Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Ponieważ większość funkcji komórkowych jest wykonywana przez białka, które dynamicznie łączą kompleksy makromolekularne, identyfikacja interakcji białko-białko (PPI) jest głównym przedsięwzięciem w badaniach biomedycznych. Rzeczywiście, IPP są często rozregulowane w chorobie i stanowią potencjalne cele terapeutyczne¹. Najpowszechniej stosowaną metodą identyfikacji IPP jest metoda oczyszczania powinowactwa (AP), w której po lizie komórek białko będące przedmiotem zainteresowania jest specyficznie oczyszczane na matrycy, a powiązane białka są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas (MS). Chociaż AP-MS jest potężnym podejściem, zazwyczaj nie działa dobrze w przypadku słabo rozpuszczalnych kompleksów białkowych, bardzo przejściowych interakcji lub IPP, które wymagają nienaruszonej struktury subkomórkowej. Co więcej, interpretacja danych może być skomplikowana ze względu na dynamiczną naturę sieci PPI, ponieważ pojedyncze białko jest często częścią kilku odrębnych kompleksów białkowych.

Techniki oznaczania bliskości, takie jak BioID² lub APEX2^3,4 zostały niedawno opracowane w celu rozwiązania niektórych ograniczeń podejść AP-MS. W BioID enzym BirA* (odpowiadający wariantowi G115R dzikiego enzymu E. coli) katalizuje tworzenie labilnego biotynyl-AMP (bio-AMP), który może reagować z aminami pierwszorzędowymi. W przeciwieństwie do enzymu typu dzikiego, który zatrzymuje bio-AMP w swoim aktywnym centrum, BirA* uwalnia bio-AMP, umożliwiając jego dyfuzję do sąsiedniego środowiska. W związku z tym, po fuzji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i ekspresji w komórkach, białka proksymalne mogą być biotynylowane w szacowanym zakresie 10 nm⁵. Te oznaczone białka proksymalne są następnie izolowane przez ściąganie streptawidyny i identyfikowane przez stwardnienie rozsiane. W przeciwieństwie do AP-MS, BioID wymaga ekspresji białka fuzyjnego. W związku z tym można go stosować tylko do białek, których funkcja nie jest zakłócona przez znakowanie. Co więcej, szybkość etykietowania jest niska, zwykle 6–24 h^2,6, co sprawia, że wykrywanie krótkożyciowych białek jest trudne. Jednak w porównaniu z AP-MS, BioID-MS oferuje kilka kluczowych zalet: po pierwsze, wychwytuje interakcje w ich natywnym środowisku komórkowym; po drugie, znakowane białka, a nie złożone kompleksy, są izolowane po lizie komórek; Po trzecie, ściąganie streptawidyny pozwala na stosowanie denaturujących i trudnych warunków mycia. W związku z tym metoda jest bardziej czuła na wykrywanie przejściowych lub słabych interakcji⁷ lub interakcji zachodzących na określonej i trudnej do wyizolowania strukturze subkomórkowej⁸.

Jednak większość białek jest zazwyczaj częścią większych kompleksów, które mogą się przebudować zgodnie ze wskazówkami komórkowymi lub funkcją, która musi być wykonana. W związku z tym pojedyncze białko jest zazwyczaj częścią kilku kompleksów, odpowiadających odrębnym jednostkom funkcjonalnym, obejmującym różne i/lub nakładające się na siebie PPI. Oba podejścia dają przegląd wszystkich powiązań, jakie może mieć dane białko, ale nie odnoszą się do kontekstu poszczególnych IPP. Aby zwiększyć rozdzielczość tego ostatniego, zaprojektowaliśmy test komplementacji fragmentów białka (PCA), w którym dwa nieaktywne fragmenty BirA* (NBirA*, który zawiera domenę katalityczną, i CBirA*, który może być postrzegany jako domena reaktywacji) mogą ponownie złożyć się w aktywny enzym, gdy zostaną zbliżone do dwóch oddziałujących białek⁹. Uzyskany w ten sposób test split-BioID koncentruje biotynylację zależną od bliskości na białkach, które gromadzą się wokół pary oddziałujących białek, a tym samym umożliwia identyfikację zależnych od kontekstu zespołów białek. Niedawno zademonstrowaliśmy wyjątkową moc rozdzielczą split-BioID poprzez rozdzielenie dwóch odrębnych kompleksów białkowych zaangażowanych w szlak wyciszania genów za pośrednictwem miRNA⁹.

Łącznie, w jednym i prostym teście, split-BioID pozwala na odkrycie i specyficzne przypisanie PPI do zdefiniowanych jednostek funkcjonalnych, w których dane białko jest zaangażowane, pod warunkiem, że znane jest dodatkowe białko oddziałujące z odpowiedniego kompleksu białkowego.

UWAGA: Przegląd metody jest pokazany na stronie Rysunek 1.

1. Planowanie strategii klonowania

1. Wybrać dwa przypuszczalnie oddziałujące białka do testu.
   UWAGA: Każde z dwóch białek zostanie połączone z jednym fragmentem rozszczepionego BioID: NBirA* lub CBirA*. Jako kontrola negatywna, białka fuzyjne CBirA* zostaną przetestowane z NBirA* połączonym z białkiem zielonej fluorescencji (NBirA*-GFP). Jako dodatkową kontrolę, fuzje NBirA* mogą być testowane samodzielnie, bez pokrewnej fuzji CBirA* lub w połączeniu z CBirA* połączonym z niepowiązanym białkiem. Zaleca się, aby nie używać CBirA*-GFP jako kontroli negatywnej, ponieważ wykazano, że konsekwentnie prowadzi on do głównego tła w połączeniu z dowolnym białkiem fuzyjnym NBirA*⁹. Przyczyną tej obserwacji może być poziom ekspresji CBirA*-GFP, znacznie wyższy niż w przypadku jakichkolwiek innych białek fuzyjnych CBirA*, które do tej pory używaliśmy, co może prowadzić do znaczącej reasocjacji z fragmentem NBirA*.
2. Po wybraniu dwóch białek należy zapoznać się z literaturą, aby dowiedzieć się, czy oba zostały już pomyślnie oznaczone w badaniach funkcjonalnych (na przykład jako białko fuzyjne znakowane GFP).
   1. Jeśli takie badania istnieją, zwróć uwagę na położenie znacznika (na końcu N lub C) i użyj tej samej orientacji do oznaczenia interesujących białek za pomocą podzielonych fragmentów BioID.
   2. Jeśli takie badanie nie istnieje, należy zaplanować konstrukty kodujące dla obu białek znakowanych na końcu N i C oraz zaplanować test w celu przetestowania funkcjonalności białek fuzyjnych (na przykład eksperyment ratunkowy w linii komórkowej zubożonej na białko WT).
      UWAGA: Podczas parowania dwóch białek fuzyjnych za pomocą plazmidów opisanych w Rysunek 2, które kodują długie, elastyczne łączniki, orientacja białek fuzyjnych (fragmenty BirA* połączone przed lub za białkami będącymi przedmiotem zainteresowania) na ogół nie ma znaczenia. Rzeczywiście, używając FRB i FKBP jako białek modelowych, wykazano, że wszystkie cztery możliwe iteracje (obie fragmenty na końcach N, oba na końcach C, jeden na końcu N, a drugi na końcu C i odwrotnie) dają porównywalną biotynylację⁹.
3. Zaprojektuj startery do amplifikacji ORF dwóch białek będących przedmiotem zainteresowania do klonowania do rozszczepionych plazmidów BioID. Zwróć uwagę, że ramki translacji są takie same jak fragmenty BirA*. W przypadku użycia plazmidów opisanych w Rysunek 2, użyj enzymów restrykcyjnych PmeI i PacI do budowy fuzji CBirA* oraz enzymów ClaI i MluI do fuzji NBirA*.
   UWAGA: Plazmidy przedstawione w Rysunek 2 przenoszą dwukierunkowy element reagujący na tet, otoczony miejscami rekombinacji F3 / FRT. Pozwala to na regulację koekspresji na mniej więcej tym samym poziomie obu białek fuzyjnych z tego samego plazmidu¹⁰ oraz możliwość szybkiej budowy stabilnych linii komórkowych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinacji (RMCE). W tych plazmidach NBirA* ma znacznik myc, podczas gdy CBirA* ma znacznik FLAG. ORF można oczywiście również klonować na pojedynczych plazmidach z konstytutywnymi promotorami.
   KROK KRYTYCZNY: Podczas badania dwóch białek oddziałujących ze sobą zaleca się porównanie NBirA* skondensowanego z białkiem 1 w połączeniu z CBirA* skondensowanego z białkiem 2 oraz NBirA* połączonego z białkiem 2 w połączeniu z CBirA* połączonego z białkiem 1. Rzeczywiście, często obserwuje się, że jedna iteracja działa lepiej niż druga.

2. Klonowanie ORF interesujących genów do plazmidu Split-BioID

UWAGA: W tym przykładzie brane są pod uwagę dwa białka, które mogą być oznaczone na N-końcu. Przetestowane zostaną cztery warunki i porównane z komórkami nietransfekowanymi (Tabela 1).

1. Użyj reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby amplifikować ORF dwóch białek, które mają być testowane za pomocą odpowiednich starterów. Zaprojektuj startery, które wprowadzają miejsca restrykcyjne ClaI i MluI dla białek fuzyjnych NBirA* oraz miejsca PacI i PmeI dla białek fuzyjnych CBirA*.
   UWAGA: PCR można wykonać z dowolną komercyjną, preferencyjnie korektorą, polimerazą DNA. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem z podręcznika i dostosuj go do temperatury topnienia starterów i długości ORF, który ma być wzmocniony, zgodnie z wytycznymi producenta.
2. Subklonowanie pierwszego ORF
   1. Trawić zarówno plazmid (około 2 μg), jak i ORF1 amplifikowany PCR (do fuzji z NBirA*) za pomocą ClaI i MluI. Przeprowadzać reakcje trawienia przy użyciu 1 μl każdego enzymu, zmieszanego z odpowiednią objętością DNA i buforem reakcyjnym w całkowitej objętości 20 μl w probówce o pojemności 1,5 ml przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Obie próbki trawienia należy umieścić na 1% żelu DNA agarozo-TAE. Za pomocą czystego skalpela należy wyciąć prążki odpowiadające strawionemu plazmidowi i ORF1 i przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml.
   3. Oczyść oba prążki za pomocą standardowego zestawu do ekstrakcji DNA.
   4. Zwiąż strawiony plazmid i ORF1 przy użyciu standardowych odczynników.
      1. W przypadku korzystania z zestawu do ligacji wskazanego w Tabeli Materiałów, należy podwiązać 100 ng DNA zawierającego od trzech do pięciu nadmiaru molowego wstawić na plazmid w całkowitej objętości 4,5 μL. Dodać 5 μL 2x buforu ligazy T4 i 0,5 μl ligazy DNA T4 z zestawu do ligacji. Przeprowadzić reakcję ligacji w probówce o pojemności 1,5 ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
   5. Przekształć się w standardowe komórki DH-5α E. coli (przygotowane zgodnie z metodą Inoue¹¹).
      1. Zmieszać 3 μl reakcji ligacji z 50 μl kompetentnych komórek w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie i inkubować przez 30 min. Przenieść komórki do bloku grzewczego ustawionego na 42 °C przez 30-45 s, a następnie inkubować z powrotem na lodzie przez 2 minuty. Dodać 250 μl wstępnie podgrzanego (37 °C) bulionu lizogennego (LB) i rozlać 100 μl komórek na wstępnie podgrzane ( 37 °C) płytka z agarem LB zawierająca ampicylinę. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C.
   6. Następnego dnia wybierz od czterech do sześciu kolonii i inkubuj je w temperaturze 37 °C, 180 obr./min, przez noc w 3 ml pożywki LB zawierającej 100 μg⋅^mL-1 ampicyliny w probówce o pojemności 15 ml.
   7. Wyizoluj plazmidy z pobranych kolonii za pomocą standardowego zestawu DNA MiniPrep.
   8. Sprawdź poprawność plazmidów za pomocą sekwencjonowania Sangera przy użyciu startera odwróconego Cassette 2 (Tabela 2).
3. Po zidentyfikowaniu plazmidu zawierającego pierwszy ORF, należy dokonać subklonacji drugiego ORF w tym plazmidzie, wykonując te same czynności, co w kroku 2.2, ale przy użyciu enzymów PmeI i PacI.
4. Sekwencjonuj powstałe plazmidy za pomocą startera odwrotnego kasety 1 (Tabela 2).

3. Testowanie białek fuzyjnych

UWAGA: Poniższe instrukcje dotyczą plazmidów o podwójnej ekspresji indukowanej (Rysunek 2) i komórek HeLa-11ht, subklonalnej linii komórkowej HeLa-CCL2, stabilnie wyrażającej aktywator transkrypcji kontrolowany przez odwrotną tetracyklinę rtTA-M2 i zawierającej locus dla RMCE¹². Pożywką dla wzrostu tych komórek jest zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierająca 10% wolnej od tetracyklin płodowej surowicy bydlęcej (FBS). W przypadku stosowania innego typu komórek konieczne będzie dostosowanie dokładnych warunków wysiewu i podłoża wzrostowego.

1. Transfekcja przejściowa
   1. Komórki nasienne w stężeniu 1 x 10⁵ komórek w 2 ml na studzienkę sześciodołkowej płytki dzień przed transfekcją i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli komórkowych.
   2. W dniu transfekcji usunąć pożywkę z każdej studzienki i zastąpić ją 2 ml świeżego podłoża.
   3. Przygotować cztery reakcje transfekcji zgodnie z tabelą 1. Do każdej studzienki do transfekcji dodać 6 μg polietyleniny do 3 μg plazmidowego DNA w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml i napełnić do 500 μl pożywką DMEM bez surowicy.
   4. Inkubować każdą mieszankę transfekcyjną przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej przed dodaniem kroplami do każdej studzienki. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Indukcja i znakowanie zbliżeniowe
   1. Dzień po transfekcji usunąć pożywkę i zastąpić pożywką uzupełnioną biotyną w stężeniu 50 μM w celu stymulacji biotynylacji i doksycykliny w stężeniu 200 ng⋅mL⁻¹ w celu indukcji ekspresji białek fuzyjnych. Inkubować komórki przez co najmniej 20 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
      1. Aby sporządzić roztwór podstawowy biotyny, należy rozpuścić biotynę w 50 mg⋅^mL-1 (odpowiada ok. 200 mM) w 2 M wodorotlenku amonu. Po całkowitym rozpuszczeniu rozcieńczyć go do 50 mM w 500 mM Hepes, pH 7,4, a następnie dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl. Podwielokrotność i przechowywać otrzymany 1000x roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C. Rozpuścić doksycyklinę w 10 mg⋅^mL-1 w 70% etanolu i przechowywać w mikroprobówce z zakrętką w temperaturze -20 °C w ciemności.
3. Przygotowanie lizatu komórkowego
   1. Umyj komórki raz 1 ml zimnego (4 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   2. Do każdej studzienki dodaj 100 μl buforu do lizy (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT i inhibitory proteazy).
   3. Zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś do probówek o pojemności 1,5 ml.
   4. Odwirować próbki o masie 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek.
   5. Przenieść supernatanty do świeżych probówek i umieścić na lodzie.
   6. Określ ilości białka za pomocą testu Bradforda.
4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE) i Western blot
   1. Przygotuj żel poliakryloamidowy SDS.
   2. Dla każdego oczyszczonego lizatu należy przygotować próbkę PAGE zawierającą 30 μg (minimum 15 μg) białka w sumie 30 μl buforu ładującego SDS. Następnie załadować równe ilości każdej próbki (20 μl/studzienkę) do żelu poliakrylamidowego SDS i przystąpić do elektroforezy.
   3. Po elektroforezie przenieś frakcjonowane białka do błony kleksowej PVDF o niskiej fluorescencji przy użyciu dowolnego standardowego protokołu.
      UWAGA: Do analizy biotynylacji białek zwykle dobrze sprawdza się 10-minutowy czas transferu z programem "high MW" półsuchego urządzenia do blottingu Western blotting z szybkim transferem.
   4. Po przeniesieniu zablokować membranę w 5% suchym mleku w PBS na 30 min w temperaturze pokojowej.
   5. Inkubować błonę przez 30–60 minut w temperaturze pokojowej z fluorescencyjnym koniugatem streptawidyny rozcieńczonym w stosunku 1:15 000 w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% Tween-20.
   6. Przemyć membranę trzy razy, każdy przez 10 minut, PBS zawierającym 0,1% Tween-20, a następnie ponownie PBS.
   7. Zeskanuj membranę za pomocą skanera fluorescencyjnego.
      UWAGA:Typowy Western blot jest pokazany na Rysunek 3. Powyższa procedura opisuje detekcję opartą na fluorescencji, ale detekcja oparta na luminescencji przy użyciu streptawidyny sprzężonej z HRP działa równie dobrze.

4. Split-BioID do badań proteomicznych

KRYTYCZNA UWAGA: Dla końcowej analizy spektrometrii mas, wszystkie poniższe kroki muszą być wykonane w warunkach wolnych od keratyny, wszystkie materiały i odczynniki powinny być jak najbardziej wolne od keratyny.

1. Transfekcja przejściowa
   1. Dzień przed transfekcją wysiać trzy do czterech 10 cm płytek dla każdego stanu w stężeniu 8 x 10⁵ komórek w 10 ml na płytkę i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli komórkowych.
   2. Następnego dnia przygotuj główną mieszankę transfekcyjną dla każdego warunku transfekcji: dla trzech płytek na warunek, 36 μg polietyleniminy i 18 μg plazmidowego DNA rozpuszczonych w 900 μl DMEM bez surowicy. Inkubować każdą mieszankę wzorcową przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. W międzyczasie zastąp podłoże z każdej potrawy świeżym podłożem, a następnie dodaj kroplami 300 μl mieszanek do transfekcji do każdej płytki.
   4. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
2. Indukcja i znakowanie zbliżeniowe
   1. Dzień po transfekcji przenieś komórki na 15 cm szalki. Z każdej pożywki należy usunąć pożywkę, przemyć komórki 7 ml PBS, dodać 1,5 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 3,5 ml pożywki wzrostowej w celu ponownego zawieszenia komórek i przenieść zawiesinę komórek do 15-centymetrowego naczynia wypełnionego 20 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej biotyną w stężeniu 50 μM w celu stymulacji biotynylacji i doksycykliny w temperaturze 200 ng⋅mL⁻¹ (końcowej stężenia) w celu wywołania ekspresji białek fuzyjnych.
   2. Inkubować komórki przez co najmniej 20 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
3. Pobieranie i przechowywanie komórek
   1. Umyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj 1,5 ml PBS do każdej płytki i zbierz komórki za pomocą skrobaka.
   2. Przenieść pobrane komórki odpowiadające jednemu warunkowi do probówki o pojemności 15 ml i zebrać je przez odwirowanie w temperaturze 1 200 x g, 5 min, 4 °C.
   3. Usunąć supernatanty i zatrzaskowo zamrozić granulki w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze 80 °C do czasu dalszej obróbki.
      UWAGA: Alternatywnie, komórki można również odłączyć przez trypsynizację, zebrać w pożywce wzrostowej, przenieść do probówki o pojemności 15 ml i trzykrotnie przemyć PBS przed zamrożeniem.
4. Przygotowanie lizatów komórkowych
   1. Ponownie zawiesić osady komórek w 1 ml buforu do lizy (50 mM Tris pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1x kompletny inhibitor proteazy) w temperaturze RT. Przepuść komórki 10-20 razy (od pięciu do dziesięciu uderzeń) przez igłę 25 G.
   2. Sonikować próbki za pomocą urządzenia sonifikacyjnego.
      UWAGA: Za pomocą urządzenia sonifikacyjnego wskazanego w Tabeli Materiałów można zastosować następujący program: cztery cykle o dużej intensywności, 30 s na cykl w zimnej (4 °C) łaźni wodnej. Każde inne urządzenie do sonifikacji jest odpowiednie, ale parametry mogą wymagać odpowiedniego dostosowania.
   3. Dodaj Triton X-100 do odzyskanego sonikowanego lizatu, aby osiągnąć końcowe stężenie 2% (zazwyczaj dodaje się 100 μl 20% Triton X-100 do 900 μl sonikowanego lizatu komórkowego), a następnie 2,3 ml 50 mM Tris, pH = 7,4 na 1 ml lizatu, aby dostosować stężenie NaCl do 150 mM przed związaniem się z kulkami sprzężonymi ze streptawidyną.
      UWAGA KRYTYCZNA: Wyższe stężenia soli często skutkują znacznie mniej efektywnym wiązaniem się z kulkami.
   4. Rozprowadzić dostosowane lizaty w probówkach o pojemności 1,5 ml (ok. 1,1 ml w trzech probówkach) i odwirować je w temperaturze 16 000 x g, 10 min, 4°C.
   5. Przenieść supernatanty (ok. 3,2 ml) do probówki o pojemności 15 ml i zachować 50–100 μl jako materiał WEJŚCIOWY.
   6. Zmierzyć stężenie każdej próbki za pomocą testu Bradforda i użyć równoważnika 3 do 3,5 mg zawartości białka do obniżenia streptawidyny.
5. Streptawidyna pulldown
   UWAGA: Przegląd procedury rozwijania jest pokazany na stronie Rysunek 4. Jest prawie identyczny z oryginalnym protokołem opublikowanym przez Roux i współpracowników². Przy pierwszym wykonywaniu pulldownu, próbki przepływu i płukania 1-4 można odłożyć na bok do analizy Western blot, aby upewnić się, że procedura zadziałała prawidłowo (Rysunek 5).
   1. Dla każdego warunku przenieś 200 μl zawiesiny kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż koraliki przykleją się do boku rurek (ok. 1 min) i wyjmij bufor do przechowywania.
   2. Umyj kulki, delikatnie mieszając z 1 ml buforu równoważącego (50 mM Tris pH 7–4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 i 1 mM DTT).
   3. Wyślij zrównoważone kulki w równej ilości w niezbędnej liczbie probówek (zwykle, gdy zaczynasz od 3-3,5 mg zawartości białka, lizaty z każdego stanu można wysłać w dwóch do czterech probówkach o pojemności 1,5 ml) i umieść z powrotem na stojaku magnetycznym.
   4. Usunąć bufor równowagi i ponownie zawiesić każdy zestaw kulek z równymi ilościami odpowiednich lizatów komórkowych z kroku 4.4.7. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na obracającym się kole.
   5. Następnego dnia umieść probówki o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż kulki przykleją się do boku probówek i przenieś supernatanty do probówki o pojemności 15 ml oznaczonej jako Flow Through.
      UWAGA: Od teraz wszystkie czynności wykonywane są w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej.
   6. Ponownie zawiesić kulki w każdej probówce z 200 μl buforu do przemywania 1 (2% SDS w wodzie) i połączyć każdy zestaw ponownie zawieszonych kulek odpowiadających jednemu warunkowi w probówkach o pojemności 1,5 ml.
   7. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu myjącego 1.
   8. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu płuczącego 2 (50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 i 0,1% Na-deoksycholanu).
   9. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu płuczącego 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40 i 0,5% Na-deoksycholanu).
   10. Umyj kulki dwukrotnie przez 8 minut na kole obrotowym z 1 ml buforu płuczącego 4 (50 mM Tris pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1% NP-40).
   11. Aby upewnić się, że bufor płuczący został całkowicie usunięty po ostatnim etapie płukania, należy usunąć większość supernatantu, a następnie odwirować próbki. Umieść je z powrotem na stojaku magnetycznym, poczekaj, aż koraliki przykleją się do boku rurek, a następnie usuń pozostały bufor.
   12. Dodać 30 μl buforu elucyjnego (10 mM Tris pH 7,4, 2% SDS, 5% β-merkaptoetanolu i 2 mM biotyny) do kulek. Inkubować w temperaturze 98 °C przez 15 minut, a następnie natychmiast usunąć kulki na stojaku magnetycznym.
   13. Przenieść eluowaną próbkę do świeżej probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.
6. SDS-PAGE i Western blotting
   UWAGA: Przed analizą spektrometrii mas zaleca się ocenę powodzenia biotynylacji i pulldown za pomocą SDS-PAGE i Western blot. Jeśli nie obserwuje się wzorca biotynylacji, można uznać, że do pożywki nie dodano ani doks, ani biotyny lub że jeden z dwóch roztworów podstawowych jest zagrożony.
   1. Dla każdej próbki wejściowej należy przygotować próbkę PAGE, mieszając równe ilości próbki białka z odpowiednią objętością 3 ładujących SDS w sumie 28 μl. Przygotować próbki PAGE, mieszając 5 μl każdej próbki elucyjnej z 2,5 μl buforu ładującego 3x SDS.
   2. Załadować próbki (25 μl/studzienkę dla wejść, 7 μl/studzienkę dla próbek elucyjnych) na żel poliakryloamidowy SDS. Przystąpić do elektroforezy i Western blot, jak opisano w punkcie 3.4.
   3. Jeśli wykonujesz pulldown po raz pierwszy, przygotuj próbki PAGE dla każdego etapu pulldown (wejście, przepływ, mycie 1–4, elucja), mieszając 20 μl każdej próbki (wejście, przepływ, przemycie 1–4) z 10 μl 3x bufora ładującego SDS lub 5 μl (elucja) z 2,5 μl bufora ładującego 3x SDS i postępuj jak w kroku 4.6.4 (Rysunek 5).
7. SDS-PAGE do analizy MS
   UWAGA: Aby zminimalizować potencjalne zanieczyszczenie keratyną, można stosować prefabrykaty żelowe i komercyjny bufor do ładowania próbek.
   1. Dodać 6,25 μl 4-krotnego buforu do 18,75 μl każdej próbki elucyjnej i uruchomić próbki na 4-20% prefabrykowanym żelu SDS, aż przejdą na 2-3 cm do żelu.
   2. Zabarwić żel koloidalnym Coomassie Brilliant Blue G250 staining¹³ na 15 cm szalce Petriego.
   3. Za pomocą czystego skalpela wyciąć całe pasy dla każdej próbki, z wyłączeniem pasma streptawidyny (działającego z prędkością ok. 17 kDa, Ryc. 6), a następnie przenieść wycięte pasma do probówek o pojemności 1,5 ml.
   4. Wyślij te próbki do ośrodka proteomicznego w celu dalszej analizy.
      UWAGA: Typowe wyniki stwardnienia rozsianego można zobaczyć w pozycji bibliograficznej 9 (rysunek 3 i rysunek 7 oraz tabele uzupełniające). Całość zbiorów danych jest dostępna w repozytorium PRIDE (numer dostępu PXD005005).

Aby zilustrować, jak działa ta metoda, otwarte ramki odczytu (ORF) białek Ago2, TNRC6C i Dicer (wszystkie zaangażowane w szlak wyciszania genów za pośrednictwem miRNA) zostały sklonowane w plazmidach o podzielonym BioID. Wiadomo, że Ago2 oddziałuje z TNRC6C w kompleksie wyciszającym indukowanym przez miRNA (miRISC), który hamuje translację i stymuluje rozpad docelowych mRNAs14. Przed złożeniem miRISC, Ago2 wchodzi w interakcję z Dicer, enzymem wytwarzającym dojrzałe miRNA, w kompleksie, w którym może zostać załadowany miRNA15. W związku z tym split-BioID zastosowano do pary Ago2/Dicer, albo do pary Ago2/TNRC6C. Dla każdej pary badanych białek, Ago2 został połączony z NBirA* lub CBirA* przy użyciu naszych plazmidów split-BioID (Figura 2), a Dicer i TNRC6C do odpowiedniego pokrewnego fragmentu BirA*. Ponadto każde białko zostało połączone z CBirA* i sparowane z fuzją NBirA*-GFP jako kontrola ujemna. Wynikiem jest przetestowanie czterech iteracji dla każdej pary badanych białek (tabela 1).

Aby sprawdzić, czy split-BioID aktywuje się po interakcji pary badanych białek, postępowaliśmy zgodnie ze schematem przedstawionym na stronie Rysunek 1. Plazmidy były przejściowo transfekowane w linii komórkowej HeLa kompatybilnej z systemem tet. Ekspresję białek fuzyjnych indukowano za pomocą doksycykliny (dox), a biotynylację stymulowano przez dodanie nadmiaru biotyny do pożywki wzrostowej. Po 20-godzinnym czasie inkubacji z dox i biotyną, komórki poddano lizie i analizie za pomocą Western blot przy użyciu sprzężonej streptawidyny w celu wykrycia biotynylowanych białek. W komórkach ssaków dwa główne prążki są zwykle wykrywane przez sprzężoną streptawidynę w nietransfekowanej próbce (Ryc. 3, gwiazdki) i odpowiadają endogennie biotynylowanym białkom (najprawdopodobniej karboksylazom mitochondrialnym). Te dwa pasma są obecne we wszystkich próbkach i mogą być wygodnie używane jako wewnętrzna kontrola obciążenia, dlatego wykrywanie białka czyszczącego w celu kontrolowania obciążenia równymi ilościami białka jest zbędne. Typowe dla eksperymentu BioID/split-BioID jest to, że dodatkowe główne prążki, które można zaobserwować, to białka fuzyjne, które uległy samobiotynylacji. Nawet jeśli nie zaobserwuje się żadnego innego biotynylowanego białka, wykrycie biotynylacji białek fuzyjnych na tym etapie wskazuje już, że dwa badane białka oddziaływały w komórkach. W eksperymencie przedstawionym na Rysunek 3, jest jasne, że posiadanie białka fuzyjnego NBirA*-Ago2 sparowanego z fuzjami CBirA* do TNRC6C lub Dicer jest bardziej efektywne niż odwrotne kombinacje, w których CBirA*-Ago2 jest sparowany z fuzjami NBirA* pozostałych dwóch białek (Rysunek 3, górny panel, porównaj intensywności linii 2-3 z liniami 6-7). Co więcej, aktywacja była specyficzna, ponieważ żadna z fuzji CBirA* nie mogła aktywować kontrolnego białka fuzyjnego NBirA*-GFP do znacznych poziomów (Rysunek 3, porównaj pasy 1, 4-5 z linią 8, która odpowiada komórkom nietransfekowanym). Ponieważ w naszych plazmidach NBirA* ma znacznik myc, a CBirA* ma znacznik FLAG (Rysunek 2), poziomy ekspresji każdego białka fuzyjnego można analizować za pomocą przeciwciał przeciwko tym dwóm znacznikom (Rysunek 3, dolny panel).

Gdy zaobserwuje się biotynylację wywołaną interakcją, eksperyment można zwiększyć i wyizolować biotynylowane białka na koralikach sprzężonych ze streptawidyną, jak wskazano w paragrafie 4 protokołu (Rysunek 4). Wykonując izolację po raz pierwszy, wszystkie etapy oczyszczania mogą być analizowane za pomocą Western blotting (Rysunek 5). Zazwyczaj wiązanie z kulkami powinno być prawie ilościowe i praktycznie nie należy zaobserwować przeciekania w praniu. Przed przetworzeniem próbek do spektrometrii mas zalecamy przeprowadzenie Western blot, aby upewnić się, że indukowana biotynylacja działa zgodnie z oczekiwaniami i że białka fuzyjne uległy ekspresji. Brak ekspresji białek fuzyjnych jest spowodowany albo słabą wydajnością transfekcji, albo wadliwą indukcją doks. Jeśli białka fuzyjne uległy ekspresji, ale nie zaobserwowano biotynylacji, sprawdź, czy nadmiar biotyny (50 μM) został rzeczywiście dodany do pożywki i czy biotyna podstawowa jest nadal aktywna. Gdy eluowany materiał jest analizowany na wybarwionym Coomassie żelu białkowym (Rysunek 6), zazwyczaj najsilniejsze pasmo, które można zaobserwować, występuje przy około 17 kDa i odpowiada monomerycznej streptawidynie. Można również zaobserwować prążki odpowiadające endogennym biotynylowanym białkom i białkom fuzyjnym. Zazwyczaj wycinamy obszar pasa próbki powyżej pasma streptawidyny aż do studzienki załadowczej (Rysunek 6). Wycięte pasmo można przechowywać w probówce o pojemności 1,5 ml i wysłać do zakładu spektrometrii mas. Alternatywnie, związane białka mogą być również trawione trypsyną na kulkach sprzężonych ze streptawidyną, a strawione peptydy eluowane z kolumny. Rutynowo używamy oprogramowania MaxQuant 16 (używając głównie parametrów domyślnych i dodając biotynylację lizyny jako możliwą modyfikację potranslacyjną, zobacz odniesienie 9, aby uzyskać więcej informacji i typowe wyniki MS) do analizy surowych danych MS i Perseus suite17 do późniejszej analizy statystycznej, oba są wolnym oprogramowaniem. Próbki są zwykle badane w trzech powtórzeniach biologicznych. Korzystając z kwantyfikacji bez znaczników, można zidentyfikować specyficznie wzbogacone białka w warunkach kontrolnych. Aby przefiltrować endogennie biotynylowane białka i białka, które nie są specyficznie znakowane przez enzym BirA*, bierzemy pod uwagę tylko białka, które są znacznie wzbogacone w wyniku trafień z sześciu zestawów danych wygenerowanych z sześcioma niepowiązanymi białkami. Ponadto bierzemy pod uwagę tylko te trafienia, które zostały wzbogacone w stosunku do podzielonego zestawu danych BioID, w którym białka fuzyjne NBirA* zostały zastąpione przez NBirA*-GFP. Zaproponowano inne strategie analizy danych, w szczególności wykorzystujące znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) dla proteomiki ilościowej18. Ponadto opisano różne strategie bezpośredniej izolacji biotynylowanych peptydów przy użyciu wariantu streptawidyny o osłabionym powinowactwie do biotyny18, specjalne warunki elucji przy użyciu rozpuszczalników organicznych19 lub przeciwciała specyficzne dla biotyny20,21. Chociaż identyfikacja miejsc biotynylacji niekoniecznie prowadzi do odkrycia większej liczby białek, daje większą pewność co do specyficzności trafień i jest przydatna przy zajmowaniu się topologią interakcji.

Rysunek 1: Przegląd procedury split-BioID. Białko 1 oddziałuje z białkiem 2 jako część kompleksu A lub z białkiem 3 jako część kompleksu B. Aby dokładnie zbadać skład kompleksu A, split-BioID można zastosować do białek 1 i 2. Zdjęcie spektrometru mas jest objęte licencją Creative Commons Uznanie autorstwa-Na tych samych warunkach 3.0 Unported i zostało pobrane z https://commons.wikimedia.org z nazwą pliku ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kasety ekspresyjne plazmidów rozszczepionych BioID. Udostępniamy cztery plazmidy, aby umożliwić testowanie wszystkich kombinacji białek fuzyjnych NBirA* i CBirA*. Plazmidy i pełne mapy są dostępne na stronie addgene.org pod wskazanymi numerami. Plazmidy mają element reagujący na tet (7x tetO) i muszą być używane w linii komórkowej, która jest kompatybilna z systemem ekspresji tet. Należy również zauważyć, że we wszystkich plazmidach ORF FKBP i FRB są połączone odpowiednio z fragmentami NBirA* i CBirA*. Te dwa białka oddziałują tylko w obecności rapamycyny, a zatem plazmidy mogą być użyte do szybkiego przetestowania systemu w obecności lub braku tej substancji chemicznej9. Wskazane miejsca z ograniczeniami są unikalne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Typowy Western blot dla eksperymentu z podzielonym BioID. Górny panel: wykrywanie biotynylowanych białek za pomocą znakowanej fluorescencyjnie streptawidyny. Dolny panel: wykrywanie białek fuzyjnych z przeciwciałami anty-Myc i anty-FLAG. Badano dwie pary białek: Ago2/TNRC6C i Ago2/Dicer. Na pasach 2 i 3 Ago2 został dołączony do fragmentu CBirA*. Na pasach 6 i 7 Ago2 został dołączony do fragmentu NBirA*. Nie zaobserwowano istotnego sygnału, gdy którekolwiek z trzech białek połączono z NBirA*-GFP (pasy 1, 4-5). Gwiazdy wskazują pasma odpowiadające endogennie biotynylowanym białkom, które mogą służyć jako wewnętrzna kontrola obciążenia. Ten rysunek jest zaadaptowany z Rysunek 5B z Schopp et al.9 na licencji Creative Commons Uznanie autorstwa 4.0 Międzynarodowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Przegląd procedury usuwania streptawidyny. Przedstawiono główne etapy izolacji biotynylowanych białek do analizy spektrometrii mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Typowy Western blot dla eksperymentu z pulldownem streptawidyny. Równe objętości każdej wskazanej próbki załadowano na żel poliakryloamidowy SDS. Po Western blot wykryto biotynylowane białka ze streptawidyną sprzężoną z HRP. Wskazane są pasma odpowiadające NBirA*-TNRC6C i CBirA*-Ago2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Typowy żel białkowy barwiony metodą Coomassie do analizy spektrometrii mas. Wymytą próbkę z kulek sprzężonych ze streptawidyną załadowano na prefabrykowany żel białkowy i prowadzono, aż próbka przeniesie się na odległość 2-3 cm. Głównym pasmem obserwowanym przy ciśnieniu około 17 kDa jest streptawidyna. Obszar znajdujący się bezpośrednio nad tym pasmem jest wycinany i wysyłany do zakładu spektrometrii mas. Wskazane są pasma odpowiadające NBirA*-TNRC6C i CBirA*-Ago2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Zazwyczaj testowane warunki podczas stosowania split-BioID do dwóch białek.

Tabela 2: Startery sekwencjonowania dla plazmidów z podziałem BioID.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.