Testowanie odpowiedzi metapoznawczej za pomocą testu opóźnionego dopasowania do próbki opartego na zapachu u szczurów

Summary

Ten protokół opisuje metodę badania możliwości metapamięci, czyli świadomości pamięci, u gryzoni. Paradygmat opóźnionego dopasowania do próbki oparty na zapachu jest nowatorskim, ekologicznie istotnym testem behawioralnym, przydatnym do określenia zakresu, w jakim gryzonie mogą reagować adaptacyjnie w oparciu o poznawcze monitorowanie siły ich stanów pamięci.

Abstract

Metamemory obejmuje zdolność poznawczą do oceny siły swoich wspomnień. Aby zbadać możliwość metapamięci u zwierząt innych niż ludzie, stworzono wiele zadań behawioralnych, z których wiele wykorzystuje opcję odrzucenia testów pamięciowych. Aby ocenić metapamięć u szczurów, wykorzystaliśmy ten paradygmat testu spadku, dostosowując poprzednie wizualne testy opóźnionego dopasowania do próbki (DMTS)^1,2 opracowany dla gatunków naczelnych do testu opartego na zapachu odpowiedniego dla gryzoni. Najpierw szczury otrzymują próbkę do zapamiętania, kopiąc w kubku pachnącego piasku. Po pewnym czasie szczurowi przedstawia się cztery kubki o wyraźnie pachnącym zapachu, z których jeden zawiera identyczny zapach odczuwany podczas pobierania próbki; Jeśli ten pasujący kubek zostanie wybrany, szczur otrzymuje preferowaną, większą nagrodę. Wybór któregokolwiek z pozostałych trzech niepasujących do siebie kubków zapachowych wypełnionych piaskiem nie skutkuje żadną nagrodą. Interwały retencji są indywidualnie miareczkowane w taki sposób, aby badani wykonywali od 40 do 70% poprawnie, dzięki czemu szczury czasami pamiętają, a czasami zapominają próbkę. W tym przypadku operacyjna definicja metapamięci to zdolność do rozróżniania obecności i braku pamięci poprzez reagowanie behawioralne. W tym celu, w dwóch trzecich prób, oprócz czterech kubków wyboru (próby wyboru), przedstawiana jest opcja odrzucenia. Jeśli wybrana zostanie opcja testu odrzucenia – bezzapachowy kolorowy kubek z piaskiem, badany otrzymuje mniejszą, mniej preferowaną nagrodę i unika testu pamięci. W pozostałej jednej trzeciej prób opcja testu odrzucenia nie jest dostępna (próby wymuszone), co powoduje, że badani zgadują właściwą filiżankę, gdy próbka zostanie zapomniana. W testach wyboru badani, którzy wiedzą, kiedy pamiętają, powinni wybrać opcję odrzucenia, gdy pamięć jest słaba, zamiast przystąpić do testu i wybrać nieprawidłowo. W związku z tym znacznie wyższa wydajność w wybranych testach w porównaniu z testami wymuszonej pamięci wskazuje na adaptacyjne wykorzystanie odpowiedzi testu odrzucenia i odpowiedzi metapoznawczej.

Introduction

Metamemory to zdolność do oceny siły swoich wspomnień^2,3,4. Podczas gdy ludzie konsekwentnie wykazywali tę zdolność poznawczą, toczy się debata na temat istnienia metapamięci u zwierząt innych niż ludzie, np. ^5,6. Jedną z powszechnych metod testowania możliwości metapamięci jest przedstawienie zwierzętom innym niż ludzie opcji testu odrzucenia, która, jeśli zostanie wybrana, daje gwarantowaną, ale mniejszą nagrodę niż nagroda za poprawną odpowiedź na test. Jeśli badani mogą monitorować swoje stany pamięci, powinni odrzucić testy, gdy ich pamięć jest słaba (recenzje można znaleźć na stronie:^7,8,9,10).

W ciągu ostatnich kilku dekad procedury opracowane dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt¹¹ i gołębie¹² zostały dostosowane na kilka sposobów do dalszego testowania obecności metapamięci u małp^1,2,13. Być może najbardziej przełomowym badaniem metapamięci u małp był test opóźnionego dopasowania do próbki (DMTS) Hamptona¹. Po przeszkoleniu w zadaniu MTS opóźnienia między próbką a testem były miareczkowane tak, aby poziom trudności był pośredni, tak aby małpy miały szansę zapamiętać i zapomnieć próbkę. W związku z opóźnieniem, małpom zaprezentowano możliwość odrzucenia testu. Wyniki pokazały, że badani osiągali znacznie dokładniejsze wyniki w próbach, w których zdecydowali się wziąć udział w teście, niż w próbach przymusowych, co sugeruje, że małpy monitorowały siłę pamięci próby¹.

Większość testowanych do tej pory paradygmatów metapamięci wykorzystywała bodźce wzrokowe lub słuchowe, co nie jest zaskakujące, biorąc pod uwagę, że najczęściej testowanymi gatunkami były wysoce wzrokowe naczelne niebędące ludźmi, np. ^11,14. Spośród wcześniejszych ograniczonych badań, które istnieją na temat metapoznania u szczurów, zastosowaną modalnością sensoryczną była również wizualna lub słuchowa^15,16,17,18. Biorąc pod uwagę niedawne solidne dowody na reagowanie metakognitywne, gdy użyto zadania opartego na zapachu¹⁹, możliwe jest, że poprzednie niejednoznaczne wyniki u szczurów mogły wynikać z braku zastosowanych standardowych paradygmatów. Zaprojektowaliśmy paradigm^{19, który wykorzystywał} podstawowy zmysł szczura, węch, dostosowując paradygmat DMTS podobny do tego używanego u małp opisanych powyżej¹. Opisane tutaj zadanie polega na kopaniu w kubkach wypełnionych piaskiem, aby uzyskać nagrodę w postaci jedzenia, wykorzystując naturalne zachowanie gryzonia do kopania.

Metamemory można ocenić u szczurów za pomocą zadania DMTS opartego na zapachu, które jest tutaj prezentowane. Po pierwsze, ustalana jest hierarchia nagród w postaci jedzenia, dzięki czemu badani wykazują wyraźną preferencję dla bardziej cenionej nagrody. Szczury są następnie szkolone, aby kopać w kubku pachnącego piasku, aby otrzymać nagrodę. Po przedstawieniu kubka z próbką zapachową, badani muszą wybrać jeden z czterech kubków o wyraźnie pachnącym zapachu. Na dnie kubka zakopuje się nagrodę o tym samym zapachu co próbka. Po tym, jak szczury osiągną biegłość w podstawowych testach MTS, odstępy retencji (RI) są miareczkowane dla każdego szczura, tak aby wydajność mieściła się w przedziale od 40% do 70% wskaźnika sukcesu. W 2/3 prób szczury mają możliwość odrzucenia testu pamięci na rzecz mniej preferowanej nagrody. Zdolności metakognitywne szczurów ocenia się poprzez porównanie wyników w badaniach, w których przedstawiono opcję testu odrzucenia (próby wyboru) z próbami, w których szczury są zmuszane do przystąpienia do testu (próby wymuszone).

Chociaż tylko szczury Long-Evans były testowane w tym paradygmacie, zadanie to mogłoby być wykorzystane do testowania innych szczepów szczurów laboratoryjnych i myszy w celu dalszego badania metapamięci u gatunków gryzoni. Korzystne będzie również przetestowanie starzejących się gryzoni lub myszy transgenicznych z patologiami choroby Alzheimera, aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób zaburzenia pamięci wpływają na procesy metapoznawcze.

Protocol

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Providence College.

1. Tworzenie aparatury testowej

1. Skorzystaj z Komory Interakcji Społecznej (76,2 x 114,3 cm.), która jest podzielona na 3 oddzielne pokoje.
   1. Podziel środkowe pomieszczenie na próbkę i opóźnij pochylenie za pomocą tekturowej wkładki, którą można podnieść, przesuwając się po metalowych prowadnicach przymocowanych do ścian bocznych.
2. Użyj nieprzezroczystego papieru kontaktowego, aby przykryć przezroczyste ściany, aby uniemożliwić wzrokowy dostęp do innych pomieszczeń.
3. Po jednej stronie pomieszczenia po prawej stronie (pomieszczenie do testowania; patrz Rysunek 1), przykryj podłogę granulkami piasku i czerwonym papierem kontaktowym. Będzie to służyć jako wizualna i dotykowa wskazówka dyskryminująca dla opcji odrzucenia.
4. Po przeciwnej stronie sali egzaminacyjnej przykryj podłogę wypukłymi paskami, używając pasków taśmy maskującej, aby służyły jako wizualna i dotykowa wskazówka dyskryminująca dla testu wyboru. Przykryj paski czarnym papierem kontaktowym. Pozostałą środkową trzecią część komory pozostaw niezmienioną.

2. Rozwijanie hierarchii nagród za preferowane jedzenie/testowanie preferencji

1. Wybierz możliwe nagrody w postaci jedzenia do przetestowania. Upewnij się, że jedna nagroda jest większą nagrodą, a zatem "preferowaną" w stosunku do drugiej.
   1. Użyj całego kawałka płatka jako większej, "preferowanej" nagrody, a 1/4 kawałka płatka jako mniejszej, "mniej preferowanej" nagrody.
      nuta: Zboża mogą zawierać słodzone płatki zbożowe lub suszone prawoślaz. Możliwe jest również użycie dwóch różnych nagród (np. granulki zbożowe vs. standardowe granulki dla gryzoni (TestDiet, 45 mg)), ale trudno było określić wiarygodny ranking preferencji wśród osób i między osobami, gdy jakość, a nie ilość, była źródłem różnic między nagrodami.
2. Przynieś szczury (dorosłego samca Long Evans) do ciemnego pomieszczenia testowego 30 minut przed rozpoczęciem testów. Użyj czerwonego światła, aby oświetlić komorę testową, jeśli szczury znajdują się w ciemnej fazie swojego cyklu dziennego. Jeśli nie, przetestuj w normalnych warunkach oświetleniowych, jak pokazano na filmie.
3. Umieść dwie nagrody, cały kawałek płatków i 1/4 kawałka płatka, w przeciwległych rogach prawego pomieszczenia komory (patrz Rysunek 1).
4. Umieść szczura po przeciwnej stronie komory, tyłem do nagród i pozwól szczurowi zjeść jedną z nagród.
   nuta: Aby przejść testy preferencji i upewnić się, że większy kawałek płatków zbożowych jest preferowaną nagrodą, badany musi zjeść większą nagrodę w 4 z 5 prób (5 prób na sesję) przez 2 kolejne sesje. Przeprowadzaj dwie sesje dziennie.
   1. Jeśli po 10 sesjach szczur nie wykazał preferencji dla większego kawałka płatków zbożowych, wprowadź inną nagrodę.
5. Podczas testów, aby upewnić się, że preferencje szczurów pozostają spójne, wykonuj kontrole preferencji raz w tygodniu.
   1. Przeprowadzaj kontrole preferencji w taki sam sposób, jak testy preferencji, z całością i 1/4 kawałkiem zboża w przeciwległych rogach komory.
      Uwaga: 2 próby obejmują kontrolę preferencji.
   2. Jeśli szczury wybiorą mniej preferowaną nagrodę w obu próbach, przetestuj szczura w pełnym teście preferencji składającym się z 5 prób.
      1. Jeśli szczur przejdzie, może kontynuować testy.
      2. Jeśli szczur nie powiedzie się, przerwij testy i wprowadź inny rodzaj lub ilość nagrody.

3. Metody ogólne

1. Używaj konsekwentnych eksperymentatorów podczas testów, aby szczury były w pełni przyzwyczajone do zapachów eksperymentatorów i obchodzenia się z nimi.
   nuta: Zakłada się, że przed badaniem szczury były traktowane przez ludzi przez co najmniej 1 tydzień, tak aby przyzwyczaiły się do bycia podnoszonymi i przenoszonymi przez eksperymentatorów.
2. Przynieś szczury w ich klatkach z pudełkami po butach (klatka domowa) do pomieszczenia testowego 30 minut przed rozpoczęciem testów, aby zaaklimatyzować je w nowym pomieszczeniu.
3. Jeżeli badanie jest przeprowadzane w ciemnej fazie cyklu u szczurów, należy utrzymywać ciemne środowisko testowe, z wyjątkiem czerwonych świateł oświetlających aparaturę.
4. Upewnij się, że kubki zapachowe są ułożone we właściwej kolejności, zgodnie ze skryptem losowania, który zawiera równoważenie. Zanęć odpowiedni kubek całym kawałkiem płatków zbożowych.
5. Pozwól szczurowi kopać tylko w jednym kubku i natychmiast wyjmij szczura z aparatu po wybraniu kubka, jak wskazano podczas kopania. Umieść szczura w klatce domowej, w której szczur może dokończyć spożywanie nagrody.
6. Interwał między próbami (ITI) jest ustalony na 4 minuty. Rozpocznij odmierzanie czasu na stoperze, gdy szczur znajdzie się w klatce domowej.
   1. Podczas ITI należy wyczyścić urządzenie, odkurzając rozsypany piasek i przecierając podłogę 70% alkoholem izopropylowym. Wyrzuć nagrodę, jeśli nie została zjedzona podczas poprzedniej próby. Również raz w tygodniu wyczyść ceramiczne kubki, wyrzucając stary piasek i przecierając kubki alkoholem izopropylowym.
   2. Przygotuj kubki z piaskiem do następnej próby, zmieniając kolejność na podstawie skryptu losowania i nęcąc odpowiednią filiżankę.

4. Nauka kopania w kubkach z piaskiem i przyzwyczajenie do testowania aparatury

1. Wlej około 1/2 szklanki piasku do zabawy do ceramicznych kubków (6,99 cm średnicy i 8,81 cm wysokości).
2. Umieść na noc wypełniony piaskiem kubek z nagrodami w postaci jedzenia w domowej klatce każdego szczura.
   nuta: Szczury muszą z powodzeniem wkopać się do kubka i zjeść nagrodę przez noc przez dwie kolejne noce.
3. Przyzwyczaj szczura do aparatury testowej, umieszczając go w aparaturze na 5 minut.
   1. Rozłóż nagrody żywnościowe w całym urządzeniu, aby zachęcić do eksploracji aparatu i podróżowania przez otwarte drzwi. Upewnij się, że szczury nie oddają moczu, kału ani nie zamrażają się w komorze przez dwa dni z rzędu.
4. Przenieś bezwonny kubek wypełniony piaskiem z nagrodą w postaci jedzenia do aparatury badawczej. Upewnij się, że szczury z powodzeniem kopią w piasku i pobierają nagrodę co najmniej dwa dni z rzędu, bez zamarzania, kału lub oddawania moczu. W razie potrzeby wyjmij ceramiczne kubki i umieść zboża w komorze.

5. Trening Match-to-Sample (MTS)

1. Stwórz 4 różne pachnące stosy piasku, mieszając około 3 filiżanek piasku do zabawy z 1/4 łyżeczki pachnącej przyprawy (cynamon, kawa, papryka i tymianek). Aby kontrolować sygnały zapachowe, pokrusz jedną część nagrody w kubkach niewłaściwego wyboru.
   1. Mieszaj pachnący piasek raz w tygodniu i przechowuj w szklanych pojemnikach, aby siła zapachu była stała przez wszystkie dni testowe.
2. Wlej 1/2 szklanki każdego pachnącego piasku do 4 filiżanek i ułóż kubki w półkolu na czarnym papierze kontaktowym (obszar zadań MTS; Rysunek 1A). Upewnij się, że wszystkie kubki znajdują się w równej odległości od drzwi wejściowych.
   1. Uporządkuj kubki, umieszczając je w przypisanej pozycji na podstawie danych wyjściowych z oprogramowania do programowania "R" za pomocą funkcji próbkowania bez wymiany.
3. Poza zasięgiem wzroku obiektu zakop pełną część nagrody w odpowiednim pachnącym kubku. Zakop 1/2 cząstki nagrody w identycznie pachnącym kubku na próbkę. Zakop wszystkie nagrody co najmniej 1/2 wysokości piasku.
   1. Pseudolosowo wybierz odpowiednio pachnący kubek, jedynym ograniczeniem jest to, że żaden zapach nie jest zapachem próbki więcej niż 2 razy z rzędu.
4. Umieść badanego w komorze na próbkę i opuść kubek na próbkę za pomocą wygiętej szpatułki (uchwyt-taca pod kątem 90 stopni). Pozwól testerowi zagłębić się w kubek na próbkę i pobrać nagrodę w postaci 1/2 płatków zbożowych. Wyjmij kubek, gdy tylko badany zacznie jeść nagrodę.
5. Gdy tester skończy jeść nagrodę, podnieś kartonową przegrodę pokoju i otwórz drzwi do komory testowej, gdy badany wejdzie do pokoju opóźnienia.
6. Pozwól badanemu "wybrać" jedną z filiżanek, kopiąc. Gdy tylko tester dokona wyboru i odzyska nagrodę, jeśli jest obecna, usuń testera z komory i umieść go w klatce transferowej. Szczury mogą wąchać każdą filiżankę, ale mają tylko jeden wybór, zgodnie ze wskazaniami podczas kopania.
   1. Podczas 4-minutowego ITI należy oczyścić komorę 70% alkoholem izopropylowym. Odkurz piasek, który mógł się rozlać i w razie potrzeby uzupełnij kubki na piasek.
   2. Zdobądź następny kubek na próbkę i zanęć zarówno próbkę, jak i kubek testowy. Jeśli badany wybierze niewłaściwy kubek w poprzednim badaniu, usuń i wyrzuć niezjedzoną nagrodę.
7. Upewnij się, że pacjenci otrzymują jedną 6-próbną sesję MTS dziennie. Aby przejść szkolenie MTS, badani muszą wybrać właściwą filiżankę trzy z sześciu prób w dwóch kolejnych sesjach.
   nuta: Gwarantuje to, że wydajność jest powyżej szansy, ale poniżej pułapu w teście 4 wyborów.

6. Opóźnione miareczkowanie w opóźnionym dopasowaniu do próbki (DMTS)

1. Kontynuuj szkolenie przedmiotów na MTS jak poprzednio (zaczynając z opóźnieniem 0 s).
   nuta: Wydajność musi utrzymywać się na poziomie od 40 do 70%, aby zapewnić, że wydajność jest znacznie powyżej prawdopodobieństwa (25%), ale poniżej pułapu. Wydajność w tym zakresie pozwala badanym doświadczyć przypadków, w których pamiętają to samo i przypadków, gdy zapominają próbki. Stwarza to możliwość wykorzystania odpowiedzi testu odrzucenia na korzyść badanego w momencie wprowadzenia wybranych prób.
2. Jeśli wydajność przekracza 70% poprawnie przez 2 kolejne 6-próbne sesje, zwiększ opóźnienie od 0 do 30 s.
   1. W próbach, w których opóźnienie nie wynosi 0 s, użyj stopera, aby zmierzyć czas każdego opóźnienia. Po tym, jak tester skonsumuje próbkę, podnieś tekturową ściankę działową i pozwól testerowi wejść do komory opóźniającej. Zamknij tekturową przegrodę i rozpocznij odmierzanie czasu opóźnienia na stoperze.
   2. Po upływie 30 sekund otwórz drzwi do pokoju testowego i zamknij drzwi, gdy tester wejdzie do komory testowej.
   3. Kontynuuj pozostałą część procesu jak poprzednio.
3. Jeśli wydajność nadal utrzymuje się powyżej 70% poprawności przez 2 kolejne 6 sesji próbnych, zwiększ każde kolejne opóźnienie o 1,5 raza w stosunku do poprzedniego opóźnienia.
4. Jeśli wydajność spadnie poniżej 40% przez 2 kolejne sesje, opóźnienie zostanie przywrócone do poprzednio użytego.
5. Jeśli wydajność utrzymuje się między 40% a 70% przez 2 kolejne sesje, ustaw to opóźnienie jako opóźnienie kryterium specyficznego dla tematu.

7. Odrzuć szkolenie z użytkowania

1. Po każdej sesji treningu DMTS umieść kolejną filiżankę piasku o innej teksturze i kolorze, naprzeciwko pachnących kubków z piaskiem. Zanęć kubek mniej preferowaną nagrodą, 1/4 kawałka płatków zbożowych, który będzie kubkiem spadkowym. Wyjmij pachnące kubki z piaskiem z komory.
2. Przeprowadź próbę, tak jak podczas treningu DMTS, pozwalając badanemu na pobranie próbki losowo pachnącego kubka i poczekanie w komorze opóźniającej na opóźnienie specyficzne dla pacjenta.
3. Pozwól testerowi wkopać się w bezzapachowy kubek z piaskiem i odzyskać nagrodę. Następnie wyjmij obiekt z komory. Będzie to uważane za próbę "wymuszonej odmowy".
4. Przeprowadź dwie próby wymuszonego odrzucenia po każdej sesji treningu DMTS.

8. Testowanie: Próby przymusowe vs. z wyboru

1. Badani na DMTS przy użyciu opóźnienia kryterium. Przetestuj każdego uczestnika podczas jednej 12-próbnej sesji dziennie.
   1. Losowo wybierz 8 prób, które będą próbami "wyboru" i umieść kubek z opadkiem naprzeciwko kubków zapachowych. Użyj skryptu randomizacji, aby określić kolejność typu próby z ograniczeniem, że nie więcej niż 3 próby wyboru lub wymuszone występują po sobie.
      nuta: Pozostałe 4 próby zostaną "wymuszone", a kubek opadający zostanie usunięty z komory.
   2. W zależności od opóźnienia kryterium badanego, możliwe może być przetestowanie 2 lub 3 osób podczas ITI jednego szczura. Podczas ITI 1 pacjenta przeprowadź badanie kliniczne drugiego pacjenta. Upewnij się, że komora została oczyszczona alkoholem izopropylowym po każdej próbie.
   3. Badani na dziesięciu sesjach.
2. Podczas każdej próby, gdy szczur wejdzie do komory opóźniającej, upewnij się, że albo skręci w lewo, aby odrzucić test, albo skręci w prawo, aby przystąpić do testu (patrz Rysunek 1A; zdjęcie z góry na dół). Zapisz, czy szczur przemieszcza się z jednej strony pokoju na drugą (np. "decyduje się przystąpić do testu", a następnie przechodzi na stronę pomieszczenia z testem spadku).
   nuta: W związku z tym szczur dokonuje prospektywnego wyboru metapamięci, decydując się na przystąpienie lub odrzucenie testu przed napotkaniem czterech zapachów wyboru (zobacz dokument z wynikami¹⁹ w celu dokładnego omówienia równoległych i prospektywnych testów metapamięci).
3. Obliczaj dokładność prób wymuszonych w sposób ciągły po dwóch sesjach testowania i monitoruj użycie testu odrzucenia.
   1. Jeśli dokładność wzrośnie powyżej 70% w ciągu dwóch sesji, przerwij testowanie i wróć do opóźnienia miareczkowania z dłuższym opóźnieniem.
   2. Jeśli użycie testu odrzucenia zbliża się do 0% lub 100% konsekwentnie (przez 2 sesje), wstrzymaj testowanie i rozważ zwiększenie lub zmniejszenie wartości odpowiedzi testu odrzucenia, upewniając się, że wskaźniki odrzucenia wynoszą od 10% do 40%.
   3. Jeśli dokładność spadnie poniżej 40% przez 2 sesje, przerwij testowanie i wróć do miareczkowania opóźnionego z krótszym opóźnieniem.
   4. Powrót do testowania po dokładności w próbach wymuszonych pozostaje poprawny od 40% do 70% przez dwie kolejne sesje.
   5. W trakcie testów, aby upewnić się, że preferencje szczurów pozostają takie same, przeprowadzaj kontrole preferencji (2 próby na sesję) raz w tygodniu. Sprawdzanie preferencji opisano powyżej.

9. Sugerowane testy uogólniające

1. Testy uogólniające, takie jak te opisane w artykule z wynikami¹⁹ mogą być użyte do określenia, czy reagowanie metapoznawcze przenosi się między warunkami, w których żadne pojedyncze powiązanie z bodźcami zewnętrznymi prawdopodobnie nie kontroluje reagowania.
   1. Szczury testowe w próbach z sondą bez pobierania próbek, w których nie przedstawiono fazy próbki, ale RI i faza testowa prób są identyczne z normalnymi próbami. Losowo przemieszaj 4 próby sondowe z 8 próbami normalnymi, aby utworzyć 12-próbną sesję. Badani w 10 sesjach. Porównaj wskaźniki odrzucenia w próbach bez próbki ze wskaźnikami odrzucenia w normalnych próbach.
   2. Przetestuj szczury na podwójnej próbie, w której badanym dwukrotnie przedstawia się oryginalny zapach próbki, aby zwiększyć siłę pamięci. Losowo przemieszaj próby sondy z normalnymi próbami próbek, jak wyjaśniono powyżej. Porównaj wskaźniki odrzucenia w badaniach z dwiema próbami ze wskaźnikami odrzucenia w normalnych próbach.
   3. Badane szczury z trzema różnymi RI : opóźnieniem kryterium, jednym krótszym (np. 0 s) niż opóźnienie kryterium i drugim, który jest dłuższy (np. 4 min). Na każde opóźnienie w sesji należy przydzielić badanym cztery próby wyboru i dwie próby przymusowe, tak aby sesje składały się z 18 prób. Losowo wymieszaj wszystkie próby i testuj szczury podczas dziesięciu sesji. Porównaj wskaźniki odrzucenia prób dla trzech opóźnień, w których siła pamięci powinna być odpowiednio zmniejszona i zwiększona.

10. Analiza danych

1. Po zakończeniu testów należy obliczyć średnią proporcję poprawną dla prób przymusowych i wybranych dla każdego badanego.
   1. Aby określić proporcję prawidłowych prób przymusowych, należy podzielić liczbę prawidłowych prób przymusowych przez łączną liczbę prób przymusowych.
   2. Aby określić odsetek prawidłowo wybranych badań, należy najpierw odjąć odrzucone badania od całkowitej liczby badań klinicznych. Podzielić liczbę prób prawidłowego wyboru przez całkowitą liczbę prób wyboru pomniejszoną o odrzucone badania dla każdego szczura.
   3. Przeprowadź test t na danych grupowych, aby porównać proporcję prawidłowych prób wymuszonych z proporcją prawidłowo wybranych prób (patrz Rysunek 2).
   4. Jeśli przeprowadzane są testy uogólniające, należy przeprowadzić testy t dotyczące wskaźników spadku w normalnych próbach w porównaniu z próbami sondowymi, jak opisano w 9. W przypadku mieszanych prób opóźnionych, jak opisano w 9.1.3, należy porównać testy wymuszone i wybrane z ANOVA powtarzanych pomiarów z opóźnieniem i typem próby jako czynnikiem wewnątrzobiektowym. Przeprowadź również jednokierunkowe użycie ANOVA przy odrzuceniu w przypadku opóźnień, aby określić, czy dokładność różniła się w zależności od RI.

Results

W celu zbadania metapoznawczej odpowiedzi badanego, proporcja prawidłowych prób wymuszonych (podstawowa wydajność pamięci) jest porównywana z proporcją prawidłowo wybranych prób lub prób, w których występuje opcja odrzucenia. Na pozytywne wyniki wskazuje znacznie wyższa dokładność wybranych prób w porównaniu z próbami przymusowymi (Rysunek 2A). Wyniki te wskazują, że szczury mogą monitorować swoje stany pamięci i odmawiać wykonania zadania, gdy ich wspomnienia są słabe, co prowadzi do wzrostu dokładności, gdy w wybranych próbach dostępna jest opcja odrzucenia.

Jeśli wyniki nie są znacznie dokładniejsze w wybranych próbach w porównaniu do prób wymuszonych, wyniki są zerowe. Ten hipotetyczny brak dowodów na metapamięć u szczurów (Ryc. 2B) jest wskazywany przez nieużycie opcji testu odrzucenia, podczas gdy byłoby to adaptacyjne: w próbach, w których próbka została zapomniana.

Jeśli przeprowadza się testy uogólniające, wydajność metapoznawcza zostanie wskazana, jeśli badani odrzucą próby bez próby, znacznie częściej niż normalne próby próby, a próby podwójnej próby znacznie częściej niż normalne próby. Odrzucenie użycia powinno wykazywać odwrotną zależność od dokładności pamięci, jak wskazano na dokładności w próbach wymuszonych. Jeśli dokładność w testach wymuszonych nie różni się w zależności od warunków próby, zmień parametry (np. zwiększ RI), ponieważ niemożliwe jest określenie, czy badani zachowują się metakognitywnie, czy nie. W przypadku mieszanych testów opóźnień dokładność wybranych testów powinna być znacznie wyższa niż dokładność testów wymuszonych, a uczestnicy powinni być bardziej skłonni do odrzucenia testów z dłuższymi RI i najmniej skłonni do odrzucenia testów z krótszymi RRI. Zobacz dokument z wynikami, aby uzyskać więcej informacji na temat testów uogólniających i ich interpretacji¹⁹.

Rysunek 1. Fotografia aparatury doświadczalnej i procesu doświadczalnego. A) Zdjęcie aparatury zaadaptowane z¹⁹ za zgodą. B) Proces eksperymentalny. Pierwszy etap przyzwyczajenia, czyli nauczenie szczurów kopania w kubkach wypełnionych piaskiem, trwa dwie noce. Następnie szczury są przyzwyczajane do aparatury doświadczalnej i szkolone do kopania w kubkach wypełnionych piaskiem. Badani mają następnie do wyboru dwie nagrody, reprezentowane jako zielony trójkąt i czerwony półksiężyc (cały kawałek płatków zbożowych vs. ćwiartka płatków). Po tym, jak szczury wykazują znaczną preferencję dla jednej nagrody, przechodzą do treningu MTS, w którym kubki są wypełnione pachnącym piaskiem, reprezentowanym przez obrazy cynamonu, papryki, tymianku i kawy. Jeśli wskaźnik sukcesu jest niższy niż 50% przez dwie sesje, uczestnik kontynuuje szkolenie. Jeśli wskaźnik sukcesu szczurów wynosi 50% lub więcej, pacjent przechodzi do opóźnienia miareczkowania. Podczas miareczkowania opóźnionego szczury kontynuują trening MTS, ale wprowadza się opóźnienie między próbką a testem (zaczynając od 0 s). Jeśli dokładność pamięci szczurów przekracza 70%, RI jest zwiększane. Jeśli dokładność spadnie poniżej 40%, RI zostanie zmniejszone, a szkolenie MTS będzie kontynuowane. Ta pętla trwa do momentu, gdy dokładność szczurów spadnie między 40% a 70% przez dwie kolejne sesje. W tym momencie szczury przechodzą do testu eksperymentalnego, który składa się z losowo mieszanych prób wymuszonych i wybranych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Pozytywne wyniki wskazujące na odpowiedź metapoznawczą i hipotetyczne wyniki zerowe wskazujące na brak odpowiedzi metapoznawczej. A) Pozytywne wyniki zaadaptowane z ¹⁹ za zgodą. Średnia proporcja prawidłowych prób wymuszonych i wybranych została uzyskana na podstawie wyników 9 szczurów w 120 próbach każda. *=p<,05 w sparowanym dwustronnym teście t. Istotnie wyższy odsetek badań, w których udzielono prawidłowych odpowiedzi w wybranych badaniach, w porównaniu z badaniami wymuszonymi, wskazuje na właściwe zastosowanie odpowiedzi testu odrzucenia. B) Równoważny odsetek prób, na które udzielono prawidłowych odpowiedzi w próbach wymuszonych i wybranych, wskazuje na brak testów malejących na podstawie siły pamięci. Szansa, 0,25, jest oznaczona linią przerywaną. Słupki błędów reprezentują błąd standardowy średnich. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Przedstawiono nową metodę oceny reakcji metakognitywnej u szczurów przy użyciu zadania DMTS opartego na zapachu. Ze względu na to, że węch jest podstawowym zmysłem gryzoni, stosowanie zapachu jest lepsze niż wskazówki wizualne u szczurów i myszy ^20,21. Kopanie w piasku jest naturalnym zachowaniem żerowym szczurów, co sprawia, że zadanie to jest ekologicznie istotne dla gatunków gryzoni.

Kluczowym krokiem w protokole jest zapewnienie hierarchii nagród żywieniowych, z których jedna jest wyraźnie preferowana w stosunku do drugiej. We wczesnych fazach badania szczury musiały wybierać między przypuszczalnie preferowaną nagrodą, kawałkiem słodzonych płatków zbożowych i małymi standardowymi granulkami pokarmowymi. Jednak testowanie preferencji przyniosło bezkrytyczne zachowania związane z wyborem, powodując użycie ilości jako źródła zmienności nagrody. Szczury wybierały między całym kawałkiem zboża a 1/4 kawałka zboża i niezawodnie preferowały większą ilość. Bez preferencji, niezależnie od tego, czy chodzi o jakość żywności, czy ilość, nie ma motywacji do poddania się testowi zamiast jej odrzucenia, więc ten krok jest kluczowy.

Innym ważnym aspektem protokołu jest ustalenie odpowiednich RI i ITI, tak aby dokładność MTS pozostawała w zakresie od 40 do 70% poprawności. Jeśli opóźnienia są zbyt krótkie, a zakłócenia są minimalne - ze względu na długie ITI, szczury nigdy nie doświadczają "zapomnienia" próbki. I odwrotnie, jeśli RI są zbyt długie, a ITI są zbyt krótkie, test staje się zbyt trudny i szczury nigdy nie pamiętają próbki. Takie reakcje można wykryć nie tylko na podstawie dokładności wymuszonych prób, ale także na podstawie wskaźników odrzucenia, które są albo zbyt wysokie, albo zbyt niskie. Uczestnicy powinni odrzucić około 10-50% prób wyboru: jeśli uczestnik odmawia każdej próby lub nigdy nie odmawia, dane nie mogą być interpretowane jako pozytywne lub negatywne dla obecności metapamięci, a względna wartość odpowiedzi w teście odrzucenia musi zostać ponownie oceniona. Przez cały czas trwania eksperymentu średnia wydajność w próbach wymuszonych jest konsekwentnie obliczana na koniec dwóch dni testów. W miarę postępów szczurów w kolejnych próbach DMTS, ich wydajność może ulec poprawie, co zainicjuje miareczkowanie opóźnienia powrotu (patrz Rysunek 1B) tak, że opóźnienia mogą być odpowiednio zwiększone, tak aby dokładność pozostała poniżej 70% poprawności. Jeśli pamięć dla próbki stale przekracza 70%, rozważ zmniejszenie ITI. Jeśli pamięć próbki jest stale poniżej 40%, rozważ zwiększenie ITI i/lub zwiększenie wielkości próbki zapachu z czterech do 10-20 zapachów, aby zmniejszyć zakłócenia pamięci.

W zależności od użytego szczepu szczurów, środowiska przetrzymywania i cyklu jasnego i ciemnego, w którym przebywają zwierzęta, pamięć może być słabsza lub silniejsza. W porównaniu z innymi laboratoryjnymi szczepami szczurów, takimi jak Wistar czy Sprague Dawleys, Long Evans są znane z nabywania zadań poznawczych przy stosunkowo mniejszej liczbie prób ^22,23. W związku z tym może wymagać więcej etapów przyzwyczajenia i więcej treningu, aby inne gryzonie nauczyły się tego zadania. Szczury w niniejszym badaniu były trzymane w wysoce wzbogaconym środowisku z dostępem do ćwiczeń, więc możliwe jest, że ich pamięć była stosunkowo silna 24,25,26. Szczury użyte tutaj były również trzymane w odwróconym cyklu światło-ciemność, co może zwiększyć wydajność poznawczą, ponieważ były testowane podczas ich ciemnego cyklu.

Adaptacyjne zastosowanie odpowiedzi testu odrzucenia, na którą wskazuje znacznie wyższa wydajność przy wyborze w porównaniu z testami wymuszonymi, sugeruje odpowiedź metakognitywną. Jednak reagowanie metapoznawcze może wynikać z polegania na sygnałach pamięci wewnętrznej lub sygnałach zewnętrznych⁸. Aby ustalić, czy w rzeczywistości adaptacyjne użycie odpowiedzi testu odrzucenia jest wynikiem sygnałów pamięci wewnętrznej, eksperymentatorzy powinni dążyć do wyeliminowania jak największej liczby sygnałów zewnętrznych ^8,14. Za sygnały zewnętrzne uważa się wszelkie publicznie dostępne bodźce lub wskazówki specyficzne dla testu, które badani mogą wykorzystać do kierowania użyciem testu odrzucenia⁸. Potencjalne wskazówki zewnętrzne w tym zadaniu obejmują względną istotność poszczególnych zapachów, czas trwania próbki, opóźnienie odpowiedzi i czas trwania RI. Testy uogólniające, jak opisano tutaj i bardziej szczegółowo w dokumencie^{wyników 19}, są przydatne w wykluczaniu reakcji behawioralnych na podstawie sygnałów zewnętrznych, takich jak skojarzenia wskazówek środowiskowych, z powodu niespójności parametrów zadania w eksperymentach.

W tym paradygmacie szczur musi podjąć decyzję o przystąpieniu lub odrzuceniu testu przed przedstawieniem testu pamięci (patrz 8.2), co w dużej mierze eliminuje potencjalną konkurencję odpowiedzi w celu kontrolowania użycia odpowiedzi testu odrzucenia. Konkurencja odpowiedzi to skłonność do przystąpienia do testu w oparciu o widok lub zapach właściwej opcji testowej, gdy wybór metapoznawczy jest prezentowany równolegle z testem pamięci podstawowej⁸. Wymaganie od szczurów, aby zdecydowały się przystąpić do testu lub odrzucić go przed napotkaniem samego testu pamięci, znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo, że konkurencja odpowiedzi kontroluje użycie odpowiedzi testu odrzucenia. Jednak jednym z ulepszeń tego projektu byłoby umożliwienie szczurom wyboru przystąpienia do testu lub odrzucenia go poprzez udzielenie określonej odpowiedzi w pomieszczeniu oddzielonym od samego testu pamięci. To jeszcze bardziej zwiększyłoby perspektywiczny charakter tego paradygmatu, co może pozwolić na bardziej skuteczną eliminację zewnętrznych sygnałów ^8,19. Dodatkowym ulepszeniem dla przyszłych badań jest, jeśli to możliwe, rejestrowanie opóźnienia odpowiedzi w momencie, gdy szczur wchodzi do pomieszczenia testowego, do czasu potrzebnego na skręcenie w lewo lub w prawo (odpowiednio odmów lub przystąpij do testu). Pozwoliłoby to naukowcom określić, czy opóźnienie odpowiedzi służyło jako zewnętrzna wskazówka, którą badani nauczyli się kojarzyć z określonymi reakcjami w czasie (patrz⁸). Pouczające byłoby również rejestrowanie, czy i kiedy badani zmieniają swoją reakcję (patrz 8.2; np. przemieszczanie się z wybranej przez MTS strony pokoju do obszaru testu spadku lub odwrotnie). Jak omówiono w artykule z wynikami, zaobserwowaliśmy to zachowanie tylko raz, co przyczynia się do wniosku, że szczury podjęły decyzję o przystąpieniu lub odrzuceniu testu, gdy tylko weszły do pokoju testowego i zanim napotkały sam test pamięci, co zrobiły, systematycznie pobierając próbki każdego wybranego zapachu.

Ponieważ szczury testowane w tym paradygmacie przenosiły odpowiedzi metapoznawcze w wielu testach uogólniających, stwierdzono, że szczury były zdolne do metapamięci - mogły monitorować swoje wspomnienia dla próbki¹⁹. Dla innych grup badawczych ważne będzie przetestowanie tego paradygmatu lub podobnych jego adaptacji, ponieważ potrzebne są potwierdzające dowody z różnych laboratoriów, zanim będzie można stwierdzić z całą pewnością, że szczury są zdolne do metakognitywnej reakcji i że zachowanie jest kontrolowane przez wewnętrzną, a nie zewnętrzną wskazówkę. Testy na obecność tej ważnej zdolności mnemonicznej, która pogarsza się wraz z wiekiem, mogą okazać się przydatne w translacyjnych podejściach do badania dysfunkcji pamięci, takich jak myszy transgeniczne i modele choroby Alzheimera. Byłoby szczególnie owocne dla badaczy zastosowanie tego paradygmatu behawioralnego w połączeniu z uszkodzeniami mózgu, tymczasowymi dezaktywacjami lub aktywacjami mózgu (np. optogenetyka, chemogenetyka) oraz z zapisami elektrofizjologicznymi, ponieważ badania te mogą wyjaśnić mechanizmy neuronalne leżące u podstaw procesów metapoznawczych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pętle Froot	Kellogg's	B00I8QZ4HM	Słodzone płatki zbożowe
Izba Towarzyska	Technologie Noldus	46503 / 46553
papier kontaktowy	Kontakt
Tektura
Ceramiczne naczynia dla małych zwierząt	Norpro	B00061N0QO	7 cm średnicy i 3,8 cm wysokości
Piasek do zabawy	ACTIVA	B004BNBXJ4	Taśma klejąca z białym piaskiem
	3M	B001HT720O	taśma klejąca
Cynamon	Po prostu organiczne	FNTR07824	Amazonka
Kawa	Folgers	B016KZTPJU	Amazonka
Papryka	Po prostu organiczne	B06XB9QGVB	Amazonka
Tymianek	Po prostu organiczne	579193	Amazonka
Kolorowy piasek	Produkty Sandtastik	B000Q4O9UW	Pomarańczowy piasek
70% alkohol izopropylowy	Łabędź	B00HKDI6WO	Amazonii
Pogromca kurzu (próżnia)	Black + Decker	B01DAI5BZ2	Odkurzacz bezprzewodowy
Gąsienice metalowe	Magazyn domowy	EC751BA	Używany do drzwi w komorze
Szpatułka	Szef Rzemiosła	B00B0M5LQK	Zgięty pod kątem prostym, aby opuścić kubek na próbkę do aparatury badawczej