Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57522

⸱

4 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Otolaryngology, University of Rochester Medical Center, 3Center for Oral Biology, University of Rochester Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy szczegółowe podejście do pobierania śliny, w tym mysią tracheostomię i izolację trzech głównych gruczołów ślinowych.

Streszczenie

Wydzielanie śliny jest często obserwowane w reakcji autoimmunologicznej zespołu Sjögrena lub po popromiennym uszkodzeniu głównych gruczołów ślinowych. W takich przypadkach pozostają pytania dotyczące patogenezy choroby i skutecznych interwencji. Zoptymalizowana technika, która umożliwia funkcjonalną ocenę gruczołów ślinowych, jest nieoceniona w badaniu biologii, dysfunkcji i terapii gruczołów zewnątrzwydzielniczych. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku podejście do wykonywania wydzielania śliny stymulowanego pilokarpiną, w tym tracheostomię i rozwarstwienie trzech głównych mysich gruczołów ślinowych. Wyszczególniamy również odpowiednią anatomię głowy i szyi myszy dostępną podczas tych technik. Takie podejście jest skalowalne, co pozwala na jednoczesne przetwarzanie wielu myszy, poprawiając w ten sposób wydajność przepływu pracy. Naszym celem jest poprawa powtarzalności tych metod, z których każda ma dalsze zastosowania w tej dziedzinie. Oprócz pobierania śliny omawiamy wskaźniki służące do ilościowego określania i normalizacji zdolności funkcjonalnej tych tkanek. Reprezentatywne dane dotyczą gruczołów podżuchwowych z obniżoną czynnością gruczołów ślinowych 2 tygodnie po frakcjonowanym napromienianiu (4 dawki 6,85 Gy).

Wprowadzenie

Zaburzenia gruczołów ślinowych obejmują zespoły rozregulowanego lub upośledzonego wydzielania, prowadzące do nadprodukcji (sialorrhea) lub niedostatecznej produkcji (kserostomia i hipoślinotok) śliny1. W obu przypadkach istnieje zainteresowanie pogłębieniem naszej wiedzy na temat biologii gruczołów ślinowych w kierunku ostatecznego celu, jakim jest rozwój terapeutyczny2.

Gruczoły ślinowe są bardzo wrażliwymi na promieniowanie narządami i często ulegają uszkodzeniu podczas radioterapii raka głowy i szyi, co prowadzi do trwałej suchości w jamie ustnej (xerostomia)3,4. Jednak w przeciwieństwie do innych tkanek wrażliwych na promieniowanie ślinowe tempo rotacji gruczołów ślinowych jest stosunkowo niskie, a mechanizm utraty wydzieliny jest słabo poznany5,6. W tym wyjątkowym urazie strategie regeneracji tkanek i radioprotekcji wymagają oceny funkcjonalnej śliny. Eksperymentalnie zbieranie śliny mysiej jest szczególnie cennym narzędziem w ocenie odpowiedzi gruczołu zarówno na promieniowanie, jak i środki terapeutyczne.

Tutaj prezentujemy metodę wykonywania i ilościowego oznaczania stymulowanego wydzielania śliny za pomocą pilokarpiny, silnego agonisty muskaryny7. Pilokarpina stymuluje autonomiczny układ nerwowy do indukowania wydzielania gruczołów8,9. Aby prawidłowo wykonać ten test, wymagana jest tracheostomia, aby upewnić się, że mysz utrzymuje drożność dróg oddechowych przez cały czas trwania procedury oraz zmniejszyć ryzyko zadławienia i zachłyśnięcia się z powodu nagromadzonych wydzielin w jamie ustnej10.

To jest procedura terminalna, której kulminacją jest usunięcie trzech głównych gruczołów ślinowych: ślinianki przyusznej (PG), podżuchwowej (SMG) i podjęzykowej (SLG). W badaniach funkcjonalnych rejestrowane są masy gruczołów, które są często używane do normalizacji pomiaru śliny11,12,13. Dane te są szczególnie ważne w badaniach nad promieniowaniem, w których atrofia gruczołów jest oczekiwanym wynikiem14,15

W literaturze istnieje zmienność w odniesieniu do tego, jak stymulowane wydzielanie śliny jest wykonywane i raportowane16. Na przykład dawki pilokarpiny w literaturze obejmują co najmniej trzy rzędy wielkości17,18,19,20,21,22,23. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół stosowania pilokarpiny w wysokich dawkach w celu poprawy odtwarzalności w wykonywaniu metody, a także zapewnienia modułowej platformy technik (tracheostomia, pobieranie śliny i wypreparowanie gruczołów), które można dostosować w razie potrzeby.

Oprócz demonstracji protokołu, dołączamy reprezentatywne dane funkcjonalne dotyczące przepływu śliny po 2 tygodniach od frakcjonowanego promieniowania (4 dawki 6,85 Gy) do regionu SMG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury in vivo opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Uniwersytecką Komisję ds. Zasobów Zwierzęcych na Uniwersytecie w Rochester, Rochester. Ny.

1. Przygotowanie

  1. Za pomocą wagi analitycznej odważyć 20 mg pilokarpiny. Rozpuścić go w 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w probówce do mikrowirówki.
    UWAGA: Ponieważ pilokarpina jest wrażliwa na światło i z czasem traci aktywność, roztwór ten należy przygotować w dniu wstrzyknięcia i chronić przed światłem do czasu podania.
  2. Za pomocą wagi analitycznej zważ i zidentyfikuj wszystkie probówki zbiorcze i szklane kapilary. Liczba probówek i szklanych naczyń włosowatych powinna odpowiadać liczbie myszy.

2. Tracheostomia

  1. Zważyć myszy C57/BL6 za pomocą wagi analitycznej.
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 ml z igłą 29G x 1/2" znieczulić myszy sterylnym roztworem soli fizjologicznej 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Przejdź do następnego kroku, gdy mysz nie reaguje już na bodźce (np. brak odruchu wycofania pedału), który zwykle występuje w ciągu 5 do 10 minut po wstrzyknięciu.
  3. Po nałożeniu lubrykantu na aplikator z bawełnianą końcówką, delikatnie nałóż go na oczy i umieść mysz w pozycji leżącej na scenie. Znieczulone zwierzę należy trzymać na ciepłej powierzchni.
    UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.
  4. Przymocuj nos, kończyny i ogon do sceny za pomocą taśmy chirurgicznej.
  5. Oczyść i zwilż szyję chusteczką nasączoną alkoholem.
    UWAGA: Pomoże to zapobiec przedostawaniu się futra do kolejnych nacięć.
  6. Podnosząc brzuszną skórę szyi w linii środkowej za pomocą kleszczy, wykonaj małe, powierzchowne cięcie za pomocą nożyczek preparujących. Wsuń nożyczki do otworu i powoli otwieraj ostrza podskórnie, aby oddzielić płaszczyzny tkanek.
  7. Trzymając skórę uniesioną, ostrożnie przyciąć do 1 cm poniżej ust.
  8. Wykonaj dwa boczne nacięcia w dolnej i górnej części pierwszego cięcia. Za pomocą kleszczy delikatnie odbij skórę, aby umożliwić dostęp do struktur głowy i szyi.
  9. Używając mikroskopu preparacyjnego przy 8-krotnym powiększeniu, uwidocznij gruczoły podżuchwowe (linia środkowa: Rysunek 1).
  10. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie unieś gruczoły, aby odsłonić cztery mięśnie podgnykowe (paski) leżące nad tchawicą. Unikaj rozrywania lub przerywania otaczających naczyń krwionośnych lub przewodów wydalniczych.
  11. Jeśli zbierasz ślinę z więcej niż jednej myszy, powtórz kroki 2.1 - 2.10 dla każdej myszy przed kontynuowaniem.
    UWAGA: Tę procedurę można bezpiecznie wykonać na maksymalnie 5 myszach jednocześnie.
  12. Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych usuń przyśrodkową część mięśni paska, pozostając jak najbliżej linii środkowej. Wytnij tylko tyle, ile jest to konieczne, aby uwidocznić tchawicę i utrzymać mięśnie paska z dala od drogi podczas zabiegu. Należy unikać nacinania pobliskich naczyń, ponieważ jeśli występuje zmniejszenie objętości wtórne do znacznego krwotoku, pilokarpina nie będzie skuteczna w indukowaniu wydzielania.
  13. Odbij mięśnie paska od tchawicy.
  14. Wizualizuj krtań, tchawicę i tarczycę. Upewnij się, że tchawica jest wolna od leżącej na niej tkanki.
  15. Wykonaj poziome nacięcie w tchawicy dolnej/tylnej do tarczycy za pomocą małych nożyczek preparacyjnych. Upewnij się, że drogi oddechowe są drożne i wolne od płynu.

3. Zbieranie śliny

  1. Usuń taśmę w pobliżu ust i pod kątem rozwarstwienia w dół (45°, czaszka), aby wspomóc przepływ śliny.
  2. Za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 29G x 1/2" wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie 10 μl/g pilokarpiny o masie ciała w całkowitej dawce 100 mg/kg.
  3. Uruchom minutnik. W przypadku dawkowania wielu myszom skróć czas realizacji, poruszając się szybko i jednocześnie wstrzykując pozostałym myszom asystenta.
  4. Za pomocą standardowych kleszczy otwórz usta, aby uzyskać dostęp do rurki kapilarnej.
  5. Po zaobserwowaniu kropli śliny w jamie ustnej umieść proksymalny koniec rurki kapilarnej w płynie, a dystalny koniec umieść w probówce zbiorczej umieszczonej poniżej etapu sekcji (obie probówki są wstępnie zważone).
    UWAGA: U samic myszy C57/BL6 w wieku 6 - 10 tygodni duże ślinotok pojawia się w ciągu 2 minut od wstrzyknięcia pilokarpiny.
  6. Jeśli ślina gromadzi się w jamie ustnej, ale nie przepływa przez rurkę, spróbuj ponownie wykonać poprzedni krok. Upewnij się, że rurka nie jest umieszczona bezpośrednio na powierzchni błony śluzowej, co może blokować wlot.
  7. Zbieraj ślinę przez łącznie 12 minut po stymulacji pilokarpiną. Upewnij się, że stomia pozostaje czysta.
    UWAGA: Zwiększona objętość oddechowa i wydzieliny (ślina, mocz, kał) są w tym czasie normalne.
  8. Jeśli myszy mają obniżoną czynność śliny (np. z powodu urazu lub interwencji), przenieś pozostały płyn z jamy ustnej do probówki zbiorczej za pomocą mikropipety P200. W przypadku zbierania od wielu myszy upewnij się, że końcówki zostały zmienione.
  9. Zapisz masę pobranej śliny wraz z probówkami 12 minut po wstrzyknięciu pilokarpiny.

4. Rozwarstwienie gruczołów

  1. Eutanazja myszy przez eutanazję CO2 (zgodnie z opisem w wytycznych AVMA dotyczących eutanazji zwierząt: wydanie 2013), a następnie torakotomię, zwracając uwagę na zachowanie struktur głowy i szyi. Z tego powodu należy unikać zwichnięcia szyjki macicy jako metody eutanazji.
  2. Umieść mysz w pozycji leżącej na stole montażowym. Zmień położenie gruczołów w pierwotnym miejscu nad tchawicą (Ryc. 1).
  3. Używając mikroskopu preparacyjnego pod 8-krotnym powiększeniem, zwizualizuj główne gruczoły: PG, SMG i SLG. Aby odróżnić gruczoły podczas sekcji, zidentyfikuj, że PG jest rozlany, leżący bocznie w stosunku do SMG i SLG.
    UWAGA: W przypadku preparowania PG należy to zrobić najpierw, ponieważ jest on najmniej zdefiniowany i najbardziej prawdopodobne, że zostanie rozerwany.
  4. Chwyć ogon PG kleszczami, odciągając go od leżących pod spodem struktur i delikatnie napręż przed przecięciem głowy PG nożyczkami preparującymi.
  5. Przebij się przez kapsułę otaczającą pistolety maszynowe za pomocą kleszczy. Delikatnie oddziel lewy i prawy pistolet maszynowy.
  6. Uwolnij grzbietową część SMG od przylegającej tkanki niegruczołowej za pomocą kleszczy.
  7. Usuń pistolet maszynowy z szyi, naciągając przewód Whartona za pomocą kleszczy i przecinając kanał nożyczkami preparacyjnymi.
  8. Delikatnie oddziel SLG od pistoletu maszynowego za pomocą kleszczy.
    UWAGA: SLG znajduje się w superobocznym aspekcie pistoletu maszynowego.
  9. Korzystając z wagi analitycznej, zapisz masy pistoletów maszynowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas pobierania śliny stymulowanej wysoką dawką pilocarpiny ważne jest utrzymanie drożności dróg oddechowych, aby zapobiec aspiracji lub zadławieniu wydzielinami w jamie ustnej. Schemat tracheotomii przedstawiono na Rysunku 1. Po nacięciu tchawicy stoma musi pozostać wolna od tkanek i płynów.

Aby wzmocnić działanie kapilarne podczas pobierania śliny, myszy należy ustawić głowami w dół pod kątem 4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy wieloetapową metodę oceny funkcji gruczołów ślinowych, która może być zastosowana do badania uszkodzeń gruczołów i terapii. Nasza procedura obejmuje tracheostomię, pobranie śliny i rozwarstwienie gruczołów, z których każdy ma zastosowania eksperymentalne, które mogą wspierać zintegrowane badanie biologii gruczołów ślinowych. Na przykład tracheostomia mysia jest stosowana do ogólnego udrażniania dróg oddechowych podczas zabiegów niedrożności jamy ustnej.

Prawidłowe rozwarstwienie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) oraz National Cancer Institute (NCI) of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R56 DE025098, UG3 DE027695 i F30 CA206296. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Prace te były również wspierane przez NSF DMR 1206219 oraz nagrodę IADR Innovation in Oral Care Award (2016).

Chcielibyśmy podziękować dr Eri Maruyamie i Andrew Hollomonowi za pomoc w pobieraniu śliny. Chcielibyśmy podziękować Pei-Lun Wengowi za pomoc w rozwarstwieniu gruczołów. Serdecznie dziękujemy Matthew Ingallsowi za pomoc w przygotowaniu figury. Chcielibyśmy podziękować dr Elaine Smolock i Emily Wu za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorowodorek pilokarpinySigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki o naukach91500-9Nożyczki sprężynowe do tracheostomii
Sterylny roztwór soli fizjologicznejMedlineRDI30296HSól
fizjologiczna Dumont #7Kleszcze Fine Science Tools11274-20Zakrzywione kleszcze
Dumont #5Fine Science Tools11251-10Kleszcze proste
Kleszcze o standardowym wzorzeNarzędzia do nauki11000-12kleszcze
Drobne nożyczki - narzędzia z węglika wolframuFine Science Tools14568-09Nożyczki preparacyjne
Mikrohematokryt Heparynizowane rurki kapilarneFisher Scientific22362566Rurki kapilarne
Smar Maśćdo oczuRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat poliklonalny anty-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Przeciwciało
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Oprogramowanie statystyczne
Aplikator z bawełnianą końcówkąMedlineMDS202000Aplikator do maści do oczu
0,5 ml Strzykawka insulinowa, 29G x 1/2 "BD7629Strzykawka do wstrzykiwań dootrzewnowych
o wysokiej jakości

Bibliografia

  1. Bradley, P., O'Hara, J. Diseases of the salivary glands. Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).
  2. Fox, P. C. Salivary enhancement therapies. Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).
  3. Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
  4. Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).
  5. Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication. Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).
  6. Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both? Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).
  7. Ono, K., et al. Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats. Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).
  8. Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).
  9. Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals. Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).
  10. Urita, Y., et al. Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation. North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Kondo, Y., et al. Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands. Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).
  13. Evans, R. L., et al. Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).
  14. Delanian, S., Lefaix, J. L. The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway. Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).
  15. Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment. Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).
  16. Lin, A. L., et al. Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).
  17. Montenegro, M. F., et al. Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research. Redox biology. 10, 206-210 (2016).
  18. Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model. Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).
  19. Imamura, T. K., et al. Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).
  20. Ma, T., et al. Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels. Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).
  21. Parkes, M. W., Parks, J. C. Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse. British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).
  22. Nishiyama, T., et al. Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516(2007).
  23. Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).
  24. Kamiya, M., et al. X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses. BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).
  25. Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).
  26. Droebner, K., Sandner, P. Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).
  27. Lamy, E., et al. Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet. Proteome Science. 8 (1), 65(2010).
  28. Mahomed, F. Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).
  29. Kohlgraf, K. G., et al. Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay. Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).
  30. Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells. Radiotherapy and Oncology. , (2015).
  31. Lombaert, I. M., et al. Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands. PLoS One. 3 (4), e2063(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mysia liniankawydzielanie linyprocedura tracheotomiisekcja liniankifunkcja linianeklinianka pod uchwowapobieranie linyanatomia g owy i szyi
Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.