Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Streszczenie

Złośliwa transformacja melanocytów, komórek barwnikowych ludzkiej skóry, powoduje powstawanie czerniaka, wysoce agresywnego nowotworu o zwiększonym potencjale przerzutowym. Ostatnio monochemioterapia nadal ulega poprawie dzięki terapiom skojarzonym specyficznym dla czerniaka z celowanymi inhibitorami kinaz. Mimo to czerniak z przerzutami pozostaje chorobą zagrażającą życiu, ponieważ nowotwory wykazują pierwotną oporność lub rozwijają oporność na nowe terapie, odzyskując w ten sposób zdolność rakotwórczą. W celu poprawy skuteczności terapeutycznej czerniaka złośliwego konieczne jest określenie mechanizmów molekularnych nadających oporność na konwencjonalne metody leczenia; Wymaga to jednak innowacyjnych komórkowych modeli in vitro. W tym miejscu przedstawiamy trójwymiarowy (3D) organotypowy model sferoidalny czerniaka in vitro, który może przedstawić architekturę czerniaka złośliwego in vivo i może uzasadnić nowy wgląd w interakcje wewnątrz guza, a także guz-gospodarz. Model zawiera zdefiniowaną liczbę dojrzałych i zróżnicowanych sferoid czerniaka w trójwymiarowym modelu pełnej rekonstrukcji ludzkiej skóry składającym się z pierwotnych komórek skóry. Skład komórkowy i status różnicowania osadzonych sferoid czerniaka jest podobny do przerzutów czerniaka skóry in vivo. Wykorzystanie tego organotypowego modelu sferoidalnego czerniaka jako platformy badań przesiewowych leków może pomóc w identyfikacji osób reagujących na wybrane terapie skojarzone, przy jednoczesnym oszczędzeniu niepotrzebnego obciążenia związanego z leczeniem u osób niereagujących na leczenie, zwiększając w ten sposób korzyści z interwencji terapeutycznych.

Wprowadzenie

Ludzka skóra składa się z dwóch odrębnych komór, które pełnią różne funkcje w ochronie ciała przed niekorzystnym wpływem środowiska¹. Dolny przedział skórny składa się z włóknisto-elastycznej tkanki łącznej. Składa się z luźno połączonych włókien kolagenu i elastyny syntetyzowanych przez fibroblasty, pełniących funkcję bariery mechanicznej. Skóra właściwa jest oddzielona od górnego naskórka blaszką podstawną, która jest wytwarzana jako macierz zewnątrzkomórkowa w wyniku ciągłej komunikacji między obydwoma przedziałami skóry. W przeciwieństwie do skóry właściwej, naskórek jest nabłonkiem płaskonabłonkowym, który składa się głównie z keratynocytów i może być podzielony na cztery warstwy. Warstwa podstawowa składa się z niezróżnicowanych keratynocytów podstawnych, które stale pochodzą z komórek progenitorowych skóry, rozwarstwiając się przez etapy warstwy kolczastej i warstwy ziarnistej do warstwy rogowej naskórka w celu ochrony organizmu przed odwodnieniem i infekcjami². Melanocyty są ustawione w jednej linii na błonie podstawnej i komunikują się poprzez dendrytyczne rozszerzenia z wieloma keratynocytami. Wytwarzają pigment melaninę, aby chronić tkankę skórną przed niekorzystnymi skutkami promieniowania UV, takimi jak starzenie się skóry, immunosupresja, stany zapalne i indukcja nieczerniakowego raka skóry. Udział promieniowania UV w przekształcaniu melanocytów w czerniaka złośliwego jest jednak nadal przedmiotem dyskusji³.

Rozwój czerniaka jest zróżnicowany na różne etapy progresji guza i charakteryzuje się pewnymi zmianami genetycznymi, morfologicznymi i histologicznymi⁴. Powstają albo de novo, albo z wrodzonego lub nabytego znamienia z powodu lokalnego wzrostu proliferacji melanocytów powodującego łagodną neoplazję. Ta zmiana prekursorowa może przekształcić się w strukturalnie zmodyfikowaną tkankę dysplastyczną zawierającą komórki atypowe, która może przejść do pierwszego złośliwego etapu, radialnej fazy wzrostu (RGP). Ta wczesna faza progresji guza charakteryzuje się promieniście proliferującymi komórkami w naskórku, wykazując niewiele miejscowo inwazyjnych komórek w brodawkowatej skórze właściwej. Podczas kolejnej fazy wzrostu pionowego (VGP) komórki czerniaka wykazują już przerzutowy i inwazyjny fenotyp, przebijając się przez blaszkę podstawną, aby naciekać głębsze części skóry właściwej, a także tkankę podskórną⁵. Wreszcie, czerniak z przerzutami (MM) stanowi najbardziej agresywny etap progresji, w którym komórki przerzutowe rozprzestrzeniają się ogólnoustrojowo w układzie krwionośnym i limfatycznym, aby zaatakować dystalne narządy, takie jak wątroba, płuca i mózg⁶.

Do tej pory, wczesna diagnoza, a następnie operacja, nadal pozostaje najskuteczniejszą terapią czerniaka złośliwego. Rokowanie dla pacjentów z przerzutami odległymi pozostaje jednak szczególnie złe⁷, ponieważ klasyczne schematy chemioterapii przynoszą tylko niewielkie korzyści w zakresie przeżycia^8,9. Jednak po dziesięcioleciach stagnacji, ostatnie postępy w terapiach celowanych znacznie poprawiły rokowanie w przypadku czerniaka złośliwego.

Rozregulowanie dwóch głównych szlaków aktywowanych przez mitogen, szlaków sygnałowych RAS-RAF-MEK-ERK i PI3K-AKT-PTEN, stanowią kluczowe czynniki progresji czerniaka, zwłaszcza gdy konstytutywnie aktywowane są mutacje punktowe protoonkogenów BRAFV600 i NRAS¹⁰. W związku z tym wynalezienie celowanych inhibitorów kinaz obiecywało korzyści terapeutyczne dla pacjentów cierpiących na czerniaka z przerzutami. Wiele badań klinicznych przeprowadzonych do tej pory nie przyniosło znaczących korzyści dla pacjentów z czerniakiem z przerzutami. Prawie wszystkie odpowiedzi są częściowe, a subpopulacja pacjentów wykazuje pierwotną oporność. Ponadto u większości pacjentów zaobserwowano nabycie wtórnej oporności prowadzącej do nawrotu choroby^11,12.

Staje się jasne, że sama analiza statusu mutacji nie wystarcza do opracowania najskuteczniejszej strategii terapeutycznej. Nowe, szybkie i niezawodne narzędzia diagnostyczne są niezbędne do systematycznego rejestrowania i analizowania odpowiedzi poszczególnych komórek nowotworowych. Zdecydowana większość obecnie dostępnych danych dotyczących czerniaka u ludzi została uzyskana z dwuwymiarowych (2D) hodowli komórek czerniaka. Jednak komórki nowotworowe hodowane w 3D umożliwiają przesłuch międzykomórkowy między zróżnicowanymi subpopulacjami komórek rakowych, a także między komórkami rakowymi a nieprzekształconą otaczającą tkanką gospodarza. Dlatego najlepiej byłoby zrekonstruować środowisko 3D, w którym rozwinął się czerniak, aby wykorzystać je jako przedkliniczny model przesiewowy^13,14.

Protokół

Wszystkie prace nad tkankami ludzkimi zostały wykonane przy użyciu zatwierdzonych protokołów instytucjonalnych.

1. Oddzielenie skóry właściwej i naskórka od ludzkiej skóry (napletek młodzieńczy od obrzezania)

1. Umieść napletek (zwykle 1 - 2 cm²) w nieprzywierającym sterylnym naczyniu do hodowli komórek (Ø 10 cm) i przykryj go 10 - 12 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami⁺ (PBS, 0,5 mM MgCl₂, 0,9 mM CaCl₂, pH 7,2 = PBS⁺). Usuń cały nadmiar tkanki tłuszczowej za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy.
2. Pokrój skórę na kawałki o wymiarach 3 mm x 5 mm, umyj je PBS i przenieś do nieprzywierającej sterylnej miski do hodowli komórkowych (Ø 6 cm). Przykryj kawałki tkanki 5 - 7 ml roztworu dyspazy (2 U/ml w PBS). Uszczelnić naczynie do hodowli komórkowych folią parafinową i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
3. Wycofaj naskórek z części skórnej za pomocą dwóch sterylnych kleszczy. Przenieść wypreparowane kawałki tkanki do indywidualnych nieprzywierających naczyń do hodowli komórkowych (Ø 6 cm) i przykryć każdą z nich PBS⁺.

2. Izolacja pierwotnych keratynocytów od naskórka

1. Ostrożnie wyjąć PBS⁺ z naczynia do hodowli komórkowych za pomocą pipety Pasteura i przemyć fragmenty tkanki naskórka (sekcja 1.3) PBS. Pokrój naskórek na mniejsze kawałki (1^mm2) i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 1x Trypsin-EDTA (podgrzanej do 37 °C) i inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Mieszać zawiesinę tkankową co 2 minuty.
2. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 1 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS). Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół plastikową pipetą o pojemności 10 ml przez 4 minuty. Staraj się unikać bąbelków i tworzenia się piany.
3. Odpipetować zawiesinę komórek do sitka komórkowego (wielkość porów 100 μm), umieszczonego na wierzchu świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przepłukać 3x 5 ml PBS. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 2 - 6 ml pożywki hodowlanej zawierającej 1% (v/v) gentamycyny. Określ liczbę komórek ręcznie, zliczając komórki w hemocytometrze i zasiewając 6 x 10⁵ komórek do kolby do hodowli komórkowych T75.

3. Uprawa pierwotnych keratynocytów

1. Inkubować pierwotne keratynocyty wyizolowane w kroku 2.3 w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w pożywce keratynocytów bez FCS, do 50 - 70% konfluencji.
2. Aby przejść keratynocyty, ostrożnie usuń pożywkę, dodaj 5 ml PBS-EDTA i inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Sprawdź, czy komórki zaczęły odłączać się od kolby hodowlanej pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4X: komórki będą wyglądały na zaokrąglone, ale nadal są przyczepione!). W przeciwnym razie należy zastąpić stary PBS-EDTA świeżym PBS-EDTA i ponownie inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C.
3. Dodać 5 ml 1x Trypsin-EDTA do zaokrąglonych komórek nadal pokrytych 10 ml PBS-EDTA i ponownie je inkubować przez 1 - 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 1 ml FCS i zebrać oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce keratynocytowej i wysiać 6 x 10⁵ komórek do świeżej kolby do hodowli komórek T75.
   UWAGA: Do wygenerowania organotypowych rekonstrukcji skóry należy użyć keratynocytów pierwotnych nie później niż w pasażu 3 - 4.

4. Izolacja pierwotnych fibroblastów od skóry właściwej

1. Pociąć tkankę skórną (sekcja 1.3) na mniejsze kawałki (1^mm2) i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml roztworu kolagenazy (5 j./ml w PBS⁺) i inkubować przez 45 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Odwirować mieszaninę fragmentów tkanek i komórek w temperaturze 200 x g przez 5 min.
2. Przemyj osad komórkowy dwukrotnie 10 ml DMEM zawierającym 4,5 g/l glukozy i L-glutaminy, ale bez L-pirogronianu. Na koniec ponownie zawiesić fragmenty tkanki w 2 ml DMEM zawierającym 1% (v/v) gentamycyny i 10% FCS. Przenieść je do kolby do hodowli komórkowych T25 i inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez noc.
   UWAGA: Mała objętość pozwala fibroblastom na migrację z resztek tkankowych i zmusza je do przyłączenia się do kolby hodowlanej.
3. Następnego ranka dodaj kolejne 6 ml DMEM/Gentamycyny/FCS i inkubuj przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną zbieżność 80-90%.

5. Uprawa pierwotnych fibroblastów

1. Aby przejść przez fibroblasty, usuń pożywkę i przemyj przylegające komórki PBS. Dodać 5 ml 1x Trypsyna-EDTA i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
2. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 5 ml DMEM/FCS i zbierz oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce DMEM i wysiać 6 x 10⁵ komórek do świeżej kolby do hodowli komórek T75.
   UWAGA: Do wygenerowania organotypowych rekonstrukcji skóry należy użyć pierwotnych fibroblastów nie później niż w pasażu 4 - 6.

6. Generowanie sferoid czerniaka 3D metodą wiszącej kropli

1. Hodowla komórek czerniaka (np. 451-LU lub dowolnej interesującej nas linii komórkowej czerniaka) zgodnie z ogólnymi protokołami, przy użyciu RPMI zawierającego 10% FCS¹⁵.
   1. Aby wytworzyć sferoidy czerniaka o podobnej wielkości i jakości, umyj komórki czerniaka w PBS, dodaj 5 ml 1x Trypsyna-EDTA w PBS do komórek w kolbie do hodowli komórek T175 i inkubuj przez 3 - 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Zneutralizuj trypsynę, dodając 5 ml RPMI/10% FCS. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w RPMI/FCS przy końcowym stężeniu 10 000 komórek/ml, określonym przez zliczenie w hemocytometrze.
2. Za pomocą elektronicznej pipety wielofunkcyjnej umieścić 40 x 25 μl (= 250 komórek) zawiesiny komórkowej na wewnętrznej powierzchni pokrywy sterylnego, nieprzywierającego naczynia do hodowli komórkowych (Ø 10 cm). Szybkim, ale płynnym ruchem odwróć pokrywkę i umieść ją na odpowiednim naczyniu do hodowli komórkowych zawierającym 5 ml PBS.
   1. Hodowla "wiszące naczynia kroplowe" w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 10 - 14 dni, w zależności od użytego typu komórki.
      UWAGA: Komórki z fazy wzrostu MM zazwyczaj rosną szybciej i tworzą bardziej stałe sferoidy w zwisającej kropli w porównaniu z komórkami czerniaka pochodzącymi z RGP lub VGP. W celu indywidualnej oceny obserwuj wzrost sferoidy pod lornetką lub pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4x). Zazwyczaj sferoidy stają się wykrywalne po 48 godzinach pod lornetką lub pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4x). Po 10 - 14 dniach są widoczne bez żadnego urządzenia powiększającego.
3. 5 dni po pierwszym zauważeniu kropli dodaj 10 μl świeżej pożywki RPMI/10% FCS do każdej kropli. Następnie wymieniaj 10 μl pożywki co drugi dzień. Bardzo pomocne w tym kroku jest korzystanie z elektronicznego dozownika.
4. W zależności od typu komórek, sferoidy (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 10) należy zebrać po 10 - 15 dniach, delikatnie spłukując je z pokrywki naczynia do hodowli komórkowych za pomocą PBS. Zbierz je w świeżym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórkowych.
   UWAGA: Okres hodowli zależy od fazy wzrostu guza komórek czerniaka, kiedy zostały one pierwotnie uzyskane, np. sferoidy pochodzące z komórek 451-LU osiągają średnicę około 500 μm w ciągu 12 dni od hodowli w wiszącej kropli ¹⁵.

7. Generowanie kompartmentu skórnego organotypowych rekonstrukcji całej skóry

1. Generuj modele skóry za pomocą 24-dołkowych wkładek mikroporowatej błony komórkowej (wielkość porów 8 μm) umieszczonych w 24-dołkowych płytkach.
   UWAGA: Upewnij się, że nie używasz wiszących, ale stojących wkładów, ponieważ na późniejszym etapie zostaną one umieszczone na 6-dołkowej płytce do uprawy powietrzno-płynnej.
2. Przygotuj roztwór neutralizujący żel (GNL)¹⁵, a także pożywki hodowlane określane jako MM i pożywki wzrostu śródbłonka (EGM)^16,17. Aby zapobiec krzepnięciu, przechowuj kolagen typu I (zwykle z ogona szczura, 3,5 - 4 mg / ml w 0,02 N kwasu octowego) na lodzie do czasu użycia, ponieważ zaczyna żelować w temperaturze pokojowej.
3. Ponownie zawiesić 1 x 10⁵ fibroblastów na wkładkę w GNL i szybko wymieszać zawiesinę komórkową z kolagenem w stosunku 1:3 w końcowej objętości 500 μl / wkładkę. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki mogą pogorszyć jakość rekonstrukcji skóry.
4. Pozwól, aby poszczególne żele skórne osiadły, trzymając je bez podłoża w temperaturze pokojowej przez 30 minut w sterylnym kapturze. Następnie przykryj każdy żel DMEM zawierającym 4,5 g/l glukozy, 1% L-glutaminy, 10% FCS i bez L-pirogronianu i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.

8. Wytwarzanie kompartmentu naskórkowego organotypowych rekonstrukcji pełnej skóry

1. Następnego dnia usunąć pożywkę z żeli skórnych i zrównoważyć je z pożywką EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/ml gentamycyny) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Pobrać pożywkę i ostrożnie wysiać 1 x 10⁵ keratynocytów zawieszonych w 100 μl EGM na wierzchu żelu skórnego.
2. Inkubować rekonstrukcje przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C, aby keratynocyty mogły przylegać do komory skórnej.
   UWAGA: W tym czasie inkubacji żele zaczną się kurczyć z powodu skurczu wywołanego przez fibroblasty, a tym samym przynajmniej częściowo oderwą się od ścianek wkładu.
3. Przykryj odpowiedniki skóry około 800 μl EGM i ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładki za pomocą małej (białej) końcówki pipety. Hodować odpowiedniki skóry zanurzone w EGM przez 7 dni w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i zmieniać pożywkę co drugi dzień.
   UWAGA: W tym czasie odpowiedniki skóry znacznie się skurczą.

9. Powietrzno-płynna uprawa organotypowych rekonstrukcji całej skóry

1. W 8 dniu przenieś każdą wkładkę do indywidualnego dołka na 6-dołkowej płytce. Do każdej studzienki należy dodać tylko 1,2 - 1,4 ml pożywki MM, tak aby rekonstrukcja skóry była zaopatrywana w podłoże z dna studzienki, ale nie była pokryta podłożem.
   UWAGA: Uprawa na granicy faz powietrze-ciecz umożliwia rozwarstwienie części naskórka i utworzenie pełnej warstwy rogowej naskórka (stratum corneum).
2. W ciągu następnych 10 - 17 dni należy zmieniać podłoże zgodnie z punktem 9.1 co drugi dzień. W tym okresie dodaj do pożywki leki lub inne bodźce w razie potrzeby. Ostrożnie usuń pełną rekonstrukcję skóry z wkładu mikroporowatej błony za pomocą zakrzywionej pęsety w celu dalszej analizy, np. analizy immunohistochemicznej (Rysunek 1).

10. Generowanie organotypowych modeli skóry sferoidalnej czerniaka

1. Aby zintegrować sferoidy czerniaka z kompartmentem skórnym organotypowej pełnej rekonstrukcji skóry, należy ostrożnie spłukać sferoidy (po kroku 6.4) z pokrywki wiszącego naczynia do hodowli komórek kroplowych za pomocą PBS. Zbierz 10 - 20 sferoidów/włóż do sterylnego, nieprzywierającego naczynia do hodowli komórkowych. Ostrożnie usuń nadmiar PBS za pomocą pipety Pasteura.
2. Zassać sferoidy w najmniejszej możliwej objętości NWZ. W tym momencie obserwuj i licz sferoidy gołym okiem, bez żadnego dodatkowego urządzenia powiększającego. Weź 10 - 20 sferoid na model skóry/żel, jak podano w kroku 10.1.
3. Przenieś je do żądanej objętości GNL zawierającej fibroblasty (podczas kroku 7.3) i wymieszaj z kolagenem typu I. Począwszy od tego kroku, postępuj zgodnie z opisem w sekcjach 7.3 - 9.1.
   UWAGA: Sferoidy guza stają się widoczne w żelu skórnym jako białe plamy (Rysunek 2)

Wyniki

Skuteczność leczenia przerzutów czerniaka może być wpływana przez komunikację między komórkami nowotworowymi, a także między komórkami nowotworowymi a nietransformowanymi komórkami gospodarza. Celem opracowania organotypowych modeli raka in vitro jest zapewnienie odpowiednich przedklinicznych systemów testowych, które odzwierciedlają trójwymiarową organizację i złożoność czerniaka u ludzi in vivo. Pozwala to na równoległe badanie wpływu terapeutycznego na guz w środowisku organotypowym oraz działań niepożądanych na otaczającą tkankę pierwotną.

Aby opracować optymalne organotypowe modele skóry, kluczowa jest jakość pierwotnych komórek. Korzystne jest zastosowanie pierwotnych fibroblastów i keratynocytów pochodzących od osobników młodszych, ponieważ są one zazwyczaj mniej zróżnicowane w porównaniu do pierwotnych komórek skóry dorosłych. Komórki skóry osobników młodszych można wyizolować z młodzieńczego napletka, zgodnie z opisem w sekcjach protokołu 1–5, ale można je również zakupić w firmach jako prenatalne pierwotne fibroblasty i keratynocyty. W przypadku zakupu konieczne jest zamówienie komórek od różnych dawców, aby uniknąć wyników specyficznych dla konkretnego dawcy, np. w zakresie wrażliwości na leki. Cały protokół przedstawiono w formie schematu na Rysunku 3.

Kontrola jakości trójwymiarowych ekwiwalentów pełnej skóry wymaga analizy immunohistochemicznej. Wstępne spostrzeżenia można uzyskać poprzez barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) skrawków zatopionych w parafinie (3 µm). Szczegółowa analiza jakości różnicowania naskórka i formowania błony podstawnej między skórą właściwą a naskórkiem wymaga analizy immunohistochemicznej z użyciem specyficznych przeciwciał przeciwko markerowi stratyfikacji naskórka. Pozwala to na rozróżnienie między nieróżnicującymi się, silnie proliferującymi komórkami zlokalizowanymi blisko błony podstawnej a silnie zróżnicowanymi i zkeratynizowanymi komórkami w stratum corneum poprzez formowanie wyraźnych warstw naskórka pomiędzy nimi. Jak pokazano w barwieniu immunohistologicznym (Rycina 4), różnicowanie keratynocytów w całym naskórku przebiegało podobnie jak w normalnej skórze: głównie nieróżnicujące się komórki z dolnych warstw naskórka (stratum basale i stratum spinosum) wykazują pozytywne barwienie na keratynę 14, podczas gdy bardziej zróżnicowane komórki z warstw ponadpodstawnych (stratum granulosum i stratum corneum) barwią się pozytywnie na keratynę 10 i inwolukrynę. Odpowiednio, barwienie na filaggrinę można zaobserwować jedynie w silnie zróżnicowanych komórkach stratum corneum. Co najważniejsze, barwienie na lamininę 5 wykazuje, że utworzyła się błona podstawna, która fizjologicznie łączy komponent naskórkowy z komponentem skóry właściwej w rekonstrukcie sztucznej skóry. Dowodzi to, że wygenerowano komunikujące się mikrośrodowisko organotypowe do hodowli komórek czerniaka lub sferoidów w celu analizy fizjologicznej i patofizjologicznej.

W celu przesiewania leków przeciwmelanomowych, pojedyncze komórki czerniaka można również zintegrować z skórą właściwą pełnych ekwiwalentów skóry, aby umożliwić de novo tworzenie gniazd czerniaka^18,19W związku z tym komórki czerniaka łączy się z fibroblastami pierwotnymi w stosunku 5:1, wiruje wspólnie z prędkością 200 x g przez 5 min, a następnie resuspenduje w GNL przed wymieszaniem z kolagenem. W efekcie w przedziale skórnym samoistnie tworzą się gniazda komórek czerniaka. Z naszego doświadczenia wynika, że jedynie komórki w fazie wzrostu przerzutowego tworzą właściwe gniazda, w przeciwieństwie do komórek czerniaka w fazie RGP lub VGP.¹⁵Jedną z głównych wad tego typu modeli jest fakt, że liczba i wielkość tworzących się gniazd czerniaka nie są przewidywalne i mogą różnić się pomiędzy poszczególnymi rekonstrukcjami skóry, niezależnie od zastosowanego leczenia. Na przykład, 1000 komórek zasianych w przedziale skórnym może utworzyć 10 gniazd składających się ze 100 komórek lub 100 gniazd składających się z 10 komórek każde (Rysunek 5). Zmienne biologiczne te przejawiają trzy deficyty: po pierwsze, liczba i wielkość tworzonych gniazd czerniaka są nieprzewidywalne; po drugie, przerzuty in vivo są zazwyczaj większe niż gniazda czerniaka i wykazują bardziej złożoną różnorodność wewnątrznowotworową; po trzecie, ze względu na ograniczony czas życia modeli gniazd nowotworowych, leczenie jest rozpoczynane wcześnie, co w konsekwencji raczej hamuje wzrost nowotworu, zamiast powodować regresję istniejących gniazd nowotworowych.

Aby pokonać te ograniczenia, można wytworzyć organotypowe modele skóry z sferoidami czerniaka. Poprzez hodowlę 250 przerzutowych komórek czerniaka w kropli wiszącej przez 14 dni²⁰, w sposób powtarzalny generowane są sferoidy składające się z żywotnych komórek czerniaka o zwartej strukturze i końcowej średnicy około 500 µm, co naśladuje nieunaczynione guzki nowotworowe, mikroprzerzuty lub międzykapilarne mikroregiony guzów litych^21,22. Generalnie każda linia komórkowa czerniaka nadaje się do wytwarzania sferoidów metodą kropli wiszącej; jednak komórki pochodzące z bardziej zaawansowanych stadiów przerzutowych guza tworzą bardziej zwarte sferoidy w porównaniu do linii komórkowych pochodzących z wczesnych stadiów progresji, np. RGP.

W przypadku niektórych komórek, w celu prawidłowego formowania sferoidów, korzystne jest zwiększenie lepkości pożywki do hodowli w kropli wiszącej. Można to osiągnąć poprzez dodanie 10 - 50% metylocelulozy do pożywki hodowlanej. Aby przygotować roztwór stokowy metylocelulozy, należy autoklawować 1,2 g metylocelulozy wraz z magnetycznym mieszadłem w 100 mL szklanej butelce. Należy dodać 100 mL podgrzanej (60 °C) pożywki i mieszać przez 20 min w temperaturze pokojowej oraz przez kolejne 1 - 2 h w temperaturze 4 °C. Roztwór stokowy należy wirować przez 2 h przy 5,000 x g, a lepki nadsącz przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

Właściwa walidacja pełnych modeli sferoidów czerniaka skóry wynika z faktu, że określona liczba sferoidów czerniaka może – przynajmniej statystycznie – zostać zintegrowana z rusztowaniem z fibroblastów skóry i kolagenu I w 1. dniu konstrukcji modelu skóry, co pozwala na ich wspólny rozwój podczas różnicowania naskórka przez kolejne 25–27 dni. Wydajność sferoidów można przeanalizować bezpośrednio po wysianiu, ponieważ sferoidy pojawiają się jako białe punkty w przezroczystym żelu dermy i są widoczne bez użycia żadnego urządzenia powiększającego (Rysunek 2). W rezultacie powstaje trójwymiarowy model skóry zawierający dojrzałe sferoidy czerniaka, które były hodowane in vitro przez łącznie około 42 dni, wykazując najwyższy poziom wewnątrznowotworowego różnicowania komórek¹⁵.

Barwienie H&E modelu sferoidów czerniaka skóry ujawnia, że wygląd histologiczny i rozkład komórkowy sferoidów czerniaka są bardzo podobne do tych obserwowanych w nieunaczynionych przerzutach czerniaka do skóry człowieka in vivo¹⁵ (Rysunek 6). W tych warunkach wyraźnie rozróżnić można dwie subpopulacje komórek czerniaka: obwodową subpopulację proliferującą oraz centralną subpopulację składającą się głównie z obkurczonych komórek apoptotycznych lub nekrotycznych, tworzących tzw. centrum nekrotyczne. Immunohistochemicznie żywe i proliferujące subpopulacje można wykryć za pomocą przeciwciał przeciwko markerowi proliferacji KI-67, natomiast komórki centrum nekrotycznego można zwizualizować za pomocą barwienia TUNEL¹⁵. Taki specyficzny rozkład subpopulacji komórek nowotworowych jest uzależniony od rozmiaru sferoidu (≥500 µm), co wynika z braku składników odżywczych i tlenu w części centralnej, gdzie gromadzą się produkty przemiany materii. Postępowanie zgodnie z przedstawionym protokołem pozwoli na stworzenie wiarygodnego i powtarzalnego organotypowego modelu pełnowarstwowej skóry ludzkiej z osadzonymi sferoidami czerniaka ludzkiego, które naśladują przerzuty czerniaka do skóry człowieka. Zastosowania tego modelu obejmują testowanie leków, screening toksyn, badanie wpływu związków kosmetycznych lub terapii laserowej na wzrost czerniaka oraz jego leczenie.

Rysunek 1: Hodowla 3D organotypowych rekonstruktów skóry w warunkach zanurzenia w medium oraz na interfejsie powietrze-ciecz. W dniu 0 pierwotne keratynocyty są wysiewane na wierzch przedziału dermalnego składającego się z pierwotnych fibroblastów zatopionych w macierzy z kolagenu typu I. Rekonstrukty skóry 3D pozostają w hodowli zanurzonej w EGM przez 7 dni, odrywają się od ścianek insertu i zaczynają się kurczyć. W dniu 8 inserty są przenoszone do płytek 6-dołkowych i hodowane na interfejsie powietrze-ciecz, aby umożliwić stratyfikację naskórka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Sferoidy czerniaka osadzone w przedziale skórnym widoczne jako białe punkty. Podczas przygotowywania przedziału skórnego w rekonstrukcji skóry 3D do mieszaniny fibroblastów i kolagenu typu I można dodać określoną liczbę sferoidów czerniaka. Po zastygnięciu żelu skórnego sferoidy czerniaka stają się widoczne jako białe punkty.

Rycina 3: Schemat konstrukcji trójwymiarowego organotypowego modelu skóry. Usunąć tkankę tłuszczową z próbki skóry i pociąć ją na mniejsze kawałki. Inkubacja z roztworem dyspazy przez noc w temperaturze 4 °C ułatwia oddzielenie naskórka od skóry właściwej. Izolowane pierwotne fibroblasty i keratynocyty należy hodować oddzielnie i wykorzystać odpowiednio między 4. a 6. oraz 3. a 4. pasażem. Następnie można przystąpić do generowania modelu 3D skóry zgodnie z opisem w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4: Trójwymiarowe organotypowe rekonstrukcje skóry wykazują poziom zróżnicowania podobny do prawidłowej skóry ludzkiej. Przekroje parafiniowe ekwiwalentów skóry (A) w porównaniu do prawidłowej skóry ludzkiej (B) zostały zabarwione w celu wykazania ekspresji keratyn 14 (czerwony: λ_ex 554 nm; λ_em 568 nm) i 10, inwolukryny (zielony: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), filagryny (zielony: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm) oraz lamininy 5 (zielony: λ_ex 490 nm; λ_em 525 nm), a następnie przeanalizowane za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Jądra komórkowe zwizualizowano za pomocą barwienia DAPI (niebieski: λ_ex 340 nm; λ_em 488 nm). Badanie immunohistochemiczne pełnej grubości 3D ekwiwalentów skóry wykazało prawidłową stratyfikację naskórka, tworząc wyraźne warstwy naskórka, jak ma to miejsce w prawidłowej skórze ludzkiej. Podczas gdy komórki z dolnych warstw naskórka barwiły się dodatnio na keratynę 14, bardziej zróżnicowane komórki z warstwy nadbazalnej wykazywały barwienie na keratynę 10 i inwolukrynę. Silnie zróżnicowane komórki w pobliżu stratum corneum wykazywały ekspresję filagryny. Barwienie na lamininę 5 pokazuje, że powstaje błona podstawna, która fizjologicznie łączy komponent naskórkowy z dermalnym (dolny panel). Rycina została zaczerpnięta z pracy Voersmann et al.¹⁵ za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Liczby i rozmiary spontanicznie powstałych gniazd czerniaka nie można przewidzieć. De novo tworzenie gniazd czerniaka w przedziale skóry właściwej pełnych ekwiwalentów skóry można osiągnąć poprzez zmieszanie określonej liczby komórek czerniaka z pierwotnymi fibroblastami w celu osadzenia obu typów komórek w macierzy kolagenu typu I. Liczbę i rozmiar spontanicznie powstałych gniazd czerniaka można przeanalizować dopiero w dojrzałej rekonstrukcji skóry 3D po około 21 dniach. Jak pokazano na dwóch próbkach (A) i (B), liczba i rozmiary gniazd czerniaka mogą się różnić między poszczególnymi rekonstrukcjami skóry. W konsekwencji trudno jest walidować te modele i przewidzieć wpływ terapeutyczny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6: Sferoidy czerniaka zintegrowane z ekwiwalentami skóry odtwarzają kluczowe cechy przerzutów skórnego czerniaka u ludzi. Przekroje parafinowe sferoidów nowotworowych osadzonych w ekwiwalentach skóry, barwione H&E, wykazały, że sferoidy dzielą kluczowe cechy z nieunaczynionymi przerzutami skórnego czerniaka u ludzi in vivo. Wyraźnie widoczne są dwie subpopulacje komórek: obwodowa subpopulacja żywych komórek oraz centralna subpopulacja składająca się głównie z obkurczonych komórek apoptotycznych lub nekrotycznych, tworzących centrum „nekrotyczne”. Taki rozkład subpopulacji komórek nowotworowych jest warunkowany wielkością sferoidu. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Voersmann et al.¹⁵ za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj organotypowy sferoidalny model skóry czerniaka gwarantuje nowe spostrzeżenia dla głębszego zrozumienia interakcji wewnątrz guza i guza-gospodarza oraz może zapewnić zaawansowaną platformę przesiewową do badania molekularnych mechanizmów rozwoju guza i oporności na terapię w przyszłości.

Aby zagwarantować najlepsze warunki fizjologiczne i naśladujące in vivo rekonstrukcji skóry, jakość komórek pierwotnych ma ogromne znaczenie. Jak wspomniano powyżej, młodzieńcze lub prenatalne komórki skóry wykazują najniższy stopień zróżnicowania i dlatego najlepiej nadają się do wytwarzania odpowiedników skóry o pełnej grubości. Pierwszą możliwą kontrolą jakości jest stopień skurczu skóry w 2 dniu po wysianiu keratynocytów i wyrównaniu żelu z EGM (sekcje 8.2 i 8.3 Protokołu). Żele skórne kurczą się najbardziej dzięki najlepszej jakości fibroblastom. Również integracja zbyt małej lub zbyt dużej liczby fibroblastów może upośledzać skurcz skóry, a w konsekwencji przyczepianie się naskórka do przedziału skórnego. To z kolei zaburzy różnicowanie naskórka, ponieważ proces ten wymaga rozległego wzajemnego oddziaływania między komórkami skóry właściwej i naskórka.

Jakość komórek pierwotnych zależy również krytycznie od konfluencji komórek, a także od przejścia komórek. Jeśli keratynocyty osiągną ≥80% zbieżności, natychmiast przestają się namnażać i zaczynają się różnicować. Dlatego ważne jest, aby hodować je do 40 - 70% zbiegu podczas pasażu i używać nie później niż w pasażu 3 - 4. Fibroblasty są mniej wrażliwe, ale nie powinny być używane później niż pasaż 4 - 6. Należy również pamiętać, że wszystkie pierwotne komórki i linie komórkowe używane do generowania organotypowych sferoidalnych modeli skóry czerniaka są hodowane bez antybiotyków, a zatem ryzyko zanieczyszczenia jest wysokie. Jednak dodatek antybiotyków zmienia fizjologię poszczególnych komórek, a tym samym obniża jakość ich odpowiedników w skórze.

Ogólnie rzecz biorąc, tworzenie sferoidów guza jest możliwe z prawie wszystkich rodzajów linii komórek nowotworowych, a także z komórek nowotworowych świeżo wyizolowanych z materiału pacjenta. Początkowa liczba komórek i/lub czas hodowli w celu uzyskania optymalnych rozmiarów sferoidów mogą się różnić w zależności od użytego typu komórek. Do wielkości 150 - 200 μm wszystkie komórki wchodzące w skład sferoidy mogą być nadal wystarczająco zaopatrywane w składniki odżywcze poprzez prostą dyfuzję. Tylko sferoidy o rozmiarach ≥500 μm wykazują wysoki stopień zróżnicowania komórkowego i reprezentują typowe cechy nieunaczynionej tkanki nowotworowej²².

Opracowany tutaj organotypowy model czerniaka i sferoidalnej skóry jest szczególnie przydatny do badania interakcji między guzem a gospodarzem oraz do testowania leków na czerniaka w warunkach zbliżonych do in vivo ¹⁵. Jednak środowisko czerniaka in vivo jest jeszcze bardziej złożone, zawiera różne typy komórek związanych z nowotworem, w tym komórki odpornościowe i komórki śródbłonka. Ponieważ dodanie odpowiednich pierwotnych komórek odpornościowych napotyka problemy z kompatybilnością tkankową, modele te nie są jeszcze w stanie odpowiednio monitorować podejść immunologiczno-terapeutycznych.

Niemniej jednak sferoidy czerniaka mogą być generowane ze świeżo wyizolowanego materiału pacjenta, a po włączeniu do pełnej rekonstrukcji skóry mogą służyć jako indywidualne platformy przesiewowe leków. Możliwe jest nawet włączenie fragmentów przerzutów czerniaka do rekonstrukcji skóry w celu przetestowania kombinacji leków w dostosowanym podejściu terapeutycznym. Włączenie organotypowego modelu 3D czerniaka skóry do badań przedklinicznych prawdopodobnie pomoże zapewnić, że tylko najbardziej obiecujące nowatorskie koncepcje terapeutyczne zostaną włączone do badań klinicznych, zmniejszając w ten sposób wskaźnik wyczerpania potencjalnych nowych metod leczenia tej choroby i zwiększając wskaźnik sukcesu terapeutycznego w badaniach klinicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
albumina surowicy płodu (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270106	dodać 10 % do pożywki do hodowli komórkowych
Trypsyna-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	1X rozcieńczony w PBS
RPMI	Thermo Fisher Scientific	61870010	do hodowli linii komórkowych czerniaka
DMEM	Thermo Fisher Scientific	41965062	do hodowli fibroblastów pierwotnych
Dispase	Gibco life technologies	17105041	2U/ml, rozpuścić w PBS
Kolagen typu I	BD Biosciences	354249	zwykle z ogona szczura, stężenie powinno wynosić 3,5-4 mg/ml
24-dołkowe wkładki Nunclon	Nunc	140629	8 & mikro; m wielkość porów; Używaj wkładek stojących, a nie wiszących!
sitko komórkowe	BD Falcon	352360	żółte
Gentamycine	Thermo Fisher Scientific	15750060	rozpuszczają się w
pożywce keratycytowej PBS Keralife	Systemy		nie dodają FCS ani antybiotyków
Kolagenaza	SERVA	17454	NB4 standardowe
młodzieńcze ludzkie keratynocyty	Systemy komórkowe	FC-0007	alternatywa dla własnego preparatu z młodzieńczego napletka
młodocianych ludzkich fibroblastów	Cell Systems	FC-0001	alternatywa dla własnego preparatu z młodego napletka
DMEM [+] 4,5 g/l Glukoza, [+] L-glutamina, [-] L-pirogronian	Gibco technologie życia	41965	wymieszać 1:1 z szynką i ostrą; s F-12 dla średniego MM;                   wymieszać 3:1 z szynką i ostrą; s F-12 dla NWZ średni
Ham´ s F-12 [+] L-Glutamina	Gibco life technologies	21765-029	dodaj do DMEM w celu wygenerowania medium EGM i MM (patrz linia 15)
EGF	Technologie życiowe Gibco	13247-051	dodać 10 ng/ml tylko do wytworzenia pożywki EGM
Chlorek wapnia	Merck Chemicals	2381	dodać 1,9 mM do wytworzenia EGM i 3,8 mM do pożywki MM
Kwas selenowy	Alfa Aesar	18851	dodać 53 nM do wytworzenia pożywki EGM i MM
Insulina	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	dodać 5 &mikro; g/ml do wytwarzania pożywki EGM i MM
Etanoloaminy	Sigma-Aldrich	E-0135	dodać 0,1 mM dla generacji EGM i MM medium
P-Etanoloamina	Sigma-Aldrich	P-0503	dodać 0,1 mM dla generacji EGM i MM medium
Holo-Transferrine	Sigma-Aldrich	T-0665	dodaj 5 &mikro; g/ml dla wytworzenia pożywki EGM i MM
Trijodtyronina	Sigma-Aldrich	T-6397	dodać 20 pM do wytworzenia EGM i pożywki MM
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H-088816	dodać 0,4 i mikro; g/ml dla generacji pożywki EGM i MM
Progesteron	Sigma-Aldrich	P-8783	dodać 10 nM tylko dla generacji pożywki EGM
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	dodać 15 mM dla generacji pożywki NWZ i MM
Serine	Sigma-Aldrich	S-4311	dodać 1 mM dla generacji NWZ i MM pożywki
Cholinchloride	Sigma-Aldrich	C-7017	dodać 0,64 mM dla wytworzenia NWZ i medium MM
dFCS	Sigma-Aldrich	F-0392 Lot 086K0361	dodać 2 % dla wytworzenia NWZ i MM medium
Adenine	Sigma-Aldrich	A-9795	dodać 0,18 mM do wytworzenia EGM i pożywki MM
L-Glutamina	PromoCell	C-42209	dodać 7,25 mM do wytworzenia EGM i MM pożywki
chlorek strontu	Sigma-Aldrich	255521	dodać 1 mM do wytworzenia EGM i MM pożywki
przeciwciało antycytokeratyny 10	Dako	M7002	1:50
przeciwciało anty cytokeratyny 14	Santa Cruz	SC-53253	1:200
przeciwciało anty laminina 5	Santa Cruz	sc-32794	1:50
przeciwciało anty filagrynowe	Thermo Fisher Scientific	MA5-13440	1:50
przeciwciało anty inwolukrynowe	Przeciwciała Acris	AM33368PU	1:50
drugorzędowe poliklonalne kozie anty-mysie IgG FITC oznaczone	LifeSpan Biosciences	LS-C153907	1:50
drugorzędowe poliklonalne kozie anty-mysie IgG Cy3 oznaczone	Jackson Immuno Research	115-165-003	1:1000
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	1:100

komórkowe