Artykuł metodologiczny

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

DOI:

10.3791/57471

⸱

5 maja 2018

 ,  ,  , 
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki zatopione w parafinie w formalinie stanowią cenne źródło molekularnych biomarkerów chorób ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy laboratoryjny protokół przygotowania biblioteki cDNA, początkowo zaprojektowany ze świeżo mrożonym RNA i zoptymalizowany do analizy zarchiwizowanych mikroRNA z tkanek przechowywanych do 35 lat.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

–Zarchiwizowane, klinicznie sklasyfikowane tkanki zatopione w parafinie (FFPE) mogą dostarczyć kwasów nukleinowych do retrospektywnych badań molekularnych rozwoju raka. Wykorzystując nieinwazyjne lub przednowotworowe zmiany u pacjentów, u których później rozwija się choroba inwazyjna, analizy ekspresji genów mogą pomóc w identyfikacji wczesnych zmian molekularnych, które predysponują do ryzyka zachorowania na raka. Zostało dobrze opisane, że kwasy nukleinowe odzyskane z tkanek FFPE uległy poważnym uszkodzeniom fizycznym i modyfikacjom chemicznym, co utrudnia ich analizę i generalnie wymaga dostosowanych testów. Jednak wykazano, że mikroRNA (miRNA), które reprezentują niewielką klasę cząsteczek RNA obejmujących tylko do ~18-24 nukleotydów, wytrzymują długotrwałe przechowywanie i zostały z powodzeniem przeanalizowane w próbkach FFPE. Poniżej przedstawiamy protokół przygotowania biblioteki 3' komplementarnego DNA z kodem kreskowym (cDNA) specjalnie zoptymalizowany do analizy małych RNA wyekstrahowanych z archiwalnych tkanek, który niedawno okazał się solidny i wysoce odtwarzalny przy użyciu zarchiwizowanych próbek klinicznych przechowywanych przez okres do 35 lat. To przygotowanie biblioteki jest dobrze przystosowane do analizy multipleksowej uszkodzonego/zdegradowanego materiału, w którym próbki RNA (do 18) są ligowane za pomocą pojedynczych adapterów z kodami kreskowymi 3', a następnie łączone razem w celu kolejnych preparatów enzymatycznych i biochemicznych przed analizą. Wszystkie oczyszczania są przeprowadzane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), która umożliwia selekcję i wzbogacanie małych gatunków RNA oznaczonych kodami kreskowymi w zależności od wielkości. Ten preparat biblioteki cDNA jest dobrze przystosowany do drobnych wejść RNA, ponieważ pilotażowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) umożliwia określenie określonego cyklu amplifikacji w celu wytworzenia optymalnych ilości materiału do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Podejście to zostało zoptymalizowane pod kątem wykorzystania zdegradowanego RNA FFPE z próbek archiwizowanych przez okres do 35 lat i zapewnia wysoce powtarzalne dane NGS.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA są wyjątkowo dobrze zachowane w próbkach z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie1,2,3. Wcześniejsze prace wykazały, że ekspresja tych krótkich, niekodujących jednoniciowych cząsteczek RNA może być z powodzeniem oceniona przy użyciu całkowitego RNA z próbek FFPE i dostarczyć odpowiednich danych dotyczących ekspresji genów w porównaniu z oryginalnymi świeżymi tkankami4,5,6,7,8. W porównaniu z dużymi rozmiarami informacyjnymi RNA, które, jak wykazano, są krytycznie dotknięte przetwarzaniem tkanek FFPE (formaldehyd, ciepło, wysuszenie itp.), endogennymi RNazami i wiekiem próbek, mały rozmiar miRNA (~18-24 nukleotydy) wydaje się czynić je odpornymi na degradację i odpornymi na długotrwałe przechowywanie, co wykazano również w badaniach ekspresji miRNA, które przewyższają wysokoprzepustowe badania mRNA w zarchiwizowanych próbkach9. Badania ekspresji miRNA z wykorzystaniem archiwalnych próbek klinicznych, które w większości zostały przeprowadzone w analizach na małą skalę, wykazały, że pojedyncze lub multipleksowane ilościowe testy PCR, różne rodzaje technologii mikromacierzy, a ostatnio NGS mogą być wykorzystywane do oceny ekspresji zachowanych miRNA po optymalizacji tych testów10,11,12,13,14.

Biorąc pod uwagę, że dysregulacja ekspresji miRNA jest związana z rozwojem różnych nowotworów złośliwych u ludzi i że istnieje potencjalnie ogromna ilość klinicznie opisanych próbek archiwizowanych, stało się oczywiste, że te małe cząsteczki RNA stanowią obiecujące źródło potencjalnych biomarkerów raka15,16,17,18. Zastosowanie wysokoprzepustowej technologii ekspresji genów, takiej jak NGS, ma tę zaletę, że zapewnia globalną ocenę wszystkich transkryptów miRNA w porównaniu z technologiami celowanymi, takimi jak PCR i/lub mikromacierze19. Z tego powodu zoptymalizowany, niedrogi i łatwy w zastosowaniu protokół przygotowania biblioteki cDNA małych RNA ze starszych zarchiwizowanych próbek dla NGS został zoptymalizowany, aby umożliwić zakrojone na szeroką skalę badania retrospektywne20.

Wcześniej ustaliliśmy protokół jednoczesnej ekstrakcji RNA/DNA do oddzielnego odzyskiwania RNA i DNA ze starszych zarchiwizowanych próbek, który okazał się lepszy od współczesnych komercyjnych zestawów21. Korzystając z tego protokołu ekstrakcji, w celu uzyskania całkowitego RNA z tkanek FFPE archiwizowanych przez dłuższy czas, zoptymalizowaliśmy przygotowanie bibliotek cDNA dla NGS miRNA zachowanych w próbkach klinicznych przez okres do 35 lat. Ponadto w niedawno opublikowanym badaniu, w którym przygotowaliśmy biblioteki cDNA z klinicznie sklasyfikowanych próbek raka przewodowego in situ (DCIS), zidentyfikowaliśmy miRNA o zróżnicowanej ekspresji, które zostały zwalidowane przez ilościowy PCR, co wskazało, że specyficzne zmiany ekspresji miRNA mogą być wykrywalne w zmianach DCIS u pacjentów, u których rozwija się rak piersi, w porównaniu ze zmianami DCIS u pacjentów, u których nie rozwija się rak piersi.

Biorąc pod uwagę koszt komercyjnych zestawów do przygotowania małych bibliotek cDNA RNA, możliwość ich wycofania, a także użycie odczynników chronionych prawem autorskim/patentowym, które nie mogą być zoptymalizowane, zdecydowaliśmy się dostosować wcześniej opublikowany laboratoryjny i wolny od zestawów protokół przygotowania biblioteki cDNA z kodami kreskowymi 3' dla NGS małych RNA zarchiwizowanych w próbkach FFPE, Umożliwia jednoczesną analizę 18 próbek22. Protokół ten zapewnia idealną i solidną procedurę krok po kroku z wizualnymi i technicznymi punktami kontrolnymi, które miały kluczowe znaczenie dla adaptacji do próbek RNA FFPE i mają duży potencjał do zastosowania w innych źródłach uszkodzonego lub trudnego do użycia materiału RNA. Możliwość zastosowania pierwotnego protokołu została poprawiona poprzez zastąpienie znakowanych radioaktywnie markerów wielkości fluorescencyjnymi (np. SYBR Gold) wykrywalnymi markerami wielkości RNA, stosowanymi podczas selekcji ligowanych bibliotek na dużych żelach poliakrylamidowych. Ten zoptymalizowany protokół opiera się na ligacji adapterów z kodem kreskowym 3' do 18 pojedynczych próbek RNA FFPE, które są następnie łączone w celu poddania się ligacji adaptera 5', odwrotnej transkrypcji i pilotażowej analizie PCR w celu dostosowanej amplifikacji końcowej biblioteki cDNA przed amplifikacją PCR na dużą skalę, oczyszczaniem i NGS na sekwenatorze o wysokiej przepustowości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie wszystkich odczynników i starterów

  1. Zamów wszystkie podkłady i adaptery zgodnie z opisem w Rysunek 1.
  2. Przygotuj bulion koktajlowy kalibratora, który będzie wzbogacany w każdym pojedynczym podwiązaniu.
    1. Zawiesić oligonukleotyd nośnikowy (Rysunek 1) do 0,5 μM wodą wolną od RNaz. Zawiesić ponownie 10 oligonukleotydów kalibracyjnych (Rysunek 1) do 100 μM za pomocą roztworu oligonukleotydów nośnikowych 0,5 μM.
    2. Połączyć 10 μl każdego z 10 kalibratorów w silikonowanej mikrowirówce, aby uzyskać 100 μM kalibratora koktajli i przygotować roztwór 0,026 nM do przechowywania w temperaturze -20 °C.
  3. Rozcieńczyć 20 unikalnych, liofilizowanych, adenylowanych adapterów 3' wodą wolną od RNaz do końcowego stężenia 50 μM (Rysunek 1).
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie 2,5 μl porcji z każdego adaptera w osobnych silikonowanych probówkach i przechowywanie ich w temperaturze -80 °C przez okres do 2 lat.
  4. Ponownie zawiesić odsolone oligonukleotydy znacznika wielkości adaptera 19 nt-3' i łącznika 24 nt-3' do 250 ng / ml (Rysunek 1).
  5. Ponownie zawiesić oczyszczony adapter 5' HPLC na 100 μM wodą wolną od RNAzy. Ponownie zawiesić startery 5' i 3' PCR do 100 μM przy użyciu wody wolnej od RNaz (Rysunek 1).
    UWAGA: Podwielokrotnić wszystkie oligonukleotydy w ilościach niezbędnych do 1–2 eksperymentów i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Przygotować barwnik w żelu denaturującym poliakryloamid (PAA), łącząc 98,8% formamidu, 1% (v/v) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 i 0,2% błękitu bromofenolowego, a następnie ustawić 1 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
    1. Przygotować roztwór 0,5 M Na2H2 EDTA, dodając 18,6 g proszku Na2H2 EDTA do 50 ml wody wolnej od nukleaz. Dodaj granulki NaOH, aby osiągnąć pH 8,0. Dostosować objętość do 100 ml, aby uzyskać roztwór podstawowy o pH 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0.
    2. Odważyć 15 mg błękitu bromofenolowego w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 600 μl wody wolnej od nukleaz. Dodać 14,25 ml zdejonizowanego formamidu. Dodać 150 μl roztworu 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0.
    3. Podwielokrotność końcowego roztworu PAA o stężeniu 15 ml w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
  7. Przygotuj 5x barwnik ładujący żel agarozowy, łącząc 0,2% błękitu bromofenolowego, 0,2% cyjanolu ksylenu FF, 50 mM Na2H2 EDTA, pH 8,0 i 20% Ficoll Type-400.
    1. Zawiesić 1,86 g Na2H2-EDTA w 50 ml wody wolnej od nukleaz w zlewce o pojemności 400 ml na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej (RT). Dodaj granulki NaOH, aby osiągnąć pH 8,0. Dodaj wodę wolną od nukleaz, aby osiągnąć 100 ml, aby uzyskać 50 mM Na2H2 EDTA.
    2. Odważyć 20 mg proszku błękitu bromofenolowego, 20 mg proszku ksylocyjanolu FF i 2 g proszku Ficoll Type-400 i ponownie zawiesić w 5 ml 50 mM Na2H2 EDTA.
    3. Zmieszać probówkę zawierającą trzy barwniki i dodać 5 ml 50 mM Na2H2 EDTA. Wymieszaj 5x barwnik w żelu agarozowym, przygotuj 1 ml porcji i przechowuj w temperaturze -80 °C.

2. Ustaw 3' ligacje adaptera z kodami kreskowymi z 18 pojedynczymi próbkami RNA

  1. Zidentyfikuj 18 pojedynczych próbek RNA (wstępnie zaalitowanych przy 100 ng w 9,5 μl wody wolnej od nukleaz w 1,5 ml silikonowanych probówek wirówek) i umieść probówki na lodzie do rozmrażania na 10 minut.
  2. Przygotuj 10x bufor ligazy RNA (bez ATP) na świeżo.
    1. W silikonowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wymieszaj 343 μl wody wolnej od RNaz, 500 μl Tris 1 M pH 7,5, 100 μl 1 M MgCl2, 50 μl 20 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej i 7 μl 14 M 2-merkaptoetanolu. Wymieszać przesuwając probówkę, odwirować przez 2 s przy 2 000 x g i RT, a następnie umieścić na lodzie.
      UWAGA: Wszystkie kroki w tym protokole, które wskazują "wirowanie przez 2 s", są wykonywane w mikrowirówce stołowej przy RT i maksymalnej prędkości 2,000 x g w celu zebrania roztworów na dno probówek.
  3. Przygotuj 50% wodnego bulionu DMSO, dodając 1 ml wody wolnej od RNaz do 1 ml DMSO w 2 ml silikonowanej probówce mikrowirówkowej, zawiń probówkę w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  4. Rozmrażaj koktajl kalibratora 0,026 nM na lodzie przez 10 minut. Przygotuj Ligation Master Mix, łącząc w następującej kolejności w 1,5 ml silikonowanej probówce mikrowirówkowej: 40 μl 10x buforu ligazy RNA i 120 μl 50% wodnego DMSO za pomocą pipety 200 ml i dodaj 10 μl koktajlu kalibratora 0,026 nM za pomocą pipety 10 μL. Przesuń probówkę o pojemności 1,5 ml do wymieszania, odwiruj przez 2 sekundy i umieść na lodzie.
  5. Dodać 8,5 μl Ligation Master Mix do każdej z 18 indywidualnie porcjowanych próbek RNA FFPE, delikatnie przesunąć probówki, odwirować przez 2 sekundy i przechowywać na lodzie.
  6. Rozmrozić 2,5 μl porcji z każdego z 18, 3-calowych adapterów z kodami kreskowymi i umieścić je na lodzie do rozmrażania przez 20 minut.
    1. Za pomocą pipety o pojemności 3 μl przenieś 1 μl każdego adaptera do odpowiednich próbek RNA FFPE zawierających RNA i Ligation Master Mix (tj. 9,5 μl + 8,5 μl).
    2. Nie pipetuj w górę i w dół, po prostu wlej do płynu i wyciągnij końcówkę. Pamiętaj, aby wymieniać końcówki między próbkami RNA FFPE. Zamknij każdą probówkę, przesuń do wymieszania, odwiruj przez 2 sekundy i umieść na lodzie.
  7. Denaturację reakcji należy poddać umieszczeniu 18 probówek na bloku grzewczym o temperaturze 90 °C na 1 minutę, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
  8. Przygotować roztwór enzymu ligacji, rozcieńczając 10 μl skróconej ligazy RNA K227Q T4 2 z 10 μl wody wolnej od RNaz w świeżej 1,5 ml silikonowanej probówki do mikrowirówki.
  9. Za pomocą pipety o pojemności 3 μl przenieś 1 μl rozcieńczonego enzymu ligacyjnego do każdej z 18 próbek RNA (nie pipetuj w górę i w dół, a końcówki zmieniaj między każdą probówką). Umieścić 18 ligacji na lodzie i umieścić w chłodni o temperaturze 4 °C na 18 godzin inkubacji przez noc.

3. Oczyszczanie ligowanych małych RNA

  1. Dezaktywować reakcje ligacji, umieszczając 18 probówek na 1 minutę na bloku grzewczym o temperaturze 90 °C, a następnie powrócić do lodu na co najmniej 2 minuty w celu ostygnięcia.
  2. Przygotować główną mieszankę strącania, dodając 1 μl niebieskiego barwnika kowalencyjnie połączonego z glikogenem do 26 μl 5 M NaCl wolnego od RNaz do świeżej silikonowanej probówki do mikrowirówki.
    1. Przenieść 1,2 μl Precipitation Master Mix do każdej z 18 probówek. Dodaj 63 μl 100% etanolu do każdej z 18 probówek. Zamknij każdą probówkę, przesuń, aby wymieszać, odwiruj przez 2 sekundy i umieść probówki na lodzie. Połącz zawartość wszystkich 18 probówek w jedną silikonowaną probówkę o pojemności 1,5 ml.
    2. Zamknij probówkę, odwróć trzy razy, aby wymieszać, odwiruj przez 2 s i umieść na lodzie na 60 minut, aby się wytrącić.
  3. Przygotuj duży (16 x 20 cm2) żel 15% poliakryloamidowy dla PAGE.
    1. Odlew dwie silikonowane płyty szklane (zabezpieczone bezpieczną alternatywą dla powłok silikonowych) z przekładkami o grubości 0,1 cm.
    2. Połączyć 9 ml rozcieńczalnika systemowego, 18 ml koncentratu systemowego, 3 ml buforu systemowego, 240 μl APS (9%) i 12 μl TEMED w probówce o pojemności 50 ml.
    3. Przenieś roztwór żelu PAGE między szklane płytki za pomocą pipety o pojemności 30 ml, włóż 14-dołkowy grzebień (o grubości 0,1 cm) i pozwól żelowi zestalić się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  4. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml z pulą ligacji w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 60 minut.
  5. Wyjmij grzebień. Oczyść studnie obficie wodą wolną od RNaz za pomocą butelki ze spryskiwaczem z końcówką o pojemności 200 μl na końcu, aby dotrzeć do wnętrza studzienek i wypchnąć niespolimeryzowany akrylamid (jedna studzienka na raz) nad zlew. Ustaw 15% PAGE na aparacie żelowym, napełnij zbiorniki 0,5x roztworem Tris-Borate EDTA (TBE) i uruchom żel przez 30 minut przy napięciu 450 V.
  6. Odzyskać probówkę z pulami ligacji z wirówki i ostrożnie wysuszyć osad RNA.
    1. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, ale pozostawić trochę płynu na dnie. Przechylić probówkę i za pomocą pipety o pojemności 20 ml usunąć pozostały supernatant bez dotykania osadu. Odsysać próżniowo probówkę za pomocą pipety Pasteura z końcówką o pojemności 10 μl na końcu, nie dotykając granulki.
    2. Ponownie zawiesić osad RNA w 20 μl wody wolnej od RNaz, przesuwając probówkę. Dodać 20 μl roztworu ładującego żel PAA w celu ponownego zawieszenia RNA, przetrzepać do wymieszania, odwirować przez 2 sat RT i ustawić probówkę na 90 ºC na 1 minutę, a następnie natychmiast umieścić na lodzie.
  7. Zastąp 0,5 x TBE aparatu żelowego świeżym 0,5 x TBE i załaduj drabinkę, znaczniki wielkości i ligowane miRNA w środku żelu, pozostawiając 2 puste dołki po obu stronach (Rysunek 2).
  8. Uruchom żel przy napięciu 450 V (35 mA) przez 60 minut, zatrzymaj pracę na 10 minut, aby ostygł, i uruchom ponownie przy napięciu 520 V (25 mA) przez kolejne 60 minut. Odrzuć 15% PAGE, usuwając jedną ze szklanych płytek.
  9. Lekko spryskaj żel znajdujący się na szklanej płytce roztworem barwnika fluorescencyjnego (10 μl) w 25 ml 0,5 x TBE i pozostaw płasko na 5 minut w ciemności.
  10. Połóż szklankę z żelem na transiluminatorze światła niebieskiego i wyrównaj znaczniki o rozmiarach 19 nt i 24 nt za pomocą linijki, aby skierować wycięcie ligowanych małych RNA (Rysunek 2). Wyciąć żel.
  11. Umieść wycięty żel w probówce o pojemności 0,5 ml, przeznaczonej do fragmentacji plastrów żelu, bezpiecznie umieszczonej w silikonowanej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 16 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić rozdrobniony żel w 300 μl 400 mM roztworu NaCl, zamknąć probówkę i uszczelnić ją folią parafinową.
  12. Ustawić probówkę na mieszanie na termomikserze na 1 100 obr./min w chłodni o temperaturze 4 °C na nocną inkubację (16-17 godzin).

4. Podwiązanie adaptera 5'

  1. Przenieść roztwór i rozdrobniony żel do probówki filtracyjnej o pojemności 5 μm umieszczonej w silikonowanej probówce o pojemności 1,5 ml, zamknąć folią parafinową i odwirować przez 5 minut przy 2,300 x g i RT.
  2. Do przefiltrowanego roztworu dodać 950 μl 100% etanolu, zamknąć probówkę, odwrócić do mieszania, odwirować przez 2 s, uszczelnić probówkę folią parafinową i ustawić na lodzie na 1 godzinę.
  3. Przygotuj 12% żel PAGE zgodnie z opisem w kroku 3.3, ale połącz 12,6 ml rozcieńczalnika, 14,4 ml koncentratu, 3 ml buforu, 240 μl APS i 12 μl TEMED w probówce o pojemności 50 ml. Uruchom żel 12% PAGE przez 30 minut przy napięciu 450 V (~ 35 mA) przy 0,5x TBE.
  4. Odwirować oczyszczony roztwór małego RNA o sile 16 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie odpipetować supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu usunięcia większości roztworu i użyć pipety o pojemności 200 ml w celu usunięcia pozostałego roztworu, nie dotykając osadu.
  6. Używając pipety Pasteura z końcówką o pojemności 10 ml na końcu, podłączonej do kolby próżniowej, ostrożnie wysuszyć granulkę, nie dotykając jej.
  7. Zawiesić osad w 9 μl wody wolnej od RNaz bez pipetowania w górę iw dół, ale lekko przesuwając probówkę, odwirować przez 2 sekundy i umieścić probówkę na lodzie.
  8. Przygotuj 10x bufor ligazy RNA (z ATP) na świeżo, łącząc 500 μl 1 M Tris pH 7,5, 100 μL 1 M MgCl2, 50 μL 20 mg / ml acetylowanego BSA, 200 μL 10 mM ATP, 7 μL 2-merkaptoenolu 14 M i 143 μl wody wolnej od RNaz.
  9. Wymieszaj 10x bufor ligazy RNA (z ATP), przesuwając probówkę i wiruj przez 2 sekundy, aby zebrać roztwór na dnie probówki.
  10. Ustaw ligację adaptera 5', dodając 2 μl 10x bufora ligazy RNA (z ATP), 1 μl adaptera 100 μM 5' i 6 μl 50% wodnego DMSO do 9 μl, 3' zakodowanego kreskowo roztworu małego RNA.
  11. Lekko przesuń probówkę, aby wymieszać, odwiruj przez 2 sekundy, aby zebrać roztwór, umieść probówkę na bloku grzewczym w temperaturze 90 °C na 1 minutę i z powrotem na lodzie na co najmniej 2 minuty.
  12. Dodać 2 μl ligazy T4 RNA Ligazy 1 do roztworu (nie pipetować w górę i w dół), przesunąć probówkę, odwirować przez 2 sekundy i umieścić probówkę w pływającym stojaku w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 60 minut.
  13. Jednocześnie ustaw dwie ligacje między adapterem 19 nt-3' a adapterem 5' oraz dwa podwiązania między adapterem 24 nt-3' a adapterem 5'.
    1. Połącz 2 μL adaptera 19nt-3' (250 ng/μL) lub adaptera 24 nt-3' (250 ng/μL) z: 2 μL adaptera 5' (100 μM), 2 μL buforu ligazy 10x RNA (z ATP), 6 μL 50% wodnego DMSO, 6 μL wody wolnej od RNaz, i 2 μl ligazy T4 RNA 1 w 1,5 ml silikonowanej probówce mikrowirówkowej.
    2. Przesuń probówki, aby wymieszać, odwirować przez 2 sekundy i ustawić probówki w temperaturze 37 °C na 60 minut.
  14. Dodaj 20 μl buforu denaturującego PAA do wszystkich ligacji (oczyszczone małe RNA, 2 ligacje z adapterem 19nt-3' i 2 ligacje z adapterem 24nt-3').
    1. Wymieszać przez trzepocznięcie probówek, odwirować przez 2 sekundy i inkubować probówki na bloku grzewczym w temperaturze 90 °C przez 1 minutę. Przenieść wszystkie probówki do lodu i przygotować drabinkę (3 ml drabinki z 20 μl PAA).
  15. Opróżnij górny zbiornik aparatu żelowego za pomocą wstępnie uruchomionego żelu 12% PAGE i dodaj świeży 0,5 x roztwór TBE poniżej poziomu studzienek (studzienki są opróżniane długą pipetą z cienką końcówką).
    1. Załaduj próbki cienką końcówką pipety, zgodnie z opisem w Rysunek 3.
    2. Użyj świeżego 0,5x TBE, aby napełnić poszczególne dołki do górnej części żelu.
    3. Dodaj świeże 0,5x TBE do zbiornika nad studzienkami i rozpocznij elektroforezę 12% PAGE przez 60 min przy 450 V (~35 mA).
    4. Przerwij bieg, wyłączając generator na 10 minut, aby schłodzić żel. Uruchom ponownie generator i uruchom żel na 60 minut przy napięciu 520 V (~25 mA).
  16. Zatrzymaj generator, opróżnij zbiorniki, odwracając aparat nad zlewem, i odrzuć 12% PAGE, wyjmując jedną ze szklanych płyt.
  17. Ułóż szklankę z żelem płasko, spryskaj żel 10 μl barwnika fluorescencyjnego w 25 ml 0,5 TBE i inkubuj w ciemności przez 5 minut. Połóż szklankę z żelem na transiluminatorze światła niebieskiego i wyrównaj zarówno znaczniki o rozmiarze 19 nt, jak i 24 nt za pomocą linijki, aby skierować wycięcie ligowanych małych RNA (Rycina 3).
    1. Wyciąć żel i przenieść wycięty kawałek żelu do probówki z łamaczem żelu o pojemności 0,5 ml. Zamknij nakrętkę probówki z wyłącznikiem żelowym, umieść w silikonowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zabezpiecz folią parafinową. Wyjmij probówkę z łamaczem żelu, dodaj 300 μl 300 mM NaCl i 1 μl 100 μM 3' startera PCR do pokruszonych kawałków żelu w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Uszczelnić rurkę folią parafinową po zmieszaniu na termomikserze przy 1 100 obr./min w temperaturze 4 °C, przez noc (17–18 godzin) w chłodni
      3. .

5. Odwrotna transkrypcja 5' ligowanych i 3' oczyszczonych małych RNA z kodami kreskowymi

  1. Wyjmij probówkę z termomiksera i przefiltruj, oczyść roztwór za pomocą rurki filtracyjnej 5 μM.
    1. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś roztwór na probówkę filtracyjną o pojemności 5 μM włożoną do 1,5 ml probówki zbiorczej wolnej od silikonów RNaz. Wirować probówkę przez 3 minuty przy 2 300 x g i RT.
    2. Wyrzucić rurkę filtracyjną i dodać 950 μl 100% etanolu do 1,5 ml probówki zbiorczej mikrowirówki zawierającej przefiltrowany roztwór. Odwróć probówkę do wymieszania, odwiruj przez 2 s i umieść na lodzie na 60 minut. Wytrącić osad RNA, odwirowując probówkę w temperaturze 16 000 x g i 4 °C przez 1 godzinę.
  2. Wysuszyć osad RNA.
    1. Otwórz nakrętkę i ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml, pozostawiając trochę płynu na dnie.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 20 μl usunąć cały pozostały supernatant bez dotykania osadu. Przechyl rurkę, aby dowolny roztwór znalazł się po przeciwnej stronie granulki.
    3. Użyj pipety Pasteura z niefiltrowaną końcówką pipety o pojemności 10 ml, aby zassać supernatant i wysuszyć osad za pomocą próżni
      4. .
  3. Zawiesić osad RNA w 5,6 μl wody wolnej od RNaz.
    1. Rozmrażaj odczynniki do odwrotnej transkrypcji na lodzie przez 15 minut. Przygotuj reakcję odwrotnej transkrypcji, dodając 3 μl 5x buforu, 4,2 μl 10x trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP) (każdy 2 mM) i 1,5 μl ditiotreitolu (DTT) do 5,6 μl zawieszonego osadu bez RNazy.
    2. Delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać reakcję i odwiruj przez 2 sekundy, aby zebrać roztwór. Ustawić reakcję na bloku grzewczym w temperaturze 90 °C dokładnie na 30 sekund, a następnie przenieść bezpośrednio do termomiksera w temperaturze 50 °C.
    3. Pozostaw rurkę na termomikserze na 2 minuty, aby temperatura się wyrównała. Dodać 0,75 μl enzymu odwrotnej transkrypcji bezpośrednio do roztworu, delikatnie strzepnąć do wymieszania i natychmiast umieścić probówkę z powrotem na termomikserze w temperaturze 50 °C na 30 minut.
  4. Po 30 minutach przenieść probówkę do bloku grzewczego o temperaturze 95 °C na 1 minutę, aby zatrzymać odwrotną transkrypcję. Dodaj 95 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do odwrotnej transkrypcji, przesuń probówkę do wymieszania i umieść ją bezpośrednio na lodzie na 2 minuty.
  5. Oznacz probówkę biblioteką cDNA i identyfikatorem biblioteki.

6. Pilotażowy PCR i amplifikacja PCR na dużą skalę

  1. Przygotować świeży 10x bufor PCR, dodając 304 μL wody wolnej od RNaz, 125 μL 2 M KCl, 50 μL 1 M Tris pH 8,0, 10 μL 1 M MgCl2, 5 μL 1% Triton X-100 i 6 μL 1 M 2-merkaptoetanolu w silikonowanej probówce mikrowirówkowej, i trzymaj się RT.
  2. Złóż reakcję Pilot PCR, łącząc 67 μl wody wolnej od RNaz, 10 μl 10x buforu PCR, 10 μl 10x dNTP, 0,5 μl 100 μM 5' startera PCR, 0,5 μl 100 μM 3' startera PCR, 10 μL biblioteki cDNA i 2 μl 50x polimerazy Taq.
    1. Ustaw dwa cykle PCR na termocyklerze w następujący sposób: Plik 1: 94 °C przez 45 s, 50 °C przez 85 s i 72 °C przez 60 s przez 10 cykli, trzymaj w temperaturze 4 °C; Plik 2: 94 °C przez 45 s, 50 °C przez 85 s i 72 °C przez 60 s przez 2 cykle, trzymaj w temperaturze 4 °C. Ustaw reakcję Pilot PCR w termocyklerze i uruchom File 1.
    2. Na końcu pliku 1 otwórz probówkę do PCR i za pomocą pipety o pojemności 20 μl przenieś 12 μl z reakcji Pilot PCR do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 3 μl barwnika ładującego żel 5x, wymieszaj pipetując w górę iw dół, zamknij probówkę i oznacz ją jako "10 cykli".
    3. Zamknij probówkę Pilot PCR i uruchom file 2 na termocyklerze. Na końcu pliku 2 otwórz probówkę PCR i za pomocą pipety o pojemności 20 ml przenieś 12 μl roztworu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 3 μl barwnika 5x w żelu i oznacz to jako "12 cykli".
    4. Powtórz kroki opisane w krokach 6.2.2 i 6.2.3, aby zebrać 12 μl produktów PCR z reakcji Pilot PCR w cyklach PCR 14, 16, 18 i 20. Dodać 3 μl 5x barwnika ładującego żel do każdej z 12 μl podwielokrotności PCR oraz do 20 nt drabinki zawierającej 3 μl drabinki i 9 μl wody wolnej od RNaz.
  3. Przygotuj żel agarozowy 2,5% z 0,5x TBE.
    1. Odważyć 2,5 g agarozy w czystej zlewce i dodać 100 ml 0,5 TBE. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje. Wyjmij roztwór z kuchenki mikrofalowej, zakręć butelką, aby wymieszać agarozę, dodaj 4 μl bromku etydyny (10 mg/ml) i przenieś roztwór na tacę do elektroforezy o wymiarach 7 x 10cm2, zamkniętą z obu stron taśmą.
    2. Ustaw grzebień z 8 dołkami i pozwól żelowi agarozowemu zastygnąć w temperaturze pokojowej. Przenieś zestalony żel agarozowy do aparatu do elektroforezy wypełnionego 0,5x TBE.
  4. Załaduj drabinkę i próbki PCR na żel agarozowy i uruchom go na 30 minut przy napięciu 120 V.
  5. Oceń żel na pudełku UV, aby określić optymalny cykl PCR (Rysunek 4A).
    UWAGA: Rozmiar przewidywanych prążków PCR jest pokazany w Rysunek 4B.
    1. Obserwuj dwa prążki PCR w każdym z różnych dołków (górne pasmo: biblioteka DNA, dolne pasmo: dimery starterów).
    2. Zidentyfikuj odpowiedni cykl PCR dla amplifikacji cDNA, wybierając cykl, w którym biblioteka cDNA jest widoczna, ale dimery starterów są ledwo zauważalne.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedni cykl PCR jest wybierany między 12–16 cyklami. Na Rysunek 4A, odpowiedni cykl PCR dla tej biblioteki to 14.
  6. Przygotuj reakcje PCR na dużą skalę (6 x 100 μl) do oczyszczania biblioteki żelu agarozowego.
    1. Przygotuj świeżą probówkę z 10x buforem PCR, postępując zgodnie z krokiem 6.1.
    2. Przygotuj wielkoskalową mieszankę PCR Master Mix w probówce o pojemności 1,5 ml, łącząc 435,5 μl wody wolnej od RNaz, 65 μl 10x buforu PCR, 65 μl 10x dNTP, 3,25 μl startera 5' PCR, 3,25 μl startera 3' PCR i pipetując w górę iw dół do mieszania.
    3. Przenieś 88 μl PCR Master Mix do sześciu probówek PCR o pojemności 0,5 ml. Przenieś 10 μl biblioteki cDNA (przechowywanej na lodzie), dodaj 2 μl 50x polimerazy Taq do każdej z 6 probówek PCR i odpipetuj do wymieszania.
    4. Przygotuj probówkę z ujemnym wynikiem reakcji PCR, łącząc 77 μl wody wolnej od RNaz, 10 μl 10x buforu PCR, 10 μl 10x dNTP, 0,5 μl startera 5' PCR, 0,5 μl startera 3' PCR i 2 μl 50x polimerazy Taq i pipetę do mieszania.
    5. Umieść probówki PCR w termocyklerze, korzystając z cyklu PCR opisanego w kroku 6.2.1 i ustaw optymalną liczbę cykli amplifikacji. Przygotuj 2,5% żel agarozowy, używając 0,5 raza KZM, jak opisano w kroku 6.3.
  7. Po amplifikacji PCR przenieś 9 μl z każdej probówki PCR do sześciu 1,5 ml probówek mikrowirówek zawierających 3 μl 5x barwnika ładującego żel.
    1. Przygotuj drabinkę o długości 20 nt, łącząc 3 ml drabinki z 9 μl wody wolnej od RNaz i dodając 3 μl barwnika ładującego żel do probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Załaduj drabinę, ujemną kontrolę PCR i 6 produktów PCR na żel agarozowy i uruchom żel na 30 minut przy napięciu 120 V.
    3. Sprawdź jednorodność amplifikacji PCR między liniami na pudełku UV (zrób zdjęcie).
    4. Połącz 3 reakcje PCR w dwóch silikonowanych probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml (3 x 91 μl), dodaj 27 μl 5 M NaCl i 950 μl 100% etanolu. Odwróć probówki do wymieszania i ustaw je w temperaturze -20 °C na noc, aby wytrącić produkty PCR.

7. Oczyszczanie i ocena biblioteki cDNA

  1. Odwirować obie probówki w reakcjach PCR przy 16 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml, następnie przechylić probówkę z osadem na górnej stronie i płynem na dolnej stronie i użyć pipety Pasteura podłączonej do kolby próżniowej z wanną i odessać ciecz za pomocą końcówki o pojemności 10 ml na końcu pipety Pasteura.
  3. Ustawić skrót PmeI.
    1. Ponownie zawiesić jedną z pastylek PCR w 17,5 μl wody wolnej od nukleaz i przenieść zawieszoną pastylkę na drugą pastylkę PCR. Dodać 2 μl 10x buforu i 0,5 μl enzymu PmeI i ustawić trawienie w łaźni wodnej na 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Przygotuj 2,5% żel agarozowy, używając 0,5x TBE (krok 6.3). Dodaj 6 μl 5x barwnika ładującego żel do roztworu. Przenieś 13 μl każdego trawienia do dwóch sąsiednich studzienek żelu agarozowego, załaduj drabinę o rozmiarze 20 nt w dołkach końcowych i uruchom żel przez 90 minut przy napięciu 150 V (Rysunek 4D).
    3. Usuń górne pasma PCR z żelu na pudełku UV, przenieś kawałki żelu do świeżo zważonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zważ kawałki żelu na wadze.
  4. Oczyść wyciętą bibliotekę cDNA amplifikowaną metodą PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Określ ilościowo bibliotekę cDNA za pomocą testu kwantyfikacji DNA i przyrządu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Oceń rozmiar i czystość biblioteki cDNA za pomocą chipa DNA o wysokiej czułości na bioanalizatorze (Rysunek 5). Sekwencjonowanie biblioteki cDNA przy użyciu systemu o wysokiej przepustowości. Przenieś plik danych FASTQ do potoku RNAworld w celu przycięcia adaptera i dopasowania do ludzkiego genomu w celu identyfikacji sekwencji miRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak opisano w tej metodzie, łącznie 18 pojedynczych próbek RNA FFPE (100 ng każda) umieszcza się w oddzielnych probówkach, aby przejść przez noc ligację 3' oligonukleotydów T4 z adenylowanym kodem kreskowym. Następnego dnia reakcje enzymatyczne są dezaktywowane termicznie, łączone i wytrącane w jednej probówce. Osad RNA jest ponownie zawieszany, a ligowane cząsteczki RNA są rozdzielane na 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym (PAGE), gdzie markery wielkości oligonukleotydów RNA, które ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole przedstawiono wysoce powtarzalny i solidny protokół przygotowania biblioteki cDNA dla NGS małych RNA zarchiwizowanych w próbkach RNA FFPE, który jest zmodyfikowaną i zoptymalizowaną wersją procedury opisanej przez Hafnera i wsp.22 Rozdział 22

Wszystkie kroki tego protokołu zostały zoptymalizowane do użytku ze starszymi, zarchiwizowanymi i naruszonymi całkowitymi RNA odzyskanymi z próbek FFPE. Kluczowym etapem tego protokołu, służącym do p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną ujawnić, że publikacja zawierająca niektóre z danych przedstawionych w tym manuskrypcie została opublikowana w International Journal of Molecular Sciences przez Loudiga i wsp.Lokal mieszkalny 21.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Thomasowi Tuschlowi, szefowi laboratorium biologii molekularnej RNA, a także członkom jego laboratorium za wsparcie i dzielenie się technologią opracowaną w jego laboratorium oraz za udostępnienie rurociągu RNAworld. Dziękujemy również dr Markusowi Hafnerowi za podzielenie się swoim protokołem i dostarczenie szczegółowych opisów wszystkich etapów biochemicznych i enzymatycznych zastosowanych w jego początkowej procedurze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MerkaptoetanolSigmaO3445I-100
20 nt drabinkaJena BioscienceM-232S
20 mg / ml Albumina surowicy bydlęcejSigmaB8894-5ML
50X Tytan TaqClontech Laboratories639208
Nadsiarczan amonuFisher Scientific7727-54-0
BRL Pionowy system elektroforezy żelowej ze szklanymi płytkami i grzebieniamiGIBCOV16
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD9170-5VL
Mikrowirówka Eppendorf 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Silikonowane probówki wirówkowe o niskiej retencji 1,5 mlFisher Scientific02-681-320
Rurka do łamania żelu 0,5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Aparat do elektroforezy żelowej 7 cm x 10 cm - Mini-sub Cell GT z tackami żelowymi i grzebieniamiBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge Wirówka osobista dwuwirnikowaUSA scientific2641-0016
Model V16 aparatura do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, okulary, grzebienie i przekładkiCiore Life Science21070010
Oligonukleotydyzdefiniowane IDT podczas zamówienia
Owl EasyCast B2 mini system do elektroforezy - z tackami żelowymi i grzebieniamiThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Enzym restrykcyjny PmeINEBR0560S
Woda wolna od RNazAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Nadajnik światła niebieskiego Safe Imager 2.0ThermofisherG6600
SeaKem LE agarozaLonza50002
Indeks górny III zestaw do odwrotnej transkrypcjiInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 Ligaza RNA 1NEBM0204S
T4 Ligaza RNA 2 Skrócony K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocykler z podgrzewaną pokrywąApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7,5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8,0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system koncentrat, rozcieńczalnik i bufor Krajowy DiagnostykaEC-833

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517(2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393(2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144(2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500(2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627(2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683(2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja RNA z pr bek FFPEprzygotowanie biblioteki cDNAelektroforeza w elu poliakrylamidowympilota owa amplifikacja PCRoczyszczanie w elu agarozowymsekwencjonowanie nast pnej generacjianaliza ma ych RNAarchiwalne preparaty tkankoweadaptery z kodem kreskowym 3

Powiązane artykuły