Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Podsumowanie

Tutaj używamy dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność włókien podobnych do amyloidu o niejednorodnej wielkości i wykluczyć możliwość, że niejednorodność wielkości jest spowodowana dysocjacją włókien amyloidowych podczas procesu działania żelu.

Streszczenie

Włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu były związane z wieloma ludzkimi chorobami, a teraz odkrywa się, że są ważne dla wielu szlaków sygnałowych. Zdolność do łatwego wykrywania powstawania tych włókien w różnych warunkach eksperymentalnych jest niezbędna do zrozumienia ich potencjalnej funkcji. Do wykrywania włókien zastosowano wiele metod, ale nie obyło się bez pewnych wad. Na przykład mikroskopia elektronowa (EM) lub barwienie czerwienią Kongo lub tioflawiną T często wymaga oczyszczenia włókien. Z drugiej strony, półdenaturująca elektroforeza w żelu agarozowym (SDD-AGE) umożliwia wykrywanie opornych na SDS włókien amyloidowych w ekstraktach komórkowych bez oczyszczania. Ponadto pozwala na porównanie różnicy wielkości włókien. Co ważniejsze, można go wykorzystać do identyfikacji określonych białek we włóknach za pomocą Western blotting. Jest to mniej czasochłonne i łatwiej dostępne dla większej liczby laboratoriów. Wyniki SDD-AGE często wykazują zmienny stopień niejednorodności. Nasuwa się pytanie, czy część niejednorodności wynika z dysocjacji kompleksu białkowego podczas elektroforezy w obecności SDS. Z tego powodu zastosowaliśmy drugi wymiar SDD-AGE, aby określić, czy niejednorodność wielkości obserwowana w SDD-AGE jest naprawdę wynikiem heterogeniczności włókien in vivo, a nie wynikiem degradacji lub dysocjacji niektórych białek podczas elektroforezy. Metoda ta pozwala na szybkie, jakościowe potwierdzenie, że włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu nie dysocjują częściowo podczas procesu SDD-AGE.

Wprowadzenie

Od dawna wiadomo, że powstawanie włókien amyloidowych w wyniku nieprawidłowego fałdowania białek odgrywa rolę w stanach patologicznych, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i choroba Huntingtona¹. Ostatnio wykazano, że tworzenie włókien amyloidowych lub podobnych do amyloidu jest częścią szlaków sygnałowych u ludzi, w tym podczas przeciwwirusowej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej² i nekroptozy^3,4, oraz w organizmach niższych, takich jak drożdże^5,6. Dlatego ważna jest możliwość wykrycia tych włókien w laboratorium. Obecnie istnieją trzy główne sposoby wykrywania włókien amyloidowych i amyloidopodobnych: użycie barwników, EM i SDD-AGE.

Użycie barwników, takich jak czerwień Kongo czy tioflawina T, ma tę zaletę, że jest szybkie i łatwe do wykrycia za pomocą mikroskopii lub spektroskopii⁷. Jednak detekcja za pomocą mikroskopii, w przypadku czerwieni kongijskiej, nie dostarcza żadnych informacji na temat tego, które białka składają się na włókna, ani jaka jest ich wielkość. Podobnie, zastosowanie spektroskopii do wykrywania wiązania czerwieni Kongo lub tioflawiny T z kompleksami białkowymi daje tylko wynik dodatni lub negatywny.

EM dostarcza rozstrzygających dowodów na obecność włókien, a także ilościowych informacji na temat długości i średnicy włókna⁸. Jednak ta metoda wymaga bardzo rygorystycznego oczyszczania. Dodatkowo EM jest specjalistyczną techniką, która wykorzystuje drogi sprzęt.

SDD-AGE został użyty do wykrywania odpornych na SDS mega daltonowych kompleksów białkowych, w tym włókien amyloidowych lub amyloidowych. Ma wiele zalet. Po pierwsze, nie wymaga oczyszczania włókien i jest łatwy do uformowania⁹. Po drugie, dostarcza jakościowych informacji o wielkości włókien, w tym względnej wielkości i ilości niejednorodności włókien. Wreszcie, ponieważ Western blot można przeprowadzić po elektroforezie, łatwo jest wykryć obecność dowolnego białka, dla którego istnieje przeciwciało, chociaż należy zauważyć, że ponieważ SDD-AGE jest częściowo denaturujący, niektóre epitopy mogą pozostać ukryte, co komplikuje wykrywanie przez przeciwciało.

Ostatnio donoszono, że kinazy białkowe 1 (RIPK1) i 3 (RIPK3) oddziałujące z receptorami tworzą włókna amyloidowe, które służą jako platformy sygnalizacyjne podczas nekroptozy, zaprogramowanej formy martwicy³. Podczas badania tych włókien nasze laboratorium wykazało, że inne białko związane z nekroptozą, kinaza mieszana (MLKL), również tworzy włókna podobne do amyloidu⁴. Jednak po zbadaniu za pomocą SDD-AGE, rozmiar włókien MLKL wydawał się różny od włókien RIPK1 i RIPK3, które wydawały się identyczne ze sobą (Rysunek 1). Było to nieoczekiwane, ponieważ powszechnie wiadomo, że MLKL wiąże się z RIPK1/RIPK3, tworząc kompleks sygnalizacyjny nekroptozy zwany necrosome¹⁰.

Istnieją co najmniej dwa wyjaśnienia. Po pierwsze, podczas nekroptozy mogą powstać dwa całkowicie odrębne włókna podobne do amyloidu, z których jeden zawiera RIPK1/RIPK3, a drugi MLKL. Po drugie, tylko jeden rodzaj włókien podobnych do amyloidu zawierających RIPK1 / RIPK3 / MLKL może powstać podczas nekroptozy, ale asocjacja MLKL z innymi białkami jest na tyle słaba, że dysocjuje podczas SDD-AGE.

Aby rozwiązać ten problem, proponujemy przeprowadzenie dwuwymiarowego (2D) WIEKU SDD. Włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu stabilne w SDD-AGE będą miały ten sam wzorzec migracji podczas elektroforezy pierwszego i drugiego wymiaru. Będzie to wykrywalne po przeniesieniu białek do błony i przeprowadzeniu Western blot. Stabilne włókna będą miały ostry ukośny wzór. Jakiekolwiek odchylenie od tego sugerowałoby, że włókna ulegają zmianom w wyniku elektroforezy SDS.

Protokół

1. Przygotuj próbki

1. Hodowla 2 x 10⁶ komórek raka jelita grubego HT-29 wytwarzających amyloid w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i penicyliny-streptomycyny. Hodować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .}
   1. Po tym, jak komórki osiągną 80% zlewności, umyj je 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 3 ml roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
   2. Po całkowitym odłączeniu komórek od naczynia dodać 10 ml pożywki hodowlanej i przenieść komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki hodowlanej i policzyć komórki za pomocą licznika komórek. Talerz 2 x 10 6 komórek w każdej z dwóch 10-centymetrowych naczyń.
   3. Pozostawić komórki do przylegania i zregenerować się przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Zastosuj leczenie do jednego naczynia, aby indukować tworzenie amyloidów za pomocą 20 ng / ml czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetic i 20 μM inhibitora pan-kaspazy Z-VAD-FMK¹¹. Kombinacja jest w skrócie TSZ. Drugą potrawę z pojazdem traktuj jako kontrolę.
2. Po upływie odpowiedniego czasu, zwykle 6 godzin, należy pobrać lizat komórkowy.
   1. Zeskrob komórki z płytki za pomocą plastikowego skrobaka i za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
   2. Przemyć komórki 2 razy, ponownie zawieszając w 10 ml lodowatego PBS i odwirowując przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór PBS.
      Uwaga: W tym miejscu proces można wstrzymać, zamrażając osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowując go w temperaturze ˗80 °C przez okres do 1 miesiąca.
   3. Przenieś osad komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubuj w 0,3 ml buforu do lizy przez 30 minut na lodzie. Wirować przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Supernatantem jest lizat całego komórki.
      Uwaga: W tym miejscu proces można wstrzymać, przechowując próbkę w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.
   4. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda zgodnie z protokołem producenta. Dodać 4x bufor ładujący SDD-AGE, aby przygotować 20 μl próbki 3 μg/μL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

2. Przygotuj i uruchom żele

1. Dodaj 2 g agarozy do 200 ml 1x buforu tris-octanowego (TAE) w szklanej zlewce i podgrzej w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Dodaj 1 ml 20% SDS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% SDS. Ostrożnie zamieszaj, aby wymieszać. Uważaj, aby nie generować bąbelków po dodaniu SDS.
2. Wlej roztwór agarozy do płyty żelowej o wymiarach 15 cm x 14 cm. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Umieść jeden 20-dołkowy grzebień na górze.
3. Pierwszy wymiar: Odpipetować 60 μg lizatu pełnokomórkowego na skrajnym prawym pasie. Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około 4 godziny (do momentu, gdy czoło barwnika przejdzie przez żel w około 3/4), używając TAE zawierającego 0,1% SDS jako buforu bieżącego.
4. Drugi wymiar: Ostrożnie obróć żel o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (Rysunek 2A). Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około 4 godziny
   Uwaga: Ogólne warunki pracy to długość żelu 4 V/cm. Ważne jest, aby warunki pracy były dokładnie takie same dla pierwszego i drugiego wymiaru.

3. Transfer

1. Użyj metody transferu kapilarnego, aby przenieść białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (Rysunek 2B).
   1. Dodać 500 ml buforu transferowego do pojemnika o wymiarach około 20 cm x 20 cm. Ułóż obok pojemnika stos ręczników papierowych o wysokości 5 cm. Powierzchnia górnej części stosu musi być większa niż wymiary żelu.
   2. Namocz bibułę filtracyjną o wymiarach 14 cm x 15 cm w buforze transferowym i umieść na stosie ręczników papierowych. Uważaj, aby umieścić na papierze bez zmarszczek i pęcherzyków. Powtórz z kolejnym kawałkiem bibuły filtracyjnej.
   3. Aktywuj membranę PVDF o wymiarach 14 cm x 15 cm w metanolu przez 30 sekund, a następnie ułóż ją na bibule filtracyjnej, uważając, aby użyć wałka do usunięcia wszystkich pęcherzyków. Spłucz żel buforem transferowym i ułóż go na wierzchu membrany, ponownie rozwałkowując wszelkie pęcherzyki.
   4. Przykryj krawędź ręczników papierowych najbliżej pojemnika bufora transferowego folią spożywczą. Ważne jest, aby mostek papierowy zbudowany w kolejnym kroku nie stykał się bezpośrednio ze stosem ręczników papierowych.
   5. Namocz kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 15 cm x 35 cm w buforze transferowym i umieść go tak, aby jeden koniec zakrywał górną część żelu, a drugi koniec znajdował się w pojemniku buforu transferowego. Powtórz z innym mostkiem.
   6. Przykryj pojemnik folią spożywczą i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.

4. Wykrywanie Western Blotting

1. Przepłukać membranę 50 ml PBS zawierającego 0,05% Tween-20 (PBST) w pojemniku o średnicy 20 cm × 20 cm. Dodaj 20 ml mleka 5% do PBST. Kołysz w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zablokować.
2. Odpipetować 10 μl króliczego przeciwciała anty-MLKL do 20 ml 5% mleka w PBST i dodać do pojemnika. Inkubować na bujaku przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Płukać membranę w 20 ml PBST przez 5 minut. Powtórzyć 5 razy.
4. Odpipetować 4 μl anty-króliczej HRP do 20 ml 5% mleka w PBST i dodać do pojemnika. Inkubować na bujaku w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
5. Płukać membranę w 20 ml PBST przez 5 minut. Powtórzyć 5 razy.
6. Dodaj ulepszony substrat chemiluminescencyjny (ECL) i wystaw na klisze rentgenowskie zgodnie z protokołem producenta.

Wyniki

Po indukcji nekroptozy, RIPK1 i RIPK3 wykazywały prawie identyczne wzorce podobne do amyloidu (pasy 2 i 4, Rysunek 1). Jednak włókna MLKL były bardziej niejednorodne i wydawały się być mniejsze niż włókna RIPK1/RIPK3 (linia 6, Rysunek 1). To skłoniło nas do opracowania metody 2D SDD-AGE, aby odpowiedzieć na pytanie, czy MLKL tworzy włókna niezależne od RIPK1/RIPK3, czy też MLKL po prostu dysocjuje od dużych włókien RIPK1/RIPK3/MLKL podczas SDD-AGE.<...

Dyskusja

Najbardziej krytycznym aspektem 2D SDD-AGE jest to, że warunki elektroforezy są takie same dla pierwszego i drugiego wymiaru. Zdolność do wykrycia ostrej linii ukośnej pod kątem 45° (wskazującej, że nie nastąpiła dysocjacja lub degradacja) zależy od włókien migrujących w identyczny sposób podczas obu elektroforezy. Stosowanie różnych warunków, na przykład zmiana napięcia lub długości czasu pracy, zaciemni te wyniki. Ponadto, podobnie jak w przypadku tradycyjnego 1D SDD-AGE, należy unikać gotowania próbki, ponieważ spowod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie do elektroforezy żelowej	Fisher	HE99XPRO	apratusa do biegania żelowego.
agroza	VWR	97062-250	Do żelu agarozowego.
wieża papierowa	Fisher	19-120-2484	do przenoszenia
bibuły filtracyjnej	VWR	21427-386	do przenoszenia
membrany PVDF	Bio-Rad	162-0177	do przenoszenia blokującego
mleko w proszku	Bio-Rad	1706404XTU	do blokowania w Western blot
Przeciwciało anty-MLKL	Genetex	GTX107538	królik
Przeciwciało RIPK1	BD Biosciences	610459	mysie przeciwciało anty-RIPK1
Przeciwciało RIPK3	prezent od dr Xiaodong Wang		królik anty-RIPK3. Patrz Ostrzeżenie 11.
drugorzędowe	anty-Rabbit-HRP	Sigma	A6154
ECL	Fisher	WBKLS0500	Zachodni chemiluminescencyjny substrat HRP
Film rentgenowski	Fisher	F-BX810	do wyniku Western blot
DMEM	Sigma	D6429	do hodowli komórkowych
płodowej surowicy bydlęcej	Sigma	F4135	do hodowli komórkowej
penicyna-streptomycyna	Sigma	P4333	do hodowli komórkowych
Roztwór trypsyny	Sigma	T4049	do hodowli komórkowych
PBS do hodowli tkankowych	Sigma	D8662	do hodowli komórkowych
rekombinowany TNF	wykonany w naszym laboratorium		do indukowania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.
smac-mimetyczny	prezent od dr Xiaodong Wang		do wywoływania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	do indukowania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.
Licznik komórek	Bio-Rad		1450102 Model TC20; do liczenia komórek
Pierce™ Zestaw do oznaczania białek BCA	Thermo Scientific	23225	do pomiaru stężenia białka w lizatach komórkowych
Podnośnik komórek	Fisher	07-200-364	do usuwania komórek z naczynia
Bufor do lizy (1 l)			20 ml 1 M Tris pH 7,4 10 ml glicerolu 30 ml 5 M NaCl 840 ml ddH2O 10 mL Triton-X100 (inhibitory proteazy i fosforanów według uznania)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris zasada 11,42 ml lodowaty kwas octowy 20 ml 0,5 M EDTA pH 8 ddH20 do 1 L
4X SDD-AGE bufor ładujący (50 ml)			5 ml 10X TAE 10 ml glicerolu 4 ml 20% SDS 0,5 ml 10% błękitu bromofenolowego 31 ml ddH2O
TBS Bufor transferowy (1 l)			20 ml 1 M Tris pH 7,4 30 ml 5 M NaCl 950 ml ddH2O
Bufor do płukania PBST (1 l)			100 ml 10xPBS 800 ml ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 l)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4· 2H2O 24 g KH2PO4 dodać ddH2O do 10 L