Proste i skuteczne podawanie i wizualizacja mikrocząstek w układzie krążenia małych ryb za pomocą iniekcji nerki

Podsumowanie

Ten artykuł demonstruje zasady szybkiego, minimalnie inwazyjnego wstrzykiwania mikrocząsteczek fluorescencyjnych do układu krążenia małych ryb oraz wizualizacji in vivo mikrocząsteczek we krwi ryb.

Streszczenie

Systemowe podawanie mikrocząsteczek do żywego organizmu może być stosowane do wizualizacji naczyń krwionośnych, dostarczania leków i szczepionek, implantacji komórek transgenicznych i maleńkich czujników optycznych. Jednak mikroiniekcje dożylne małym zwierzętom, które są najczęściej stosowane w laboratoriach biologicznych i weterynaryjnych, są bardzo trudne i wymagają przeszkolonego personelu. W niniejszym artykule przedstawiamy solidną i skuteczną metodę wprowadzania mikrocząstek do układu krążenia dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) poprzez wstrzyknięcie do nerki ryby. Aby uwidocznić wprowadzone mikrocząstki do układu krwionośnego, proponujemy prostą technikę obrazowania przyżyciowego w skrzelach ryb. Monitorowanie in vivo pH krwi danio pręgowanego przeprowadzono za pomocą wstrzykiwanej mikrokapsułkowanej sondy fluorescencyjnej SNARF-1, aby zademonstrować jedno z możliwych zastosowań opisanej techniki. W artykule przedstawiono szczegółowy opis enkapsulacji barwnika wrażliwego na pH oraz przedstawiono zasady szybkiego wstrzykiwania i wizualizacji otrzymanych mikrokapsułek w celu rejestracji sygnału fluorescencyjnego in vivo. Proponowana metoda iniekcji charakteryzuje się niską śmiertelnością (0-20%) i wysoką skutecznością (70-90% sukcesu), a także jest łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu. Wszystkie opisane zabiegi można wykonywać na innych małych gatunkach ryb, takich jak gupiki i medaka.

Wprowadzenie

Podawanie mikrocząsteczek do organizmu zwierzęcego jest ważnym zadaniem w takich dziedzinach jak dostarczanie leków i szczepionek¹, wizualizacja naczyń krwionośnych², implantacja komórek transgenicznych³, oraz implantacja małego czujnika optycznego^4,5. Jednak procedura implantacji mikrocząstek do układu naczyniowego małych zwierząt laboratoryjnych jest trudna, szczególnie w przypadku delikatnych organizmów wodnych. W przypadku popularnych okazów badawczych, takich jak danio pręgowany, zaleca się wyjaśnienie tych procedur za pomocą protokołów wideo.

Mikroiniekcje dosercowe i kapilarne wymagają przeszkolonego personelu i unikalnego zaplecza mikrochirurgicznego do dostarczania mikroobiektów do krwi danio pręgowanego. Wcześniej, manualne wstrzykiwanie po orbicie po orbicie³ było sugerowane jako łatwa i skuteczna metoda podawania całych komórek. Jednak z naszego doświadczenia wynika, że ze względu na mały obszar sieci naczyń włosowatych oka, osiągnięcie pożądanego rezultatu tej techniki wymaga dużo praktyki.

Tutaj opisujemy metodę solidnego i skutecznego wszczepiania mikrocząsteczek do układu krążenia poprzez ręczne wstrzykiwanie bezpośrednio do tkanki nerkowej dorosłego danio pręgowanego, która jest bogata w naczynia włosowate i nerkowe. Technika ta opiera się na protokole wideo do przeszczepu komórek do nerki danio pręgowanego⁶, ale traumatyczne i czasochłonne etapy mikrochirurgiczne zostały wyeliminowane. Proponowana metoda charakteryzuje się niską śmiertelnością (0-20%) i wysoką skutecznością (70-90% skuteczności), a także jest łatwa do wdrożenia przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu.

Ważną częścią proponowanego protokołu jest wizualizacja wszczepionych mikrocząsteczek (jeśli są fluorescencyjne lub kolorowe) w naczyniach włosowatych skrzelowych, co pozwala na weryfikację jakości iniekcji, przybliżoną względną ocenę liczby wstrzykniętych cząstek, oraz wykrywanie sygnału spektralnego do pomiarów fizjologicznych bezpośrednio z krążącej krwi. Jako przykład możliwych zastosowań opisanej techniki przedstawiamy protokół pomiarów in vivo pH krwi danio pręgowanego za pomocą mikrokapsułkowanej sondy fluorescencyjnej SNARF-1, pierwotnie zasugerowanej w Borvinskaya i wsp. 2017⁵.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą UE 2010/63/UE dla eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet Badawczy ds. Zwierząt Instytutu Biologii na Irkuckim Uniwersytecie Państwowym.

1. Wytwarzanie mikrokapsułek

UWAGA: Mikrokapsułki zawierające barwnik fluorescencyjny są przygotowywane przy użyciu zestawu warstwa po warstwie przeciwnie naładowanych polielektrolitów^7,8. Wszystkie zabiegi wykonywano w temperaturze pokojowej.

1. Aby zsyntetyzować porowate mikrordzenie CaCO₃ otaczające barwnik fluorescencyjny, należy zmieszać 2 ml roztworu SNARF-1-dekstranu (można użyć większości barwników fluorescencyjnych związanych z polimerami, takich jak FITC-BSA) w stężeniu ~ 2 mg / ml z 0,6 ml każdy z 1 mol/L roztworów CaCl₂ i Na₂CO₃ pod szybkim mieszaniem.
   UWAGA: Zwróć uwagę na różną wrażliwość barwników fluorescencyjnych na fotowybielanie; jeśli używana jest światłoczuła sonda fluorescencyjna (taka jak SNARF-1), manipulacja i przechowywanie mikrocząstek muszą odbywać się przy jak najmniejszej ilości światła.
2. Po 5-10 s mieszania przenieść zawiesinę do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml i wirować przez 15 s przy 10 000-12 000 g do granulek CaCO₃ mikrordzenie.
3. Wyrzucić supernatant, umyć rdzenie ~ 2 ml wody dejonizowanej i ponownie zawiesić osad przez wstrząsanie.
4. Powtórzyć procedurę wirowania-mycia w sumie trzy razy. Po ostatnim odwirowaniu wyrzucić supernatant.
5. Inkubować mikrordzenie przez 1 minutę w kąpieli ultradźwiękowej, aby zmniejszyć ich agregację.
   UWAGA: Nie zapomnij zabezpieczyć uszu słuchawkami.
6. Aby osadzić pierwszą warstwę polimerową na matrycach, ponownie zawieś rdzenie w ~2 ml roztworu 4 mg/ml chlorowodorku poli(alliloaminy) (WWA) w 1 mol/l NaCl.
   1. Trzymaj mikrordzenie w roztworze przez ~5 minut, ciągle wstrząsając.
   2. Po 15 s wirowania odrzucić supernatant z niezwiązanym WWA. Umyj pokryte mikrordzenie wodą dejonizowaną co najmniej 3 razy w wielu etapach wirowania i mycia. Po ostatnim odwirowaniu wyrzucić supernatant.
   3. Inkubować mikrordzenie przez 1 minutę w kąpieli ultradźwiękowej, aby zmniejszyć ich agregację.
      UWAGA: Jeśli zastosowany barwnik fluorescencyjny jest kationowy, należy rozpocząć od poli(4-styrenosulfonianu sodu) (PSS) w 1 mol/L NaCl (patrz krok 1.7).
7. Powtórzyć krok 1.6 z ~2 ml roztworu PSS o stężeniu 4 mg/ml (zawierającego również 1 mol/l NaCl), aby nałożyć drugą warstwę polimeru na matryce.
8. Powtórz kroki 1.6 i 1.7 sześć razy, aby nałożyć 12 warstw polimerowych.
   UWAGA: Nie zaleca się robienia długiej przerwy (~12 h lub więcej) w procedurze do momentu osadzenia ~3-5 warstw, ponieważ mikrordzenie CaCO₃ bez pokrycia mogą mieć tendencję do rekrystalizacji. Należy pamiętać, że pokrycie PSS powoduje większą agregację mikrordzeni, a długa przerwa jest wskazana tylko wtedy, gdy PAH lub poli-L-lizyna szczepiona glikolem polietylenowym (PLL-g-PEG) jest warstwą zewnętrzną.
9. Inkubować pokryte mikrordzenie w 2 mg/ml PLL-g-PEG (~1 ml na mikroprobówkę) przez co najmniej 2 godziny.
   1. Umyj mikrordzenie wodą poprzez sekwencyjne wirowanie i ponowne zawieszenie. Po ostatnim odwirowaniu wyrzucić supernatant.
10. Aby uzyskać puste w środku mikrokapsułki, rozpuść matryce CaCO₃, dodając 2 ml roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o stężeniu 0,1 mol/l (dostosowanego do pH 7,1 z NaOH) do pokrytych mikrordzeni.
    1. Po ~5 minutach inkubacji odwirować mikrokapsułki przez 45 s i wyrzucić supernatant z EDTA.
    2. Powtórz kroki 1.10-1.10.1 dwukrotnie.
11. Przemyć mikrokapsułki 0,9% NaCl trzykrotnie przez wiele etapów wirowania w ciągu 45 sekund, a następnie przejść przez etapy mycia. Po ostatnim etapie wirowania wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Końcowy roztwór mikrokapsułek do wstrzykiwań musi być utrzymywany w sterylnej (na przykład przez dodanie ampicyliny, 0,1 mg/ml), a podłoże powinno być biozgodne z przedmiotem badania (podłoże izotoniczne o neutralnym pH).
12. Oszacuj stężenie przygotowanych mikrokapsułek w hemocytometrze pod mikroskopem fluorescencyjnym. Zrób serię zdjęć mikrokapsułek, zmierz średnicę około stu mikrokapsułek za pomocą ImageJ⁹ lub równoważnego oprogramowania i zbadaj rozkład rozmiarów za pomocą histogramu.
13. Otrzymaną sondę w obudowie należy przechowywać w ciemności.
    UWAGA: Po kilku praniach w sterylnym 0,9% NaCl, mikrokapsułki mogą być przechowywane przez miesiące w temperaturze 4 °C. Nie zaleca się całkowitego wysuszenia mikrokapsułek podczas przechowywania.

2. Przygotowanie konfiguracji optycznej i kalibracja mikrokapsułkowanego SNARF-1

Uwaga: Przybliżone pomiary pH za pomocą mikrokapsułkowanego SNARF-1 można wykonać przy użyciu obrazów w dwóch kanałach mikroskopu fluorescencyjnego⁷, ale w tym protokole zastosowano jednokanałowy mikroskop fluorescencyjny połączony ze spektrometrem światłowodowym.

1. Umieść wymagany zestaw filtrów fluorescencyjnych w mikroskopie fluorescencyjnym zgodnie z charakterystyką nałożonego barwnika fluorescencyjnego i włącz lampę fluorescencyjną.
   1. Wyciągnij dźwignię do okularów.
      UWAGA: Nadmiar światła może uszkodzić matrycę spektrometru. Dlatego upewnij się, że dźwignia jest w trybie "okularu", gdy spektrometr nie jest używany.
   2. Podłącz jeden koniec światłowodu do spektrometru, a drugi koniec do kolimatora. Za pomocą adapterów umieść kolimator w ogniskowej tubusu kamery lub innym dostępnym porcie mikroskopu fluorescencyjnego.
   3. Włącz spektrometr. Uruchom program sterujący spektrometrem i przygotuj spektrometr do pomiarów.
2. W celu kalibracji partii mikrokapsułek należy umieścić ~5 μl zawiesiny mikrokapsułek (~10 000 mikrokapsułek na μl w wodzie dejonizowanej) na szkiełku mikroskopowym i wysuszyć kroplę w ciemnym miejscu (na przykład w termostacie o temperaturze 35 °C).
   1. Aby skalibrować charakterystykę spektralną mikrokapsułkowanego SNARF-1, należy użyć serii o różnych wartościach pH w zakresie ~6-9. Upuść ~10 μL buforu na wysuszone mikrokapsułki z SNARF-1-dekstranem i przykryj szkiełkiem nakrywkowym.
   2. Umieść szklane szkiełko na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj mikrokapsułki za pomocą obiektywu ×40.
   3. Przekręć dźwignię mikroskopu do portu aparatu. Zarejestruj ich fluorescencję za pomocą spektrometru. Przekręć dźwignię z powrotem do okularów.
      UWAGA: Upewnij się, że sygnał widmowy wykracza daleko poza poziom tła i upewnij się, że mikrokapsułki w polu view nie znajdują się w bańce (w razie potrzeby przełączając się na mniejsze powiększenie). Należy unikać długotrwałego oświetlenia tych samych mikrokapsułek. SNARF-1 jest wrażliwy na fotowybielanie.
   4. Powtórz krok 2.2.3 dla różnych mikrokapsułek 10-15 razy.
3. Obliczyć współczynniki pików fluorescencji (na przykład przy użyciu R lub Scilab) dla wszystkich zarejestrowanych widm i wyznaczyć linię regresji między medianą stosunku (dla każdego buforu) a pH podłoża za pomocą następującego wzoru:
   
   UWAGA: SNARF-1 ma widmo z dwoma pikami odpowiadającymi emisji protonowanego i zdeprotonowanego barwnika, a stosunek między pikami reaguje na pH pożywki. W tym badaniu zastosowano stosunek intensywności fluorescencji dla 605 i 660 nm. Te długości fal są wybierane w zależności od zastosowanego zestawu filtrów. a i b są współczynnikami, które należy wyznaczyć za pomocą regresji nieliniowej (na przykład przy użyciu R). Wartości 0,15 i 1,1 są odpowiednio minimalnymi i maksymalnymi wartościami I₆₀₅/I₆₆₀ zaobserwowanymi podczas kalibracji.
4. Zbierz około 10 μl krwi ryb od około 5 dorosłych zwierząt. Umieść rybę na szalce Petriego z 1 μl/ml zawiesiny wodnej olejku goździkowego do znieczulenia i poczekaj, aż zwierzę przewróci się na bok i przestanie reagować na szczypanie płetwy (zwykle ~2-3 min). Przełóż rybę na szklane szkiełko. Odetnij rybi ogon lancetem i zbierz około 2 μl krwi ryb z żyły ogonowej.
   UWAGA: Aby zapobiec krzepnięciu krwi, należy potraktować nacięcie heparyną (5000 U/ml) i użyć heparynizowanych szklanych naczyń włosowatych i probówek do mikrowirówek do pobrania krwi.
   1. Na końcówkę mikroelektrody wlać pipetą około 10 μl krwi i oznaczyć pH za pomocą pH-metru.
   2. Umieścić krew na szkiełku z wysuszonymi mikrokapsułkami i zarejestrować stosunek intensywności fluorescencji zgodnie z opisem dla kalibracyjnych (kroki 2.2 - 2.3).
5. Dostosuj współczynnik liniowy krzywej kalibracyjnej, aby krzywa odpowiadała pomiarom we krwi ryb (więcej informacji można znaleźć w Borvinskaya et al. 2017⁵).

3. Przygotowanie do iniekcji

1. Zwolnij stalową igłę z końcówki wstrzykiwacza insuliny (lub strzykawki), usuwając plastik ostrym lancetem.
   UWAGA: Do mikroiniek><>
2. Włóż igłę do połowy do szklanej mikrokapilary; szybko i delikatnie ją za pomocą palnika gazowego.
3. Podłącz szklaną mikrokapilę do mikrowtryskiwacza i trzykrotnie przepłucz ją sterylną wodą. Upewnij się, że płyn przepływa przez igłę.
4. Napełnij system wodą destylowaną.
   UWAGA: Upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.

4. Wtrysk

1. Zawiesić przygotowaną zawiesinę mikrokapsułek (w sterylnym 0,9% NaCl lub innym podłożu używanym do wstrzykiwań, o stężeniu od 0,5 do 6 milionów mikrokapsułek na mikrolitr) za pomocą kąpieli ultradźwiękowej przez 1 min.
   UWAGA: Ponieważ mikrokapsułki mają tendencję do wytrącania się, podczas następnego wstrzyknięcia należy wstrząsać fiolką z mikrokapsułkami mechanicznie (za pomocą rotora) lub ręcznie co kilka minut, aby ponownie je zawiesić i zapobiec ich agregacji.
2. Umieść rybę na szalce Petriego ze środkiem znieczulającym (0,1 ml/l olejku goździkowego zawieszonego w wodzie) na ~2-3 min. Poczekaj, aż ryba przewróci się na bok i przestanie reagować na lekkie uszczypnięcie płetwy.
3. Za pomocą łyżki wyjmij rybę ze środka znieczulającego i delikatnie ułóż ją na wilgotnej gąbce w pozycji bocznej z głową skierowaną w lewo (dla osoby praworęcznej) lub w prawo (dla osoby leworęcznej).
4. Tuż przed iniekcją należy zassać 1-2 mm powietrza do szklanej kapilary połączonej z mikrowtryskiwaczem. Następnie załaduj go około 2 μl zdyspergowanych mikrokapsułek.
   UWAGA: Przed wstrzyknięciem roztwór mikrokapsułek należy dostosować do temperatury, w jakiej trzymane są ryby.
5. Delikatnie ustabilizuj ciało ryby na gąbce ręką niedominującą.
   1. Znajdź linię boczną ryby. W myślach wybierz segment, który rozciąga się od wieczka do końca jamy brzusznej. Znajdź środek tego segmentu. Umieścić igłę o 1 mm niżej w kierunku brzusznym.
   2. Ruchem skrobania delikatnie odsuń rybie łuski na bok i wykonaj nakłucie. Wbić igłę do korpusu pod kątem 45° do powierzchni stołu.
   3. Popchnij igłę w kierunku kręgosłupa, aż ostrożnie oprze się o niego.
   4. Uwolnić około 1 μl zawiesiny mikrokapsułek do nerki i powoli wyjąć igłę.
      UWAGA: Aby łatwiej znaleźć właściwe miejsce nakłucia, warto poćwiczyć znajdowanie nerki tułowia poprzez transoświetlenie ryb za pomocą dolnego światła, jak pokazano na Rysunek 2A i 2B.
6. Opłukać rybę od głowy do ogona strumieniem wody, aby usunąć wszelkie rozlane mikrokapsułki w miejscu wstrzyknięcia.

5. Wizualizacja in vivo

1. Użyj nożyczek do preparowania, aby usunąć pokrywę skrzeli z głowy ryby i pozbawić skrzela ryb. Opłucz skrzela wodą.
2. Za pomocą łyżki przenieś rybę na szkiełko mikroskopowe i umieść ją na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.
   UWAGA: Upewnij się, że skrzela ryb nie wysychają podczas kolejnych zabiegów. Aby tego uniknąć, okresowo zwilżaj je wodą za pomocą pipety Pasteura (mniej więcej co 1-2 min).
3. Zaciemnij pomieszczenie i używając małego powiększenia (obiektyw x10) sprawdź skrzela, aby znaleźć fluorescencyjne mikrokapsułki.
   UWAGA: Gdy procedura jest stosowana do wprowadzania niektórych cząstek fluorescencyjnych do układu krążenia ryb, zaleca się sprawdzenie skrzeli kilku osób pod kątem nieoczekiwanych cząstek fluorescencyjnych przed wstrzyknięciem. Skrzela danio pręgowanego typu dzikiego nie mają autofluorescencji, ale w niektórych przypadkach sporadyczne cząstki fluorescencyjne (takie jak kawałki jedzenia lub jednokomórkowe symbionty) mogą być obecne na skrzelach. W razie potrzeby takie cząstki można rozpoznać na podstawie ich specyficznego kształtu (na przykład kawałki żywności mają nieregularny kształt, w przeciwieństwie do sferycznych mikrokapsułek) lub widma fluorescencji (tj. koloru).
   1. Zmień soczewkę na wyższą jasność (obiektyw ×40) i umieść mikrokapsułkę lub grupę mikrokapsułek w środku pola view.
   2. Przekręć dźwignię do portu z podłączonym spektrometrem. Nagraj sygnał spektralny.
   3. Przekręć dźwignię z powrotem do okularu.
   4. Powtórz pomiary dla różnych mikrokapsułek kilka razy.
4. Przenieś rybę do akwarium z odpowiednim napowietrzeniem w celu regeneracji.
   UWAGA: Przy minimalnej wprawie możliwe jest wykonanie iniekcji i rejestracji sygnału z przybliżoną szybkością 2-3 minut na rybę. Pomiar może być powtórzony dla jednej osoby kilka razy przy użyciu powtarzających się niskich, nieszkodliwych dawek znieczulenia lub innej metody utrwalenia. Do długotrwałej obserwacji użyj systemu z ciągłym znieczuleniem¹².

Wyniki

Uzyskane wyniki pochodzą z jednej z trzech głównych kategorii prezentowanego protokołu: tworzenie mikrocząstek fluorescencyjnych przez enkapsulację barwnika fluorescencyjnego (Rysunek 1), wstrzyknięcie mikrokapsułek do nerki z dalszą wizualizacją w naczyniach skrzelowych (Rysunek 2 i 3) i wreszcie in vivo spektralny zapis fluorescencji SNARF-1 w celu monitorowania poziomu pH krwi (

Dyskusja

Aby zademonstrować wstrzykiwanie mikrocząstek do nerki danio pręgowanego, użyliśmy półprzepuszczalnych mikrokapsułek wypełnionych barwnikiem wskaźnikowym. W związku z tym protokół zawiera instrukcje dotyczące wytwarzania mikrokapsułek przy użyciu montażu warstwa po warstwie przeciwnie naładowanych polielektrolitów 7,8,15,16,17,18 (

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	. Jako wypełniacz mikrokapsułek można użyć dowolnego innego odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego związanego z polimerem
Koniugat izotiocyjanianu albuminy-fluoresceiny (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Sonda fluorescencyjna
Izotiocyjanian rodaminy B (RITC-dektran)	SIGMA	R9379	Sonda fluorescencyjna
Chlorek wapnia	SIGMA	C1016	Tworzenie
szablonów CaCO3Węglan sodu	SIGMA	S7795	CaCO3 tworzenie matryc
Poli(chlorowodorek alliloaminy), MW 50000 (WWA)	SIGMA	283215	polimer kationowy
Poli(4-styrenosulfonian sodu), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionowy polimer
Poli-L-lizyna [20 kDa] szczepiony glikolem polietylenowym [5 kDa], g = 3,0 do 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)Końcowy	polimer zwiększający biokompatybilność mikrokapsułek
Chlorek sodu	SIGMA	S8776	Do rozpuszczania zastosowanych polimerów
System oczyszczania wody	Millipore	SIMSV0000	Do przygotowania wody dejonizowanej
Mieszadło magnetyczne	Stegler		Do tworzenia
szablonów CaCO3Eppendorf  Badania  plus pipeta, 1000 i mikro; L	Eppendorf		Rozwiązania dozujące
Eppendorf  Badania  plus pipeta, 10 i mikro; L	Eppendorf		Rozwiązania dozujące
Końcówki do pipet, zakres objętości od 200 do 1000 i mikro; L	F.L. Medical	28093	Roztwory dozujące
Końcówki do pipet, zakres objętości 0,1-10  μ L	Eppendorf	Z640069	Roztwory dozujące
Miniwirówka Microspin 12, szybkoobrotowa	BioSan		Do procedury wirowania i mycia mikrokapsułek
Probówki do mikrowirówek, 2 ml	Eppendorf	Z666513	Synteza i przechowywanie mikrokapsułek
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Sp. z o.o.		Aby zmniejszyć agregację mikrokapsułek
Myjka			Aby zmniejszyć agregację mikrokapsułek
Słuchawki			Do ochrony uszu przed ultradźwiękami
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	SIGMA	EDS	Do rozpuszczania matryc CaCO3
Fosforan sodowy	SIGMA	S9638	Przygotowanie pH Fosforan
disodowy	SIGMA	S9390	Przygotowanie pH
Wodorotlenek sodu	SIGMA	S8045	Do regulacji pH roztworu EDTA i
Komora			Do suszenia mikrokapsułek na szkiełku Komora
do zliczania krwinek Hemocytometr Badanie			rozkładu wielkości i stężenia przygotowanych mikrokapsułek
Mikroskop fluorescencyjny Mikmed 2	LOMO		Wizualizacja in vivo mikrokapsułek we krwi ryb
Zestaw filtrów fluorescencyjnych do SNARF-1 (należy dobrać w zależności od modelu mikroskopu; przykład jest podany)	Chroma	79010	Wizualizacja mikrokapsułek z sondami fluorescencyjnymi
Spektrometr światłowodowy QE Pro	Ocean Optics		Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Światłowód QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 m	Optyka oceaniczna		Do połączenia spektrometru z portem mikroskopu
Kolimator F280SMA-A	Thorlabs		Do połączenia spektrometru z portem mikroskopu
Szkiełko mikroskopowe	Fisherbrand	12-550-A3	Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Szkiełka nakrywkowe, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Kalibracja mikrokapsułek pod mikroskopem
Mikrokapilary szklane Intra MARK, 10 µ L	Blaubrand	BR708709	Do pobierania krwi ryb
Olejek goździkowy	SIGMA	C8392	Lancet do znieczulenia ryb
Lancet nr 11	Apexmed international B.V.	P00588	Aby przeciąć rybi ogon i zwolnić stalową igłę z końcówki automatycznego wstrzykiwacza insuliny
Heparyna, 5000 U/ml	Calbiochem	L6510-BC	Do leczenia wszystkich powierzchni, które mają kontakt z krwią ryb podczas pobierania krwi ryb
PH-metr Seven 2 Go Pro z mikroelektrodą	Mettler Toledo		Aby określić pH krwi ryb
Igły do wstrzykiwacza insuliny Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Do zabiegu iniekcyjnego. Każda cienka igła (Ø 0,33 mm lub mniej) jest odpowiednia
Kapilary szklane, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	Do procedury iniekcyjnej
Palnik			Do stalowej igły do szklanej kapilary
Mikrowtryskiwacz IM-9B	NARISHIGE		Do precyzyjnego dozowania zawiesiny mikrokapsułek
Petriego, 60 mm x 15 mm, polistyren	SIGMA	P5481	Do manipulacji rybami pod narkozą
Łyżka			plastikowaDo manipulacji rybami pod narkozą
Wilgotna gąbka			Do manipulacji rybami pod narkozą
Nożyczki preparacyjne	Thermo Scientific	31212	Aby usunąć pokrywę skrzeli z głowy ryby
Pipeta Pasteura, 3,5 ml	MARKI	Z331767	Do nawilżania skrzeli ryb