny nacisk ekotoksykologii i toksykologii środowiskowej polegał na testowaniu śmiertelności, narażenia na pojedynczą substancję chemiczną, ostrego narażenia i fizjologicznych skutków narażenia, jako sposobu pomiaru wpływu zanieczyszczeń na przeżycie6,7,8,9,10. Chociaż obserwuje się zwrot w kierunku etycznych i nieinwazyjnych podejść do testów na zwierzętach, obecne podejścia są ograniczone ze względu na rolę, jaką rozwój, właściwości emergentne i czynniki zewnętrzne (takie jak interakcje na poziomie populacji i ekosystemu) odgrywają w pośredniczeniu w ważnych ekologicznie punktach końcowych8. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na metody, które uwzględniają bardziej holistyczne podejście bez poświęcania dzikiej przyrody i/lub kręgowców w laboratorium.

Systemy modelowe bezkręgowców, takie jak Drosophila melanogaster, są atrakcyjną alternatywą, która zaspokaja potrzebę bardziej holistycznego podejścia do badań toksyczności. D. melanogaster, został pierwotnie opracowany jako system modelowy bezkręgowców do badań genetycznych związanych z człowiekiem około sto lat temu11. D. melanogaster jest obecnie powszechnie stosowany jako alternatywa dla modelu kręgowców z kilku powodów: 1) zachowanie genów i szlaków między D. melanogaster a ludźmi; 2) krótki czas generacji w porównaniu z modelami kręgowców; 3) niedrogie koszty utrzymania; 4) łatwość w generowaniu dużych rozmiarów próby; oraz 5) mnóstwo istotnych pod względem fenotypowym i ekologicznym punktów końcowych dostępnych do testowania11,12,13,14,15,16,17.

Kilka laboratoriów11,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 używają teraz D. melanogaster jako alternatywy dla modelu kręgowców do testowania toksyczności, aby zrozumieć wpływ zanieczyszczeń na ludzi. Lokalne dzikie gatunki Drosophila mogą być również wykorzystywane jako modele toksyczności dla dzikiej przyrody (i ludzi), aby odpowiedzieć na pytania istotne ekologicznie, behawioralnie i ewolucyjnie na wielu biologicznych poziomach organizacji. Korzystając z gatunków z rodzaju Drosophila jako modelu, możliwych jest kilka mierzalnych punktów końcowych11,15,16,18,19,20,21,22,23,24,25. Ponadto, korzystając z modelu Drosophila, toksykolodzy mogą: 1) etycznie łączyć efekty na wielu poziomach biologicznych organizacji; 2) uwzględnianie roli czynników emergentnych i rozwoju; 3) badanie punktów końcowych ważnych z punktu widzenia środowiska (oprócz punktów końcowych ważnych z medycznego punktu widzenia); 4) testuj wiele stresorów jednocześnie; 5) i testować długoterminowe, wielopokoleniowe (np. ewolucyjne i międzypokoleniowe) implikacje stresorów. Dlatego wykorzystanie Drosophila jako systemu modelowego umożliwia wiele podejść, nie ograniczając się do badania podejść mechanistycznych z wsobnymi szczepami D. melanogaster w laboratorium.

W tym artykule prezentujemy metody hodowli i zbierania Drosophila, aby odpowiedzieć na różne pytania toksykologiczne. Dokładniej rzecz ujmując, opisujemy metodologię 1) hodowli Drosophila w podłożu z jednym lub kilkoma zanieczyszczeniami; 2) zbieranie Drosophila przez cały okres rozwoju (np. wędrujące larwy w trzecim stadium rozwojowym, przypadki poczwarek, nowo zamknięte dorosłe osobniki i dojrzałe osobniki dorosłe); oraz 3) hodowla Drosophila w skażonym podłożu w celu zbadania transmisji międzypokoleniowej i międzypokoleniowej, a także ewolucyjnych implikacji długotrwałego narażenia na toksyny. Korzystając z tego protokołu, poprzedni autorzy18,19,20,21,22,23,24,25 zgłosili różne fizjologiczne, genetyczne i behawioralne skutki rozwojowego ołowiu (Pb2+) ekspozycji. Protokół ten umożliwia toksykologom stosowanie bardziej holistycznego podejścia toksykologicznego, które jest niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób zanieczyszczenia są czynnikami ryzyka zarówno dla ludzi, jak i dzikich zwierząt w coraz bardziej zanieczyszczonym środowisku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest protokołem eksperymentalnym stosowanym do hodowli gatunków z rodzaju Drosophila na zanieczyszczonym podłożu w przypadkach, gdy odpowiednią drogą podania toksyny jest spożycie doustne; w modelu Drosophila możliwe są również inne formy ekspozycji11,15,16,26. Metody opisane w niniejszym protokole zostały wcześniej przedstawione przez Hirsch et al.19 oraz Peterson et al.23,24,25.

1. Zakładanie populacji wyjściowych Drosophila w laboratorium badawczym

  1. Przygotuj inkubator z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi (lub małe pomieszczenie) do utrzymywania populacji stokowych Muszka owocówka poprzez ustawienie w inkubatorach stałej temperatury, cyklu światło:ciemność oraz wilgotności, w zależności od preferencji badanych gatunków.
    UWAGA: Preferowane warunki środowiskowe będą się różnić w zależności od naturalnej ekologii gatunku wybranego do badania. Na przykład, D. melanogaster pochodzi z Afryki subsaharyjskiej27 i zazwyczaj utrzymuje się na poziomie 25 °C, cykl światła i ciemności 12:12 oraz wilgotność powietrza na poziomie około 60%16,18,19,20,21,22,23,24,25,28,29,30Z drugiej strony, *D. montana* zasięg obejmuje większość Kanady oraz środkową część USA, co stanowi znacznie chłodniejszy region; w związku z tym, *D. montana* zwykle utrzymuje się na poziomie 19–20 °C a niekiedy 24-godzinny reżim świetlny w celu symulacji warunków panujących w okresie godowym31. Bardziej szczegółowy opis zasięgów geograficznych poszczególnych gatunków Muszka owocówka, zobacz Muszka owocówka Strona internetowa Speciation Patterns32.
  2. Uzyskać preferowany Muszka owocówka gatunki i/lub linie inbredowe z centrum zasobów (patrz Tabela materiałów), z innego laboratorium badawczego na prośbę lub zebrane z terenu dzikie, zmienne genetycznie populacje.
    UWAGA: Poniższe kroki wyjaśniają metody pobierania dzikich, zmiennych genetycznie populacji Muszka owocowa do utrzymania w laboratorium badawczym. Metody te zostały zmodyfikowane na podstawie prac Markowa i O'Grady33 oraz Werner i Jaenike34 aby zebrać jednocześnie jak najszerszą różnorodność gatunków, zamiast kierować się ku konkretnym gatunkom za pomocą jednego źródła przynęty.
    1. Zamrozić sześć dojrzałych bananów w zamrażarce przez noc i rozmrozić przed ustawieniem pułapek z przynętą.
    2. Przygotuj kilka plastikowych butelek o pojemności 1–2 l, wycinając w przedniej części każdej z nich nacięcie w kształcie litery U, aby muchy mogły dostać się do butelki z przynętą i nie mogły z niej uciec. Zakręć butelki plastikowymi nakrętkami, aby zapobiec ucieczce much przez górną część.
    3. Dodaj rozmrożonego banana na dno butelek w taki sposób, aby na dnie każdej z nich znalazła się warstwa banana o grubości około jednej uncji. Włóż do butelki plaster dojrzałego pomidora. Dodaj zawiesinę drożdżową (pozostałość drożdży z procesu warzenia piwa) do banana na dnie butelki, tak aby banan był zanurzony w zawiesinie drożdżowej.
    4. Do butelki należy włożyć drewniane patyczki (w pozycji pionowej), aby muchy miały czyste podłoże do chodzenia, oddzielone od zawiesiny drożdżowej i banana.
      Rysunek 1 przedstawia produkt końcowy tych metod.
    5. Zawieś butelki z przynętą na drzewach na noc i sprawdzaj je co 24 godziny. Odessać muchy z butelek za pomocą aspiratora ustnego, a następnie umieścić pojedynczo samice w fiolkach z pożywką w celu stworzenia linii izofemale.
      UWAGA: Można tworzyć linie wielosamicowe, jednak tylko wtedy, gdy samice każdego gatunku można wyraźnie zidentyfikować. Ponadto muchy z rodzaju Muszka owocówka zajmują różne nisze ekologiczne i będą mieć różne wymagania pokarmowe w zależności od tych nisz (Werner i Jaenike34); patrz Werner i Jaenike34 do zaleceń dietetycznych i przepisów kulinarnych.
    6. Zbadaj dorosłą samicę1 potomstwo pod mikroskopem stereowym w celu zidentyfikowania gatunku zebranego Muszka owocówka (patrz Markow i O'Grady)33 oraz Werner i Jaenike34 w celu uzyskania pomocy w identyfikacji różnych gatunków).

Układ eksperymentu dotyczącego równowagi statycznej na gałęzi drzewa z wahadłem z plastikowej butelki, badanie środowiskowe.
Rycina 1: Przedstawienie graficzne pułapek i przynęty użytych do zbierania dzikich populacji Drosophila w terenie. (A) Pułapki na muchy rozmieszczone na lokalnym obszarze badań w Kolorado. (B) Zbliżenie na pułapki na muchy rozmieszczone na tym obszarze badań. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Utrzymuj linie izofemalne lub wielofemalne w inkubatorze lub pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach środowiskowych, ze stałą temperaturą, cyklem światło:ciemność i wilgotnością. W tym celu hoduj muchy w fiolkach lub butelkach z preferowanym podłożem, pozwalając zapłodnionym samicom składać jaja w podłożu. Monitoruj fiolki pod kątem obecności larw i pociorek.
    UWAGA: Muchy z rodzaju Drosophila zajmują różne nisze ekologiczne i będą miały różne wymagania dietetyczne oraz preferencje abiotyczne w zależności od tych nisz33,34. Preferencje środowiskowe i zalecenia dietetyczne (oraz dalsze instrukcje dotyczące hodowli much) można znaleźć u Elgin i Millera28, Shaffera et al.29, Stockera i Gallanta30, Markowa i O'Grady33 oraz Wernera i Jaenike34. W przypadku stosowania gatunków odłowionych z natury, w inkubatorach można symulować lokalne warunki środowiskowe do momentu zidentyfikowania gatunku.
  2. Często przenoś populacje na świeże podłoże, utylizując stare fiolki, aby utrzymać zdrowe linie i uniknąć infekcji roztoczami.
    UWAGA: Częstotliwość przenoszenia zależy od cyklu życiowego gatunku. Na przykład Drosophila melanogaster przenosi się na świeże podłoże co 2 tygodnie. W celu uzyskania dalszych informacji na temat utrzymywania linii w laboratorium patrz Rand et al.16, Elgin i Miller28, Shaffer et al.29, Stocker i Gallant30, Greenspan35 oraz Science Education Database36.

2. Hodowla Drosophila w zanieczyszczonym podłożu

UWAGA: Jeśli po raz pierwszy testujesz Drosophila w laboratorium lub używasz nowego zanieczyszczenia/zanieczyszczeń, najpierw określ dawkę letalną (metody opisano u Castaneda et al.37 oraz Massie et al.38) oraz LD50 (metody opisano u Castaneda et al.37 oraz Akins et al.39). Następnie wyznacz krzywą zależności dawka-odpowiedź, aby określić biologicznie istotne stężenia dla pożądanego efektu fenotypowego; metody opisano u Hirsch et al.19 oraz Zhou et al.40.

  1. Przygotować roztwory zapasowe zanieczyszczonego medium o pożądanych stężeniach, w zależności od charakterystyki chemicznej zanieczyszczenia.
    UWAGA: Na przykład, aby przygotować roztwory zapasowe PbAc: przygotować roztwory zapasowe octanu ołowiu (PbAc) poprzez dodanie zanieczyszczenia do wody destylowanej (dH2O)20) aż pożywka sporządzona z zanieczyszczonej wody osiągnie pożądane stężenie. Na przykład roztwór stokowy 1,000 µM PbAc można przygotować poprzez dodanie PbAc do dH2O20 aż do osiągnięcia 1,000 µM PbAc. Następnie rozcieńczyć roztwór zapasowy (np. the 1,000 µM roztwór PbAc) do pożądanego stężenia (takiego jak 500 µM PbAc) i przechowywać te roztwory również jako roztwory zapasowe.
  2. Przygotować pożywkę zgodnie z wytycznymi producenta, która będzie służyć jako pożywka kontrolna. Przygotować dodatkową pożywkę zgodnie z wytycznymi producenta, jednak uzupełnić ją przygotowanym roztworem zanieczyszczeń dla dH.20.
    UWAGA: Na przykład w przypadku zastosowania natychmiastowego Muszka owocówka pożywka, dodać około jednej łyżeczki pożywki liofilizowanej do plastikowej probówki. Dodać około 5–5,5 ml dH20 do medium. Posypać kilkoma ziarnami żywych drożdży piekarskich, aby przygotować medium kontrolne. W celu przygotowania medium eksperymentalnego, uzupełnić roztwór zapasowy (taki jak 500 µM PbAc) dla dH20.
  3. Przenieś do medium kontrolnego oraz eksperymentalnego dojrzałe, zdolne do reprodukcji osobniki męskie i żeńskie z populacji wyjściowych.
    UWAGA: Czas od momentu wyklucia do osiągnięcia dojrzałości rozrodczej jest różny pomiędzy Muszka owocówka gatunki41.
    1. Delikatnie opukaj fiolkę z populacją wyjściową much dominującą ręką. Upewnij się, że muchy przemieściły się na dno fiolki. Drugą ręką zdejmij korek z fiolki, jednocześnie ją opukując, a następnie nałóż na nią świeżą fiolkę z podłożem kontrolnym lub zanieczyszczonym. Trzymając obie fiolki razem, odwróć je i delikatnie opukuj, aby muchy automatycznie przeniosły się do świeżej fiolki z podłożem kontrolnym lub zanieczyszczonym. Zakręć fiolkę z muchami, wciąż ją opukując.
    2. Powtórz procedurę z większą liczbą probówek, dbając o ustandaryzowanie liczby much w każdej z nich.
      UWAGA: całkowita liczba przeniesionych osobników dorosłych poprzez Pojedynczy transfer lub znieczulenie będą zależeć od rozmiaru użytych fiolek, aby uniknąć zbyt dużego zagęszczenia.
    3. Inkubować osobniki dorosłe w standardowych warunkach środowiskowych (t.j. (inkubator) i pozostawić osobniki dorosłe w celu kopulacji i złożenia jaj w podłożu przez 24–96 h.
    4. Po 24–96 h osobniki dorosłe należy przenieść do pułapki (kolby wypełnionej olejem mineralnym i zamkniętej szczelnym lejkiem), pozostawiając zapłodnione jaja (które w późniejszym etapie będą stanowić grupę badawczą) do dojrzewania przed testami. Probówki należy umieścić w inkubatorze, aby umożliwić rozwój jaj.
    5. Monitoruj fiolki pod kątem obecności larw w stadium wędrownym, szukając osobników wynurzających się z podłoża.

3. Pobieranie obiektów doświadczalnych na różnych etapach rozwoju

UWAGA: Obiekty doświadczalne można pobierać na dowolnym etapie rozwoju, umieszczać w zakodowanych probówkach stożkowych o pojemności 15 mL i badać pod kątem akumulacji. Metody badania akumulacji zanieczyszczeń będą zależeć od badanego związku. Na przykład akumulację PbAc można badać przy użyciu spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-MS)42. Ponadto obiekty doświadczalne można pobierać na dowolnym etapie rozwoju, aby zbadać różnorodne efekty fenotypowe zanieczyszczeń. Rysunek 2 przedstawia cykl życiowy Drosophila43. Rysunek 3 przedstawia protokół doświadczalny ekspozycji oraz poszczególne etapy rozwoju przeznaczone do poboru próbek.

Schemat cyklu życiowego muszki owocówki; stadia: jajo, larwa, poczwarka, osobnik dorosły. Przedstawiono odstępy czasu pobierania próbek.
Rysunek 2: Koncepcyjny przegląd cyklu życiowego D. melanogaster (najczęściej stosowanego systemu modelowego Drosophila). Stadia cyklu życiowego Drosophila to: 1) jajo, 2) larwa pierwszego stadium, 3) larwa drugiego stadium, 4) larwa trzeciego stadium, 5) wędrująca larwa trzeciego stadium, 6) poczwarka z białymi oczami, 7) poczwarka z czerwonymi oczami, 8) nowo wykluty osobnik dorosły oraz 9) dojrzały osobnik dorosły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Schemat procesu reprodukcji i ekspozycji na toksynę; przepływ etapów cyklu życia eksperymentalnego.
Rysunek 3: Koncepcyjny przegląd metod doustnej ekspozycji Drosophila na zanieczyszczoną pożywkę w pokoleniu rodzicielskim (F0) oraz w kolejnych pokoleniach (F1 i następnych). (A) Metody ekspozycji doustnej podczas rozwoju w pokoleniu eksponowanym. (B) Metody badania przenoszenia zanieczyszczeń na potomstwo (od F1 do pożądanej generacji). Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Peterson et al.24 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Zbiór larw trzeciego stadium w fazie wędrówki
    1. Rozpocznij monitorowanie probówek w momencie zapalenia się świateł w inkubatorze, ponieważ larwy opuszczą pożywkę i zaczną przemieszczać się w górę ścianek probówki w ciągu godziny od włączenia światła. W ciągu tej godziny ostrożnie usuń larwy trzeciego stadium w fazie wędrówki ze ścianek probówki, używając drewnianego patyczka lub pęsety.
      UWAGA: Liczba larw dostępnych do zbioru zależy od liczby jaj złożonych w punkcie „2.3.4”).
    2. Aby usunąć nadmiar pożywki z larw, umieść je w małym zlewce z dH2O. Odlej dH2O ze zlewki i przenieś larwy na chłonny papier do precyzyjnych prac (delicate task wiper). Używając takiego papieru, delikatnie usuń nadmiar dH2O z larw.
    3. Utrzymuj populacje doświadczalne w inkubatorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi.
  2. Zbiór nowo wyklutych osobników dorosłych
    1. Monitoruj proces wykluwania w probówkach, obserwując barwę poczwarek znajdujących się przy ściankach probówek.
      UWAGA: Poczwarki ciemnieją w trakcie rozwoju. Czas rozwoju, szczególnie przed wykluciem, zależy od badanego gatunku.
    2. Gdy pierwsze osobniki dorosłe zaczną się wykluwać, usuń je i wyrzuć do pojemnika z olejem mineralnym.
    3. Następnego ranka, po zapaleniu świateł w inkubatorze, usuń i wyrzuć wszystkie osobniki dorosłe o nieznanym wieku (lub stanie dziewictwa), które mogły się wykluć w nocy lub rano przed włączeniem światła.
    4. Około 4 h później znieczul wszystkie osobniki, które wykluły się jako nowo wyklute, za pomocą pistoletu z CO2 bezpośrednio w probówkach. Umieść osobniki dorosłe na płytce z CO2 pod mikroskopem stereoskopowym. Określ płeć osobników, szukając grzebieni płciowych na przednich odnóżach samców oraz pokładaczy u samic.
      UWAGA: D. melanogaster muszą zostać zebrane w ciągu 6 h od wyklucia, aby uniknąć kopulacji, jednak inne gatunki mogą mieć dłuższy czas rozwoju (a zatem nie muszą być zbierane w tym przedziale czasowym).
    5. Rozdziel osobniki dorosłe na płytce z CO2 za pomocą drewnianego patyczka. Delikatnie przenieś osobniki w grupach podzielonych według płci, używając drewnianego patyczka, na pożywkę zgodną z wcześniejszą historią ekspozycji.
  3. Zbiór dojrzałych osobników dorosłych po wykluciu
    1. Pozostaw osobniki dorosłe na pożywce odpowiadającej ekspozycji przed wykluciem (od stadium jaja) do osiągnięcia pożąganego wieku po wykluciu w inkubatorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi.
    2. Przenieś pojedynczo osobniki dorosłe na pożywkę kontrolną na 24 h przed badaniem, aby umożliwić im oczyszczenie ciała z nadmiaru zanieczyszczonej pożywki.

4. Przebudowa grup badawczych w celu przetestowania efektów ekspozycji wielopokoleniowej lub transgeneracyjnej.

  1. Aby wyhodować pokolenie rodzicielskie (znane również jako pokolenia P0 lub F0 ), przenieś osobniki dorosłe z populacji wyjściowych do medium kontrolnego oraz eksperymentalnego, postępując zgodnie z krokami od „2.1” do „2.3” oraz od „3.1” do „3.3”.
  2. Gdy osobniki dorosłe osiągną dojrzałość rozrodczą (patrz Pitnick et al.41), przenieś pojedynczo (zgodnie z opisem w punkcie 2.3.1) jedną fiolkę samców do nowej fiolki z medium kontrolnym lub eksperymentalnym. Przenieś pojedynczo jedną fiolkę samic do nowej fiolki, w której znajdują się już samce. Pozostaw osobniki dorosłe w celu kopulacji i zniesienia jaj do medium na 24-96 h. Usuń osobniki dorosłe do naczynia z olejem mineralnym i ponownie inkubuj fiolki, aby umożliwić rozwój potomstwa.
  3. Powtarzaj kroki od 4.1 do 4.2 w zależności od pożądanej liczby pokoleń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poprzez doustną ekspozycję Drosophila na zanieczyszczenie(a) w trakcie rozwoju, można badać różne zagadnienia toksykologiczne, poddając Drosophila działaniu tych substancji na różnych poziomach organizacji biologicznej. W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu tego protokołu w wcześniej opublikowanych pracach23,24. W szczególności protokół ten był wcześniej stosowany do oceny akumula...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Drosophila melanogaster została uznana za potężny model dla szeregu procesów biologicznych ze względu na rozległą ochronę genów i szlaków między D. melanogaster a ludźmi13,14. Z tych samych powodów, dla których jest to potężny model dla nauk medycznych, Drosophila pojawiła się jako odpowiedni system modelowy do badania wpływu zanieczyszczeń antropogenicznych na szereg toksykologicznych punktów końcowych. Kilka laboratoriów z powodzeniem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta publikacja została wsparta grantem z Departamentu Edukacji (PR Award #P031C160025-17, tytuł projektu: 84.031C) dla społeczności Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) na rzecz budowania aktywnego zaangażowania STEM (C-BASE). Dziękujemy wydawnictwom Current Zoology i Elsevier za udostępnienie praw do wykorzystania reprezentatywnych wyników opublikowanych w poprzednich artykułach, a także redakcji JoVE za umożliwienie nam opublikowania tego protokołu. Chcielibyśmy również podziękować programowi C-BASE, dr Brianowi Vanden Heuvelowi (C-BASE i Wydział Biologii, CSU-Pueblo), wydziałowi biologii CSU-Pueblo, Thomasowi Graziano, dr Bernardowi Possidente (Wydział Biologii, Skidmore College) i dr Claire Varian Ramos (Wydział Biologii, Colorado State University-Pueblo) za ich wsparcie i pomoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24Fiolki Carolina Biological173204
Drosophila, wąskie (PS), polistyren, Superbulk, 1000 fiolek / jednostkęGenessee Scientific32-116SBSłuży do przechowywania much
Flugs Zamknięcia do fiolek i butelek, Wąskie plastikowe fiolkiGenessee Scientific49-102Służy do przechowywania much
Tacki tekturowe, tacki tylko, wąskiGenessee Scientific32-124Służy do organizowania populacji much
Tacki kartonowe, tylko przegrody, wąskieGenessee Scientific32-126Służy do organizowania populacji much
Thermo Scientific  Nalgene Kwadratowe butelki HDPE z szerokim otworem z zamknięciemFischer Scientific03-312DPrzydatne do przechowywania zanieczyszczeń
Thermo Scientific  Nalgene Oznaczone kolorami butelki do mycia LDPEFischer Scientific03-409-17CPrzydatne do przechowywania zanieczyszczeń
Eppendorf  Repeater M4 Ręczny ręczny dozownik do pipetFischer Scientific14-287-150Służy do przygotowania średnich
końcówek Combitips Zaawansowane końcówki do pipet - standardowe, Eppendorf Quality TipsFischer Scientific13-683-708Służy do przygotowania średniego
Flypad, standardowy rozmiar (8,1 x 11,6 cm)Genessee Scientific59-114Służy do znieczulania much
Zawór stopowy FlystuffGenessee Scientific59-121Służy do znieczulania much
Rurka, zielona (1 stopa warunkowa/jednostka)Genessee Scientific59-124GSłuży do znieczulania much
Olej mineralny, lekki, biały, o wysokiej czystości, 500 ml Butelka HDPEVWR97064-130Używany do produkcji kostnicy
Zestaw szklanych kolb Erlenmeyera - 3 rozmiary - 50, 150 i 250 ml, Karter Scientific 214U2WalmartNie dotyczyUżywany do budowy kostnicy
BGSET5 Szklana zlewka Zestaw 5 sztukWalmart
Linia wsobna lub dzika DrosophilaBloomington Drosophila Stock Center na Uniwersyteciehttps://bdsc.indiana.edu
Dzikie populacje DrosophilaUC San Diego Drosophila Stock Centerhttps://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php
Indiana

Bibliografia

  1. Postel, S. Defusing the Toxics Threat: Controlling Pesticides and Industrial Waste. , Worldwatch Institute. Washington, DC. (1987).
  2. Vitousek, P. M., Mooney, H. A., Lubchenco, J., Melillo, J. M. Human domination of earth's ecosystems. Science. 277, 494-499 (1997).
  3. United Nations Environment Program (UNEP). Saving Our Planet: Challenges and Hopes. , UNEP. Nairobi. (1992).
  4. Hansen, L. J., Johnson, M. L. Conservation and toxicology: Integrating the disciplines. Conservation Biology. 13, 1225-1227 (1999).
  5. Johnston, E. L., Mayer-Pinto, M., Crowe, T. P. REVIEW: Chemical contaminant effects on marine ecosystem functioning. Journal of Applied Ecology. 52, 140-149 (2015).
  6. Dell'Omo, G. Behavioral ecotoxicology. , John Wiley & Sons, LTD. West. Sussex, UK. (2002).
  7. Clotfelter, E. D., Bell, A. M., Levering, K. R. The role of animal behaviour in the study of endocrine-disrupting chemicals. Animal Behaviour. 68, 665-676 (2004).
  8. Peterson, E. K., Buchwalter, D. B., Kerby, J. L., LeFauve, M. K., Varian-Ramos, C. W., Swaddle, J. P. Integrative behavioral ecotoxicology: bringing together fields to establish new insight to behavioral ecology, toxicology, and conservation. Current Zoology. 63, 185-194 (2017).
  9. Scott, G. R., Sloman, K. A. The effects of environmental pollutants on complex fish behaviour: Integrating behavioural and physiological indicators of toxicity. Aquatic Toxicology. 68, 369-392 (2004).
  10. Zala, S. M., Penn, D. J. Abnormal behaviors induced by chemical pollution: A review of the evidence and new challenges. Animal Behaviour. 68, 649-664 (2004).
  11. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic & Applied Medicine. 1, 33-38 (2013).
  12. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology and medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  13. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacology Reviews. 63, 411-436 (2011).
  14. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287, 2204-2215 (2000).
  15. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32, 74(2010).
  16. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1.12.1-1.12.20 (2015).
  17. Burke, M. K., Rose, M. R. Experimental evolution with Drosophila. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 296, R1847-R1854 (2009).
  18. He, T., Hirsch, H. V. B., Ruden, D. M., Lnenicka, G. A. Chronic lead exposure alters presynaptic calcium regulation and synaptic facilitation in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 30, 777-784 (2009).
  19. Hirsch, H. V., et al. Behavioral effects of chronic exposure to low levels of lead in Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 24, 435-442 (2003).
  20. Hirsch, H. V. B., et al. Variations at a quantitative trait locus (QTL) affect development of behavior in lead-exposed Drosophila melanogaster. NeuroToxicology. 30, 305-311 (2009).
  21. Morley, E. J., Hirsch, H. V. B., Hollocher, K., Lnenicka, G. A. Effects of chronic lead exposure on the neuromuscular junction in Drosophila larvae. NeuroToxicology. 24, 35-41 (2003).
  22. Ruden, D. M., et al. Genetical toxicologenomics in Drosophila identifies master- modulatory loci that are regulated by developmental exposure to lead. NeuroToxicology. 30, 898-914 (2009).
  23. Peterson, E. K., et al. Accumulation, elimination, sequestration, and genetic variation of lead (Pb2+) loads within and between generations of Drosophila melanogaster. Chemosphere. 181, 368-375 (2017).
  24. Peterson, E. K., et al. Asymmetrical positive assortative mating induced by developmental lead (Pb2+) exposure in a model system, Drosophila melanogaster. Current Zoology. 63, 195-203 (2017).
  25. Peterson, E. K. Consequences of developmental lead (Pb2+) exposure on reproductive strategies in Drosophila. , University at Albany-State University of New York. Dissertation (2016).
  26. Chifiriuc, M. C., Ratiu, A. C., Popa, M., Ecovolu, A. A. Drosophotoxicology: An emerging research area for assessing nanoparticles interaction with living organisms. International Journal of Molecular Sciences. 17, 36(2016).
  27. Lachaise, D., Cariou, M. L., David, J. R., Lemeunier, F., Tsacas, L., Ashburner, M. Historical biogeography of the Drosophila melanogaster species subgroup. Evolutionary Biology. 22, 159-225 (1988).
  28. Elgin, C. R., Miller, D. W. Mass rearing of flies and mass production and harvesting of embryos. The Genetics and Biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, 112-121 (1978).
  29. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, C. R. Chapter 5: Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods in Cell Biology. 44, 99-108 (1994).
  30. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  31. Jennings, J. H., Etges, W. J., Schmitt, T., Hoikkala, A. Cuticular hydrocarbons of Drosophila montana: geographic variation, sexual dimorphism and potential roles as pheromones. Journal of Insect Physiology. 61, 16-24 (2014).
  32. Drosophila Speciation Patterns. , http://www.drosophila-speciation-patterns.com/rangemaps.html. (2018).
  33. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. London. (2005).
  34. Werner, T., Jaenike, J. Drosopholids of the midwest and northeast. , River Campus Libraries, University of Rochester. Rochester NY. (2017).
  35. Greenspan, R. J. The basics of doing a cross. Fly Pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 3-24 (1997).
  36. JoVE Science Education Database. . Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  37. Castañeda, P. L., Muñoz, G. L. E., Durán, D. A., Heres, P. M. E., Dueñas, G. I. E. LD50 in Drosophila melanogaster. fed on lead nitrate and lead acetate. Drosophila Information Service. 84, 44-48 (2001).
  38. Massie, H. R., Aiello, V. R., Whitney, S. J. P. Lead accumulation during aging of Drosophila and effect of dietary lead on life span. Age. 15, 47-49 (1992).
  39. Akins, J. M., Schroeder, J. A., Brower, D. L., Aposhian, H. V. Evaluation of Drosophila melanogaster as an alternative animal for studying the neurotoxicity of heavy metals. BioMetals. 5, 111-120 (1992).
  40. Zhou, S., et al. The genetic basis for variation in sensitivity to lead toxicity in Drosophila melanogaster. Environmental Health Perspectives. 124, 1062-1070 (2016).
  41. Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. Delayed male maturity is a cost of producing large sperm in Drosophila. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92, 10614-10618 (1995).
  42. Beauchemin, D. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82, 4786-4810 (2010).
  43. Tyler, M. S. Development of the fruit fly Drosophila melanogaster. Developmental Biology, a Guide for Experimental Study. Tyler, M. S. , 2nd, Sinauer Associates Inc. Sunderland, MA, USA. 8-27 (2000).
  44. Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107, 416-426 (2009).
  45. Bonilla, E., Contreras, R., Medina-Leendertz, S., Mora, M., Villalobos, V., Bravo, Y. Minocycline increases the life span and motor activity and decreases lipid peroxidation in manganese treated Drosophila melanogaster. Toxicology. 294, 50-53 (2012).
  46. Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 199-228 (2003).
  47. Posgai, R., Cipolla-McCulloch, C. B., Murphy, K. R., Hussain, S. M., Rowe, J. J., Nielsen, M. G. Differential toxicity of silver and titanium dioxide nanoparticles on Drosophila melanogaster development, reproductive effort, and viability: size, coatings and antioxidants matter. Chemosphere. 85, 34-42 (2011).
  48. Gupta, S. C., et al. Adverse effect of organophosphate compounds, dichlorvos and chlorpyrifos in the reproductive tissues of transgenic Drosophila melanogaster: 70kDa heat shock protein as a marker of cellular damage. Toxicology. 238, 1-14 (2007).
  49. Wasserkort, R., Koller, T. Screening toxic effects of volatile organic compounds using Drosophila melanogaster. Journal of Applied Toxicology. 17, 119-125 (1997).
  50. Markow, T. A., O'Grady, P. O. Reproductive ecology of Drosophila. Functional Ecology. 22, 747-759 (2008).
  51. Dev, K., Chahal, J., Parkash, R. Seasonal variations in the mating-related traits of Drosophila melanogaster. Journal of Ethology. 31, 165-174 (2013).
  52. Salminen, T. S., Vesala, L., Laiho, A., Merisalo, M., Hoikkala, A., Kankare, M. Seasonal gene expression kinetics between diapause phases in Drosophila virilus group species and overwintering differences between diapausing and non-diapausing females. Nature Scientific Reports. 5, 11197(2015).
  53. Miller, R. S., Thomas, J. L. The effects of larval crowding and body size on the longevity of adult Drosophila melanogaster. Ecology. 39, 118-125 (1958).
  54. Peterson, E. K., Ghiradella, H., Possidente, B., Hirsch, H. Transgenerational epigenetic effects of lead exposure on behavior in Drosophila melanogaster. Abstracts of the IBANGS Genes, Brain and Behavior Meeting, May 16-19, 2012, Boulder, CO, 11, Genes, Brain & Behavior 492-493 (2012).
  55. Soares, J. J., et al. Continuous liquid feeding: New method to study pesticides toxicity in Drosophila melanogaster. Analytical Biochemistry. 537, 60-62 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Badanie toksyczności u Drosophilaekspozycja na zanieczyszczenia środowiskowekrzywa zależności dawka-odpowiedźekspozycja na etapie rozwojuekspozycja wielopokoleniowatest behawioralnybadanie akumulacji ołowiuefekty transgeneracyjneocena kondycji organizmuprotokół bezpieczeństwa dotyczący zanieczyszczeń
Protokół doświadczalny wykorzystania Drosophila jako modelowego systemu bezkręgowców do badań toksyczności w laboratorium
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.