Artykuł metodologiczny

Ablacja populacji neuronów za pomocą lasera dwufotonowego i jej ocena za pomocą obrazowania wapnia i rejestracji behawioralnej u larw danio pręgowanego

DOI:

10.3791/57485

⸱

2 czerwca 2018

 , 
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do ablacji genetycznie znakowanej subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego lasera z larw danio pręgowanego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić rolę subpopulacji neuronów w zachowaniu, konieczne jest przetestowanie konsekwencji blokowania jej aktywności u żywych zwierząt. Laserowa ablacja neuronów jest skuteczną metodą w tym celu, gdy neurony są selektywnie znakowane za pomocą sond fluorescencyjnych. W niniejszej pracy opisano protokoły laserowej ablacji subpopulacji neuronów za pomocą mikroskopu dwufotonowego oraz badania jej konsekwencji funkcjonalnych i behawioralnych. W tym badaniu jako model badawczy wykorzystano zachowanie chwytania zdobyczy u larw danio pręgowanego. Wiadomo, że obwód pretekto-podwzgórzowy leży u podstaw tego wizualnie sterowanego zachowania łapania zdobyczy. Pretectum zebry pręgowanego poddano ablacji laserowej i zbadano aktywność neuronalną w dolnym płacie podwzgórza (ILH; cel projekcji przedtektalnej). Przetestowano również zachowanie chwytania zdobyczy po ablacji pretektalnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć, jak zachowanie wynika z aktywności neuronów w mózgu, konieczne jest zidentyfikowanie obwodów neuronowych, które są zaangażowane w generowanie tego zachowania. W stadium larwalnym danio pręgowany stanowi idealny model zwierzęcy do badania funkcji mózgu związanych z zachowaniem, ponieważ ich małe, przezroczyste mózgi umożliwiają badanie aktywności neuronalnej w rozdzielczości komórkowej w szerokim obszarze mózgu podczas obserwacji zachowania1. Obrazowanie aktywności neuronalnej w określonych neuronach stało się możliwe dzięki wynalezieniu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Ca) (GECI), takich jak GCaMP2. Transgeniczne danio pręgowane GCaMP okazały się przydatne do kojarzenia funkcjonalnego obwodu neuronalnego z zachowaniem poprzez przeprowadzanie obrazowania Ca u zachowujących się zwierząt3.

Podczas gdy obrazowanie Ca może wykazać korelacje między aktywnością neuronalną a zachowaniem, aby pokazać przyczynowość, tłumienie aktywności neuronalnej i testowanie jej konsekwencji dla zachowania są ważnymi krokami. Można to osiągnąć na różne sposoby: wykorzystanie mutacji genetycznej, która zmienia określone obwody neuronalne4, ekspresja neurotoksyn w określonych neuronach5,6, użycie narzędzi optogenetycznych, takich jak halorodopsyna7, oraz laserowa ablacja docelowych neuronów8,9. Ablacja laserowa jest szczególnie przydatna do eliminowania aktywności w stosunkowo niewielkiej liczbie określonych neuronów. Nieodwracalna eliminacja aktywności neuronalnej poprzez zabijanie neuronów ułatwia ocenę konsekwencji behawioralnych.

Ciekawym zachowaniem, które można zaobserwować w stadium larwalnym u danio pręgowanego, jest chwytanie zdobyczy (Rysunek 1A). To wizualnie sterowane, ukierunkowane na cel zachowanie zapewnia korzystny system eksperymentalny do badania ostrości wzroku10, transformacja wzrokowo-ruchowa11,12,13, percepcja wzrokowa i rozpoznawanie obiektów14,15,16,17,18, i podejmowanie decyzji19. To, w jaki sposób ofiara jest rozpoznawana przez drapieżniki i jak wykrywanie zdobyczy prowadzi do zachowania łapania zdobyczy, było głównym pytaniem w neuroetologii20. W niniejszej pracy skupimy się na roli obwodu pretekto-podwzgórza utworzonego przez rzuty jądra w pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, dalej nazywane po prostu pretectum) do ILH. Wykazano, że laserowa ablacja przedpiersia zmniejsza aktywność chwytania zdobyczy i znosi aktywność neuronalną w ILH, która jest związana z wizualną percepcją zdobyczy21. W tym miejscu opisano protokoły wykonywania ablacji laserowej i testowania jej działania za pomocą obrazowania Ca2+ i rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ablacja subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego mikroskopu laserowego

Uwaga: Jeśli użytkownicy planują wykonać obrazowanie Ca po ablacji, użyj UAShspzGCaMP6s line21. Jeśli użytkownicy planują wykonanie rejestracji behawioralnej po ablacji, należy użyć linii UAS:EGFP, ponieważ ablacja komórek EGFP-dodatnich jest łatwiejsza do wykonania niż komórek wykazujących ekspresję GCaMP6s.

  1. Zacznij od skonfigurowania krycia linii Gal4, która oznacza określone neurony do badania i UAS:EGFP lub UAShspzGCaMP6s. Pamiętaj, aby użyć tła masy perłowej dla obojga rodziców, aby można było uzyskać homozygoty masy perłowej.
    nuta: Homozygoty masy perłowej nie zawierają melanoforów na powierzchni ciała (Ryc. 1B). W niniejszym badaniu użyto linii Gal4 gSAIzGFFM119B (która oznacza pretectum) i innej linii Gal4 hspGFFDMC76A (która oznacza ILH)21.
  2. Następnego dnia po utrwaleniu godów zbierz jaja danio pręgowanego i podnieś je do stadium larwalnego, w którym to momencie neurony będące przedmiotem zainteresowania będą wyrażać fluorescencyjne reportery.
  3. Zamontuj larwę danio pręgowanego w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (Rysunek 1B).
    1. Zacznij od przygotowania 2% roztworu podstawowego agarozy: rozpuść 2 g proszku agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml wody systemowej (tj. wodzie używanej do utrzymywania dorosłego danio pręgowanego w systemie wody krążącej)22 lub E3 water23, doprowadzając wodę do temperatury wrzenia w kuchence mikrofalowej i energicznie mieszając.
    2. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej 2% bulion agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aż się zagotuje. Wlej 3,5-4,0 ml agarozy na pokrywkę 6-centymetrowej szalki Petriego. Poczekaj, aż agaroza ostygnie, aby była ciepła w dotyku, zanim przejdziesz dalej.
    3. Następnie umieść pojedynczą larwę (nie znieczuloną na tym etapie) w agarozie. Kontynuuj regulację pozycji i orientacji larwy tak, aby była pionowa, używając igły preparującej (Rysunek 1C), aż agaroza zastygnie, aby zapewnić prawidłowe ułożenie larwy.
      nuta: Larwa będzie nadal pływać, podczas gdy agaroza zestala się.
    4. Po umieszczeniu larwy odczekaj 5 minut, aż agaroza całkowicie się zestali.
    5. Wlać 5 ml roztworu tricainy (0,4% przy 1x stężeniu roboczym) na agarozę.
      nuta: Aby uniknąć ruchów larw podczas ablacji laserowej, larwy muszą być znieczulone przez cały czas trwania procedury ablacji.
  4. Abblować larwę za pomocą funkcji wybielania w dwufotonowym systemie mikroskopii laserowej.
    1. Umieść larwę zanurzoną w agarozie pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym i uruchom system mikroskopowy.
    2. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij przycisk "Włącz" na karcie "Laser", aby włączyć laser (Rysunek 1D). Poczekaj, aż "Stan" lasera zmieni się z "Zajęty" na "Zablokowany w trybie".
    3. W zakładce "Kanały" ustaw długość fali lasera na 880 nm (maksymalna moc: około 2 300 mW) dla ablacji EGFP lub na 800 nm (maksymalna moc: około 2 600 mW) dla ablacji GCaMP.
    4. Wybierz soczewkę obiektywu 20X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu. Kliknij kartę "Zlokalizuj", kliknij "GFP", aby zmienić ścieżki optyczne i bezpośrednio view fluorescencja na oko.
    5. Zlokalizuj mózg larwy danio pręgowanego w centrum view, a następnie kliknij zakładkę "Akwizycja", aby wrócić do mikroskopii dwufotonowej.
    6. Aby zapisać stan "przed ablacją", należy wykonać zdjęcie stosu z użyciem soczewki obiektywu 20X z dużą szybkością skanowania (aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych wysoką temperaturą). Później porównaj zdjęcia wykonane przed i po eksperymentach ablacyjnych (Rysunek 2A). Aby uzyskać z-stack, kliknij "Z-Stack", aby wybrać opcję z-stack i rozwinąć zakładkę. Ustaw dolną granicę (kliknij przycisk "Ustaw najpierw") po skupieniu się na brzusznym końcu mózgu larwy i ustaw górną granicę (kliknij przycisk "Ustaw ostatnią") po skupieniu się na najbardziej grzbietowej powierzchni mózgu. Następnie kliknij przycisk "Rozpocznij eksperyment", aby uruchomić akwizycję obrazu z-stack.
    7. Wybierz soczewkę obiektywu 63X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu.
    8. Kliknij kartę "Zlokalizuj", aby przełączyć się na mikroskopię epifluorescencyjną, zlokalizuj komórki do ablacji w centrum view przez oko, a następnie kliknij kartę "Akwizycja", aby wrócić do laserowej mikroskopii skaningowej.
  5. Na karcie "Tryb akwizycji" ustaw "Rozmiar ramki" na 256 x 256. Kliknij "Na żywo" i obserwuj interesujące Cię neurony.
  6. Zaczynając od najbardziej grzbietowej strony, znajdź płaszczyznę ogniskową, w której komórki do ablacji są ostre.
  7. Zaznacz mały, okrągły obszar o średnicy około jednej trzeciej średnicy komórki na każdym neuronie jako obszar zainteresowania (ROI) za pomocą funkcji "Regiony".
  8. Ustaw prędkość skanowania na 13,93 s/256 x 256 pikseli (134,42 μm x 134,42 μm), co odpowiada czasowi przebywania lasera wynoszącemu około 200 μs/piksel lub 200 μs/0,5 μm. Ustaw również 4 powtórzenia ("Cykl iteracji: 4"). Alternatywnie zoptymalizuj liczbę iteracji i szybkość skanowania, aby osiągnąć wystarczającą ablację.
  9. Wykonaj funkcję "Wybielanie" dla ablacji, w połączeniu z "Szeregiem czasowym (2 cykle)", aby zobrazować próbkę (przed i po ablacji) i "Regiony" (aby ustawić ROI) lub równoważnymi funkcjami w używanym oprogramowaniu (Rysunek 1D).
  10. Porównując pierwszy obraz (przed ablacją) i drugi obraz (po ablacji) w cyklu szeregów czasowych, upewnij się, że po wybielaniu fluorescencja w docelowych komórkach zmniejsza się do wartości obserwowanej na poziomie tła (Rysunek 2B).
  11. Jeśli fluorescencja jest nadal obecna po ablacji, zwiększ liczbę iteracji.
  12. Następnie przesuń płaszczyznę ogniskową nieco głębiej (tj. w kierunku strony brzusznej) i wybierz kolejną płaszczyznę ogniskowej, w której pojawiają się komórki niepoddane ablacji.
  13. Wykonaj funkcję wybielania zgodnie z powyższym opisem (krok 1.9). Powtarzaj te kroki, aż wszystkie komórki w interesującej nas strukturze neuronalnej zostaną usunięte.
  14. Po przejściu przez wszystkie płaszczyzny ogniskowe pokrywające struktury nerwowe, które mają zostać poddane ablacji, sprawdź komórki pod kątem zniesionej fluorescencji. Jeśli okaże się, że niektóre komórki nadal są fluorescencyjne z powodu niewystarczającej ablacji, należy je ponownie naświetlić laserowo, jak opisano powyżej.
  15. Jeśli larwa musi zostać odzyskana z agarozy po napromieniowaniu laserowym, nie próbuj wypychać jej z agarozy, ponieważ może to uszkodzić larwę. Zamiast tego ostrożnie wykonaj drobne nacięcia w agarozie wokół larwy prostopadle do powierzchni jej ciała. Następnie poczekaj, aż larwa sama wypłynie z agarozy, gdy środek znieczulający ustąpi.
  16. Przejdź do następnej larwy w celu ablacji lub przeprowadź eksperymenty kontrolne przy użyciu innej populacji neuronów, które nie są zaangażowane w badane zachowanie.
    nuta: Tutaj, jako kontrola, neurony opuszki węchowej w UAS:EGFP; Larwy gSAIzGFFM119B zostały poddane ablacji laserowej przy użyciu tego samego protokołu opisanego powyżej (Rysunek 2A, po prawej).
  17. Odczekaj kilka godzin lub 1 dzień na regenerację przed przystąpieniem do obrazowania Ca (sekcja 2) lub rejestracji behawioralnej (sekcja 3). W tym czasie rekonwalescencji należy sprawdzić stan zdrowia larw (tj. normalne spontaniczne pływanie, brak widocznych uszkodzeń termicznych wokół obszaru poddanego ablacji itp.) i usunąć larwy wykazujące jakiekolwiek oznaki złego stanu zdrowia.

2. Obrazowanie wapnia w celu zarejestrowania aktywności neuronalnej wywołanej przez zdobycz u larw danio pręgowanego

  1. Aby przygotować komorę zapisu, umieść uszczelkę komory hybrydyzacyjnej z bezpiecznym uszczelnieniem na szkiełku podstawowym do szyby, stroną klejącą skierowaną do szkła i zdejmij górną uszczelkę.
    nuta: W ten sposób powstaje mała komora zapisu o średnicy 9 mm i głębokości 0,8 mm (Rysunek 3A).
  2. Następnie umieść nylonową siatkę (rozmiar otworu: 32 μm) na probówce o pojemności 50 ml, która ma rozcięte dno. Użyj nasadki, aby przymocować siatkę do rurki (Rysunek 3B).
  3. Przygotuj pantofelka (który jest zdobyczą, która ma być wykorzystana jako bodziec wzrokowy dla larwy).
    nuta: Przygotuj wcześniej kulturę pantofelka (kroki 2.3.1 i 2.3.2).
    1. Uzyskaj kulturę nasion pantofelka ze źródeł komercyjnych lub akademickich centrów zasobów biologicznych24 z wyprzedzeniem.
    2. Hoduj pantofelek przez kilka dni w wodzie zawierającej autoklawowaną słomę ryżową i granulkę suchych drożdży piwnych22 (Rysunek 3C).
    3. Przelej kulturę pantofelka kolejno przez 2 sita (jedno z aperturą 150 μm, a następnie drugie z aperturą 75 μm), aby usunąć zanieczyszczenia z kultury.
    4. Zbierz pantofelek w przepływie z poprzedniego kroku na siatce nylonowej (otwór 13 μm).
    5. Ponownie zawieś pantofelek na nylonowej siatce w szklanej zlewce, używając wyciśniętej butelki z wodą systemową (Rysunek 3D).
  4. Opłucz siatkę (Rysunek 3B) w wodzie systemowej 2x (Rysunek 3E).
    nuta: Celem tego etapu jest usunięcie wszelkich możliwych substancji zapachowych i smakowych zawartych w pożywce hodowlanej pantofelków, ponieważ celem niniejszego badania jest obserwacja wizualnie sterowanej aktywności neuronalnej.
  5. Umieść larwę danio pręgowanego w roztworze tricainy w celu znieczulenia.
  6. Zamontuj pojedynczą larwę w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia.
    1. Najpierw podgrzej w kuchence mikrofalowej 2% agarozę o niskiej temperaturze topnienia i dodaj 1/10 objętości 10x stężonej trikainy do agarozy.
    2. Umieść jedną kroplę agarozy zawierającej trikainę w komorze zapisu (Rysunek 3A).
    3. Po upewnieniu się, że agaroza nie jest zbyt gorąca, umieść znieczuloną larwę (z kroku 2.5) w agarozie, natychmiast usuwając nadmiar agarozy, tak aby powierzchnia agarozy wyglądała na lekko wypukłą.
    4. Szybko ustaw larwę w pozycji pionowej za pomocą igły do preparowania (Rysunek 1C).
      nuta: Procedury te muszą zostać zakończone w ciągu kilku sekund, zanim agaroza zastygnie.
    5. Gdy larwa zostanie prawidłowo umieszczona, odczekaj 5 minut, aż agaroza całkowicie się zestali. Następnie wlej kroplę 1x roztworu tricainy na agarozę.
  7. Usuń agarozę wokół głowy larwy danio pręgowanego i zrób miejsce na pantofelek do pływania za pomocą noża chirurgicznego. Aby to zrobić, najpierw wykonaj kilka małych nacięć w agarozie (Rysunek 3F). Następnie ostrożnie usuń nadmiar agarozy, delikatnie wylewając wodę systemową na komorę.
    nuta: Na tym etapie tricaine zostanie wypłukana.
  8. Następnie umieść jeden pantofelek w komorze nagrywającej, aby służył jako bodziec wizualny.
    nuta: Kiedy pantofelek pływa w pobliżu głowy larwy danio pręgowanego, wywołuje reakcję neuronalną (Ryc. 3G).
  9. Umieść komorę zapisu pod mikroskopem epi-fluorescencyjnym wyposażonym w naukową kamerę CMOS ( Rysunek 3H) i wybierz soczewkę obiektywową 2,5X (Rysunek 3I).
  10. Zbieraj nagrania poklatkowe sygnałów fluorescencyjnych GCaMP.
    1. Uruchom aplikację do akwizycji obrazu dla wyposażonej kamery.
    2. Kliknij "Okienko sekwencji" i wybierz "Rekord dysku twardego" w okienku. W sekcji Scan Settings (Ustawienia skanowania) ustaw "Frame Count" (Liczba klatek) na 900 lub dowolny inny żądany łączny numer klatki.
      nuta: Jeśli to możliwe, użyj oprogramowania do nagrywania poklatkowego z modułem (tutaj "Hard Disk Record"), który umożliwia efektywne zapisywanie danych na dysku twardym.
    3. W okienku "Przechwytywanie" ustaw czas ekspozycji na 30 ms (tj. 33,3 kl./s) i Binning 2 x 2.
    4. Na panelu dotykowym sterowania mikroskopem wybierz zestaw filtrów dla GFP, ponieważ GCaMP ma podobne widma wzbudzenia/emisji do GFP.
    5. Kliknij "Na żywo" w okienku przechwytywania, aby zlokalizować larwę w widoku kamery i ostrości (Rysunek 4A), a następnie kliknij "Zatrzymaj na żywo" i kliknij przycisk "Start". Zapisz film w formacie .cxd lub innym formacie zawierającym informacje o warunku pozyskania.
  11. Po nagraniach przeanalizuj sygnały fluorescencyjne GCaMP6s (sygnały Ca), uzyskując średnie wartości pikseli dla ROI ustawionego na strukturze mózgu w filmie poklatkowym za pomocą bezpłatnego oprogramowania Fiji25.
    nuta: Fiji to wersja ImageJ z wieloma preinstalowanymi przydatnymi wtyczkami i może odczytywać pliki obrazów w formacie .cxd za pomocą wtyczki Bio-Formats.
  12. Jeśli larwa porusza się nieznacznie podczas nagrywania, przeprowadź rejestrację obrazu, uruchamiając TurboReg plug-in26 na Fidżi. Z menu wybierz "Wtyczki", "Rejestracja" i "TurboReg".
  13. Zastanów się, jak analizować dane zgodnie z celem badania. Poniżej znajduje się przykład.
    1. Obliczyć F/F0 (intensywność fluorescencji za każdym razem, podzielona przez intensywność fluorescencji w spoczynku lub przed wystąpieniem stanu przejściowego Ca) w następujący sposób:
    2. Ustaw ROI na pretectum lub ILH za pomocą Menedżera ROI: w menu wybierz "Analizuj", "Narzędzia", "Menedżer ROI" i "Dodaj" do listy ROI (Rysunek 4A).
    3. Oblicz średnie wartości pikseli dla ROI (tj. intensywności fluorescencji GCaMP6s), wybierając w panelu Menedżer ROI: "Więcej", "Wiele miar" i "OK". Zapisz wyniki jako plik arkusza kalkulacyjnego.
    4. Ponieważ sygnały są zaszumione, uśrednij sygnały dla 11 punktów czasowych (średnia ruchoma) za pomocą aplikacji, która może obsługiwać dane z arkusza kalkulacyjnego.
    5. Podziel F (intensywność fluorescencji w czasie) przez F0 (intensywność fluorescencji na poziomie podstawowym), aby obliczyć znormalizowaną intensywność fluorescencji. Jako przykład wizualizacji danych, zmiany w znormalizowanej intensywności fluorescencji GCaMP6s w pretectum i ILH są oznaczone kolorami i odwzorowane na trajektoriach pantofelka (Rysunek 4B - D).

3. Ocena konsekwencji behawioralnych po ablacji laserowej

  1. Skonfiguruj behawioralny system nagrywania, który składa się ze stereoskopu wyposażonego w kamerę wideo. Używaj aparatu z odpowiednim oprogramowaniem do akwizycji obrazu, komercyjnego lub wykonanego na zamówienie (Rysunek 5A).
  2. Zoptymalizuj warunki oświetleniowe, aby pantofelek mógł zostać wykryty przez przetwarzanie obrazu. Na przykład użyj pierścieniowego białego światła LED z elementem dystansowym (Rysunek 5B).
    nuta: Odległość od diody LED i kąt jej nachylenia wpływają na wygląd próbki (tj. jasny na ciemnym tle lub ciemny na jasnym tle) i dlatego mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego przetwarzania obrazu. Określ najlepszą wysokość przekładki (Rysunek 5C).
  3. Umieść larwę danio pręgowanego (odzyskaną z eksperymentu z ablacją laserową opisaną w sekcji 1) w komorze rejestrującej zachowanie (która była przymocowana do szklanego szkiełka) z usuniętą oryginalną górną uszczelką (Rysunek 5D).
  4. Zebrać 50 pantofelków z kultury (krok 2.3.5) za pomocą mikropipety i umieścić je w komorze rejestrującej.
  5. Umieść szkiełko nakrywkowe na górze komory nagrywania. Umieść niewielką kroplę wody na szkiełku nakrywkowym przed umieszczeniem na powierzchni wody w komorze nagrywającej, aby uniknąć wprowadzania powietrza do komory.
    nuta: Na tym etapie trochę wody z pantofelkiem wyleje się z komory nagrywającej. Pozostała liczba pantofelków w komorze zapisu wyniesie około 30-40.
  6. Umieść komorę zapisu (zawierającą larwę i pantofelek) w systemie oświetleniowym (Rysunek 5D).
  7. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe z szybkością 10 kl./s przez 11 min (6 600 klatek).
  8. (Opcjonalnie) Dla każdej larwy, która została przebadana pod kątem zachowania, obserwuj fluorescencję obszarów poddanych ablacji laserowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić skuteczność ablacji laserowej (tj. brak lub znacznie zmniejszoną liczbę komórek fluorescencyjnych w obszarze naświetlanym laserem).
    nuta: Nawet po napromieniowaniu, niektóre komórki fluorescencyjne można nadal zaobserwować ze względu na późniejszy początek ekspresji genu Gal4 w komórkach, które różnicowały się po ablacji27.
  9. Po zarejestrowaniu zachowania larwy, aby zrekompensować brak jednolitości tła, wykonaj podział piksel po pikselu każdej klatki przez średni obraz na Fidżi: kliknij "Proces", "Kalkulator obrazu", "Operacja: Dziel", "32-bitowy (zmiennoprzecinkowy) wynik" i "OK". Aby utworzyć uśredniony obraz, kliknij "Obraz", "Stosy", "Z-Project", "Średnia intensywność" i "OK" (Rysunek 5E, F).
  10. Policz liczbę pantofelków pozostałych w komorze, klikając "Analizuj", "Analizuj cząstki", ustawiając zakres obszaru, który obejmuje wszystkie pantofelki, zaznaczając pole wyboru "Pokaż: Maski" i klikając "OK". Opcja 'Pokaż:Maski' dostarczy wyodrębniony obraz pantofelka (Rysunek 5G), z listą liczby cząstek (paramecji) w każdej klatce.
  11. Wykreśl liczbę pantofelków pozostałych w komorze zapisu w czasie. Ponieważ szacunki liczby pantofelków są zaszumione, zalecamy wykonanie średniej ruchomej dla każdego punktu w zakresie 600 klatek (1 minuta) w arkuszu kalkulacyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne neurony zostały genetycznie oznaczone za pomocą EGFP lub GCaMP6, których ekspresja była sterowana liniami Gal4. Linia Gal4 gSAIzGFFM119B została użyta do znakowania jądra w obszarze przedtektalnym (magnokomórkowe powierzchowne jądro przedtektalne) oraz subpopulacji neuronów opuszki węchowej. Inna linia Gal4, hspGFFDMC76A, została użyta do oznaczenia ILH. Przeprowadziliśmy laserową ablację neuronów przedtektalnych obustronnie (Ryc. 2Lewy pan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż laser dwufotonowy ma doskonałą rozdzielczość przestrzenną, aby specyficznie ablować poszczególne neurony, należy zachować dużą ostrożność, aby uniknąć niepożądanych uszkodzeń tkanki mózgowej spowodowanych ciepłem. Najważniejszym krokiem w eksperymencie ablacyjnym jest określenie optymalnej ilości promieniowania laserowego. Niewystarczające napromieniowanie nie jest w stanie zabić neuronów. Zbyt duże napromieniowanie spowoduje uszkodzenie cieplne otaczającej tkanki, co spowoduje niepożądane skutki. Optymalny zakre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania zostały sfinansowane z grantów otrzymanych od MEXT, JSPS KAKENHI Granty o numerach JP25290009, JP25650120, JP17K07494 i JP17H05984.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NuSieve GTG AgarozaLonzaCat.#50080niska temperatura topnienia agaroza
6 cm szalka PetriegoFALCONProdukt#:351007
igła preparcyjnaAS ONE CorporationCat. Nr 2-013-01
https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 LSM7MPDwufotonowy laserowy mikroskop skaningowyCarl Zeiss
W Plan-Apochromat 63x/1.0Soczewka obiektywowa Carl Zeiss63X
Imager.Z1Carl Zeissmikroskop epi-fluorescencyjny
ZENCarl ZeissOprogramowanie do akwizycji obrazów dla mikroskopów konfokalnych
Uszczelka komory hybrydyzacji Secure-Seal, 8 komór, średnica 9 mm x głębokość 0,8 mmKatalog sond molekularnych# S-24732Używany jako komora zapisowa w obrazowaniu
Ca Komory obrazowaniaGrace Bio-LabsKomory obrazowania CoverWell PCI-A-2.5Używany jako behawioralny
nóż chirurgicznyMANINóż okulistyczny MST15
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsmodel: C11440-22CUnaukowa kamera CMOS
HCImageOprogramowanie do analizy ostrości obrazuHamamatsu Photonics
Moduł nagrywania dysku twardegoHamamatsu PhotonicsModuł oprogramowania umożliwiający zapis plików filmowych na dysku twardym w krótkim czasie
SZX7Olympusstereoskop
DF PL 0,5XOlympusobiektyw do SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 VisioFLIR Systems, Inc.Nr produktu Kamera CMOS GS3-U3-41C6NIR-CKamera
XIMEA xiQ KameraXIMEANr produktu Kamera CMOS MQ042RG-CM
z pierścieniowym światłem LEDCCSModel: LDR2-100SW2-LABiała dioda LED
Nylonowa siatka 32 i mikro; mEkran TokyoN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Siatka nylonowa 13 i mikro; mEkran tokijskiN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metal seive 150 mikronówEkranhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metal seive 75 mikronówEkranhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Food & Opieka zdrowotna, Co. Sp. z o.o.suche drożdże piwne
LabVIEWNational Instrumentszintegrowane środowisko programistyczne do programowania
Mai-Tai HPSpectra Physics Laser dwufotonowy 
w komorze zapisu tokijski tokijski

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86(2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015(2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878(2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029(2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
  24. National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
  25. Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  28. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).
  29. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dwufotonowa ablacja laserowaablacja populacji neuron wanaliza obrazowania wapniowegorejestracja behawioralna danio pr gowanegoobw d pretekto podwzg rzowym zg larw danio pr gowanegozachowanie chwytania ofiarydolny p at podwzg rzamikroskopia epifluorescencyjnaakwizycja stosu Z

Powiązane artykuły