Artykuł metodologiczny

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

20.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57479

⸱

20 kwietnia 2018

 , 
1Cluster of excellence CellNetworks, Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

W tym artykule

Podsumowanie

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Streszczenie

Aby uzupełnić istniejące podejścia do oczyszczania powinowactwa (AP) do identyfikacji interakcji białko-białko (PPI), wprowadzono enzymy, które umożliwiają zależne od bliskości znakowanie białek w żywych komórkach. Jeden z takich enzymów, BirA* (stosowany w podejściu BioID), pośredniczy w biotynylacji białek w zakresie około 10 nm. W związku z tym, po połączeniu z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i uleganiu ekspresji w komórkach, umożliwia znakowanie białek proksymalnych w ich naturalnym środowisku. W przeciwieństwie do AP, która opiera się na oczyszczaniu złożonych kompleksów białkowych, BioID wykrywa białka, które zostały oznaczone w komórkach, bez względu na to, czy nadal wchodzą w interakcję z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, gdy są izolowane. Ponieważ biotynyluje białka proksymalne, można ponadto wykorzystać wyjątkowe powinowactwo streptawidyny do biotyny, aby bardzo skutecznie je wyizolować. Podczas gdy BioID działa lepiej niż AP w identyfikacji przejściowych lub słabych interakcji, zarówno podejścia AP, jak i spektrometrii mas BioID zapewniają przegląd wszystkich możliwych interakcji, jakie może mieć dane białko. Nie zawierają one jednak informacji na temat kontekstu każdego zidentyfikowanego IPP. Rzeczywiście, większość białek jest zazwyczaj częścią kilku kompleksów, odpowiadających różnym etapom dojrzewania lub różnym jednostkom funkcjonalnym. Aby rozwiązać to powszechne ograniczenie obu metod, opracowaliśmy test komplementacji fragmentów białek oparty na enzymie BirA*. W tym teście dwa nieaktywne fragmenty BirA* mogą ponownie złożyć się w aktywny enzym, gdy znajdą się w bliskiej odległości od dwóch oddziałujących białek, z którymi są połączone. Uzyskany w ten sposób test split-BioID umożliwia znakowanie białek, które gromadzą się wokół pary oddziałujących ze sobą białek. Pod warunkiem, że te dwa elementy oddziałują na siebie tylko w danym kontekście, split-BioID umożliwia analizę określonych zależnych od kontekstu jednostek funkcjonalnych w ich natywnym środowisku komórkowym. W tym miejscu przedstawiamy protokół krok po kroku do testowania i stosowania split-BioID do pary oddziałujących białek.

Wprowadzenie

Ponieważ większość funkcji komórkowych jest wykonywana przez białka, które dynamicznie łączą kompleksy makromolekularne, identyfikacja interakcji białko-białko (PPI) jest głównym przedsięwzięciem w badaniach biomedycznych. Rzeczywiście, IPP są często rozregulowane w chorobie i stanowią potencjalne cele terapeutyczne1. Najpowszechniej stosowaną metodą identyfikacji IPP jest metoda oczyszczania powinowactwa (AP), w której po lizie komórek białko będące przedmiotem zainteresowania jest specyficznie oczyszczane na matrycy, a powiązane białka są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas (MS). Chociaż AP-MS jest potężnym podejściem, zazwyczaj nie działa dobrze w przypadku słabo rozpuszczalnych kompleksów białkowych, bardzo przejściowych interakcji lub IPP, które wymagają nienaruszonej struktury subkomórkowej. Co więcej, interpretacja danych może być skomplikowana ze względu na dynamiczną naturę sieci PPI, ponieważ pojedyncze białko jest często częścią kilku odrębnych kompleksów białkowych.

Techniki oznaczania bliskości, takie jak BioID2 lub APEX23,4 zostały niedawno opracowane w celu rozwiązania niektórych ograniczeń podejść AP-MS. W BioID enzym BirA* (odpowiadający wariantowi G115R dzikiego enzymu E. coli) katalizuje tworzenie labilnego biotynyl-AMP (bio-AMP), który może reagować z aminami pierwszorzędowymi. W przeciwieństwie do enzymu typu dzikiego, który zatrzymuje bio-AMP w swoim aktywnym centrum, BirA* uwalnia bio-AMP, umożliwiając jego dyfuzję do sąsiedniego środowiska. W związku z tym, po fuzji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i ekspresji w komórkach, białka proksymalne mogą być biotynylowane w szacowanym zakresie 10 nm5. Te oznaczone białka proksymalne są następnie izolowane przez ściąganie streptawidyny i identyfikowane przez stwardnienie rozsiane. W przeciwieństwie do AP-MS, BioID wymaga ekspresji białka fuzyjnego. W związku z tym można go stosować tylko do białek, których funkcja nie jest zakłócona przez znakowanie. Co więcej, szybkość etykietowania jest niska, zwykle 6–24 h2,6, co sprawia, że wykrywanie krótkożyciowych białek jest trudne. Jednak w porównaniu z AP-MS, BioID-MS oferuje kilka kluczowych zalet: po pierwsze, wychwytuje interakcje w ich natywnym środowisku komórkowym; po drugie, znakowane białka, a nie złożone kompleksy, są izolowane po lizie komórek; Po trzecie, ściąganie streptawidyny pozwala na stosowanie denaturujących i trudnych warunków mycia. W związku z tym metoda jest bardziej czuła na wykrywanie przejściowych lub słabych interakcji7 lub interakcji zachodzących na określonej i trudnej do wyizolowania strukturze subkomórkowej8.

Jednak większość białek jest zazwyczaj częścią większych kompleksów, które mogą się przebudować zgodnie ze wskazówkami komórkowymi lub funkcją, która musi być wykonana. W związku z tym pojedyncze białko jest zazwyczaj częścią kilku kompleksów, odpowiadających odrębnym jednostkom funkcjonalnym, obejmującym różne i/lub nakładające się na siebie PPI. Oba podejścia dają przegląd wszystkich powiązań, jakie może mieć dane białko, ale nie odnoszą się do kontekstu poszczególnych IPP. Aby zwiększyć rozdzielczość tego ostatniego, zaprojektowaliśmy test komplementacji fragmentów białka (PCA), w którym dwa nieaktywne fragmenty BirA* (NBirA*, który zawiera domenę katalityczną, i CBirA*, który może być postrzegany jako domena reaktywacji) mogą ponownie złożyć się w aktywny enzym, gdy zostaną zbliżone do dwóch oddziałujących białek9. Uzyskany w ten sposób test split-BioID koncentruje biotynylację zależną od bliskości na białkach, które gromadzą się wokół pary oddziałujących białek, a tym samym umożliwia identyfikację zależnych od kontekstu zespołów białek. Niedawno zademonstrowaliśmy wyjątkową moc rozdzielczą split-BioID poprzez rozdzielenie dwóch odrębnych kompleksów białkowych zaangażowanych w szlak wyciszania genów za pośrednictwem miRNA9.

Łącznie, w jednym i prostym teście, split-BioID pozwala na odkrycie i specyficzne przypisanie PPI do zdefiniowanych jednostek funkcjonalnych, w których dane białko jest zaangażowane, pod warunkiem, że znane jest dodatkowe białko oddziałujące z odpowiedniego kompleksu białkowego.

Protokół

UWAGA: Przegląd metody jest pokazany na stronie Rysunek 1.

1. Planowanie strategii klonowania

  1. Wybrać dwa przypuszczalnie oddziałujące białka do testu.
    UWAGA: Każde z dwóch białek zostanie połączone z jednym fragmentem rozszczepionego BioID: NBirA* lub CBirA*. Jako kontrola negatywna, białka fuzyjne CBirA* zostaną przetestowane z NBirA* połączonym z białkiem zielonej fluorescencji (NBirA*-GFP). Jako dodatkową kontrolę, fuzje NBirA* mogą być testowane samodzielnie, bez pokrewnej fuzji CBirA* lub w połączeniu z CBirA* połączonym z niepowiązanym białkiem. Zaleca się, aby nie używać CBirA*-GFP jako kontroli negatywnej, ponieważ wykazano, że konsekwentnie prowadzi on do głównego tła w połączeniu z dowolnym białkiem fuzyjnym NBirA*9. Przyczyną tej obserwacji może być poziom ekspresji CBirA*-GFP, znacznie wyższy niż w przypadku jakichkolwiek innych białek fuzyjnych CBirA*, które do tej pory używaliśmy, co może prowadzić do znaczącej reasocjacji z fragmentem NBirA*.
  2. Po wybraniu dwóch białek należy zapoznać się z literaturą, aby dowiedzieć się, czy oba zostały już pomyślnie oznaczone w badaniach funkcjonalnych (na przykład jako białko fuzyjne znakowane GFP).
    1. Jeśli takie badania istnieją, zwróć uwagę na położenie znacznika (na końcu N lub C) i użyj tej samej orientacji do oznaczenia interesujących białek za pomocą podzielonych fragmentów BioID.
    2. Jeśli takie badanie nie istnieje, należy zaplanować konstrukty kodujące dla obu białek znakowanych na końcu N i C oraz zaplanować test w celu przetestowania funkcjonalności białek fuzyjnych (na przykład eksperyment ratunkowy w linii komórkowej zubożonej na białko WT).
      UWAGA: Podczas parowania dwóch białek fuzyjnych za pomocą plazmidów opisanych w Rysunek 2, które kodują długie, elastyczne łączniki, orientacja białek fuzyjnych (fragmenty BirA* połączone przed lub za białkami będącymi przedmiotem zainteresowania) na ogół nie ma znaczenia. Rzeczywiście, używając FRB i FKBP jako białek modelowych, wykazano, że wszystkie cztery możliwe iteracje (obie fragmenty na końcach N, oba na końcach C, jeden na końcu N, a drugi na końcu C i odwrotnie) dają porównywalną biotynylację9.
  3. Zaprojektuj startery do amplifikacji ORF dwóch białek będących przedmiotem zainteresowania do klonowania do rozszczepionych plazmidów BioID. Zwróć uwagę, że ramki translacji są takie same jak fragmenty BirA*. W przypadku użycia plazmidów opisanych w Rysunek 2, użyj enzymów restrykcyjnych PmeI i PacI do budowy fuzji CBirA* oraz enzymów ClaI i MluI do fuzji NBirA*.
    UWAGA: Plazmidy przedstawione w Rysunek 2 przenoszą dwukierunkowy element reagujący na tet, otoczony miejscami rekombinacji F3 / FRT. Pozwala to na regulację koekspresji na mniej więcej tym samym poziomie obu białek fuzyjnych z tego samego plazmidu10 oraz możliwość szybkiej budowy stabilnych linii komórkowych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinacji (RMCE). W tych plazmidach NBirA* ma znacznik myc, podczas gdy CBirA* ma znacznik FLAG. ORF można oczywiście również klonować na pojedynczych plazmidach z konstytutywnymi promotorami.
    KROK KRYTYCZNY: Podczas badania dwóch białek oddziałujących ze sobą zaleca się porównanie NBirA* skondensowanego z białkiem 1 w połączeniu z CBirA* skondensowanego z białkiem 2 oraz NBirA* połączonego z białkiem 2 w połączeniu z CBirA* połączonego z białkiem 1. Rzeczywiście, często obserwuje się, że jedna iteracja działa lepiej niż druga.

2. Klonowanie ORF interesujących genów do plazmidu Split-BioID

UWAGA: W tym przykładzie brane są pod uwagę dwa białka, które mogą być oznaczone na N-końcu. Przetestowane zostaną cztery warunki i porównane z komórkami nietransfekowanymi (Tabela 1).

  1. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby amplifikować ORF dwóch białek, które mają być testowane za pomocą odpowiednich starterów. Zaprojektuj startery, które wprowadzają miejsca restrykcyjne ClaI i MluI dla białek fuzyjnych NBirA* oraz miejsca PacI i PmeI dla białek fuzyjnych CBirA*.
    UWAGA: PCR można wykonać z dowolną komercyjną, preferencyjnie korektorą, polimerazą DNA. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem z podręcznika i dostosuj go do temperatury topnienia starterów i długości ORF, który ma być wzmocniony, zgodnie z wytycznymi producenta.
  2. Subklonowanie pierwszego ORF
    1. Trawić zarówno plazmid (około 2 μg), jak i ORF1 amplifikowany PCR (do fuzji z NBirA*) za pomocą ClaI i MluI. Przeprowadzać reakcje trawienia przy użyciu 1 μl każdego enzymu, zmieszanego z odpowiednią objętością DNA i buforem reakcyjnym w całkowitej objętości 20 μl w probówce o pojemności 1,5 ml przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    2. Obie próbki trawienia należy umieścić na 1% żelu DNA agarozo-TAE. Za pomocą czystego skalpela należy wyciąć prążki odpowiadające strawionemu plazmidowi i ORF1 i przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml.
    3. Oczyść oba prążki za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji DNA.
    4. Zwiąż strawiony plazmid i ORF1 przy użyciu standardowych odczynników.
      1. W przypadku korzystania z zestawu do ligacji wskazanego w Tabeli Materiałów, należy podwiązać 100 ng DNA zawierającego od trzech do pięciu nadmiaru molowego wstawić na plazmid w całkowitej objętości 4,5 μL. Dodać 5 μL 2x buforu ligazy T4 i 0,5 μl ligazy DNA T4 z zestawu do ligacji. Przeprowadzić reakcję ligacji w probówce o pojemności 1,5 ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Przekształć się w standardowe komórki DH-5α E. coli (przygotowane zgodnie z metodą Inoue11).
      1. Zmieszać 3 μl reakcji ligacji z 50 μl kompetentnych komórek w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie i inkubować przez 30 min. Przenieść komórki do bloku grzewczego ustawionego na 42 °C przez 30-45 s, a następnie inkubować z powrotem na lodzie przez 2 minuty. Dodać 250 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) bulionu lizogennego (LB) i rozlać 100 μl komórek na wstępnie podgrzane ( 37 °C) płytka z agarem LB zawierająca ampicylinę. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C.
    6. Następnego dnia wybierz od czterech do sześciu kolonii i inkubuj je w temperaturze 37 °C, 180 obr./min, przez noc w 3 ml pożywki LB zawierającej 100 μg⋅mL-1 ampicyliny w probówce o pojemności 15 ml.
    7. Wyizoluj plazmidy z pobranych kolonii za pomocą standardowego zestawu DNA MiniPrep.
    8. Sprawdź poprawność plazmidów za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu startera odwróconego Cassette 2 (Tabela 2).
  3. Po zidentyfikowaniu plazmidu zawierającego pierwszy ORF, należy dokonać subklonacji drugiego ORF w tym plazmidzie, wykonując te same czynności, co w kroku 2.2, ale przy użyciu enzymów PmeI i PacI.
  4. Sekwencjonuj powstałe plazmidy za pomocą startera odwrotnego kasety 1 (Tabela 2).

3. Testowanie białek fuzyjnych

UWAGA: Poniższe instrukcje dotyczą plazmidów o podwójnej ekspresji indukowanej (Rysunek 2) i komórek HeLa-11ht, subklonalnej linii komórkowej HeLa-CCL2, stabilnie wyrażającej aktywator transkrypcji kontrolowany przez odwrotną tetracyklinę rtTA-M2 i zawierającej locus dla RMCE12. Pożywką dla wzrostu tych komórek jest zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierająca 10% wolnej od tetracyklin płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W przypadku stosowania innego typu komórek konieczne będzie dostosowanie dokładnych warunków wysiewu i podłoża wzrostowego.

  1. Transfekcja przejściowa
    1. Komórki nasienne w stężeniu 1 x 105 komórek w 2 ml na studzienkę sześciodołkowej płytki dzień przed transfekcją i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    2. W dniu transfekcji usunąć pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 2 ml świeżego podłoża.
    3. Przygotować cztery reakcje transfekcji zgodnie z tabelą 1. Do każdej studzienki do transfekcji dodać 6 μg polietyleniny do 3 μg plazmidowego DNA w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml i napełnić do 500 μl pożywką DMEM bez surowicy.
    4. Inkubować każdą mieszankę transfekcyjną przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem kroplami do każdej studzienki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Indukcja i znakowanie zbliżeniowe
    1. Dzień po transfekcji usunąć pożywkę i zastąpić pożywką uzupełnioną biotyną w stężeniu 50 μM w celu stymulacji biotynylacji i doksycykliny w stężeniu 200 ng⋅mL−1 w celu indukcji ekspresji białek fuzyjnych. Inkubować komórki przez co najmniej 20 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
      1. Aby sporządzić roztwór podstawowy biotyny, należy rozpuścić biotynę w 50 mg⋅mL-1 (odpowiada ok. 200 mM) w 2 M wodorotlenku amonu. Po całkowitym rozpuszczeniu rozcieńczyć go do 50 mM w 500 mM Hepes, pH 7,4, a następnie dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Podwielokrotność i przechowywać otrzymany 1000x roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C. Rozpuścić doksycyklinę w 10 mg⋅mL-1 w 70% etanolu i przechowywać w mikroprobówce z zakrętką w temperaturze -20 °C w ciemności.
  3. Przygotowanie lizatu komórkowego
    1. Umyj komórki raz 1 ml zimnego (4 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    2. Do każdej studzienki dodaj 100 μl buforu do lizy (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT i inhibitory proteazy).
    3. Zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś do probówek o pojemności 1,5 ml.
    4. Odwirować próbki o masie 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
    5. Przenieść supernatanty do świeżych probówek i umieścić na lodzie.
    6. Określ ilości białka za pomocą testu Bradforda.
  4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE) i Western blot
    1. Przygotuj żel poliakryloamidowy SDS.
    2. Dla każdego oczyszczonego lizatu należy przygotować próbkę PAGE zawierającą 30 μg (minimum 15 μg) białka w sumie 30 μl buforu ładującego SDS. Następnie załadować równe ilości każdej próbki (20 μl/studzienkę) do żelu poliakrylamidowego SDS i przystąpić do elektroforezy.
    3. Po elektroforezie przenieś frakcjonowane białka do błony kleksowej PVDF o niskiej fluorescencji przy użyciu dowolnego standardowego protokołu.
      UWAGA: Do analizy biotynylacji białek zwykle dobrze sprawdza się 10-minutowy czas transferu z programem "high MW" półsuchego urządzenia do blottingu Western blotting z szybkim transferem.
    4. Po przeniesieniu zablokować membranę w 5% suchym mleku w PBS na 30 min w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować błonę przez 30–60 minut w temperaturze pokojowej z fluorescencyjnym koniugatem streptawidyny rozcieńczonym w stosunku 1:15 000 w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% Tween-20.
    6. Przemyć membranę trzy razy, każdy przez 10 minut, PBS zawierającym 0,1% Tween-20, a następnie ponownie PBS.
    7. Zeskanuj membranę za pomocą skanera fluorescencyjnego.
      UWAGA:Typowy Western blot jest pokazany na Rysunek 3. Powyższa procedura opisuje detekcję opartą na fluorescencji, ale detekcja oparta na luminescencji przy użyciu streptawidyny sprzężonej z HRP działa równie dobrze.

4. Split-BioID do badań proteomicznych

KRYTYCZNA UWAGA: Dla końcowej analizy spektrometrii mas, wszystkie poniższe kroki muszą być wykonane w warunkach wolnych od keratyny, wszystkie materiały i odczynniki powinny być jak najbardziej wolne od keratyny.

  1. Transfekcja przejściowa
    1. Dzień przed transfekcją wysiać trzy do czterech 10 cm płytek dla każdego stanu w stężeniu 8 x 105 komórek w 10 ml na płytkę i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    2. Następnego dnia przygotuj główną mieszankę transfekcyjną dla każdego warunku transfekcji: dla trzech płytek na warunek, 36 μg polietyleniminy i 18 μg plazmidowego DNA rozpuszczonych w 900 μl DMEM bez surowicy. Inkubować każdą mieszankę wzorcową przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. W międzyczasie zastąp podłoże z każdej potrawy świeżym podłożem, a następnie dodaj kroplami 300 μl mieszanek do transfekcji do każdej płytki.
    4. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Indukcja i znakowanie zbliżeniowe
    1. Dzień po transfekcji przenieś komórki na 15 cm szalki. Z każdej pożywki należy usunąć pożywkę, przemyć komórki 7 ml PBS, dodać 1,5 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 3,5 ml pożywki wzrostowej w celu ponownego zawieszenia komórek i przenieść zawiesinę komórek do 15-centymetrowego naczynia wypełnionego 20 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej biotyną w stężeniu 50 μM w celu stymulacji biotynylacji i doksycykliny w temperaturze 200 ng⋅mL−1 (końcowej stężenia) w celu wywołania ekspresji białek fuzyjnych.
    2. Inkubować komórki przez co najmniej 20 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Pobieranie i przechowywanie komórek
    1. Umyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj 1,5 ml PBS do każdej płytki i zbierz komórki za pomocą skrobaka.
    2. Przenieść pobrane komórki odpowiadające jednemu warunkowi do probówki o pojemności 15 ml i zebrać je przez odwirowanie w temperaturze 1 200 x g, 5 min, 4 °C.
    3. Usunąć supernatanty i zatrzaskowo zamrozić granulki w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze 80 °C do czasu dalszej obróbki.
      UWAGA: Alternatywnie, komórki można również odłączyć przez trypsynizację, zebrać w pożywce wzrostowej, przenieść do probówki o pojemności 15 ml i trzykrotnie przemyć PBS przed zamrożeniem.
  4. Przygotowanie lizatów komórkowych
    1. Ponownie zawiesić osady komórek w 1 ml buforu do lizy (50 mM Tris pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1x kompletny inhibitor proteazy) w temperaturze RT. Przepuść komórki 10-20 razy (od pięciu do dziesięciu uderzeń) przez igłę 25 G.
    2. Sonikować próbki za pomocą urządzenia sonifikacyjnego.
      UWAGA: Za pomocą urządzenia sonifikacyjnego wskazanego w Tabeli Materiałów można zastosować następujący program: cztery cykle o dużej intensywności, 30 s na cykl w zimnej (4 °C) łaźni wodnej. Każde inne urządzenie do sonifikacji jest odpowiednie, ale parametry mogą wymagać odpowiedniego dostosowania.
    3. Dodaj Triton X-100 do odzyskanego sonikowanego lizatu, aby osiągnąć końcowe stężenie 2% (zazwyczaj dodaje się 100 μl 20% Triton X-100 do 900 μl sonikowanego lizatu komórkowego), a następnie 2,3 ml 50 mM Tris, pH = 7,4 na 1 ml lizatu, aby dostosować stężenie NaCl do 150 mM przed związaniem się z kulkami sprzężonymi ze streptawidyną.
      UWAGA KRYTYCZNA: Wyższe stężenia soli często skutkują znacznie mniej efektywnym wiązaniem się z kulkami.
    4. Rozprowadzić dostosowane lizaty w probówkach o pojemności 1,5 ml (ok. 1,1 ml w trzech probówkach) i odwirować je w temperaturze 16 000 x g, 10 min, 4°C.
    5. Przenieść supernatanty (ok. 3,2 ml) do probówki o pojemności 15 ml i zachować 50–100 μl jako materiał WEJŚCIOWY.
    6. Zmierzyć stężenie każdej próbki za pomocą testu Bradforda i użyć równoważnika 3 do 3,5 mg zawartości białka do obniżenia streptawidyny.
  5. Streptawidyna pulldown
    UWAGA: Przegląd procedury rozwijania jest pokazany na stronie Rysunek 4. Jest prawie identyczny z oryginalnym protokołem opublikowanym przez Roux i współpracowników2. Przy pierwszym wykonywaniu pulldownu, próbki przepływu i płukania 1-4 można odłożyć na bok do analizy Western blot, aby upewnić się, że procedura zadziałała prawidłowo (Rysunek 5).
    1. Dla każdego warunku przenieś 200 μl zawiesiny kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż koraliki przykleją się do boku rurek (ok. 1 min) i wyjmij bufor do przechowywania.
    2. Umyj kulki, delikatnie mieszając z 1 ml buforu równoważącego (50 mM Tris pH 7–4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 i 1 mM DTT).
    3. Wyślij zrównoważone kulki w równej ilości w niezbędnej liczbie probówek (zwykle, gdy zaczynasz od 3-3,5 mg zawartości białka, lizaty z każdego stanu można wysłać w dwóch do czterech probówkach o pojemności 1,5 ml) i umieść z powrotem na stojaku magnetycznym.
    4. Usunąć bufor równowagi i ponownie zawiesić każdy zestaw kulek z równymi ilościami odpowiednich lizatów komórkowych z kroku 4.4.7. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na obracającym się kole.
    5. Następnego dnia umieść probówki o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż kulki przykleją się do boku probówek i przenieś supernatanty do probówki o pojemności 15 ml oznaczonej jako Flow Through.
      UWAGA: Od teraz wszystkie czynności wykonywane są w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
    6. Ponownie zawiesić kulki w każdej probówce z 200 μl buforu do przemywania 1 (2% SDS w wodzie) i połączyć każdy zestaw ponownie zawieszonych kulek odpowiadających jednemu warunkowi w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    7. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu myjącego 1.
    8. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu płuczącego 2 (50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 i 0,1% Na-deoksycholanu).
    9. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu płuczącego 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40 i 0,5% Na-deoksycholanu).
    10. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu płuczącego 4 (50 mM Tris pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1% NP-40).
    11. Aby upewnić się, że bufor płuczący został całkowicie usunięty po ostatnim etapie płukania, należy usunąć większość supernatantu, a następnie odwirować próbki. Umieść je z powrotem na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż koraliki przykleją się do boku rurek, a następnie usuń pozostały bufor.
    12. Dodać 30 μl buforu elucyjnego (10 mM Tris pH 7,4, 2% SDS, 5% β-merkaptoetanolu i 2 mM biotyny) do kulek. Inkubować w temperaturze 98 °C przez 15 minut, a następnie natychmiast usunąć kulki na stojaku magnetycznym.
    13. Przenieść eluowaną próbkę do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.
  6. SDS-PAGE i Western blotting
    UWAGA: Przed analizą spektrometrii mas zaleca się ocenę powodzenia biotynylacji i pulldown za pomocą SDS-PAGE i Western blot. Jeśli nie obserwuje się wzorca biotynylacji, można uznać, że do pożywki nie dodano ani doks, ani biotyny lub że jeden z dwóch roztworów podstawowych jest zagrożony.
    1. Dla każdej próbki wejściowej należy przygotować próbkę PAGE, mieszając równe ilości próbki białka z odpowiednią objętością 3 ładujących SDS w sumie 28 μl. Przygotować próbki PAGE, mieszając 5 μl każdej próbki elucyjnej z 2,5 μl buforu ładującego 3x SDS.
    2. Załadować próbki (25 μl/studzienkę dla wejść, 7 μl/studzienkę dla próbek elucyjnych) na żel poliakryloamidowy SDS. Przystąpić do elektroforezy i Western blot, jak opisano w punkcie 3.4.
    3. Jeśli wykonujesz pulldown po raz pierwszy, przygotuj próbki PAGE dla każdego etapu pulldown (wejście, przepływ, mycie 1–4, elucja), mieszając 20 μl każdej próbki (wejście, przepływ, przemycie 1–4) z 10 μl 3x bufora ładującego SDS lub 5 μl (elucja) z 2,5 μl bufora ładującego 3x SDS i postępuj jak w kroku 4.6.4 (Rysunek 5).
  7. SDS-PAGE do analizy MS
    UWAGA: Aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie keratyną, można stosować prefabrykaty żelowe i komercyjny bufor do ładowania próbek.
    1. Dodać 6,25 μl 4-krotnego buforu do 18,75 μl każdej próbki elucyjnej i uruchomić próbki na 4-20% prefabrykowanym żelu SDS, aż przejdą na 2-3 cm do żelu.
    2. Zabarwić żel koloidalnym Coomassie Brilliant Blue G250 staining13 na 15 cm szalce Petriego.
    3. Za pomocą czystego skalpela wyciąć całe pasy dla każdej próbki, z wyłączeniem pasma streptawidyny (działającego z prędkością ok. 17 kDa, Ryc. 6), a następnie przenieść wycięte pasma do probówek o pojemności 1,5 ml.
    4. Wyślij te próbki do ośrodka proteomicznego w celu dalszej analizy.
      UWAGA: Typowe wyniki stwardnienia rozsianego można zobaczyć w pozycji bibliograficznej 9 (rysunek 3 i rysunek 7 oraz tabele uzupełniające). Całość zbiorów danych jest dostępna w repozytorium PRIDE (numer dostępu PXD005005).

Wyniki

Aby zilustrować działanie tej metody, otwarte ramki odczytu (ORF) białek Ago2, TNRC6C oraz Dicer (wszystkie zaangażowane w ścieżkę wyciszania genów zależną od miRNA) sklonowano w plazmidach split-BioID. Znane jest, że Ago2 oddziałuje z TNRC6C w obrębie kompleksu wyciszającego indukowanego przez miRNA (miRISC), który hamuje translację i stymuluje degradację docelowych mRNA14. Przed złożeniem miRISC, Ago2 oddziałuje z Dicerem, enzymem wytwarzającym dojrzałe miRNA, w obrębie kompleksu, w którym może dojść do załadowania miRNA15. W związku z tym metodę split-BioID zastosowano do pary Ago2/Dicer lub pary Ago2/TNRC6C. Dla każdej pary badanych białek, Ago2 połączono fuzją albo z NBirA*, albo z CBirA* przy użyciu naszych plazmidów split-BioID (Rycina 2), a Dicer i TNRC6C z odpowiednim, komplementarnym fragmentem BirA*. Dodatkowo każde białko połączono fuzją z CBirA* i sparowano z fuzją NBirA*-GFP jako kontrolę negatywną. W rezultacie dla każdej pary badanych białek przetestowano cztery warianty (Tabela 1).

Aby sprawdzić, czy split-BioID ulega aktywacji w wyniku oddziaływania badanej pary białek, zastosowano schemat przedstawiony na Rysunku 1. Plasmidy wprowadzono metodą przejściowej transfekcji do linii komórkowej HeLa kompatybilnej z systemem tet. Ekspresję białek fuzyjnych indukowano doksycykliną (dox), a biotinylację stymulowano poprzez dodanie nadmiaru biotyny do pożywki hodowlanej. Po 20 h inkubacji z dox i biotyną komórki poddano lizie, a następnie analizowano za pomocą techniki Western blotting, wykorzystując koniugowaną streptawidynę do wykrywania białek biotinylowanych. W komórkach ssaków w próbce nietransfekowanej koniugowana streptawidyna zazwyczaj wykrywa dwa główne prążki (Rysunek 3, gwiazdki), które odpowiadają endogennie biotinylowanym białkom (najprawdopodobniej karboksylazom mitochondrialnym). Te dwa prążki są obecne we wszystkich próbkach i mogą służyć jako wewnętrzne kontrole ładowania, dzięki czemu wykrywanie białka konstytutywnego w celu kontroli ilości naniesionego białka jest zbędne. Typowo dla eksperymentów BioID/split-BioID, dodatkowe główne prążki, które można zaobserwować, to białka fuzyjne, które uległy samobiotynylacji. Nawet jeśli nie widać żadnego innego biotinylowanego białka, wykrycie biotinylacji białek fuzyjnych na tym etapie już wskazuje, że dwa badane białka weszły w interakcję w komórkach. W eksperymencie przedstawionym na Rysunku 3 widać wyraźnie, że zastosowanie białka fuzyjnego NBirA*-Ago2 w parze z fuzjami CBirA* do TNRC6C lub Dicer jest bardziej efektywne niż przeciwstawne kombinacje, w których CBirA*-Ago2 jest sparowany z fuzjami NBirA* pozostałych dwóch białek (Rysunek 3, górny panel, porównać intensywność ścieżek 2-3 ze ścieżkami 6-7). Ponadto aktywacja była specyficzna, ponieważ żadna z fuzji CBirA* nie była w stanie aktywować kontrolnego białka fuzyjnego NBirA*-GFP do istotnego poziomu (Rysunek 3, porównać ścieżki 1, 4-5 ze ścieżką 8, która odpowiada komórkom nietransfekowanym). Ponieważ w naszych plazmidach NBirA* posiada znacznik myc, a CBirA* znacznik FLAG (Rysunek 2), poziomy ekspresji każdego białka fuzyjnego można analizować za pomocą przeciwciał przeciwko tym dwóm znacznikom (Rysunek 3, dolny panel).

W przypadku zaobserwowania biotynylacji indukowanej interakcją, eksperyment można przeskalować, a biotynilowane białka wyizolować na kuleczkach sprzężonych ze streptawidyną, zgodnie z opisem w punkcie 4 protokołu (Rysunek 4). Podczas pierwszej izolacji wszystkie etapy oczyszczania można analizować za pomocą Western blottingu (Rysunek 5). Zazwyczaj wiązanie do kuleczek powinno być niemal ilościowe, a w przemyciach praktycznie nie powinno być obserwowane żadnych przecieków. Przed przygotowaniem próbek do spektrometrii mas zalecamy wykonanie Western blottingu, aby upewnić się, że indukowana biotynylacja przebiegła zgodnie z oczekiwaniami i że białka fuzyjne zostały wyekspresowane. Brak ekspresji białek fuzyjnych wynika albo z niskiej wydajności transfekcji, albo z wadliwej indukcji doksycykliną. Jeśli białka fuzyjne zostały wyekspresowane, ale nie zaobserwowano biotynylacji, należy sprawdzić, czy do medium faktycznie dodano nadmiar biotyny (50 μM) i czy roztwór zapasowy biotyny jest nadal aktywny. Gdy materiał eluowany jest analizowany na żelu białkowym barwionym Coomassie (Rysunek 6), zazwyczaj najsilniejszy prążek pojawia się na wysokości około 17 kDa i odpowiada monomerycznej streptawidynie. Można również zaobserwować prążki odpowiadające endogennym białkom biotynylowanym oraz białkom fuzyjnym. Zazwyczaj wycinamy obszar ścieżki próbki powyżej prążka streptawidyny aż do dołka startowego (Rysunek 6). Wycięty fragment można przechowywać w probówce 1,5 mL i wysłać do pracowni spektrometrii mas. Alternatywnie, białka związane można poddać trawieniu trypsyną bezpośrednio na kuleczkach sprzężonych ze streptawidyną, a następnie eluować strawione peptydy z kolumny. Do analizy surowych danych MS rutynowo wykorzystujemy oprogramowanie MaxQuant16 (stosując głównie parametry domyślne i dodając biotynylację lizyny jako możliwą modyfikację potranslacyjną; szczegóły oraz typowe wyniki MS znajdują się w referencji 9) oraz zestaw narzędzi Perseus17 do późniejszej analizy statystycznej; oba programy są darmowe. Próbki są zazwyczaj analizowane w trzech powtórzeniach biologicznych. Dzięki zastosowaniu kwantyfikacji bezznacznika (label-free quantification) można zidentyfikować białka specyficznie wzbogacone w stosunku do warunków kontrolnych. Aby odsiać endogennie biotynylowane białka oraz białka niespecyficznie znakowane przez enzym BirA*, bierzemy pod uwagę tylko te białka, które są znacząco wzbogacone w porównaniu do wyników z sześciu zbiorów danych wygenerowanych z sześcioma niepowiązanymi białkami. Dodatkowo uwzględniamy tylko te wyniki, które są wzbogacone w porównaniu do zbioru danych split-BioID, w którym białka fuzyjne NBirA* zastąpiono NBirA*-GFP. Zaproponowano inne strategie analizy danych, w szczególności zastosowanie znakowania stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowlach komórkowych (SILAC) dla proteomiki ilościowej18. Ponadto opisano różne strategie bezpośredniej izolacji biotynilowanych peptydów przy użyciu wariantu streptawidyny o obniżonym powinowactwie do biotyny18, specjalnych warunków elucji z użyciem rozpuszczalników organicznych19 lub przeciwciał specyficznych dla biotyny20,21. Choć niekoniecznie prowadzi to do odkrycia większej liczby białek, identyfikacja miejsc biotynylacji zwiększa pewność co do specyficzności wyników i jest przydatna przy określaniu topologii interakcji.

Schemat przepływu pracy proteomicznej przedstawiający analizę proteomiczną Kompleksu A za pomocą split-BioID i analizy MS.
Rycina 1: Przegląd procedury split-BioID. Białko 1 oddziałuje z białkiem 2 jako część Kompleksu A lub z białkiem 3 jako część Kompleksu B. Aby specyficznie zbadać skład Kompleksu A, metodę split-BioID można zastosować do białek 1 i 2. Fotografia spektrometru mas znajduje się na licencji Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported i została pobrana ze strony https://commons.wikimedia.org pod nazwą pliku ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mapy plazmidów do edycji genów: sekwencje NBirA, FKBP, CBirA, FRB na schemacie wektora z miejscami restrykcyjnymi.
Rycina 2: Kasety ekspresyjne plazmidów split-BioID. Udostępniamy cztery plazmidy, aby umożliwić przetestowanie wszystkich kombinacji białek fuzyjnych NBirA* i CBirA*. Plazmidy oraz pełne mapy są dostępne na stronie addgene.org pod wskazanymi numerami. Plazmidy posiadają element odpowiedzi na tetracyklinę (7x tetO) i muszą być stosowane w linii komórkowej kompatybilnej z systemem ekspresji tet. Należy również zauważyć, że we wszystkich plazmidach ORF dla FKBP i FRB są odpowiednio połączone z fragmentami NBirA* i CBirA*. Te dwa białka oddziałują ze sobą tylko w obecności rapamycyny, zatem plazmidy te można wykorzystać do szybkiego przetestowania systemu w obecności lub braku tego związku chemicznego9. Wskazane miejsca restrykcyjne są unikalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza oddziaływań białkowych przy użyciu SDS-PAGE; prążki oznaczone jako Dicer, TNRC6C, Ago2; detekcja streptawidyną.
Rycina 3: Typowy Western blot dla eksperymentu split-BioID. Panel górny: detekcja biotynylowanych białek za pomocą znakowanej fluorescencyjnie streptawidyny. Panel dolny: detekcja białek fuzyjnych z użyciem przeciwciał anty-Myc i anty-FLAG. Przebadano dwie pary białek: Ago2/TNRC6C oraz Ago2/Dicer. W ścieżkach 2 i 3 Ago2 zostało dołączone do fragmentu CBirA*. W ścieżkach 6 i 7 Ago2 zostało dołączone do fragmentu NBirA*. Nie zaobserwowano istotnego sygnału, gdy którakolwiek z trzech białek została połączona z NBirA*-GFP (ścieżki 1, 4-5). Gwiazdki wskazują prążki odpowiadające endogennie biotynylowanym białkom, które mogą służyć jako wewnętrzne kontrole załadunku. Rycina ta jest opracowaniem Ryciny 5B z pracy Schopp et al.9 na podstawie licencji Creative Commons Attribution 4.0 International. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat oczyszczania biotyny: zbieranie komórek, lizowanie, wiązanie do kulek magnetycznych, płukanie, analiza SDS-PAGE.
Rycina 4: Przegląd procedury immunoprecypitacji ze streptawidyną (pulldown). Przedstawiono główne etapy izolacji białek biotynylowanych do analizy spektrometrią mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza Western blot z użyciem koniugatu streptawidyny, oczyszczanie białek, wyniki elektroforezy.
Rycina 5: Typowy Western blot dla eksperymentu streptawidynowego pulldown. Na żel SDS-poliakrylamidowy naniesiono równe objętości każdej z wskazanych próbek. Po przeprowadzeniu Western blottingu białka biotynilowane wykryto za pomocą streptawidyny sprzężonej z HRP. Wskazano prążki odpowiadające NBirA*-TNRC6C oraz CBirA*-Ago2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat elektroforezy żelowej SDS-PAGE; rozdzielanie białek; Split-BioID, NBirA*-TNRC6C, biotyna-streptawidyna.
Rysunek 6: Typowy żel białkowy barwiony Coomassie do analizy spektrometrią mas.** Próbka elowana z kulek sprzężonych ze streptawidyną została naniesiona na gotowy żel białkowy i poddana elektroforezie do momentu, aż próbka przemieściła się o 2-3 cm. Główny prążek widoczny przy około 17 kDa to streptawidyna. Obszar bezpośrednio nad tym prążkiem zostaje wycięty i przesłany do laboratorium spektrometrii mas. Wskazano prążki odpowiadające NBirA*-TNRC6C oraz CBirA*-Ago2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Próbka do transfekcjiBadany warunek
1NBirA*-białko1/CBirA*-białko2
2CBirA*-białko1/NBirA*-białko2
3NBirA*-GFP/CBirA*-białko1
4NBirA*-GFP/CBirA*-białko2
5brak transfekcji

Tabela 1: Typowe warunki testowane podczas stosowania metody split-BioID dla dwóch białek.

Starter do sekwencjonowaniasekwencja
Starter odwrotny do kasety 1 (fuzja CBirA*)TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
Starter odwrotny do kasety 2 (fuzja NBirA*)GTGGTTTGTCCAAACTCATC

Tabela 2: Primery sekwencyjne dla plazmidów split-BioID.

Dyskusja

Przedstawiona procedura opisuje, w jaki sposób klonować interesujące geny do plazmidów z rozszczepionym BioID, jak testować biotynylację indukowaną interakcją oraz jak izolować biotynylowane białka do analizy spektrometrii mas. Opisujemy tutaj procedurę opartą na transfekcji przejściowej. Podczas gdy ekspresję białek fuzyjnych można dostroić za pomocą ilości dox dodanego do pożywki, transfekcja przejściowa może prowadzić do niejednorodnej ekspresji białek z niektórymi komórkami, które rażąco nadekspresjonują białka fuzyjne w porównaniu z endogennymi odpowiednikami. Może to prowadzić do zniekształceń odpowiednich interaktomów i IPP, które nie odzwierciedlają wiernie oddziaływań obejmujących białka endogenne. W związku z tym ogólnie zaleca się konstruowanie stabilnych linii komórkowych po ustaleniu rozszczepienia BioID z układem przejściowym. Plazmidy są kompatybilne z systemem rekombinacji za pośrednictwem Flp i umieszczają oba interesujące geny pod regulacją tego samego elementu reagującego na tet. W razie potrzeby i w połączeniu z kompatybilnymi komórkami ssaków umożliwiają łatwe tworzenie stabilnych indukowalnych linii komórkowych. Na przykład używamy linii HeLa-EM2-11, która wyraża aktywator transkrypcji aktywowany tetracykliną rtTA i unikalny, celowalny locus genomowy, z którego ekspresja genów za pośrednictwem tetracykliny może być ściśle regulowana12. Korzystając z tej linii komórkowej i rekombinacji za pośrednictwem Flp, stabilne linie komórkowe, które zawierają tylko jedną kopię transgenu, można uzyskać w ciągu dwóch-trzech tygodni. Alternatywnie, można również wykorzystać obecne techniki edycji genomu do wprowadzenia fragmentów BirA* do natywnych loci genomowych genów będących przedmiotem zainteresowania.

Podobnie jak w każdym teście, który opiera się na znakowaniu białka, należy rozważyć, czy powstałe białka fuzyjne są funkcjonalne. Dostępne dane, w których białka będące przedmiotem zainteresowania zostały znakowane (na przykład za pomocą GFP w badaniach obrazowych) i przetestowane funkcjonalnie, są przydatne do podjęcia decyzji, czy fragmenty BirA* powinny być klonowane przed czy za genami będącymi przedmiotem zainteresowania. Jeśli takie dane nie są dostępne, należy przetestować białka znakowane N-końcowo lub C-końcowo w teście funkcjonalnym. Na przykład, aktywność białek fuzyjnych może być testowana w linii komórkowej, w której endogenne białko zostało znokautowane i porównana z sytuacją typu dzikiego. Jeśli interesujące białka tolerują zarówno znaczniki N-, jak i C-końcowe, należy je przetestować. Rzeczywiście, w eksperymentach BioID orientacja białka fuzyjnego może wpływać na skuteczność znakowania22. Ponadto zaobserwowaliśmy, że podczas stosowania split-BioID do pary białek, które z dwóch białek jest dołączone do fragmentu NBirA* lub CBirA*, również wpływa na skuteczność znakowania9. W plazmidach z podziałem BioID, 16 długich aminokwasów bogatych w glicynę / serynę łączników sprzężających interesujące białka z fragmentami BirA* zostało pobranych z innego PCA23 i działało dla nas dla wszystkich oddziałujących białek, które testowaliśmy do tej pory. Należy jednak wziąć pod uwagę, że niektóre pary białek mogą działać lepiej z krótszymi lub dłuższymi łącznikami. Na koniec warto wspomnieć, że inny test został opisany przez grupęBollena 24. W tym teście BirA* jest rozszczepiony w innym miejscu (E140/Q141) niż nasze (E256/G257). Przetestowaliśmy oba smaki rozszczepionego BioID obok siebie i stwierdziliśmy, że E256/G257, opisany w tym protokole, prowadzi do silniejszej reaktywacji po sprzężeniu z dwoma oddziałującymi białkami9.

Jedną z ogólnych wad tej metody jest niska szybkość etykietowania. Zazwyczaj czas inkubacji z biotyną wynosi od 6 do 24 godzin, aby uzyskać znaczną biotynylację6, co wyklucza zastosowanie tej techniki do badania dynamicznej przebudowy kompleksów białkowych. Chociaż ten test częściowo rozwiązuje to zastrzeżenie, ponieważ jest aktywowany tylko wtedy, gdy dwa białka wchodzą w interakcję, powolna prędkość znakowania wyklucza jego użycie do badania odpowiedzi na bardzo dynamiczne procesy lub do analizy krótkotrwałych białek. Zmodyfikowana peroksydaza APEX2 jest znana z tego, że wspomaga skuteczne znakowanie białek proksymalnych w ciągu 1 minuty3 . PCA oparte na APEX2 może zatem rozwiązać problemy związane z powolnym tempem znakowania testów pochodzących z BioID. W badaniu potwierdzającym zasadę opisano taki test split-APEX225. Jednakże, mimo że białko homodimeryzujące udało się poddać biotynylacji, nie wiadomo jeszcze, czy test można również wykorzystać do znakowania i identyfikacji białek, które gromadzą się wokół pary oddziałujących białek. Całkiem niedawno, ukierunkowana ewolucja została wykorzystana do stworzenia TurboID i miniTurbo, dwóch wariantów BirA* o zwiększonej aktywności, które pozwalają na znacznie krótsze okna czasowe etykietowania, do 10 minut26. Dostosowanie split-BioID do tych nowych wariantów jeszcze bardziej rozszerzy zastosowanie tej techniki na szerszy zakres zastosowań.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) poprzez niemiecką inicjatywę doskonałości (CellNetworks DFG-EXC 81) oraz częściowe finansowanie przez wspólne centrum badawcze SFB638.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy (lodowaty)VWR20104.298Aby zrobić bufor TAE
AgarozaSigmaA9539Weź żele agarozowe TAE do analizy DNA i ekstrakcji
Roztwór amoniaku 25% NH3Bernd Kraft6012Aby rozpuścić biotynę
AmpicylinaSigmaA9518Aby wybrać przekształcone bakterie
Bioruptor plus urządzenie do sonifikacjiDiagenodeB01020001Inne urządzenia do sonifikacji są również w porządku
BiotynaSigmaB4639Do dodania do podłoża wzrostowego w celu stymulacji wydajnej biotynylacji
Frakcja albuminy surowicy bydlęcej VCarl Roth8076Stosowany w Western blot i wzorzec białka w testach Bradford
Ultra odczynnik BradfordExpedeonBFU05LKażda inna metoda/zestaw do oznaczania białek jest w porządku, ten konkretny odczynnik jest bardziej tolerancyjny na detergent niż inne odczynniki Bradford
Skrobaki do komórekTPP99002Każdy inny model jest również w porządku
ClaINew England BiolabsR0197Enzym restrykcyjny do klonowania do plazmidów z podziałem BioID (fuzja NBirA*)
Pożywka DMEMSigmaD6046Jeśli używasz innej linii komórkowej, użyj odpowiedniego optymalnego zestawu
minipreppingu DNASigmaPLN350Każdy inny zestaw jest również w porządku
DoksycyklinaApplichemA2951Dox jest światłoczuły
Aplikacja DTTA2948Przygotuj 1M roztwór podstawowy, przechowuj w temperaturze -20 stopni; C i zawsze używaj świeżej
streptawidyny sprzężonej z DyLight 680Thermo scientific21848do użytku z urządzeniem do skanowania LiCor Western blot
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65002Kulki C1 nie są pokryte BSA, co jest preferowane do dalszych zastosowań MS (brak wycieku BSA w końcowej elucji)
EDTAApplichemA5097Zrób zapas 500 mM, dostosuj pH do 8, rozpuszczając proszek EDTA
EtanolSigma32205Przygotować 70% roztwór podstawowy, w którym Doksycyklina może być rozpuszczona w 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR Zestaw do ekstrakcji DNANipponGenetics FG-91302Każdy inny zestaw jest również w porządku
HCl 37%Merck1.00317.1000Aby dostosować pH roztworu podstawowego biotyny
HEPESCarl Roth6763Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 500 mM, dostosować pH do 7,4
Membrana PVDF Immobilon-FL, 0,45  &mikro; mMilliporeIPFL00010Ta membrana wykazuje minimalną autofluorescencję, gdy jest używana z urządzeniem do skanowania LiCor Western blot
LiClGrü ssing GmbH12083Zrób roztwór podstawowy 5M
System obrazowania Odyssey CLxLI-CORN/AAby zeskanować błonę Western blot ozdobioną przeciwciałem znakowanym fluoroforem
Liniowa polietyleninomina (PEI)Polysciences23966-2Każdy inny odczynnik do transfekcji jest również w porządku
Mleko w proszkuCarl RothT145Do blokowania błon Western blot
MluI-HFNew England BiolabsR3198Enzym restrykcyjny do klonowania do plazmidów podzielonych BioID (fuzja NBirA*)
Na-deoksycholanSigma30970Wykonaj 10% (w/v) roztwór podstawowy
NaClSigma31434Przygotuj roztwór podstawowy 5M
NP-40 (substytut Nonidet P40)Sigma74385Przygotuj 20% (v/v) roztwór podstawowy
PacINew England BiolabsR0547Enzym restrykcyjny do klonowania plazmidów rozszczepionych BioID (fuzja CBirA*)
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)Sigma806552Do mycia komórek przed złomowaniem
PmeINew England BiolabsR0560Enzym restrykcyjny do klonowania do plazmidów podzielonych BioID (fuzja CBirA*)
Koktajl inhibitorów proteazyRoche4693132001Dodawany do buforu do lizy w celu zapobiegania białku degradacja
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBPAddgene90003Plazmid Split-BioID, pośredniczy w koekspresji NBirA*-FKBP i CBirA*-FRB, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-NbirAddgene90004Split-BioID plazmid, pośredniczy w koekspresji FKBP-NBirA* i CBirA*-FRB, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami
pSF3-Flag-FRB-Cbir_ Myc-NBir-FKBPAddgene90008Plazmid Split-BioID, pośredniczy w koekspresji NBirA*-FKBP i FRB-CBirA*, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-NbirAddgene90009Split-BioID, pośredniczy w koekspresji FKBP-NBirA* i FRB-CBirA*, FKBP i FRB można zastąpić dwoma innymi ORFami
Zestaw Q5 High-Fidelity PCRNew England BiolabsE0555SWzmocnienie kodowania ORF dla białek, które mają być badane. Każda inna termostabilna polimeraza DNA jest w porządku.
Zestaw do szybkiej ligacjiNew England BiolabsM2200SAby podwiązać fragmenty DNA do plazmidów podzielonego BioID, każdy inny system ligacji DNA jest w porządku.
Żele prefabrykowane RunBlue 4-20% SDSExpedeonBCG42012Do użycia podczas uruchamiania próbek do analizy MS
Bufor do próbek RunBlue LDSExpedeonNXB31010Bufor do prefabrykatów żelowych RunBlue
SDSSigma5030Występuje w postaci 20% roztworu podstawowego
Surowicy wolnej od tetBiowestS181TUżywamy surowicy wolnej od tet, aby zminimalizować podstawową ekspresję białek fuzyjnych
System Trans-Blot Turbo TransferBio-Rad1704150Szybki zachodni system transferu blottingu, każdy inny system transferowy jest również w porządku
TrisCarl Roth4855Przygotuj 1M roztwory podstawowe o odpowiednim pH (7,4 i 8)
Triton X-100ApplichemA4975Przygotuj 20% (v/v) roztwór podstawowy
Tween-20Carl Roth9127Stosowany w Western blot, Tween 20 prowadzi do wysokiej fluorescencji tła i powinien być pominięty na etapie blokowania i ostatniego mycia
do

Bibliografia

  1. Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge. Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).
  2. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  3. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  4. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).
  6. Kim, D. I., et al. An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling. Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).
  7. Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes. J Proteomics. 118, 81-94 (2015).
  8. Morriswood, B., et al. Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation. Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).
  9. Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, (2017).
  10. Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells. EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).
  11. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  12. Weidenfeld, I., et al. Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci. Nucleic Acids Res. 37 (7), e50(2009).
  13. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
  14. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).
  15. MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).
  16. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  18. Opitz, N., et al. Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast. Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).
  19. Mackmull, M. T., et al. Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity. Mol Syst Biol. 13 (12), 962(2017).
  20. Kim, D. I., et al. BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation. J Proteome Res. , (2017).
  21. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  22. Chapat, C., et al. Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs. P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).
  23. Luker, K. E., et al. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  24. De Munter, S., et al. Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions. FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).
  25. Xue, M., et al. Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells. Sci Rep. 7 (1), 12039(2017).
  26. Branon, T. C., et al. Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms. bioRxiv. , (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

komplementacja fragment w bia ekbiotinylacja zale na od blisko ciwyci ganie streptawidynanaliza spektrometri maswalidacja metod Western blotfuzja z enzymem BirAwarunki wolne od keratynyoprogramowanie MaxQuant Perseus

Powiązane artykuły