Artykuł metodologiczny

Oznaczanie swoistości proteazy w ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF: manipulowanie PH w celu wywołania zmian swoistości

DOI:

10.3791/57469

⸱

25 maja 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Cell Biology, Nihon Pharmaceutical University, 2Department of Clinical Pharmaceutics, Nihon Pharmaceutical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do określania specyficzności proteazy w surowych ekstraktach tkanek myszy za pomocą spektrometrii MALDI-TOF.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteazy mają kilka funkcji biologicznych, w tym aktywację/inaktywację białek i trawienie pokarmu. Identyfikacja specyficzności proteazy jest ważna dla ujawnienia funkcji proteazy. Metoda zaproponowana w tym badaniu określa specyficzność proteazy poprzez pomiar masy cząsteczkowej unikalnych substratów za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight). Substraty zawierają iminobiotynę, podczas gdy miejsce rozszczepienia składa się z aminokwasów, a przekładka składa się z glikolu polietylenowego. Rozszczepiony substrat wygeneruje unikalną masę cząsteczkową przy użyciu rozszczepionego aminokwasu. Jedną z zalet tej metody jest to, że można ją przeprowadzić w jednym doniczce przy użyciu próbek surowych, a także nadaje się do oceny wielu próbek. W tym artykule opisujemy prostą metodę eksperymentalną zoptymalizowaną z próbkami wyekstrahowanymi z tkanki płucnej myszy, w tym ekstrakcję tkanek, umieszczanie substratów trawiennych w próbkach, oczyszczanie substratów trawiennych w różnych warunkach pH oraz pomiar masy cząsteczkowej substratów za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Podsumowując, technika ta pozwala na identyfikację specyficzności proteazy w surowych próbkach pochodzących z ekstraktów tkankowych za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF, którą można łatwo zwiększyć do przetwarzania wielu próbek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteazy regulują procesy fizjologiczne poprzez rozszczepianie białek, a inicjacja aktywności proteazy w określonych momentach i miejscach jest regulowana1. Dlatego ważne jest, aby zidentyfikować ekspresję i aktywność tkanek, które są lokalnie regulowane, oraz opracować nową metodę wykrywania proteaz. Metoda zaproponowana w tym badaniu ma na celu identyfikację swoistości proteazy równolegle z wykrywaniem proteaz.

Istnieje kilka metod wykrywania specyficzności proteazy. Metoda azokazeiny jest dobrze znana ze swojego zastosowania w wykrywaniu proteaz2, ale jej zdolność do uzyskiwania dalszych informacji jest ograniczona. Zymografia to kolejna kompleksowa metoda wykrywania proteazy, która może być wykorzystana do określenia masy cząsteczkowej proteaz3, ale nie może być używana do badania specyficzności substratu. Specyficzność proteazy można określić za pomocą testów spektrometrycznych, przy użyciu substratów, takich jak p-nitroanilide4, oraz testów fluorometrycznych, przy użyciu substratów kumaryny5 lub testów rezonansu fluorescencji (FRET)6. Metody te umożliwiają wykrywanie jednorodności substratów zawartych w jednym dołku. W niniejszym badaniu specyficzność proteazy ekstraktów tkankowych jest badana w różnych warunkach, ponieważ ekstrakty te zawierają wiele proteaz. Aktywność proteazy jest regulowana przez kilka czynników, w tym pH, koenzymy, grupy protetyczne i siłę jonów. Ostatnio metody oparte na proteomice zostały wykorzystane do identyfikacji specyficzności proteazy; na przykład metoda opisana przez Biniossek i wsp. 7 wykorzystuje proteom do określenia specyficzności substratu nawet w surowych ekstraktach i pozwala na dokładne określenie aktywności rozszczepienia proteaz, które rozpoznają wiele sekwencji aminokwasów8. Metoda ta nie nadaje się jednak do analizy wielu próbek. Natomiast nasza metoda umożliwia jednoczesne przetwarzanie wielu próbek, a zastosowanie spektrometrii mas MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) do analizy próbek ułatwia szybkie i łatwe wykrywanie rozszczepionych substratów.

Ten artykuł przedstawia metodę oceny specyficzności proteazy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF do pomiaru masy cząsteczkowej unikalnych substratów. Formy molekularne rozszczepionych substratów, wraz z ich teoretycznymi masami cząsteczkowymi, są pokazane na Rysunek 1 i Tabela 1. W poprzednich badaniach wykorzystano podłoża zawierające przekładki poliglicynowe i biotynę9; Jednak te substraty są wadliwe, ponieważ sekwencja poliglicyny może zostać rozszczepiona przez enzymy, które rozpoznają sekwencję glicyny. Dodatkowo wysokie powinowactwo między awidyną a biotyną może prowadzić do niskiego wskaźnika regeneracji. Aby poprawić te wady, w tym badaniu zsyntetyzowaliśmy unikalny substrat, który składał się z glikolu polietylenowego (PEG), iminobityny i aminokwasu, który mógł zidentyfikować miejsce rozszczepienia (Rysunek 1). Aby odróżnić aminokwasy o podobnej masie cząsteczkowej, D-serynę dodano między przekładkę PEG a aminokwas w miejscu rozszczepienia.

N-koniec substratu został oznaczony iminobiotyną, co umożliwia oczyszczanie powinowactwa z surowych próbek. Stosowanie iminobiotyny zamiast biotyny ma kluczowe znaczenie; Biotyna ma silne powinowactwo do awidyny, co skutkuje niskimi wskaźnikami odzyskiwania substratów znakowanych biotyną z żywicy awidyny, podczas gdy powinowactwo iminobiotyny do awidyny może być zmienione przez pH. Substraty znakowane iminobiotyną wiążą się z awidyną w warunkach powyżej pH 9, podczas gdy awidyna uwalnia substraty znakowane iminobiotyną w warunkach poniżej pH 4. Dlatego iminobiotyna została użyta do oczyszczania powinowactwa10. Podsumowując, opisujemy szczegółowy protokół wykrywania specyficzności proteazy przy użyciu unikalnych substratów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki Uniwersytetu Farmaceutycznego Nihon i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Uniwersytetu Farmaceutycznego Nihon. Protokół został dostosowany do ekstraktów tkankowych pochodzących od myszy ICR. Myszy ICR zakupiono od Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japonia)

1. Przygotowanie substratu znakowanego iminobiotyną

Substrat przechodzi syntezę w fazie stałej przy użyciu aminokwasów chronionych grupą 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), jak opisano poniżej11. Skorzystaj z Tabeli 2, aby określić użyty związek Fmoc, w zależności od pożądanego aminokwasu i etapu syntezy.

  1. Pomyj 0,2 g żywicy Fmoc-NH-SAL z 10 ml N,N-dimetyloformamidu (DMF) w kolumnie syntezacyjnej.
  2. Dodaj 5 ml 30% piperydyny do DMF. Kołysz roztworem przez 10 minut, aby rozszczepić grupę Fmoc.
  3. Sprawdź rozszczepienie Fmoc za pomocą testu kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS)12: Dodaj 10 μl 1% TNBS w DMF i 10 μl diizopropyloetyloaminy (DIPEA) do szklanej probówki o wymiarach 10 x 75mm2, a następnie przenieś niewielką ilość żywicy do szklanej probówki. Żywica rozszczepiona Fmoc-cleaven powinna nabrać pomarańczowego koloru.
    1. Powtórz kroki 1.2-1.3, jeśli ten wynik jest negatywny.
  4. Umyj żywicę trzykrotnie 5 ml DMF.
  5. Dodać 5 ml DMF zawierającego 0,3 mmol związku Fmoc wymienionego w tabeli 2 (zaczynając od związku stosowanego w etapie 1), 0,3 mmol o-(6-chloro-1H-benzotriazol-1-ylo)-N,N,N',N'-tetrametylofluorofosforanu (HCTU), 0,3 mmol 1-hydroksy-1H-benzotriazolu, monohydratu (HOBt) i 0,6 mmol diizopropyloetyloaminy (DIPEA). Kołysz roztworem przez 30 minut, aby połączyć go z żywicą.
    1. Sprawdź ten krok za pomocą testu TNBS. Jeśli wynik jest pozytywny, oznacza to, że reakcja nie postępowała wystarczająco i ten krok należy powtórzyć.
  6. Umyj żywicę trzykrotnie 5 ml DMF.
  7. Powtórzyć reakcję wydłużenia, powtarzając kroki 1.2-1.6, zmieniając związek Fmoc użyty w kroku 1.5 zgodnie z tabelą 2.
  8. Dodaj 1 ml 2,5% wody, 1% triizopropylosilanu (TIS) i 2,5% etanedithiolu (EDT) w kwasie trifluorooctowym, aby rozszczepić peptydy z żywicy i grup ochronnych. Kołysz roztworem przez 60 minut.
  9. Przefiltrować i zebrać filtrat w probówce o pojemności 50 ml.
  10. Dodać 40 ml zimnego etanolu dietylowego i przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.
  11. Wirować 4 000 x g w temperaturze -20 °C przez 30 min. Zebrać osad.
  12. Używać eksykatora przez 3 godziny w celu usunięcia eteru dietylowego.
  13. Dodaj 1 ml 50% acetonitrylu do wody i rozpuść surowe peptydy. Liofilizuj roztwór w celu usunięcia kwasu trifluorooctowego. Powtórz ten krok kilka razy.
  14. Oczyść peptydy za pomocą kolumny z wkładem C18.
    1. Aktywuj żywicę w kolumnie wkładu C18 za pomocą 3 ml acetonitrylu (ACN).
    2. Zrównoważyć 5 ml 5% ACN, 0,1% TFA w H2O.
    3. Załaduj surowe syntetyczne peptydy do kolumny wkładu C18.
    4. Przemyć 10 ml 5% ACN, 0,1% TFA w H2O.
    5. Eluować próbki za pomocą 3 ml 60% ACN, 0,1% TFA w H2O.
  15. Sprawdź peptydy, mierząc ich masę cząsteczkową za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.
    1. Odmierzyć pipetą 1 μl eluentu na płytce tarczowej. Natychmiast dodać nasycony roztwór kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) w 50% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym
    2. Skrystalizować mieszaninę przez suszenie na powietrzu.
    3. Pobieraj widma masowe próbek zgodnie z protokołem producenta urządzenia.
      1. Ręcznie ustaw spektrometr masowy MALDI-TOF w tryb dodatniego odbicia.
      2. Skalibrować spektrometr masowy za pomocą CHCA, fragmentu bradykininy 1-7 (monoizotopowa masa cząsteczkowa = 756,3997 Da) i angiotensyny II (monoizotopowa masa cząsteczkowa = 1 045,5423 Da).
      3. Uzyskaj widma masowe syntetycznych peptydów, a następnie oceń, porównując je z teoretyczną masą cząsteczkową.

2. Przygotowanie ekstraktów tkankowych

  1. Znieczulić samce myszy ICR w komorze inhalacyjnej izofluranu i sprawdzić głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej przez skórę, sięgające aż do wyrostka mieczykowatego.
  3. Przeciąć przeponę i zebrać całą tkankę płucną. Pokrój tkankę na małe kawałki.
  4. Umyj chusteczkę trzykrotnie lodowatym roztworem soli fizjologicznej o pojemności 50 mM buforowanym trisem (pH 7,4).
  5. Zważyć tkanki i przenieść około 100 mg tkanek do szklanej probówki o wymiarach 12 x 75mm2.
  6. Dodać 0,3 ml buforu ekstrakcyjnego (50 mM buforu trisowego, pH 7,4, zawierającego 0,1% eteru poli(oksyetyleno)oktylofenylowego).
  7. Homogenizować próbki tkanki płucnej za pomocą homogenizatora mieszającego.
    1. Schłodzić próbki na lodzie.
    2. Homogenizuj próbki z prędkością 20 000 obr./min przez 30 s w blenderze. Powtarzaj ten krok, aż próbki będą całkowicie jednorodne.
      UWAGA: Nie homogenizować przez więcej niż 1 minutę w sposób ciągły, aby uniknąć wzrostu temperatury.
  8. Przenieść 1 000 μl homogenatu do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C.
  9. Przenieść 500 μl supernatantu do nowej probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml.
  10. Użyć 10 μl próbki do oznaczenia stężenia białka, stosując metody takie jak kwas bicynkowy (BCA) lub metoda Coomassie Brilliant Blue (CBB).
  11. Aby zapobiec zamarzaniu, dodaj 80% glicerolu do próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 50% glicerolu.
  12. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Trawienie substratów w modelowych proteazach i ekstraktach tkankowych

  1. Dodać 10 μl 0,1 μg/μL N-tozylo-L-fenyloalaniny chlorometylowego ketonu (TPCK)-trypsyny, 0,1 μg/μl proteazy Staphylococcus aureus V8 lub 10 μg/μl ekstraktów tkankowych do 890 μl buforu trawiennego.
    1. Aby wyjaśnić różnicę w swoistości proteazy w zależności od pH, należy użyć dostosowanych do pH 3, 5, 7 i 9. Skład buforu do wytrawiania przedstawiono w tabeli 3.
    2. Przeprowadzić kontrolę ujemną przy użyciu nieaktywnej proteazy w ekstraktach tkankowych, przygotowanych przez inkubację we wrzącej wodzie (lub ogrzewanie w temperaturze 100 °C) przez 10 minut.
  2. Dodać 10 μl substratów znakowanych iminobiotyną (rozpuszczonych w dimetylosulfotlenku (DMSO), stężenie końcowe = 100 pmol/10 μL).
  3. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w celu wytrawienia substratów znakowanych iminobiotyną.
  4. Po inkubacji przerwać trawienie substratów wrzącą wodą (lub przez ogrzewanie w temperaturze 100 °C) na 10 minut.
  5. Odwirować strawione substraty przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

4. Oczyszczanie substratu znakowanego iminobiotyną

  1. Dodać 50 μl 50% kulek sefarozy streptawidyny do 1 M buforu Tris (pH 9) zawierającego 0,1% eteru poli(oksyetyleno)oktylofenylowego.
    1. Użyj papieru do testowania pH, aby upewnić się, że roztwór ma pH około 9. Jeżeli pH roztworu jest niskie, należy je dostosować do około pH 9, dodając 1 M bufor trisowy (pH 9) zawierający 0,1% eteru poli(oksyetyleno)oktylofenylowego. Ten etap jest ważny, ponieważ wiąże się z wiązaniem substratu znakowanego iminobiotyną ze streptawidyną.
  2. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z ciągłym delikatnym mieszaniem na kole rotatora w celu związania substratów znakowanych iminobiotyną ze streptawidyną. Koraliki powinny pozostać zawieszone przez cały okres inkubacji.
  3. Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  4. Umyj koraliki pięć razy w następujący sposób:
    1. Dodać 1 000 μl buforu do przemywania (50 mM Tris-buffer, pH 9) do kulek.
    2. Prać przez 10 minut w temperaturze 4 °C z ciągłym delikatnym mieszaniem na kole rotatora. Koraliki powinny pozostać zawieszone przez cały okres inkubacji.
    3. Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  5. Dodaj 100 μl 0,2% kwasu trifluorooctowego do kulek.
    1. Użyj bibuły testowej pH, aby upewnić się, że roztwór ma pH poniżej 2. Jeśli pH roztworu jest wysokie, należy je dostosować poniżej 2, dodając 1% kwasu trifluorooctowego.
  6. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z ciągłym delikatnym mieszaniem na kole rotatora.
  7. Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

5. Przygotowanie próbki i spektrometria mas czasu przelotu wspomagana matrycą laserową (spektrometria mas MALDI-TOF)

UWAGA: Wszystkie roztwory w poniższych krokach powinny być przygotowane z wysokiej jakości wody do chromatografii cieczowej (HPLC) lub do sekwencjonowania aminokwasów.

  1. Odpipetować 500 μl acetonitrylu na żywicę C18, aby ją aktywować. Usuń zużyty acetonitryl. Powtórz ten krok trzy razy.
  2. Zrównoważyć żywicę C18 ze 100 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego. Usunąć eluent. Powtórz ten krok trzy razy.
  3. Aby załadować próbki, zwiąż je z żywicą za pomocą pipety.
  4. Umyj żywicę 20 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego. Powtórz ten krok pięć razy.
  5. Eluować próbki za pomocą 3 μl 60% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym. Odpipetować eluent na płytce docelowej do spektrometrii mas MALDI-TOF. Natychmiast dodać nasycony roztwór kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) w 50% acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym.
  6. Skrystalizować mieszaninę przez suszenie na powietrzu.
  7. Pobieranie widm masowych próbek zgodnie z protokołem producenta urządzenia.
    1. Ręcznie ustaw spektrometr masowy MALDI-TOF w tryb dodatniego odbicia.
    2. Skalibrować spektrometr masowy za pomocą CHCA, fragmentu bradykininy 1-7 (monoizotopowa masa cząsteczkowa = 756,3997 Da) i angiotensyny II (monoizotopowa masa cząsteczkowa = 1 045,5423 Da).
    3. Uzyskaj widma masowe próbek, zwracając szczególną uwagę na widma masowe od 700 do 900 Da dla rozszczepionej formy substratów znakowanych biotyną.
  8. Zidentyfikuj wykryte szczyty, korzystając z tabeli 1. Wykrycie odpowiedniej masy cząsteczkowej wskazuje na rozszczepienie na C-końcu odpowiedniego aminokwasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena metody identyfikacji specyficzności proteazy przez proteazę modelową

Skuteczność tego systemu została oceniona przy użyciu TPCK-trypsyny i proteazy V8, których specyficzność substratową uzyskano. Oszacowano, że trypsyna TPCK i proteaza V8 rozszczepiają sekwencję aminokwasów na C-końcu reszty lizyny i argininy oraz odpowiednio po stronie karboksylowej reszt kwasu asparaginowego i kwasu glutaminowego. Tabela 1 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykorzystuje spektrometrię mas MALDI-TOF do identyfikacji specyficzności proteazy w surowych próbkach pochodzących z ekstraktów tkankowych i może być łatwo skalowany do przetwarzania wielu próbek. W szczególności manipulowaliśmy pH, aby spowodować zmianę specyficzności substratu.

W naszym protokole wykorzystano metodę kompleksu awidyna-biotyna (ABC), która jest szeroko stosowana w biochemii ze względu na swoją specyficzność wiązania. Ze względu na silne powinowactwo ABC wiązanie a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Grant Badawczy Uniwersytetu Farmaceutycznego Nihon z Nihon Pharmaceutical University (2016) oraz Grant MEXT KAKENHI Numer JP17854179.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żywica Fmoc-NH-SAL (-[2,4-dimetoksyfenylo-N-(9-fluorenylometoksykarbonylo)
aminometylo]żywica fenoksy)		Watanabe Chemical Co., Ltd.A00102
N,N-dimetyloformamid (DMF)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00185
piperydynaWatanabe Chemical Co., Ltd.A00176
Kwas trinitrobenzenosulfonowy (TNBS)WAKO Chemical209-1483
O-(6-chloro-1H-benzotriazol-1-ylo)-N,N,N',N'-tetrametylofluorofosforan (HCTU)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00067
1-hydroksy-1H-benzotriazol, monohydrat (HOBt)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00014
diizopropyloetyloamina (DIPEA)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00030
triizopropylosilan (TIS)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00170
etanedithiol (EDT)Watanabe Chemical Co., Ltd.A00057
Kwas trifluorooctowy (TFA)MiliporS6612278 403
acetonitrylKokusan Chemical2153025
kolumna nabojowa C18WodyWAT051910
eter poli(oksyetyleno)oktylofenylowyWAKO Chemical168-11805mieszający Triton X-100
KinematicaPT3100homogenizator Polytron
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250Nakarai Chemical094-09
glicerolNakarai Chemical170-18
N-tosyl-L-fenyloalanina chlorometylowy keton (TPCK)-trypsynaSigma-AldrichT1426
dimetylosulfotlenek (DMSO)WAKO Chemical043-07216
sefaroza streptawidynyGE Healthcare17-511-01
ZipTipC18MilliporeZTC18S096
α-cyjano-4-hydroksycynamonowy kwas (CHCA)Sigma-AldrichC2020
Spektrometria mas MALDI-TOFBruker Daltonics, Niemcyautoflex
2-iminobiotynaSigma-AldrichI4632
Fmoc-aminokwasyWatanabe Chemical Co., Ltd.
Homogenizator

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
  2. Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
  3. Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
  4. Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
  5. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
  6. Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
  7. Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
  8. Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
  9. Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
  10. Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
  11. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  12. Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
  13. Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
  14. Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pH ManipulationTissue HomogenizationSubstrate PurificationStreptavidin Sepharose BeadsC18 ResinAmino Acid CleavageMolecular Weight Measurement

Powiązane artykuły