Artykuł metodologiczny

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

DOI:

10.3791/57481

⸱

25 maja 2018

1Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine, 2Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samoodnawianie i różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych (ES) jest regulowane przez sygnały zewnętrzne i wewnętrzne sieci czynników transkrypcyjnych, regulatorów epigenetycznych i modyfikacji histonów po translacji, które łącznie wpływają na stan ekspresji pobliskich genów. Wykazano również, że RNA oddziałuje z różnymi białkami w celu regulacji dynamiki chromatyny i ekspresji genów. Immunoprecypitacja RNA związana z chromatyną (CARIP), po której następuje sekwencjonowanie nowej generacji (CARIP-Seq) jest nową metodą badania RNA związanych z białkami chromatyny, podczas gdy immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie nowej generacji (ChIP-Seq) jest potężną techniką genomiczną do mapowania lokalizacji potranslacyjnej modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych i modyfikatorów epigenetycznych w skali globalnej w komórkach ES. W tym miejscu opisujemy metody wykonywania CARIP-Seq i ChIP-Seq, w tym budowę biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, w celu generowania globalnego RNA związanego z chromatyną i map epigenomicznych w komórkach ES.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Decyzje dotyczące losu embrionalnych komórek macierzystych (ES) są regulowane przez komunikację między sygnałami zewnątrzkomórkowymi a wieloma regulatorami transkrypcji, w tym modyfikatorami histonów i modyfikacją ogonów histonów po translacji. Interakcje te ułatwiają dostęp do chromatyny i pakowanie chromatyny w jeden z dwóch stanów: euchromatynę, która jest otwarta i aktywna transkrypcyjnie, oraz heterochromatynę, która jest zwarta i ogólnie nieaktywna transkrypcyjnie. Czynniki transkrypcyjne z powinowactwem do wiązania specyficznym dla sekwencji DNA i modyfikatorami epigenetycznymi łączą się z regionami euchromatycznymi, aby uczestniczyć w kontrolowaniu ekspresji genów. Metody sekwencjonowania nowej generacji, w tym ChIP-Seq1, odegrały zasadniczą rolę w mapowaniu sieci transkrypcyjnych całego genomu, które mają fundamentalne znaczenie dla samoodnawiania się komórek ES i pluripotencji2,3,4,5,6. Co więcej, podczas gdy immunoprecyzja RNA, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (RIP-Seq)7 oceny interakcji RNA-białko sugerują, że białka wiążące DNA oddziałują z RNA w celu regulacji zdarzeń transkrypcyjnych7,8,9,10,11,12, niewiele badań dotyczyło lokalizacji RNA w całym genomie związanych z chromatyną12 lub globalnymi interakcjami między RNA a modyfikacjami histonów. Długie niekodujące RNA (lncRNA) to jedna z klas RNA, które, jak stwierdzono, regulują aktywność białek związanych z chromatyną13,14,15. Na przykład Xist jest lncRNA, które reguluje w komórkach ssaków żeńskich inaktywację jednego chromosomu X poprzez rekrutację represorów epigenetycznych16,17. Jednak pełne spektrum RNA związanych z chromatyną jest w dużej mierze nieznane. W tym miejscu opisujemy nowy protokół, immunoprecypitację RNA związaną z chromatyną (CARIP), a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CARIP-Seq), w celu identyfikacji RNA związanych z chromatyną na podstawie całego genomu w komórkach ES, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, oraz ChIP-Seq do mapowania globalnego zajętości modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych i modyfikatorów epigenetycznych. W przeciwieństwie do innych metod RIP-Seq7, CARIP-Seq obejmuje etapy sieciowania i sonikacji, które pozwalają na bezpośrednią identyfikację RNA związanych z chromatyną. Podsumowując, ChIP-Seq jest potężnym narzędziem do identyfikacji interakcji białko-DNA w całym genomie, podczas gdy CARIP-Seq jest potężną metodą badania RNA związanych ze składnikami chromatyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórek ES myszy w warunkach wolnych od karmnika.

UWAGA: Mysie komórki ES są tradycyjnie hodowane w pożywkach na szalce do hodowli komórkowej pokrytej żelatyną i monowarstwą mysich fibroblastów embrionalnych (MEF), które zostały mitotycznie inaktywowane (iMEF). Jednak MEF powinny zostać usunięte przed dalszymi analizami epigenetycznymi lub ekspresyjnymi, aby zapobiec zanieczyszczeniu chromatyny i RNA związanych z MEF.

  1. Przygotowanie warstwy zasilającej: Żelatynę pokryć 6-dołkową płytką do hodowli komórkowej, dodając 2 ml 0,1% żelatyny do wody i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20-30 min.
  2. Przygotuj 10% pożywkę DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającą 2 mM L-glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1x penicylinę/streptomycynę.
  3. Izoluj MEF-y od E13.5 do E14.5 mice18,19 lub kup od komercyjnego dostawcy. Mitotycznie dezaktywuj MEF-y poprzez leczenie mitomycyną C lub promieniowaniem gamma przy użyciu standardowych protokołów19. Alternatywnie, mitotycznie inaktywowane MEF-y (iMEF) można nabyć od komercyjnego dostawcy.
  4. Hodowla MEF-ów. Wstępnie podgrzać pożywkę MEF w temperaturze 37 °C, rozmrozić zamrożoną fiolkę z iMEF i kulturę w 10% pożywce FBS MEF w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Płytka MEF w ~ 200 000 komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki hodowlanej.
  5. Hodowla komórek ES na warstwie komórek zasilających (iMEF).
    1. 12-24 godziny po posianiu iMEF należy wstępnie podgrzać probówkę o pojemności 50 ml pożywki komórkowej ES (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, LIF (10 ng / ml), 15% FBS kwalifikowanego przez komórki ES, 1× 2-merkaptoetanolu kwalifikowanego do hodowli komórkowych, 1× glutaminy, aminokwasów endogennych (NEAA), 1× penicyliny/streptomycyny) w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 .
    2. Odessać pożywkę z płytek do hodowli komórkowych zawierających iMEF, ponownie zawiesić komórki ES w 2 ml pożywki (po rozmrożeniu w temperaturze 37 °C) i umieścić komórki na warstwie iMEF. Podczas umieszczania szalki hodowlanej w inkubatorze ważne jest, aby przesunąć szalkę w kształcie litery "t", aby równomiernie rozprowadzić komórki i zapobiec agregacji w kierunku środka szalki.
  6. Przenieś komórki ES na naczynia pokryte żelatyną bez podawania. Przejdź przez komórki ES, zanim staną się zlewne. Kolonie komórek ES najlepiej utrzymują samoodnowę, jeśli kolonie są równomiernie rozmieszczone i nie zlewają się. Obecność wielu stykających się ze sobą kolonii komórek ES wskazuje, że gęstość komórek jest zbyt wysoka.
    1. Posmaruj 6-dołkowe naczynie hodowlane żelatyną, jak opisano powyżej. Inkubować 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez ~ 10-15 minut, aby wstępnie podgrzać trypsynę.
    2. Następnie przeprowadź przez komórki ES, najpierw przemywając 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i dodając 1 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA. Odczekaj 1-2 minuty, aż kolonie się oderwą. Oddzielić kolonie do zawiesiny jednokomórkowej, pipetując końcówką o pojemności 1 ml ~5 razy.
    3. Użyj mikroskopu, aby potwierdzić dysocjację pojedynczych komórek ES. Aby wygasić reakcję lub "zneutralizować" trypsynę, dodaj 10% pożywki FBS MEF. Odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut i odessać pożywkę.
    4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki (komórka ES) uzupełnionej inhibitorem kinazy syntazy glikogenu-3 (GSK3) (CHIR99021; GSK3i) lub 2i (MEKi/GSK3i) (2-3 μM GSK3i: CHIR99021, 1 μM MEKi: PD0325901).
    5. Odessać żelatynę z szalki do hodowli komórkowej i dodać do niej 2 ml pożywki zawierającej ESC, a następnie umieścić szalkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C (Rysunek 1A-D). Podwójne hamowanie GSK3i i MEKi sprzyja naiwnej pluripotencji komórek ES w stanie podstawowym przy braku komórek zasilających (iMEF) i bez surowicy20. Komórki ES powinny być pasażowane dwa do trzech razy w celu usunięcia MEF przed przystąpieniem do sieciowania.

2. Sieciowanie komórek ES dla ChIP i CARIP

  1. Zebrać komórki ES myjąc je PBS, a następnie dodać 0,25% trypsyny wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C. Inkubować komórki przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Unikaj nadmiernej trypsynizacji komórek ES, która doprowadzi do śmierci komórki. Użyj mikroskopu, aby ocenić dysocjację pojedynczych komórek.
  2. Ugasić trawienie trypsyny, jak opisano powyżej, w celu pasażowania komórek ES i odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut.
  3. Ponownie zawiesić komórki we wstępnie ogrzanym (37 °C) podłożu MEF (10% FBS/DMEM) w temperaturze 2 × 106 komórek/ml.
  4. Aby usieciować komórki, dodać 37% roztwór formaldehydu do 1% stężenia końcowego i inkubować komórki w stożkowej probówce (15 ml lub 50 ml) w temperaturze 37 °C przez 8 minut. Odwrócić probówkę kilka razy w ciągu 8 minut, aby uzyskać jednorodne utrwalenie.
    UWAGA: Czas utrwalania można empirycznie zoptymalizować dla CARIP. Jeśli czas utrwalenia zostanie zmieniony, należy również dostosować liczbę cykli sonikacji. Ponadto temperatura 37 °C zwiększa skuteczność sieciowania w porównaniu z sieciowaniem w temperaturze pokojowej. Temperaturę utrwalania można zoptymalizować empirycznie.
  5. Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodać 1,25 M glicyny (wstępnie schłodzonej w temperaturze 4 °C) do stężenia 0,125 M. Odwrócić probówkę przy 8 obr./min za pomocą rotatora przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zassać pożywkę.
  6. Przemyć osad komórkowy wstępnie schłodzonym PBS (4 °C), odwirować próbkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać PBS. Ponownie umyj komórki PBS. Następnie podwielokrotność 15 × 106 komórek na probówkę o pojemności 15 ml.
  7. Zamrozić osad komórkowy, umieszczając go w ciekłym azocie na 1 minutę, na suchym lodzie na 5 minut lub natychmiast umieścić w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Stałe granulki komórek ES mogą być przechowywane do 6 miesięcy bez pogorszenia jakości w dalszych eksperymentach.

3. Sonikacja chromatyny dla ChIP i CARIP

  1. Rozmrozić utrwalony granulat komórek ES na lodzie. Ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze sonikacyjnym (2,5 ml). W przypadku czynników transkrypcyjnych lub regulatorów epigenetycznych (czynników białkowych), ponownie zawiesić osad w 1x TE, 1mM PMSF, 1x koktajlu inhibitorów proteinaz. W przypadku modyfikacji histonów ponownie zawiesić osad w 1x TE, 0,1% SDS, 1mM PMSF, 1x inhibitor proteinazy.
    UWAGA: Chociaż dodatek SDS zwiększa wydajność sonikacji, może nie być korzystny dla oceny niektórych składników chromatyny lub czynników transkrypcyjnych.
  2. W przypadku immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) sonikację chromatyny w 14-18 cyklach (30 s wł., 30 s spoczynku) przy amplitudzie 40%. W przypadku immunoprecypitacji RNA związanej z chromatyną (CARIP) należy zmniejszyć liczbę cykli sonikacji (8-10 cykli). Ze względu na zmienność komórkową, fiksacyjną i sonifiera, warunki sonikacji powinny być określone empirycznie.
  3. Uzupełnij bufor sonikacyjny 28 μl 10% SDS dla czynników białkowych, 28 μl deoksycholanu sodu i 0,28 ml 10% Triton-X100 i dobrze wymieszaj.
    UWAGA: Dodanie tych składników do bufora sonikacyjnego generuje bufor RIPA.
  4. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu wstępnego oczyszczenia chromatyny. Przenieś supernatant do nowej probówki i kontynuuj immunoprecypitację chromatyny.
  5. Alternatywnie, chromatyna sonikowana może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Jednak przechowywanie sonikowanej chromatyny w temperaturze -80 °C może prowadzić do pogorszenia jakości białka czynnika ChIP.

4. Proces ChIP i CARIP

  1. Dodaj 40 μl kulek magnetycznych białka A lub G do probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązania. Dodaj 600 μl PBS, aby umyć koraliki. Umieść probówkę na stojaku zawierającym magnes, inkubuj probówkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, usuń PBS i ponownie zawieś kulki magnetyczne w 100 μl PBS.
  2. Dodaj 2-4 μg przeciwciała do probówki z kulkami magnetycznymi. Inkubować i obracać probówkę w temperaturze pokojowej przez 40 minut przy 8 obr./min za pomocą rotatora, aby ułatwić wiązanie przeciwciał z kulkami magnetycznymi. Włóż probówkę na stojak magnetyczny, inkubuj ją przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij PBS.
  3. Dodaj 200 μl PBS, aby umyć kulki magnetyczne. Mycie PBS wykonuje się w celu usunięcia wolnych IgG. Inkubować i obracać probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut między etapami mycia. Przymocuj rurkę do magnesu i wyjmij PBS.
  4. Immunoprecypitować białka związane z chromatyną przez inkubację sonikowanego ekstraktu chromatyny (4 × 106 komórek na ChIP) z kulkami magnetycznymi i obrócić próbkę w temperaturze 4 °C (przez noc).
  5. Umyj koraliki magnetyczne. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej z następującymi i obracać próbkę przez 10 minut z każdym buforem: dwukrotnie z 1 ml buforu RIPA (TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% deocycholan sodu, 0,1% SDS), dwukrotnie z 1 ml buforu RIPA zawierającego 0,3 M NaCl, dwa razy z 1 ml buforu LiCl (0,5% deocycholanu sodu, 0,5% NP40, 0,25 M LiCl), raz z 1 ml buforu TE z 0,2% Triton X-100 i raz z 1 ml TE.
  6. De-crosslinking dla ChIP. Ponownie zawieś kulki magnetyczne w 100 μl TE. Dodać 3 μl 10% SDS i 5 μl proteinazy K (20 mg/ml). Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C (przez noc).
    UWAGA: Ważne jest, aby na tym etapie przykryć rurki folią parafilmową lub folią, aby zapobiec parowaniu.
    1. Następnego dnia odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać. Następnie użyj stojaka magnetycznego, aby przenieść supernatant do świeżej probówki. Aby przepłukać kulki magnetyczne, dodaj 100 μl TE zawierającego 0,5 M NaCl, a następnie połącz dwa supernatanty.
  7. Usuwanie sieciowania dla CARIP. Ponownie zawieś kulki magnetyczne w 100 μl TE. Dodać 3 μl 10% SDS i 5 μl proteinazy K (20 mg/ml). Inkubować próbkę w temperaturze 65 °C przez 4–12 godzin. Czas inkubacji w temperaturze 65 °C musi być określony empirycznie ze względu na zmienność między typami komórek, warunki sonikacji i utrwalania itp.
    1. Odwróć probówkę 3-5 razy, aby wymieszać, nałóż probówkę na stojak magnetyczny, a następnie przenieś supernatant do świeżej probówki.
    2. Aby przepłukać kulki magnetyczne, dodaj 100 μl TE zawierającego 0,5 M NaCl, a następnie połącz dwa supernatanty.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać odczynników wolnych od nukleaz (np. buforu TE, SDS itp.), aby zapobiec utracie DNA lub RNA podczas etapu de-sieciowania.
  8. Ekstrakcja DNA/RNA przy użyciu 200 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (PCI) (25:24:1, v/v).
    UWAGA: RNA można również ekstrahować za pomocą komercyjnych zestawów, korzystając z instrukcji producenta. Wstrząsać przez 30 s, wirować w temperaturze 10 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki.
    1. Aby wytrącić DNA/RNA, dodaj 2 μl GlycoBlue, 20 μl 3 M octanu sodu i 600 μl etanolu. Wymieszać przez odwrócenie ~5-8 razy i umieścić próbkę na suchym lodzie lub w temperaturze -80 °C na co najmniej 1-2 godziny.
    2. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 30 minut za pomocą wirówki stołowej z chłodzeniem (4 °C). Wysuszyć granulkę na powietrzu przez <1 minutę i ponownie zawiesić ją w 40 μl buforu EB (10 mM Tris-HCl). Aby przygotować bibliotekę ChIP-Seq, przejdź do kroku 6.
  9. Usuń DNA z próbek IP RNA związanych z chromatyną za pomocą DNazy. Dodać 10x bufor DNazy do 1x stężenia w próbce CARIP. Dodać 1 μl DNazy na maksymalnie 10 μg RNA (50 μl reakcji). Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Ekstrahować próbkę RNA za pomocą PCI. Zawiesić w H2O, wolnym od nukleaz.

5. Dwuniciowa synteza cDNA dla CARIP-Seq

  1. Synteza pierwszej nici cDNA. W przypadku reakcji odwrotnej transkrypcji należy ustawić następującą reakcję w probówce przeznaczonej do maszyny do PCR: 10,5 μl RNA i 1 μl losowo starterów heksameru (3 μg/μL).
  2. Inkubować probówkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut w celu denaturacji struktury drugorzędowej i przechowywać ją na lodzie przez 2 minuty. Wymieszać następujące składniki: 4 μl buforu pierwszej nici, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl dNTP i 0,5 RNazy OUT. Następnie do probówki PCR dodaj 7,5 μl mieszanki wzorcowej. Inkubować probówkę przez 2 minuty w temperaturze 25 °C. Dodać 1 μl indeksu górnego II (200 U/μL) i inkubować w następujący sposób: 25 °C przez 10 min, 42 °C przez 50 min, 70 °C przez 15 min i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  3. Synteza drugiej nici cDNA. Umieść rurkę na lodzie. Następnie dodaj kolejno następujące składniki: 91 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC), 30 μl 5x buforu reakcyjnego drugiej nici, 3 μl mieszanki dNTP (10 mM), 1 μl ligazy DNA E. Coli (10 U/μL), 4 μL polimerazy DNA E. Coli (10U/μL) i 1 μL RNazy E. Coli H (2U/μL). Wymieszać delikatnie wirując i inkubować w temperaturze 16 °C przez 2 h.
    UWAGA: Mieszanie przez trzepsy lub odwracanie probówki może nie wystarczyć do dokładnego wymieszania odczynników.
  4. Dodać 2 μl polimerazy DNA T4 i inkubować w temperaturze 16 °C przez 5 minut. Oczyść cDNA (dwuniciowe, dscDNA) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Eluować dscDNA w 40 μl buforu EB.
  5. Fragment dwuniciowego cDNA. Ścinanie cDNA (dscDNA) za pomocą sonifiera w kąpieli wodnej i probówki o pojemności 1,5 ml do wielkości 250-500 pz. Sonikacja dscDNA ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia rozmiarów fragmentów w celu ułatwienia sekwencjonowania całego transkryptu RNA.
  6. W przypadku korzystania ze standardowego modelu sonifiera do kąpieli wodnej, sonikować próbkę przez 3× 10 minut lub 4× 10 minut
    UWAGA: Na maksymalnie 1 μg całkowitego RNA należy zastosować trzy cykle, natomiast na 1-5 μg całkowitego RNA zalecane są cztery cykle. Odwirować probówkę na krótko po każdym cyklu sonikacji i utrzymywać chłodną kąpiel wodną, dodając świeży lód.
  7. Podczas korzystania z sonifikatora Pico zaleca się stosowanie sześciu cykli dla 1-5 μg całkowitego RNA i następujących warunków cyklicznych (30 s włączenia, 90 s wyłączenia). Odwirować probówkę krótko po 2-3 cyklach sonikacji. Skuteczność sonikacji można określić poprzez nałożenie frakcji ściętego dscDNA (3-4 μL) na żel agarozowy (2%). Ważne jest, aby empirycznie przetestować warunki sonikacji ze względu na zmienność między sonifikatorami.
  8. Wykonaj przygotowanie biblioteki zgodnie z opisem w kroku 6 dla sekwencjonowania nowej generacji.

6. Budowa biblioteki ChIP-Seq i CARIP-Seq

  1. Napraw końce DNA za pomocą zestawu do naprawy końcówek DNA. Ten zestaw służy do generowania tępo zakończonego DNA. Do tej reakcji należy umieścić następujące składniki w probówce o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości wiązania: 34 μl DNA, 5 μl 2,5 mM dNPT, 5 μL 10 mM ATP, 5 μL 10x buforu naprawy końcowej (5 mM DTT, 100 mM octanu magnezu, 660 mM octanu potasu, 300 mM octanu tris, pH 7,8), i 1 μl mieszanki enzymów end-repair (kinaza polinukleotydowa T4, polimeraza DNA T4).
  2. Inkubować próbkę przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania reakcji. Eluować naprawione na końcu DNA w 32 μl wstępnie podgrzanego (65 °C) buforu EB. Chociaż zwykle nie określamy ilościowo stężenia DNA po ChIP lub RNA po CARIP, przed przygotowaniem biblioteki zaleca się rozpoczęcie od co najmniej 5-10 ng DNA ChIP lub RNA CARIP.
  4. Dodanie nawisu 3' "A" do naprawionego na końcu DNA. Dodać składniki do 1,5 ml probówki o niskim stopniu wiązania: 30 μl DNA z góry, 5 μl 10x bufor NEB 2, 1 μl dATP z 10 mM bulionu, 11 μL H2O i 3 μl 5 U/μL fragmentu Klenowa (3'-5' Exo-), i delikatnie wymieszać, pipetując.
  5. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Użyj zestawu do oczyszczania reakcji, aby oczyścić DNA. Eluować DNA w 25 μl wstępnie podgrzanego (65 °C) buforu EB.
  7. Adapter Ligate. Dodać następujące składniki na lodzie: 23 μl DNA z góry, 3 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 1 μl wyżarzonego PE lub adaptera do multipleksowania (4 μM) i 3 μL ligazy DNA T4 (400 U/μL) i delikatnie wymieszać pipetując.
    UWAGA: Sekwencje adapterów można również uzyskać z komercyjnego źródła.
    Sekwencje oligonukleotydowe:
    Adaptery PE
    5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Adaptery multipleksujące
    5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
  8. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Dokonaj selekcji wielkości DNA za pomocą wstępnie odlanego (2%) żelu agarozowego. Uruchom żel przez 10 minut.
  10. Wyciąć region odpowiadający 250-450 bp.
    UWAGA: Przecinając żel powyżej 200 pz, zmniejsza się możliwość zanieczyszczenia nieligowanymi dimerami adaptera. Ważne jest, aby usunąć wszelkie nieligowane adaptery przed etapem PCR.
  11. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić DNA. Eluować w 20 μl buforu EB.
  12. PCR i oczyszczanie biblioteki dla ligowanych próbek DNA zawierających adaptery z parowanymi końcami (PE). Dodaj składniki do probówki PCR: 12 μl 50% DNA z góry, 12 μl wody, 25 μl mieszanki głównej (Phusion HF), 1 μl startera PE PCR 1.0 i 1 μl startera PE PCR 2.0.
    UWAGA: Sekwencje oligonukleotydowe można również uzyskać ze źródła komercyjnego.
    Sekwencje oligonukleotydowe:
    Grunt PE PCR 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Grunt PE PCR 2.0
    5' CAAGCAGAGACGGCATACGAGATCGGTCTCTCCTCTGCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
  13. PCR i oczyszczanie biblioteki dla ligowanych próbek zawierających adaptery Index PE. Dodaj składniki: 12 μl 50% DNA z góry, 12 μl wody, 1 μl startera PCR InPE 1.0 (rozcieńczonego 1:2), 1 μl startera PCR InPE 2.0 (rozcieńczonego 1:2) i 1 μl wskaźnika startera PCR (rozcieńczonego 1:2).
    UWAGA: sekwencje oligonukleotydowe można również uzyskać ze źródła komercyjnego.
    Sekwencje oligonukleotydowe:
    Multipleksowanie PCR Primer 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Multipleksujący podkład do PCR 2.0
    5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    Sekwencje indeksu startera PCR 1 - 12
    Starter PCR, indeks 1
    5' CAAGCAGAAGGGCATACGAGATCGTGATGATGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 2
    5' CAAGCAGAAGGGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 3
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 4
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 5
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 6
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 7
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 8
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 9
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 10
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 11
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
    Starter PCR, indeks 12
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC
  14. Wykonaj cykl PCR w następujących warunkach (denaturacja przez 30 s w temperaturze 98 °C, 18 cykli po 10 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 65 °C, 30 s w temperaturze 72 °C, 5 minut w temperaturze 72 °C, utrzymanie w temperaturze 4 °C).
    UWAGA: Liczbę cykli PCR należy określić empirycznie.
  15. Wybór rozmiaru produktów PCR. Uruchom DNA na prefabrykowanym żelu E-Gel EX (2%) lub domowym żelu 2% (agaroza) i wytnij obszar 300 - 500 pz.
  16. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić DNA z żelu. Eluować końcowy produkt PCR w 20 μl buforu EB.
  17. Użyj fluorometru, aby zmierzyć stężenie w bibliotece. Wykonuj sekwencjonowanie nowej generacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udało nam się zbadać wiązanie całego genomu H3K4me3, H3K4me2 i KDM5B w komórkach ES za pomocą tego protokołu ChIP-Seq6. Komórki ES hodowano w warunkach wolnych od karmnika (Rysunek 1) i usieciowano, jak opisano powyżej. Sonikację przeprowadzono następnie zgodnie z opisem w kroku 3.2 protokołu ChIP-Seq i oceniono, przeprowadzając DNA na 2% żelu agarozowym (Rysunek 2). Następnie wykonano ChIP zgodnie z opisem w kroku 4, a przyg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ChIP-Seq jest użyteczną metodą oceny lokalizacji globalnych interakcji białko-DNA (np. czynniki transkrypcyjne/enzymy modyfikujące histony/modyfikacje histonów i DNA) w komórkach ES, podczas gdy nowo opracowany protokół CARIP-Seq jest przydatny w badaniu asocjacji RNA w całym genomie ze składnikami chromatyny. ChIP-Seq jest podstawowym narzędziem, które służy do oceny krajobrazów epigenetycznych komórek ES i innych typów komórek. Jakość bibliotek ChIP-Seq i CARIP-Seq zależy w dużej mierze od przeciwciał klasy Ch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, grant z National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) przyznany B.L.K. W pracy wykorzystano sieć obliczeniową Wayne State University High Performance Computing Grid do zasobów obliczeniowych (). Dziękujemy Jiji Kurup za pomoc w analizie danych CARIP-Seq.

WKŁAD AUTORÓW:

B.L.K. wymyślił metodę CARIP-Seq, zaprojektował i przeprowadził eksperymenty ChIP-Seq i CARIP-Seq, przeanalizował dane sekwencjonowania i sporządził manuskrypt. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czynnik hamujący białaczkę myszy (ESGRO LIF)EMD Millipore106 lub 107 jednostek
inhibitora GSK3 i beta CHIR99021 (GSK3i)Rozpuszczalnik macierzystyDMSO 10mM
Inhibitor MEK PD0325901 (MEKi)Rozpuszczalnik stemjący: DMSO 10mM
Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM), wysoka zawartość glukozyInvitrogen11965092
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)Invitrogen10010031
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200056
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140122
2-merkaptoetanol (50 mM)Gibco31350010
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Gibco11140076
EmbryoMax ES Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca, 500 mlEMD MilliporeES-009-B
EmbryoMax 0,1% roztwór żelatynyEMD MiliporeES-006-B
GlicynaSigmaG7126-500G1,25 M kontentacja zapasu w wodzie
Roztwór formaldehyduSigmaF8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8,0 1XJakość Biologiczna351-011-131
Roztwór fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF)Sigma93482-250ML-F
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche11697498001
Roztwór dodecylosiarczanu sodu (20%)Jakość BiologicznaA611-0837-10
Q125 sonifierQsonica4422
Triton X-100 roztwórSigma93443-100ML
Deoksycholan soduSigma30970
NaClSigmaS7653
Dynabeads Białko G do immunoprecypitacjiInvitrogen10004D
Dynabeads Białko A do immunoprecypitacjiInvitrogen10002D
Dynabeads Białko A/Białko G i Zestaw startowy magnesówInvitrogen10015D
Chlorek lituSigmaL4408
IGEPAL CA-630SigmaI8896
RNeasy Mini KitQiagen74104
Dynabeads Zestaw do oczyszczania mRNA (do oczyszczania mRNA z całkowitych preparatów RNA)Invitrogen61006
SuperScript Dwuniciowa synteza cDNA ZestawInvitrogen11917010
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104
Zestaw do naprawy końca DNA End-ItLucigenER81050
Fragment Klenowa (3'→ 5' egzo-)NEBM0212L
dATP (10 mM)Invitrogen18252015
Ligaza DNA T4NEBM0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA LadderInvitrogen10488085
E-gel EX żele agarozowe, 2%InvitrogenG402002
Phusion high-fidelity 2X master mix z buforem HFThermo Fisher
ChIPAb+ trimetylohiston H3 (Lys4) - Przeciwciało zatwierdzone przez ChIPEMD Millipore17-614
Przeciwciało anty-histonowe H3 (di metylo K4) [Y47] - Klasa ChIP (ab32356)Abcamab32356
Płytki do hodowli komórkowych Corning Costar z płaskim dnem (6-dołkowe)Fisher720083
Falcon Standardowe naczynia do hodowli tkankowych (10 cm)Fisher08772E
Bioruptor picoDiagenodeB01010001
Qubit Flurometer 2.0Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Zestaw testowyThermo FisherQ32851
Zestaw do oczyszczania reakcji MinEluteQiagen28204
Zestaw do ekstrakcji żelu MinEluteQiagen28604
Przeciwciało anty-histonowe H4 (tri metylo K20) - Klasa ChIP (ab9053)Abcamab9053
Rotator LabquakeThermo Fisher400110Q
Platforma Illumina HiSeqIllumina
TURBO DNaseInvitrogenAM2238
: F531LPM

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  3. Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
  4. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  5. Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
  6. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32(2014).
  7. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
  8. Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
  9. Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  10. Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
  11. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
  12. Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28(2016).
  13. Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
  14. Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
  15. Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
  16. Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  17. Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
  18. Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
  19. Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
  20. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  21. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  22. Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
  23. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  24. Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
  25. Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
  26. Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
  27. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunoprecypitacja chromatynysekwencjonowanie nast pnej generacjimodyfikacje histon wczynniki transkrypcyjneregulatory epigenetyczne

Powiązane artykuły