Method Article

ExCYT: Graficzny interfejs użytkownika usprawniający analizę danych z cytometrii wielowymiarowej

DOI:

10.3791/57473

⸱

January 16th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Bloomberg~Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine, 2The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Immunology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ExCYT to graficzny interfejs użytkownika (GUI) oparty na MATLAB, który pozwala użytkownikom analizować dane cytometrii przepływowej za pomocą powszechnie stosowanych technik analitycznych dla danych wysokowymiarowych, w tym redukcji wymiarowości za pomocą t-SNE, różnych automatycznych i ręcznych metod grupowania, map cieplnych i nowatorskich wysokowymiarowych wykresów przepływu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się cytometrów przepływowych zdolnych do pomiaru coraz większej liczby parametrów, naukowcy kontynuują prace nad większymi panelami do fenotypowego badania cech swoich próbek komórkowych. Jednak ten postęp technologiczny daje wielowymiarowe zestawy danych, które stają się coraz trudniejsze do obiektywnej analizy w tradycyjnych programach bramkowania opartych na ręcznych. Aby lepiej analizować i prezentować dane, naukowcy współpracują z bioinformatykami posiadającymi doświadczenie w analizie danych wielowymiarowych w celu przeanalizowania danych cytometrii przepływowej. Chociaż wykazano, że metody te są bardzo cenne w badaniu cytometrii przepływowej, nie zostały one jeszcze włączone do prostego i łatwego w użyciu pakietu dla naukowców, którzy nie mają doświadczenia w obliczeniach lub programowaniu. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy ExCYT, graficzny interfejs użytkownika (GUI) oparty na MATLAB, który usprawnia analizę danych z wysokowymiarowej cytometrii przepływowej, wdrażając powszechnie stosowane techniki analityczne dla danych wysokowymiarowych, w tym redukcję wymiarowości za pomocą t-SNE, różne zautomatyzowane i ręczne metody grupowania, mapy cieplne i nowatorskie wysokowymiarowe wykresy przepływu. Dodatkowo, ExCYT zapewnia tradycyjne opcje bramkowania wybranych populacji będących przedmiotem zainteresowania do dalszej analizy t-SNE i grupowania, a także możliwość stosowania bramek bezpośrednio na powierzchniach t-SNE. Dodatkową zaletą oprogramowania jest praca z plikami FCS z kompensacją lub bez niej. W przypadku, gdy wymagana jest kompensacja po nabyciu, użytkownik może zdecydować się na udostępnienie programowi katalogu pojedynczych plam i próbki niebarwionej. Program wykrywa pozytywne zdarzenia we wszystkich kanałach i wykorzystuje te wybrane dane do bardziej obiektywnego obliczenia macierzy wynagrodzeń. Podsumowując, ExCYT zapewnia kompleksowy potok analityczny, który umożliwia pobieranie danych cytometrii przepływowej w postaci plików FCS i umożliwia każdej osobie, niezależnie od szkolenia obliczeniowego, korzystanie z najnowszych podejść algorytmicznych w zrozumieniu swoich danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w cytometrii przepływowej, jak również pojawienie się cytometrii masowej, pozwoliły klinicystom i naukowcom szybko zidentyfikować i fenotypowo scharakteryzować biologicznie i klinicznie interesujące próbki z nowymi poziomami rozdzielczości, tworząc duże, wysokowymiarowe zestawy danych, które są bogate w informacje1,2,3. Podczas gdy konwencjonalne metody analizy danych cytometrii przepływowej, takie jak bramkowanie ręczne, były prostsze w przypadku eksperymentów, w których jest niewiele markerów, a markery te mają wizualnie rozpoznawalne populacje, podejście to może nie generować powtarzalnych wyników podczas analizowania zestawów danych o wyższych wymiarach lub tych z markerami barwiącymi się w spektrum. Na przykład w badaniu wieloinstytucjonalnym, w którym przeprowadzano testy barwienia wewnątrzkomórkowego (ICS) w celu oceny odtwarzalności ilościowego określania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu, pomimo dobrej precyzji międzylaboratoryjnej, analiza, w szczególności bramkowania, wprowadziła istotne źródło zmienności4. Co więcej, proces ręcznego bramkowania populacji interesów, oprócz tego, że jest wysoce subiektywny, jest bardzo czasochłonny i pracochłonny. Jednak problem analizowania wielowymiarowych zbiorów danych w sposób solidny, wydajny i terminowy nie jest niczym nowym w naukach badawczych. Badania ekspresji genów często generują niezwykle wielowymiarowe zestawy danych (często rzędu setek genów), podczas gdy ręczne formy analizy byłyby po prostu niewykonalne. Aby poradzić sobie z analizą tych zestawów danych, włożono wiele pracy w opracowanie narzędzi bioinformatycznych do analizowania danych dotyczących ekspresji genów5. Te podejścia algorytmiczne zostały niedawno przyjęte w analizie danych cytometrycznych, ponieważ liczba parametrów wzrosła i okazały się nieocenione w analizie tych wielowymiarowych zestawów danych6,7.

Pomimo generowania i stosowania różnorodnych algorytmów i pakietów oprogramowania, które pozwalają naukowcom na zastosowanie tych wielowymiarowych podejść bioinformatycznych do danych cytometrii przepływowej, te techniki analityczne nadal pozostają w dużej mierze nieużywane. Chociaż może istnieć wiele czynników, które ograniczyły powszechne zastosowanie tych podejść do danych cytometrycznych8, główną przeszkodą, którą podejrzewamy w stosowaniu tych podejść przez naukowców, jest brak wiedzy obliczeniowej. W rzeczywistości wiele z tych pakietów oprogramowania (tj. flowCore, flowMeans i OpenCyto) jest napisanych tak, aby można je było zaimplementować w językach programowania, takich jak R, które nadal wymagają merytorycznej wiedzy programistycznej. Pakiety oprogramowania, takie jak FlowJo, znalazły uznanie wśród naukowców ze względu na prostotę obsługi i charakter "plug-n-play", a także kompatybilność z systemem operacyjnym PC. Aby zapewnić różnorodność akceptowanych i cennych technik analitycznych naukowcom niezaznajomionym z programowaniem, opracowaliśmy ExCYT, graficzny interfejs użytkownika (GUI), który można łatwo zainstalować na komputerze PC/Mac, który wykorzystuje wiele najnowszych technik, w tym redukcję wymiarowości w celu intuicyjnej wizualizacji, różnorodne metody grupowania cytowane w literaturze, wraz z nowatorskimi funkcjami do zbadania wyników tych algorytmów grupowania z mapami cieplnymi i nowatorskimi wielowymiarowymi wykresami przepływu/skrzynkowymi.

ExCYT to graficzny interfejs użytkownika wbudowany w MATLAB, dlatego może być uruchamiany bezpośrednio w MATLAB lub dostarczany jest instalator, który może być użyty do zainstalowania oprogramowania na dowolnym komputerze PC/Mac. Oprogramowanie jest dostępne pod adresem https://github.com/sidhomj/ExCYT. Przedstawiamy szczegółowy protokół importu danych, ich wstępnego przetwarzania, przeprowadzania redukcji wymiarowości t-SNE, danych klastrowych, sortowania i filtrowania klastrów w oparciu o preferencje użytkownika oraz wyświetlania informacji o interesujących klastrach za pomocą map cieplnych i nowatorskich wysokowymiarowych wykresów przepływowych/pudełkowych (Rysunek 1). Osie na wykresach t-SNE są dowolne i w dowolnych jednostkach i jako takie nie zawsze są pokazane na rysunkach dla uproszczenia interfejsu użytkownika. Kolorowanie punktów danych w "mapach cieplnych t-SNE" jest od niebieskiego do żółtego w zależności od sygnału wskazanego znacznika. W rozwiązaniach klastrowych kolor punktu danych jest oparty na dowolnym numerze klastra. Wszystkie części przepływu pracy mogą być realizowane w jednopanelowym graficznym interfejsie użytkownika (Rysunek 2 i Tabela 1)". Na koniec zademonstrujemy zastosowanie ExCYT na wcześniej opublikowanych danych badających krajobraz immunologiczny raka nerkowokomórkowego w literaturze, również analizowanych podobnymi metodami. Przykładowy zestaw danych, którego użyliśmy do stworzenia rysunków w tym manuskrypcie wraz z poniższym protokołem, można znaleźć pod adresem https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, po zarejestrowaniu konta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zbieranie i przygotowywanie danych cytometrycznych

  1. Umieść wszystkie pojedyncze plamy w folderze osobno i oznacz nazwą kanału (fluoroforem, nie markerem).

2. Import danych i wstępne przetwarzanie

  1. Aby wstrzymać lub zapisać w całym potoku analizy, użyj przycisku Zapisz obszar roboczy w lewym dolnym rogu programu, aby zapisać obszar roboczy jako znak ". MAT', który można później załadować za pomocą przycisku Załaduj obszar roboczy. Nie uruchamiaj więcej niż jednej instancji programu na raz. Dlatego podczas ładowania nowego obszaru roboczego upewnij się, że nie jest uruchomione żadne inne wystąpienie ExCYT.
  2. Aby rozpocząć potok analizy, najpierw wybierz typ cytometrii (cytometria przepływowa lub cytometria masowa – CYTOF), w obszarze Parametry wyboru pliku wybierz liczbę zdarzeń do pobrania z pliku (w tym przykładzie użyj 2 000). Po pomyślnym zaimportowaniu danych pojawi się okno dialogowe informujące użytkownika, że dane zostały pomyślnie zaimportowane.
  3. Naciśnij przycisk automatycznej kompensacji, aby przeprowadzić opcjonalny krok automatycznej kompensacji, tak jak to robi Bagwell & Adams9. Zaznacz katalog zawierający pojedyncze plamy. Wybierz niebarwioną próbkę w oknie dialogowym interfejsu użytkownika.
    1. Umieść bramkę rozproszenia do przodu/bocznego na dowolnej próbce w tym katalogu, która będzie używana do wybierania zdarzeń do obliczenia macierzy kompensacji. Zaleca się użycie do tego celu niebarwionej próbki. W tym momencie zaimplementowano algorytm do ustawiania spójnych progów na 99. percentylu niebarwionej próbki w celu zdefiniowania pozytywnych zdarzeń w każdym z pojedynczych barwień w celu obliczenia macierzy kompensacji. Po zakończeniu tego procesu pojawi się okno dialogowe z informacją, że kompensacja została wykonana.
  4. Następnie naciśnij Populacja bramki i wybierz populacje interesujących komórek, zgodnie z konwencją w analizach cytometrii przepływowej. Po wybraniu opcji Populacja komórek wprowadź liczbę procentową analizy podrzędnej zdarzeń (w tym 10 000 zdarzeń).
  5. Następnie wybierz kanały numeryczne, które mają być używane do analizy, w polu listy po prawej stronie pola Przetwarzanie wstępne (użyj określonych kanałów pokazanych w przykładzie).

3. Analiza t-SNE

  1. Naciśnij przycisk t-SNE, aby program rozpoczął obliczanie zestawu danych o zmniejszonej wymiarowości do wizualizacji w oknie poniżej przycisku t-SNE. Aby zapisać obraz t-SNE, naciśnij Zapisz obraz TSNE. Na komputerze z 8 procesorami @ 3,4 GHz każdy i 8 GM RAM ten krok powinien zająć około 2 minut dla 10 000 zdarzeń, 10 minut dla 50 000 zdarzeń i 20 minut dla 100 000 zdarzeń.
  2. Aby utworzyć "mapę cieplną t-SNE", jak widać w kilku publikacjach CYTOF10,11, wybierz opcję z menu podręcznego Marker-Specific t-SNE (użyj określonych znaczników CD64 lub CD3, jak pokazano w przykładzie). Pojawi się rysunek przedstawiający reprezentację mapy cieplnej wykresu t-SNE, którą można zapisać w celu wygenerowania figury.
  3. Wybiera obszary zainteresowania na wykresach t-SNE przez użytkownika do dalszych analiz za pomocą przycisku Gate t-SNE.

4. Analiza skupień

  1. Aby rozpocząć analizę grupowania, wybierz opcję z listy Metoda grupowania (w tym przykładzie nas DBSCAN ze współczynnikiem odległości 5 w oknie dialogowym po prawej stronie pola listy). Naciśnij przycisk Cluster (Klaster).
  2. Użyj jednej z następujących opcji dla algorytmów automatycznego grupowania, które znajdują się w panelu "Parametry automatycznego grupowania":
    1. Twarde KMEANS (na t-SNE): Zastosuj grupowanie k-średnich do zredukowanych 2-wymiarowych danych t-SNE i wymaga podania liczby klastrów do algorytmu12.
    2. Twarde KMEAN (na danych HD): Zastosuj grupowanie k-średnich do oryginalnych danych wielowymiarowych, które zostały przekazane algorytmowi t-SNE. Po raz kolejny algorytmowi należy podać liczbę klastrów.
    3. DBSCAN: Zastosuj metodę grupowania klastrów, zwaną Densesity-Based Spatial Clustering of Applications with Noise13, która grupuje zredukowane 2-wymiarowe dane t-SNE i wymaga niewymiarowego współczynnika odległości, który określa ogólny rozmiar klastrów. Ten typ algorytmu grupowania dobrze nadaje się do grupowania redukcji t-SNE, ponieważ jest w stanie grupować klastry niesferoidalne, które często występują w zredukowanej reprezentacji t-SNE. Dodatkowo, ze względu na to, że operuje na danych dwuwymiarowych, jest jednym z szybszych algorytmów grupowania.
    4. Grupowanie hierarchiczne: Zastosuj konwencjonalną metodę grupowania hierarchicznego do danych wielowymiarowych, w których cała euklidesowa macierz odległości jest obliczana między wszystkimi zdarzeniami przed podaniem algorytmowi współczynnika odległości, który określa rozmiar klastra.
    5. Oparty na grafie sieciowym: Zastosuj metodę grupowania, która została ostatnio wprowadzona do analizy danych cytometrii przepływowej, gdy istnieją rzadkie subpopulacje, które użytkownik chce wykryć11,14. Ta metoda polega na utworzeniu najpierw wykresu, który określa powiązania między wszystkimi zdarzeniami w danych. Ten krok polega na podaniu parametru początkowego w celu utworzenia wykresu, który jest liczbą k najbliższych sąsiadów. Ten parametr zazwyczaj określa rozmiar klastrów. W tym momencie pojawia się kolejne okno dialogowe z prośbą o zastosowanie jednego z 5 algorytmów grupowania, które są stosowane do wykresu. Obejmują one 3 opcje maksymalizacji modularności wykresu, metodę Danona i algorytm grupowania spektralnego14,15,16,17,18. Jeśli ktoś chce ogólnie szybszego rozwiązania do klastrowania, polecamy Spectral Clustering lub Fast Greedy Modularity Maximization. Podczas gdy metody maksymalizacji modularności wraz z metodą Danona określają optymalną liczbę klastrów, klastrowanie spektralne wymaga, aby liczba klastrów została przekazana programowi.
    6. Samoorganizująca się mapa: Wykorzystaj sztuczną sieć neuronową do grupowania danych wielowymiarowych.
    7. GMM – Maksymalizacja oczekiwań: Utwórz model mieszaniny Gaussa przy użyciu techniki maksymalizacji oczekiwań (EM) w celu grupowania danych wielowymiarowych. 19 Ten typ metody grupowania wymaga również od użytkownika wprowadzenia liczby klastrów.
    8. Wariacyjne wnioskowanie bayesowskie dla GMM: Utwórz model mieszaniny Gaussa, ale w przeciwieństwie do EM, może on automatycznie określić liczbę składników mieszaniny k.20 Chociaż program wymaga podania liczby klastrów (większej niż oczekiwana liczba klastrów), algorytm sam określi optymalną liczbę.
  3. Aby zbadać określony obszar wykresu t-SNE, naciśnij przycisk Wybierz klaster ręcznie, aby narysować zestaw klastrów zdefiniowanych przez użytkownika. Należy pamiętać, że klastry nie mogą współużytkować członków (tj. każde zdarzenie może należeć tylko do 1 klastra).

5. Filtracja klastrowa

  1. Zestawy klastrów zidentyfikowanych ręcznie lub za pomocą jednej z metod automatycznych opisanych powyżej można filtrować w następujący sposób.
    1. Aby posortować klastry (w panelu Filtr klastrów) według dowolnych znaczników zmierzonych w eksperymencie, wybierz opcję z menu podręcznego Sortuj. Aby ustawić, czy kolejność ma być rosnąca, czy malejąca, naciśnij przycisk Rosnąco/Malejąco po prawej stronie menu podręcznego Sortuj. Spowoduje to zaktualizowanie listy klastrów w polu listy "Klastry (filtracja)" i zmianę ich kolejności w kolejności malejącej wyrażenia mediany klastra tego znacznika. Wartość procentowa oznaczona w polu listy "Klastry (filtracja)" oznacza procent populacji, którą ten klaster reprezentuje.
    2. Aby ustawić minimalną wartość progową dla danego klastra w określonym kanale, wybierz opcję z menu podręcznego Próg (w tym przykładzie używamy znacznika CD65 i ustawiamy próg na 0,75). Wpisz wartość w polu liczbowym pod wykresem lub użyj suwaka, aby ustawić próg. Po ustawieniu progu naciśnij przycisk Dodaj powyżej progu lub Dodaj poniżej progu, aby określić kierunek progu. Po ustawieniu tego progu zostanie on wyświetlony w polu Progi obok panelu "Filtr klastrów", w którym zostanie wyświetlony znacznik, wartość progowa i kierunek, dzięki czemu użytkownik będzie wiedział, które progi są obecnie stosowane. Na koniec wykres t-SNE zostanie zaktualizowany poprzez rozmycie klastrów, które nie spełniają wymagań filtracji, a pole listy "Klastry (filtracja)" zostanie zaktualizowane, aby pokazać klastry spełniające wymagania filtracji.
    3. Aby ustawić minimalny próg częstotliwości klastra, wprowadź liczbowy punkt odcięcia w polu Próg częstotliwości klastra (%) w panelu Filtr klastra (w tym przykładzie należy użyć wartości 1%).

6. Analiza i wizualizacja skupień

  1. Aby wybrać klastry do dalszej analizy i wizualizacji, wybierz klastry w polu listy Klastry (filtracja) i naciśnij przycisk Wybierz à, aby przenieść je do pola listy Analiza klastrów.
  2. Aby utworzyć mapy cieplne klastrów, wybierz interesujące Cię klastry w polu listy Analiza klastrów i naciśnij przycisk Mapa cieplna klastrów. Po naciśnięciu tego przycisku pojawi się rysunek zawierający mapę cieplną wraz z dendrogramami na osiach klastra i parametrów. Dendrogram na osi pionowej pogrupuje klastry według tych, które są blisko powiązane, podczas gdy dendrogram na osi poziomej pogrupuje znaczniki, które są ze sobą powiązane. Aby zapisać mapę cieplną, naciśnij Plik | Ustawienia eksportu | Eksport.
  3. Aby utworzyć 'Wysokowymiarowy wykres pudełkowy' lub 'Wysokowymiarowy wykres przepływu', wybierz interesujące klastry w polu listy Analiza skupień i naciśnij przycisk Wysokowymiarowy wykres pudełkowy lub Wysokowymiarowy wykres przepływu. Wykresy te można wykorzystać do wizualnej oceny rozkładu danych kanałów różnych klastrów we wszystkich wymiarach.
  4. Aby wyświetlić klastry na tradycyjnych wykresach przepływu 2D, wybierz transformację (liniową, log10, arcsinh) i kanał w panelu Konwencjonalny wykres przepływu, a następnie naciśnij przycisk Konwencjonalny wykres przepływu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przetestować użyteczność ExCYT, przeanalizowaliśmy wyselekcjonowany zestaw danych opublikowany przez Chevrier et al. zatytułowany 'An Immune Atlas of Clear Cell Renal Carcinoma', gdzie grupa przeprowadziła analizę CyTOF z obszernym panelem immunologicznym na próbkach guza pobranych od 73 pacjentów11. Dwa oddzielne panele, panel szpikowy i limfatyczny, użyto do fenotypowego scharakteryzowania mikrośrodowiska guza. Celem naszego badania było podsumowanie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu prezentujemy ExCYT, nowatorski graficzny interfejs użytkownika z algorytmami opartymi na MATLAB w celu usprawnienia analizy danych z cytometrii wielowymiarowej, umożliwiając osobom bez doświadczenia w programowaniu wdrażanie najnowszych algorytmów analizy danych wielowymiarowych. Dostępność tego oprogramowania dla szerszej społeczności naukowej pozwoli naukowcom na eksplorację danych z cytometrii przepływowej w intuicyjny i prosty sposób pracy. Dzięki przeprowadzeniu redukcji wymiarów t-SNE, zastosowaniu me...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Komputer stacjonarnySuperMicroCustom BuildKomputer używany do przeprowadzania analiz
MATLABMathworksN/AOprogramowanie używane do tworzenia ExCYT

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoist, C., Hacohen, N. Flow cytometry, amped up. Science. 332 (6030), 677-678 (2011).
  2. Ornatsky, O., et al. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of immunological methods. 361 (1), 1-20 (2010).
  3. Tanner, S. D., et al. Flow cytometer with mass spectrometer detection for massively multiplexed single-cell biomarker assay. Pure and Applied Chemistry. 80 (12), 2627-2641 (2008).
  4. Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC immunology. 6 (1), 13(2005).
  5. Brazma, A., Vilo, J. Gene expression data analysis. FEBS letters. 480 (1), 17-24 (2000).
  6. Pyne, S., et al. Automated high-dimensional flow cytometric data analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (21), 8519-8524 (2009).
  7. Ge, Y., Sealfon, S. C. flowPeaks: a fast unsupervised clustering for flow cytometry data via K-means and density peak finding. Bioinformatics. 28 (15), 2052-2058 (2012).
  8. Venkatesh, V. Determinants of perceived ease of use: Integrating control, intrinsic motivation, and emotion into the technology acceptance model. Information systems research. 11 (4), 342-365 (2000).
  9. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677 (1), 167-184 (1993).
  10. Lavin, Y., et al. Innate immune landscape in early lung adenocarcinoma by paired single-cell analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
  11. Chevrier, S., et al. An immune atlas of clear cell renal cell carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
  12. Hartigan, J. A., Wong, M. A. Algorithm AS 136: A k-means clustering algorithm. Journal of the Royal Statistical Society. Series C (Applied Statistics). 28 (1), 100-108 (1979).
  13. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Density-based spatial clustering of applications with noise. International Conference Knowledge Discovery and Data Mining. 240, (1996).
  14. Levine, J. H., et al. Data-driven phenotypic dissection of AML reveals progenitor-like cells that correlate with prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
  15. Blondel, V. D., Guillaume, J. L., Lambiotte, R., Lefebvre, E. Fast unfolding of communities in large networks. Journal of statistical mechanics: theory and experiment. 2008 (10), P10008(2008).
  16. Le Martelot, E., Hankin, C. Fast multi-scale detection of relevant communities in large-scale networks. The Computer Journal. 56 (9), 1136-1150 (2013).
  17. Newman, M. E. Fast algorithm for detecting community structure in networks. Physical review E. 69 (6), 066133(2004).
  18. Hespanha, J. P. An efficient matlab algorithm for graph partitioning. , University of California. 1-8 (2004).
  19. Moon, T. K. The expectation-maximization algorithm. IEEE Signal processing. 13 (6), 47-60 (1996).
  20. Bishop, C. M. Pattern recognition and machine learning. , Springer. (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Dimensional CytometryFlow Cytometry Analysist SNE Dimensionality ReductionAutomated Clustering MethodsHeatmap VisualizationGraphical User InterfaceCompensation Matrix CalculationConventional Flow PlotsHigh Dimensional Flow PlotsCluster Analysis Thresholding

Related Articles