Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię losowej mutagenezy docelowego genu u drożdży rozszczepieniowych. Jako przykład celujemy w rpt4 +, który koduje podjednostkę proteasomu 19S i badamy pod kątem mutacji, które destabilizują heterochromatynę.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mutageneza losowa ukierunkowana na geny w celu wyselekcjonowania mutantów proteasomów destabilizujących heterochromatynę w drożdżach rozszczepieniowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Losowa mutageneza docelowego genu jest powszechnie stosowana do identyfikacji mutacji, które dają pożądany fenotyp. Spośród metod, które można zastosować do osiągnięcia mutagenezy losowej, podatny na błędy PCR jest wygodną i skuteczną strategią generowania zróżnicowanej puli mutantów (tj. biblioteki mutantów). Podatny na błędy PCR jest metodą z wyboru, gdy badacz stara się zmutować wstępnie zdefiniowany region, taki jak region kodujący gen, pozostawiając inne regiony genomu nienaruszone. Po amplifikacji biblioteki mutantów przez podatny na błędy PCR, należy ją sklonować do odpowiedniego plazmidu. Rozmiar biblioteki wygenerowanej przez podatny na błędy PCR jest ograniczony przez wydajność etapu klonowania. Jednak w drożdżach rozszczepialnych, Schizosaccharomyces pombe, etap klonowania można zastąpić zastosowaniem wysoce wydajnej jednoetapowej reakcji termojądrowej w celu wygenerowania konstruktów do transformacji. Mutanty o pożądanych fenotypach mogą być następnie selekcjonowane za pomocą odpowiednich reporterów. Tutaj szczegółowo opisujemy tę strategię, biorąc za przykład reporter umieszczony w centromerowej heterochromatynie.
Wprowadzenie
Genetyka do przodu to klasyczna metoda, w której badacze poszukują naturalnie występujących mutantów o określonym fenotypie i przeprowadzają analizy genetyczne. W genetyce odwrotnej mutacje są wprowadzane do genu będącego przedmiotem zainteresowania i badany jest fenotyp. W tym drugim przypadku losowa mutageneza genu docelowego jest często wykorzystywana do wygenerowania puli mutantów, które są następnie selekcjonowane pod kątem pożądanych fenotypów, takich jak wrażliwość na temperaturę lub zmieniona aktywność enzymatyczna. W celu osiągnięcia mutagenezy losowej można zastosować różne metody, w tym podatne na błędy PCR1; Naświetlanie promieniami....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie mediów
- Przygotuj ekstrakt drożdżowy z suplementami (TAK), TAK bez adeniny (YES Low Ade), pożywkę z glutaminianu Pombe (PMG12) i PMG bez adeniny (PMG-Ade) mieszając składniki zgodnie z opisem w Tabeli 1. Płytki YES-Ade (Low Ade) i PMG-Ade mają wszystkie te same składniki, ale adenina jest pominięta w tej ostatniej.
- Użyć następującego bulionu soli (50x): 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L Na2SO4 w wodzie destylowanej. Filtr sterylizować za pomocą filtra o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w tempera....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pozyskane mutanty Rpt4, zgodnie z procedurami opisanymi na Rysunku 1, można analizować poprzez ocenę barwy kolonii. Barwy kolonii naniesione na odpowiednie szalki w malejącej liczbie komórek przedstawiono na Rysunku 2. Reporter ade6+ wstawiony w region heterochromatyny jest wyciszony u szczepu dzikiego, co objawia się czerwonymi koloniami na pożywce YES-Ade. Po destabilizacji heterochromatyny i ekspresji reportera ad.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mutageneza losowa za pomocą podatnego na błędy PCR jest potężnym narzędziem do generowania zróżnicowanej puli mutantów w danym regionie. Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniach, które mają na celu ocenę funkcji białka w określonych okolicznościach. Na przykład w niniejszym artykule użyliśmy podatnego na błędy PCR do oceny funkcji podjednostki proteasomu 19S, Rpt4, w utrzymaniu heterochromatyny. Zmieniając region, na który ukierunkowany jest podatny na błędy PCR i dostosowując warunki badań przesiewowych, byliś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Wsparcie finansowe dla tego projektu zostało zapewnione przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych (2016R1A2B2006354).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Ekstrakt drożdżowy | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucyna | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Siarczan adeniny | ACR | 16363-0250 | |
| Uracyl | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Ftalan potasu | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inozytol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotyna | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Kwas borowy | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4• 7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2• 4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Dwuwodny molibdenian sodu | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4• 5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-mio-inozytol | MP biomedyczny | 102052 | |
| Pantotenian | YAKURI | 26003 | |
| Kwas nikotynowy | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agaroza | Biobasic | D0012 | |
| G418, genetycyna | LPS | G41805 | |
| 2. Reakcje enzymatyczne | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | Do mutagenezy ukierunkowanej |
| GeneMorphII Zestaw do mutagenezy losowej | Aglient | 200500 | Do podatnego na błędy PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | Do fuzji PCR |
| Ex Taq Polimeraza DNA | Takara | RR001b | Do ogólnego PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Ekwipunek | |||
| Aksamitny kwadrat, | VWR | 89033-116 | Do repliki |
| Replika narzędzia do galwanizacji | VWR | 25395-380 | Do repliki |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | Do przemiany drożdży rozszczepialnych |
| Kuwety do elektroporacji, odstęp 0,2 cm | Biorad | 1652086 | Do przemiany drożdży rozszczepialnych |
| Thermal Cycler | Bioer BYQ6078 | do reakcji narastania termojądrowej PCR |
Bibliografia
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
