Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57516

⸱

25 kwietnia 2018

 , 
1Laboratory of Molecular Oncology, Division of Thoracic Surgery, University Hospital Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

Znakowanie destiobiotyną syntetycznego oligo 25-nukleotydowego RNA, który zawiera motyw pierwiastka bogatego w adeninę (ARE), pozwala na specyficzne wiązanie cytozolowego białka wiążącego ARE.

Streszczenie

Pobieranie RNA in vitro jest nadal często stosowane w pierwszych krokach protokołów mających na celu identyfikację białek wiążących RNA, które rozpoznają specyficzne struktury i motywy RNA. W tym protokole RNA-pulldown, komercyjnie zsyntetyzowane sondy RNA są znakowane zmodyfikowaną formą biotyny, destiobiotyną, na końcu 3' nici RNA, która odwracalnie wiąże się ze streptawidyną, a tym samym umożliwia elucję białek w bardziej fizjologicznych warunkach. RNA-destiobiotyna jest unieruchomiona poprzez interakcję ze streptawidyną na kulkach magnetycznych, które są używane do ściągania białek, które specyficznie oddziałują z interesującym RNA. Jako źródło białek wykorzystywane są niedenaturowane i aktywne białka z cytozolowej frakcji komórek międzybłoniaka. Opisana tutaj metoda może być zastosowana do wykrywania interakcji między znanymi białkami wiążącymi RNA a sondą RNA o długości 25 nukleotydów (nt) zawierającą sekwencję będącą przedmiotem zainteresowania. Jest to przydatne do uzupełnienia funkcjonalnej charakterystyki elementów stabilizujących lub destabilizujących obecnych w cząsteczkach RNA, uzyskanej za pomocą testu wektora reporterowego.

Wprowadzenie

Ekspresja genów i końcowy poziom produktu genu mogą być ściśle regulowane, wpływając na stabilność mRNA i szybkość translacji mRNA1. Te potranskrypcyjne mechanizmy regulacyjne są wywierane poprzez interakcje niekodującego RNA i/lub białek wiążących RNA (RBP) z docelowym mRNA. Zwykle jest to nieulegający translacji region 3' mRNA (3' UTR - należący do niekodującej części genomu2), który zawiera specyficzne elementy cis-regulatorowe (CRE), które są rozpoznawane przez czynniki transakcyjne, takie jak miRNA lub RBPs3. Najlepiej zbadanym elementem cis w obrębie 3' UTR jest motyw pierwiastka bogatego w adeninę (ARE), który jest rozpoznawany przez specyficzne białka wiążące AU (AUBP), a co za tym idzie, indukuje degradację/deadenylację mRNA (rozpad za pośrednictwem ARE) lub stabilizację mRNA4.

Rozmiar 3' UTR mRNA kalretyniny (CALB2) wynosi 573 bp długości i zawiera przypuszczalny pentamer AUUUA, zgodnie z przewidywaniami AREsite2, narzędzia bioinformatycznego5. Zgodnie z obecnością przypuszczalnego motywu ARE, test wektorowo-reporterowy pmirGLO wykazał stabilizacyjną rolę tego pierwiastka w CALB2 mRNA6. Wreszcie, ekstrakcja RNA in vitro została wykorzystana do zidentyfikowania AUBP, który stabilizuje mRNA kalretyniny poprzez motyw ARE.

Ponieważ wszystkie niekodujące RNA oddziałują z białkami7, pobieranie RNA in vitro jest dobrym sposobem i pierwszym wyborem do identyfikacji interaktorów RNA, które pomogą w rozszyfrowaniu mechanizmów molekularnych. W tej metodzie RNA-pulldown użyto komercyjnie zsyntetyzowanych sond RNA, które znakowano zmodyfikowaną formą biotyny (destiobiotyny) na końcu 3' nici RNA. RNA-destiobiotyna jest unieruchomiona poprzez interakcję ze streptawidyną na kulkach magnetycznych, które są używane do ściągania białek, które specyficznie oddziałują z związanym RNA będącym przedmiotem zainteresowania. Jako źródło białek wykorzystywane są niedenaturowane i aktywne białka z cytozolowej frakcji komórek międzybłoniaka. Takie białka związane z RNA są eluowane z kulek magnetycznych, przepuszczane przez 12% żel SDS-PAGE, przenoszone do błony i badane różnymi przeciwciałami.

W standardowej procedurze oczyszczania powinowactwa streptawidyny i biotyny, wymagane są surowe warunki denaturacji, aby przerwać silne nieodwracalne wiązanie biotyna-streptawidyna w celu wymycia związanych białek8, co może prowadzić do dysocjacji kompleksów białkowych. W przeciwieństwie do biotyny, destiobiotyna odwracalnie wiąże się ze streptawidyną i jest konkurencyjnie wypierana przez buforowany roztwór biotyny, co pozwala na delikatną elucję białek i unikanie izolacji naturalnie biotynylowanych cząsteczek9, co sugeruje, że technika ta jest idealna do izolowania natywnych kompleksów białkowych w warunkach natywnych.

Warunki wiązania in vitro i rygorystyczność, które są określane przez stężenie soli, środki redukujące i procent detergentów, powinny być zbliżone do tych obecnych w kontekście komórkowym, aby zidentyfikować prawdziwe interakcje in vivo. Warunki wiązania zaimplementowane w niniejszym dokumencie zostały wcześniej wykazane jako odpowiednie do identyfikacji HuR jako białka wiążącego AU10. Takie podejście może zaoszczędzić czas, ponieważ optymalizacja odpowiednich warunków wiązania może być czasochłonna i wymagająca. Ponadto metoda ta może być stosowana jako protokół wyjściowy dla każdego eksperymentu z RNA pulldown i może być stopniowo optymalizowana poprzez zmianę stężenia soli i detergentów, zmianę procentowej zawartości glicerolu i dodanie innych soli. Co więcej, wykazaliśmy, że nawet krótka 25-nukleotydowa sonda RNA zawierająca motyw pentamerowego ARE może być wykorzystana do zademonstrowania interakcji z określonym AUBP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie cytozolowej i jądrowej frakcji białkowej

  1. Płytka 4 x 106 komórek ACC-MESO-4 w kolbie do hodowli komórek T150 wyhodowanej w pożywce RPMI - 1640 uzupełnionej 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna (100x) i 2 mM L-Glutamina (200 mM). Gdy komórki osiągną zbieg 80-90% (~5-5,5 x 106 komórek), przystąp do ekstrakcji białek frakcji jądrowej i cytozolowej.
    Uwaga: Linia komórkowa ACC-MESO-4 została uzyskana z RIKEN BioResource Centre11.
  2. Odessać pożywkę, przemyć komórki, dodając 15 ml 1x PBS, delikatnie przechylić płytkę kilka razy i odessać 1x PBS. Dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 3 min.
    UWAGA: Spójrz na komórki pod mikroskopem pod kątem oderwania; Jeśli kolba jest nadal podłączona, stuknij kolbą w dłoń 3 razy.
  3. Dodaj 7 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna (100x) i 2 mM L-glutaminy (200 mM), zbierz komórki w probówce o pojemności 15 ml i wiruj przy 200 x g przez 5 min.
  4. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1,5 ml 1x PBS, a następnie przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować w temperaturze 500 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, wszystkie etapy wirowania należy wykonywać w temperaturze 4 °C i utrzymywać wszystkie odczynniki na lodzie.
  5. Zawiesić osad komórek w lodowatym 1,5 ml 1x PBS i odwirowywać komórki w temperaturze 500 x g i 4 °C przez 3 minuty. Wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Wymagane ilości odczynników CER I, CER II i NER to odpowiednio 10, 0,55 i 5 objętości szacowanej objętości upakowanych granulek komórek; w poniższym protokole przyjmuje się objętość 20 μl. Zalecamy przygotowanie tylko wymaganej ilości odczynnika CER I.
  6. Dodaj 200 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej (CER I) uzupełnionego 2 μl 1x inhibitora proteinazy, np. rozcieńczyć 1 tabletkę inhibitora proteazy (bez EDTA) w 500 μl wody, aby uzyskać 100x bulion. Taka ilość odczynnika CER I wystarcza do lizy 20 μl objętości upakowanej w komórkę.
    1. Aby oszacować objętość wypełnionej granulki komórek, porównaj probówkę zawierającą osad komórkowy z probówką o pojemności 1,5 ml wypełnioną 10, 20, 50 lub 100 μL 1x PBS.
  7. Ponownie zawiesić osad komórkowy, energicznie wirując probówkę przez 15 s i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Dodać 11 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji cytoplazmatycznej II (CER II) do probówki, energicznie wirować przez 5 s i inkubować 1 minutę na lodzie.
  8. Wirować energicznie przez 5 s i odwirować probówkę o temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Przenieść supernatant do czystej, wstępnie schłodzonej probówki na lodzie. Supernatant to frakcja cytoplazmatyczna, która jest dalej wykorzystywana w eksperymencie RNA-pulldown.
  9. Zawiesić pozostały osad w 100 μl lodowatego odczynnika do ekstrakcji jądrowej (NER) uzupełnionego 1 μl inhibitora proteinazy (100x) i energicznie wirować przez 15 s. Zalecamy przygotowanie tylko wymaganej ilości odczynnika NER uzupełnionego inhibitorami proteazy.
  10. Inkubować próbkę na lodzie przez 40 minut, od czasu do czasu wirując przez 15 s (co 10 minut).
  11. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant (jest to frakcja białka jądrowego) do czystej, wstępnie schłodzonej probówki.
  12. Natychmiast należy przystąpić do pomiaru stężenia białka metodą bicynkową (BCA) (patrz tabela materiałów). Aby kontrolować czystość białka każdej frakcji, należy przeprowadzić immunoblotting (Rysunek 1) przeciwko α-tubulinie (dodatnie wykrycie tylko we frakcji cytozolowej) i polimerazie poliADP-rybozy - PARP (dodatnie wykrycie tylko we frakcji jądrowej). Wizualizacja białka znajduje się w sekcji 4.
  13. Aby zachować aktywność białek i ich stan naturalny, przygotuj 25 μl podwielokrotności ekstraktów cytozolowych i jądrowych. Podwielokrotności należy zamrozić błyskawicznie, umieszczając je w ciekłym azocie na 5 s i przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C.

2. Znakowanie RNA za pomocą Desthiobiotin

  1. Komercyjnie zsyntetyzować sondy RNA i oczyścić je metodą HPLC. Zawiesić wodą wolną od nukleaz w temperaturze 10 μM.
    UWAGA: Sekwencje sond są wymienione w Tabeli 1.
  2. Użyj 50 pmol RNA na reakcję RNA-pulldown. Rozmrozić i przechowywać wszystkie odczynniki na lodzie z wyjątkiem PEG 30%, używanego do znakowania końca 3' oligonugolakukleotydu RNA.
  3. Przenieść 5 μl 10 μM sond RNA, oznaczonych jako CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) i Unrelated-RNA (IRE), do cienkościennych probówek wirówkowych o pojemności 0,5 ml i inkubować w maszynie do PCR w temperaturze 85 °C przez 5 minut. Natychmiast umieścić probówki na lodzie.
    UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ sprzyja rozluźnieniu i dostępności sondy RNA do znakowania.
  4. Dla pojedynczej reakcji 30 μl dodać do probówki zawierającej RNA następującą mieszaninę 10 μl: 3 μl wody wolnej od nukleaz, 3 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA, 1 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 1 μl bisfosforanu cytydyny destiobiotynylowanego (1 mM) i 2 μl ligazy T4 RNA (20 U/μL).
    UWAGA: Aby przygotować główną mieszankę A dla 3 próbek w nadmiarze (3.2), zmieszaj 9,6 μl wody wolnej od nukleaz, 9,6 μl 10x buforu reakcyjnego ligazy RNA, 3,2 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 3,2 μl destiobiotynylowanego bisfosforanu cytydyny (1 mM) i 6,4 μl ligazy T4 RNA (20 U/μL).
  5. Dodać ostrożnie 15 μL PEG 30% do reakcji. Użyj innej wskazówki, aby wymieszać reakcję. Inkubować reakcję przez noc w temperaturze 16 °C.
  6. Następnego dnia przygotuj następujące preparaty: 5 M NaCl (świeży/bez nukleazy), chloroform: alkohol izoamylowy w proporcji 24:1 (np. na reakcję - 96 μl chloroformu i 4 μl alkoholu izoamylowego), lodowaty 100% etanolu i lodowaty 70% etanolu.
  7. Dodać 70 μl wody wolnej od nukleaz do probówek reakcyjnych znakujących RNA. Dodać 100 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego i krótko odwirować. Odkręcanie przy 13 000 x g przez 3 min. Ostrożnie wyjmij TYLKO górną fazę i przenieś do nowej probówki 1,5 ml wolnej od nukleaz; Unikaj dotykania dolnej fazy.
  8. Dodać 10 μl 5 M NaCl, 1 μl glikogenu i 300 μl lodowatego 100% etanolu. Umieść probówkę w temperaturze -20 °C na 2 godziny < br /> UWAGA: Na tym etapie eksperyment można kontynuować następnego dnia.
  9. Wirować przy 13 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 min. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Dodać 300 μl lodowatego 70% etanolu i ponownie odwirować w temperaturze 13 000 x g i 4 °C przez 5 minut.
  10. Całkowicie odrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu (15 min). Zawiesić osad w 20 μl wody wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Kontynuuj ściąganie RNA tego samego dnia.
  11. Inkubować RNA w temperaturze 90 °C przez 2 minuty i umieścić na lodzie. Umieść oznakowany RNA na lodzie podczas następnego etapu wstępnego mycia kulek magnetycznych streptawidyny.
    UWAGA: Dłuższy czas inkubacji może uszkodzić sondę RNA.

3. Ściąganie białka RNA

  1. Wstępne mycie kulek magnetycznych streptawidyny i inkubacja z destiobiotyną-RNA
    1. Użyj 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny na 50 pmol RNA. Należy to jednak zoptymalizować w zależności od eksperymentu.
    2. Wirować probówkę z kulkami magnetycznymi streptawidyny przez 15 s i szybko usunąć 200 μl (mieszanka główna; wystarczająca na 3+1 reakcji) do czystej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą przeciętych końcówek do pipet. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym tak, aby koraliki zebrały się z boku rurki i odczekaj 1 minutę. Usunąć płyn do sporządzania zawiesiny.
    3. Aby umyć kulki, wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 400 μl 0,1 M roztworu NaOH, 0,05 M NaCl i delikatnie odpipetuj kilka razy w górę i w dół. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym. Odczekać 1 minutę i zebrać supernatant. Powtórz ten krok ponownie.
    4. Umyj kulki 200 μl 100 mM NaCl. Usunąć supernatant.
    5. Dodać 200 μl 20 mM Tris (pH 7,5), ponownie zawiesić kulki przez pipetowanie, umieścić probówkę na stojaku magnetycznym, odczekać 1 minutę i usunąć supernatant. Powtórz ten krok.
    6. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 200 μl bufora do wychwytywania RNA i ponownie zawieś kulki magnetyczne streptawidyny przez krótkie wirowanie. Usuń 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny i dodaj do każdej rurki z oznakowanym RNA za pomocą przeciętej końcówki pipety. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wałku.
  2. Wiązanie białka z RNA
    1. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i usuń supernatant.
    2. Dodać 50 μl 20 mM Tris (pH 7,5) do kulek i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i usuń supernatant. Powtórz ten krok.
    3. Dodać 100 μl 1x buforu wiążącego białko-RNA do kulek i ponownie zawiesić przez pipetowanie.
    4. W międzyczasie przygotuj następującą mieszankę: 10 μL 10x buforu wiążącego białko-RNA, 30 μL 50% glicerolu, 50 μg białek cytoplazmatycznych i woda wolna od nukleaz do 100 μL.
      UWAGA: Przygotować mieszankę wzorcową B dla 3 próbek w nadmiarze (3.3) w następujący sposób: 33 μl 10x buforu wiążącego białko-RNA, 99 μl 50% glicerolu, 165 μg białek cytoplazmatycznych i woda wolna od nukleaz do 330 μl. Probówkę z mieszanką główną B należy przechowywać na lodzie.
    5. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i zbierz supernatant. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej B, zawiesić ponownie, delikatnie pipetując w górę i w dół, unikając tworzenia się pęcherzyków. Inkubować probówki reakcyjne przez 60 minut w temperaturze 4 °C na walcu.
  3. Przemywanie i elucja
    1. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, zbierz supernatant (który przepływa - FT) i przenieś do nowej probówki.
      UWAGA: Trzymaj ten FT na lodzie do późniejszej analizy.
    2. Odpipetować 100 μl 1x buforu do płukania na kulkach, delikatnie zawiesić, włożyć z powrotem do stojaka magnetycznego, odczekać 1 minutę i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok 2 razy.
    3. Dodać 40 μl buforu elucyjnego do kulek magnetycznych, mieszać pipetując w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce probówkowej (950 obr./min) przez 30 min.
    4. Umieść probówki w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę i zbierz eluowaną próbkę (która jest eluatem - E). Umieścić na lodzie i użyć do dalszej analizy.
      UWAGA: Na tym etapie każda badana sonda RNA składa się z próbki przepływowej (FT) i eluowanej (E).

4. Elektroforeza poliakrylamidowa i analiza Western Blot

UWAGA: Zobacz Tabelę 2, aby zapoznać się z przepisami dotyczącymi używanych w tej sekcji. Wykonaj Western blot zgodnie z metodą Laemmli12.

  1. Ręcznie odlewane żele 12% SDS-PAGE (10-dołkowe, dystans 1,5 mm, 66 μL). Przygotuj płynną mieszankę żelową: 4 ml 30% roztworu podstawowego akryloamidu i bisakryloamidu, 2,4 ml buforu Lower Tris, 3,2 ml dH2O, 9,6 μl TEMED, 96 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS). Przygotuj mieszaninę żelu do układania: 3,25 ml dH2O, 0,5 ml 30% roztworu podstawowego akryloamidu i bisakryloamidu, 1,3 ml buforu Upper Tris, 10 μl TEMED, 20 μl 10% APS.
  2. Dodać 16,6 μl 6x buforu Laemmli (np. 14 ml Tris/HCl/SDS pH 6,8 (górny bufor Tris), 2 g SDS, 1,86 g DTT, 6 ml glicerolu i 0,012% błękitu bromofenolowego; przechowywanego w temperaturze -20 °C) do próbki FT i 6,6 μl 6x buforu Laemmli do próbki E. Próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  3. Załadować próbki (20 μL FT i całe Elute ~40 μL) i uruchomić je na 30 minut przy napięciu 60 V, kontynuując przy napięciu 20 V przez noc.
  4. Za pomocą półsuchego systemu elektroblottyzacji przenieś białka na membranę PVDF na 80 minut przy 15 V.
    UWAGA: Membrana PVDF musi być aktywowana przed wykonaniem transferu białka. Inkubować membranę w 100% metanolu przez 1 minutę, a następnie inkubować przez 2 minuty w ultraczystej wodzie.
  5. Po transferze białka inkubować żel SDS-PAGE z roztworem Coomassie przez 3 godziny, a następnie trzy etapy płukania ultraczystą wodą, każdy 30 minut.
  6. Pod koniec transferu białka pozostaw membranę PVDF do wyschnięcia na 1 godzinę. Reaktywuj błonę, jak wskazano w kroku 4.5. Zablokuj membranę 1 h za pomocą 5% BSA w 1x TTBS.
  7. Inkubować błonę z pierwszym przeciwciałem: HuR lub mezoteliną, oba rozcieńczone w stosunku 1:1000 w 5% BSA w 1x TTBS przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  8. Przemyć membranę trzy razy przez 7 minut w 1x TTBS i inkubować z króliczym przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) przeciwko mysiej peroksydazie chrzanowej (HRP) rozcieńczonym w stosunku 1:10 000 w 5% BSA, 1x TTBS.
  9. Wizualizacja białek za pomocą ulepszonej chemiluminescencji i cyfrowego imagera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym eksperymencie wykorzystano fragment 3' UTR kalretyniny o długości 25 nt zawierający motyw ARE (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt), aby sprawdzić, czy wiąże on specyficznie białko HuR (Human-antigen R), znany stabilizator mRNA. Aby przetestować specyficzność elementu ARE, użyto sondy RNA CALB2 3' UTR (mtARE) o długości 25 nt zawierającej mutację motywu ARE, co w poprzednich badaniach wykazało zniesienie efektu stabilizacji motywu ARE6. Trzecia sonda RNA stanowi kontrol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

3' UTR należą do niekodującego genomu3, a wszystkie niekodujące RNA mogą wchodzić w interakcje z białkami w celu pełnienia swojej funkcji7. Kiedy okazało się, że genom ssaków jest transkrybowany w sposób wszechobecny i wytwarza znaczną część długich, niekodujących RNA16, pojawiające się dowody wykazały, że te długie niekodujące RNA działają w regulacji ekspresji genów, gdy wchodzą w interakcje z kompleksami przebudowującymi chromatynę

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez szwajcarską narodową fundację nauki Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung i Zürich Krebsliga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NE-PER Zestaw do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznejThermo Fisher Scientific 78833
Tabletki inhibitora proteazy Pierce, wolne od EDTAThermo Fisher ScientificA32965
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
Pierce Magnetyczny zestaw do wyciągania białka RNA Thermo Fisher Scientific20164Zawiera koraliki magnetyczne, dlatego zestaw należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Przebić RNA 3' Zestaw do zakończenia destiobiotynylacji Thermo Fisher Scientific20163Zestaw jest częścią zestawu "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" i musi być przechowywany w temperaturze -20 stopni; C w przeciwieństwie do zestawu do opuszczania (4 & C).
DynaMag-2,  stojak magnetycznyThermo Fisher Scientific12321D
Przeciwciało monoklonalne Anti - HuR (MOUSE)Thermo Fisher Scientific-Przeciwciałoznajduje się w zestawie Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit  - 1:1000 w 5% BSA 1x TTBS - drugorzędowe przeciwciało przeciw mysi królika 1:10 000 w 5% BSA 1x TTBS
Przeciwciało monoklonalne anty - α - tubulina (MOUSE)Santa Cruz80351:1000 w 5% BSA 1x TTBS - królicze przeciwciało wtórne przeciwko myszom 1:10 000 w 5% BSA 1x TTBS
Przeciwciało poliklonalne anty - PARP (KRÓLIK)Sygnalizacja komórkowa95421:1000 w 5% BSA 1x TTBS - kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi 1:10 000 w 5% BSA 1x TTBS
Przeciwciało monoklonalne anty mezothelina (MOUSE) Rockland200-301-A87
Wtórne przeciwciało anty-królicze kozySygnalizacja komórkowa7074
Wtórne przeciwciało przeciw myszom królikaSigma-AldrichA-9044
RPMI - 1640 średnieSigma-AldrichR8758
FBS - Filtrowana surowica bydlęcaPan Biotech P40-37500
Penicylina - streptomycyna (100x)Sigma-Aldrich P4333
Roztwór L-glutaminy (200 mM)Sigma-Aldrich G7513
0,25% Trypsyna-EDTA (1x)Gibco firmy Life technologies 25200-056
Mini-PROTEAN 3 CellBio-Rad1653301
Mini Protean System Bio-Rad1653308
Płytki dystansowe Mini-PROTEAN ze zintegrowanym elementem dystansowym 1,5 mmBio-Rad1653312
Mini-PROTEAN Comb, 10-dołkowy, 1,5 mm, 66 µ LBio-Rad1653365
Mini-PROTEAN Moduły odlewnicze Tetra CellBio-Rad1658050
RNaseZap RNaza Roztwór do dekontaminacjiThermo Fisher ScientificAM9780
Żel rotyforyczny 30 - wodny 30% roztwór podstawowy akrylamidu i bisakryloamidu w proporcji 37,5:1Roth3029
20% SDS Membrana transferowa PanReac AppliChemA3942
PVDF Perkin ElmerNEF1002Musi być aktywowany przez inkubację w czystym metanolu przez 1 minutę, a następnie mycie w wodzie przez 2 minuty 
Półsucha komórka transferowa Trans-Blot SD Bio-Rad1703940
Clarity Zachodni substrat ECLBio-Rad1705061
FusionFX  Digital ImagerVilber-synteza
oligonukleotymetrii RNAMycrosynth AG, Szwajcaria-skala syntezy - 0,04 i mikro; mol - HPLC oczyszczona
albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7030
Kwas solny (HCl) 6 MPanReac AppliChem182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7,5 Thermo Fisher Scientific15567027
glicerol Thermo Fisher Scientific1790450% sterylne podwielokrotności do przechowywania w temperaturze -20& deg; C
Koraliki magnetyczne Pierce Streptawidin Thermo Fisher Scientific88817Należy pamiętać, że te kulki magnetyczne mają średnią średnicę 1 i mikro; m (zakres od 0,5 - 1,5 i mikro; m). Ponadto Dynabeads-M280 Streptawidyna, które są kulkami o jednorodnym rozmiarze 2,8 i mikro; m, są również używane w RNA-pulldown, ale należy pamiętać, że może to wpływać na proces oczyszczania.
TEMEDSigma-AldrichT9281
Nadsiarczan amonu Sigma-AldrichA3678
Coomassie G-250ApplichemA3480
Siarczan glinu-(14-18)-hydrat Sigma-Aldrich368458
kwas ortofosforowy AplikacjaA0637
Płytki szklane

Bibliografia

  1. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  2. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
  3. Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
  4. von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
  5. Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
  6. Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
  7. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
  8. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
  9. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  10. Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
  11. Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
  12. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  13. Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
  14. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
  15. Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
  16. Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
  17. Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
  18. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
  19. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

RNA pulldownznakowanie desthiobiotynekstrakt cytozolowyoddzia ywanie RNA bia koWestern blotkulki magnetycznebufor elucyjnyst enie bia ka
Oczyszczanie białek oddziałujących z RNA za pośrednictwem powinowactwa do destiobiotyny i streptawidyny w komórkach międzybłoniaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.