Tutaj prezentujemy przedkliniczne badania przesiewowe przeciwnowotworowych kumaryn z wykorzystaniem hodowli 3D i danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przedkliniczna ocena bioaktywności przeciwnowotworowej kumaryny OT48 za pomocą sferoid, testów tworzenia kolonii i ksenoprzeszczepów danio pręgowanego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedkliniczne badania in vitro i in vivo nowych środków terapeutycznych są niezbędnym narzędziem w odkrywaniu leków na raka. Chociaż ludzkie linie komórkowe nowotworów reagują na związki terapeutyczne w jednowarstwowych hodowlach komórkowych 2D (wymiarowych), systemy hodowli 3D zostały opracowane, aby zrozumieć skuteczność leków w bardziej fizjologicznie istotnych modelach. W ostatnich latach zaobserwowano zmianę paradygmatu w badaniach przedklinicznych w celu walidacji siły działania nowych cząsteczek w systemach hodowli 3D, dokładniej naśladujących mikrośrodowisko guza. Systemy te charakteryzują stan chorobowy w sposób bardziej fizjologicznie istotny i pomagają uzyskać lepszy mechanistyczny wgląd i zrozumienie farmakologicznej siły działania danej cząsteczki. Co więcej, przy obecnym trendzie ulepszania modeli nowotworów in vivo, danio pręgowany stał się ważnym modelem kręgowców do oceny powstawania nowotworów in vivo i badania wpływu środków terapeutycznych. Tutaj zbadaliśmy skuteczność terapeutyczną hydroksykumaryny OT48 w monoterapii lub w połączeniu z mimetykami BH3 w linii komórkowej raka płuc A549, stosując trzy różne systemy hodowli 3D, w tym testy tworzenia kolonii (CFA), testy tworzenia sferoidów (SFA) i ksenoprzeszczepy danio pręgowanego in vivo.
Wprowadzenie
Rak jest spowodowany mutacjami komórkowymi i w konsekwencji biochemiczne szlaki sygnałowe są zakłócone, co powoduje niekontrolowane podziały komórek i odporność na śmierć komórki. Guzy zaburzają fizjologiczne funkcje układu pokarmowego, nerwowego, krążenia, a następnie sąsiednich tkanek1. Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków badawczych, rak pozostaje najbardziej rozpowszechnioną chorobą zagrażającą życiu na świecie2. Medycyna precyzyjna została uznana za podstawę przyszłych terapii nowotworowych. Nowe jednostki molekularne są rutynowo testowane w połączeniu z istniejącymi lekami w celu poprawy wyników klinicznych.
Jednak jednym z istotnych ograniczeń związanych z rozwojem nowych, skutecznych terapii celowanych, jest brak powszechnie stosowanych testów symulujących dokładny biologiczny wynik ekspozycji na lek3. Odkrywanie leków przeciwnowotworowych nadal opiera się głównie na testowaniu skuteczności środków terapeutycznych w liniach komórek nowotworowych hodowanych w hodowlach jednowarstwowych 2D, które są trudne do walidacji w badaniach klinicznych4. W związku z tym rośnie zainteresowanie opracowywaniem lepszych modeli nowotworów, które lepiej naśladują rodzime cechy nowotworów in vivo5. W ostatnich latach rosnące zainteresowanie modelami hodowli 3D zaowocowało opracowaniem ulepszonych metodologii tworzenia modeli 3D nowotworów5.
Tutaj prezentujemy podejście z trzema różnymi technikami hodowli komórkowych 3D, które pozwalają lepiej zrozumieć moc hydroksykumaryny OT486 w połączeniu z mimetykami BH3 przed bardziej szczegółowymi testami in vivo. Nasza metoda polega na połączeniu kolonii i SFA z testem tworzenia guza in vivo opartym na modelu danio pręgowanego w celu dalszej walidacji skuteczności połączenia mimetyki OT48 i BH3 w komórkach raka płuc i monitorowania progresji raka w żywym organizmie.
Testy tworzenia kolonii są rutynowo używane do oceny skuteczności środków przeciwnowotworowych zarówno w przypadku raka stałego, jak i krwiotwórczego. Test określa zdolność komórki do namnażania się w nieskończoność i tworzenia kolonii7. Wpływ środka przeciwnowotworowego na zdolność komórek do tworzenia kolonii zależy od zmniejszenia liczby i/lub wielkości kolonii.
Sferoidy reprezentują modele nowotworów in vitro i służą jako tania platforma przesiewowa dla środków przeciwnowotworowych. Sferoidy to agregaty komórek rosnących w zawiesinie lub osadzonych w matrycy 3D. Podejście to jest szeroko stosowane do badań przesiewowych leków i badań wzrostu, proliferacji i interakcji immunologicznej guza8.
Aby w pełni zrozumieć właściwości nowego leku, konieczne jest przeprowadzenie eksperymentów in vivo na gryzoniach. Jednak ta konwencjonalna metoda jest kosztowna i czasochłonna. W ostatnich latach danio pręgowany (Danio rerio) stał się szeroko badanym organizmem laboratoryjnym, który jest tańszy i szybszy w hodowli. Guzy rozwinięte u danio pręgowanego reprezentują podejście do hodowli komórkowej 3D, ale w warunkach in vivo kręgowców9.
Razem, używamy tutaj trzech różnych podejść do hodowli 3D, w tym CFA, SFA i formowania nowotworów in vivo danio pręgowanego, aby zademonstrować zdolność przeciwnowotworową hydroksykumaryny OT48 w modelu komórkowym A549 raka płuc w połączeniu z mimetykami BH3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Testy tworzenia kolonii
- Hodowla komórek A549 w stężeniu 20 000 komórek/cm2 w 15 ml pożywki do hodowli komórkowych RPMI1640 uzupełnionej 10% FBS (płodową surowicą bydlęcą) i 1% antybiotykami w kolbie o długości 75cm2 w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- W dniu eksperymentu określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Zbierz 50 000 komórek przez odwirowanie przy 400 x g przez 7 minut w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ponownie zawieś komórki w 100 μl 1x sterylnego PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) w probówkach o pojemności 1,5 ml.
- Dozować 1,1 ml półstałego podłoża na bazie metylocelulozy (MCBM) do probówek o pojemności 15 ml za pomocą multipipety. Przygotuj jedną tubkę na każdy warunek.
- Dodaj 110 μl FBS do 1,1 ml MCBM za pomocą mikropipety P200.
- Komórki nasienne w ilości 1,000 komórek/ml. Zebrać 2,4 μl zawiesiny komórek z roztworu podstawowego (50 000 komórek w 100 μl 1x PBS) za pomocą mikropipety P2 i dodać do 1,1 ml MCBM uzupełnionego 10% FBS.
- Po dodaniu komórek wiruj probówki przez 1 minutę, trzymając je pionowo z najwyższą prędkością, aby dobrze wymieszać MCBM i komórki.
- Dodać badane związki (OT48 samodzielnie lub w połączeniu z A1210477). Przygotować oddzielną probówkę jako kontrolę dla użytego rozpuszczalnika (tutaj dimetylosulfotlenek (DMSO)). W zależności od stężenia związków i objętości dodanej dla każdego warunku, kontrola rozpuszczalnika będzie obejmować najwyższe stężenie rozpuszczalnika użyte do rozcieńczenia badanego związku, w celu oceny niekorzystnych skutków spowodowanych przez rozpuszczalnik.
- Wiruj rurki przez 1 minutę.
- Do każdego testu dodać 1 ml mieszaniny za pomocą mikropipety P1000 do środkowej studzienki 12-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.
- Napełnij puste studzienki 1 ml sterylnej wody lub 1x PBS, aby ustabilizować wilgotność.
- Inkubować płytki hodowlane przez 10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Po 10 dniach inkubacji dodać 200 μl roztworu podstawowego bromku MTT (metylotiazolyldiphenyl-tetrazolium) (5 mg/ml) do każdego dołka, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 mg/ml.
- Inkubować przez 10 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Żywotne kolonie zmienią kolor na fioletowy.
- Uchwyć obraz za pomocą aparatu cyfrowego, korzystając z białej płytki tła (taca o białej średnicy LAS). Użyj następujących ustawień: Metoda, digitalizacja; Rodzaj ekspozycji, precyzja; Czas naświetlania, ręczny, 1 sekunda; Czułość/rozdzielczość, wysoka rozdzielczość. Zapisz obraz w formacie tiff.
- Określ ilościowo żywotne kolonie za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybierz menu "Obraz | Rodzaj | 8 bitów". Wybierz menu "Dostosuj | Próg". Ustaw próg do kontroli i utrzymuj stały dla wszystkich warunków; Wybierz menu "Analizuj | Analizuj cząstki". Zapisuj dane i analizuj je za pomocą oprogramowania statystycznego do graficznej reprezentacji.
2. Test tworzenia sferoidów
- Hodowla komórek A549 w stężeniu 20 000 komórek/cm,2 w kolbach o długości 75cm2 z 15 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i 1% antybiotykami.
- W dniu eksperymentu przygotuj 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U.
- Umieść 10 000 komórek w studzince, która zawiera już interesujący nas związek (tutaj 50 μM OT48 i/lub 20 μM A1210477). Dostosować końcową objętość do 100 μl pożywki do hodowli komórkowych. Liczba komórek, które tworzą jednolite sferoidy z nienaruszoną granicą zewnętrzną, jest uważana za odpowiednią do tworzenia sferoid.
- Inkubować przez 3 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 .
- Po 3 dniach inkubacji uchwyć obrazy sferoid za pomocą mikroskopu świetlnego z 4-krotnym powiększeniem.
3. Test ksenoprzeszczepu danio pręgowanego
UWAGA: To techniczne podejście jest wizualizowane jako schemat (Rysunek 1).
- Przygotowanie odczynników podstawowych
- Przygotuj 1 l 30x roztworu Danieau: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca(NO3)2 i 150 mM HEPES. Dostosować pH buforu do 7,6 za pomocą pH-metru.
- Przygotować 1% (50x) roztwór trykainy: Rozpuść 20 mg metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu (trikainy) w 2 ml wody destylowanej.
- Przygotować 1% roztwór fenolu Red-PBS: Dodać 2 μl roztworu soli sodowej czerwieni fenolowej do 198 μl wysterylizowanego roztworu PBS w probówce o pojemności 1,5 μl.
- Przygotuj 3% metylocelulozy: Dodaj 3 g metylocelulozy do 100 ml 1x roztworu Danieau.
- Produkcja i inkubacja ikry danio pręgowanego
- Oddziel jedną samicę i jednego samca danio pręgowanego w zbiorniku wypełnionym sterylizowaną promieniami UV i przefiltrowaną wodą z kranu o temperaturze 28,5 °C w ciemności. Po 24 godzinach separacji wymieszaj ryby obu płci, aby rozpocząć krycie. Przenieść zapłodnione jaja ze zbiornika krycia na szalkę Petriego zawierającą 5 ml świeżego roztworu Danieau.
- Umyj jajka trzy razy 5 ml roztworu Danieau. Do umycia ostrożnie odessać jaja pipetą i przenieść do 5 ml świeżego roztworu. Inkubować przez 8 godzin w temperaturze 28,5 °C.
- Po 8 godzinach inkubacji w roztworze Danieau zmienić roztwór na Danieau zawierający 0,03% 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) w celu zahamowania pigmentacji. Sortuj nieprzezroczyste jaja (niezapłodnione lub zawierające nierozwinięte zarodki), aby zapobiec zakażeniu.
- Dechorionacja zarodka
- 24 godziny po zapłodnieniu (HPF) Dechorionate zarodki danio pręgowanego za pomocą ostrych kleszczy. Inkubować wylęgające się zarodki w roztworze Danieau z 0,03% PTU w temperaturze 28,5 °C do 48 hpf.
- Przygotowanie komórek poddanych działaniu związków chemicznych
- Nasiona komórek A549 w ilości 20 000 komórek/cm,2 w 25 cm, kolby hodowlane. Po 24 godzinach od wysiewu dodawać związki (w tym przypadku OT48 w temperaturze 50 μM i/lub A1210477 w temperaturze 20 μM) przez 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Ustal czas leczenia dla każdego związku, aby utrzymać żywotność komórek, ale zaangażować je w śmierć komórki. Ten punkt czasowy musi być indywidualnie ustalony na podstawie żywotności komórki, morfologii i markerów molekularnych.
- Na 2 godziny przed zakończeniem zabiegu wybarwić komórki 4 μM barwnika fluorescencyjnego CM-Dil w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 2 godzinach inkubacji trypsynizować komórki 0,05% trypsyną-EDTA, a przed wstrzyknięciem rozcieńczyć10-6 komórek w 50 μl roztworu fenolu Red-PBS.
- Mikroiniekcja komórek nowotworowych w celu wytworzenia ksenoprzeszczepu
- Znieczulenie danio pręgowanego w 0,02% roztworze tricainy przez 5 minut, aż osiądą na płytce agarowej.
- Pociągnij szklaną kapilarnę o średnicy zewnętrznej 1,0 mm (OD)) za pomocą ściągacza do mikropipet (Ustawienia programu: P: 300, Ciepło: 260, Ciągnięcie: 60, VEL: 50 i Czas: 200). Przeciąć mikrokapilę strzykawką, aby uzyskać ostrą krawędź. Załaduj mikrokapilary 20 μl roztworu komórki/fenolu Red-PBS. Ustawić ciśnienie i czas wtrysku, aby dozować 2 nL na wstrzyknięcie.
- Wstrzyknąć 100–200 komórek do woreczka żółtkowego, wstrzykując od 6 do 10 nL w 3 do 5 wstrzyknięciach. Po wstrzyknięciu należy pozostawić ryby do regeneracji przez 10 do 30 minut w 5 ml świeżego roztworu Danieau zawierającego roztwór PTU. Ryby należy wysłać na 24-dołkowe płytki z 1 ml roztworu Danieau zawierającego roztwór PTU i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 28,5 °C.
- Po 72 godzinach inkubacji znieczulić ryby w 0,02% roztworze tricainy i unieruchomić na szkiełku z kroplą 3% metylocelulozy. Wykonaj 5-krotne zdjęcia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o długości fali od 620 do 750 nm.
- Określ ilościowo rozmiar guzów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybierz menu "Analizuj | Środek". Zapisz wartości odpowiadające sygnałowi fluorescencyjnemu i analizuj je za pomocą oprogramowania statystycznego do graficznej reprezentacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Na Ryc. 2 przedstawiono linię komórkową raka płuca A549 wysianą w MCBM w celu utworzenia kolonii po traktowaniu samym OT48 lub w połączeniu z mimetykiem BH3 A1210477 w zaznaczonych stężeniach. Wyniki wykazały, że terapia skojarzona znacząco zredukowała liczbę, wielkość oraz całkowitą powierzchnię kolonii po 10 dniach inkubacji.
Na Ryc. 3 komórki A549 traktowano samym OT...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tempo tworzenia kolonii uzyskane za pomocą MCBM zależy od typu komórki. Zwykle w przypadku komórek nieprzylegających liczba kolonii jest znacznie wyższa w porównaniu z komórkami przylegającymi. Zaobserwowaliśmy, że komórki A549 utworzyły od 30 do 40 kolonii po 10 dniach. Wcześniej informowaliśmy, że dla różnych komórek białaczkowych liczba kolonii wynosi od 200 do 2509. Nasze wyniki wykazały, że sam OT48 nie spowodował znaczącego zmniejszenia liczby samych kolonii. Jednak w połączeniu z mimetyczny...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badania w SNU są wspierane przez Narodową Fundację Badawczą (NRF) przez MEST of Korea for Tumor Microenvironment Global Core Research Center (GCRC), [numer grantu 2011-0030001]; przez Seoul National University Research Grant oraz przez program Brain Korea (BK21) PLUS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiały wymagane do testów tworzenia kolonii | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicylina-Streptomycyna | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Kolba do hodowli komórkowych T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS roztwór | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1,5 ml probówka | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml probówka | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 dołków | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230-20 | C° |
| Bromek tetrazolowy błękitu tiazolilowego (proszek MTT) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| strong>Materiały wymagane do badania tworzenia sferoidów | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicylina-streptomycyna | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Kolba do hodowli komórkowych T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS roztwór | Hyclon | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96-dołkowa płytka | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| strong>Materiały wymagane do ksenoprzeszczepów danio pręgowanego | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicylina-streptomycyna | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Kolba do hodowli komórkowych T25 | SPL | 70025 | RT |
| Kolba do hodowli komórkowych T75 | SPL | 70075 | RT |
| Kolba do hodowli komórkowych T175 | SPL | 71175 | RT |
| Probówka 1,5 ml | Probówka Extragen-170-C | RT | |
| 24-dołkowa płytka | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| Roztwór PBS | Hyclon | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Chlorek potasu (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Czterowodny azotan wapnia (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| Roztwór HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| 3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (Trikaina) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Roztwór czerwieni fenolowej | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Metyloceluloza | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-fenylo-2-tiomocznik (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil barwnik | Invitrogen | C7001-20 | C° |
| Szklana kapilara | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Ściągacz do mikropipet | Przyrząd do migawki, USA | P-97 | RT |
| Mikro wtryskiwacz | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Strzykawka | KOVAX | 1ml | RT |
| Mikroładowarka | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Szkiełko szklane | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Mikroskopia fluorescencyjna | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Bibliografia
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
