Zligowany model pętli jelitowej u znieczulonych kurczaków wolnych od specyficznych patogenów w celu zbadania zjadliwości Clostridium perfringens

Summary

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego tworzenia 'podwiązanych pętli jelitowych' w jelicie cienkim kurczaka. Procedura ta pozwala na porównanie zjadliwości wielu szczepów Clostridium perfringens in situ w jednym żywicielu. Metoda ta znacznie zmniejsza liczbę kurcząt zwykle niezbędnych do podobnych eksperymentów in vivo.

Abstract

Martwicze zapalenie jelit badano u kurcząt przy użyciu różnych modeli infekcji in vivo. Większość z nich wykorzystuje kombinację czynników predysponujących, takich jak kokcydioza i dieta, z zgłębnikiem lub podawaniem przez paszę przy użyciu Clostridium perfringens. W tych modelach porównanie wielu szczepów C. perfringens do badań wirulencji wymaga dużej liczby gospodarzy w celu uzyskania znaczących wyników. Śmiertelność w trakcie badania może być wysoka w zależności od modelu eksperymentalnego, co budzi obawy etyczne dotyczące dobrostanu zwierząt w badaniach. Opracowanie nowych modeli infekcji wymagających mniejszej liczby zwierząt do badania patogenezy, a jednocześnie zapewniających statystycznie istotne i ważne wyniki, jest ważne dla ograniczenia wykorzystywania zwierząt w badaniach. Modele podwiązanej pętli jelitowej zostały wykorzystane do badania zakażeń Clostridium u różnych gatunków, takich jak myszy, króliki i cielęta. Po zabiegach chirurgicznych mających na celu wytworzenie podwiązanych odcinków pętli, szczepy C. perfringens są wstrzykiwane bezpośrednio do pętli, aby nawiązać bliski kontakt między bakteriami a błoną śluzową jelit. Próbki jelita cienkiego i treści świetlnej pobiera się po zakończeniu zabiegów po kilku godzinach. U każdego zwierzęcia można zaszczepić wiele szczepów bakteryjnych, zmniejszając w ten sposób liczbę wymaganych uczestników eksperymentów. Zabiegi wykonywane są również w znieczuleniu ogólnym w celu zmniejszenia bólu zwierząt. U kurcząt model ten byłby bardziej odpowiedni niż podawanie doustne w celu porównania patogenności szczepu C. perfringens, ponieważ potrzeba mniej zwierząt, nie są wymagane czynniki predysponujące do wywołania choroby, a ból jest kontrolowany przez leki przeciwbólowe. Model podwiązanej pętli jelitowej jest słabo opisany u kurczaków, a standaryzacja jest niezbędna do jego optymalnego wykorzystania. Niniejszy manuskrypt zawiera wszystkie niezbędne kroki do stworzenia licznych podwiązanych pętli jelitowych u kurczaków i dostarcza informacji o punktach krytycznych w celu uzyskania prawidłowych wyników.

Introduction

Wykorzystanie modeli zwierzęcych do badania chorób zakaźnych dotykających ludzi i zwierzęta jest głównym narzędziem w ocenie czynników wirulencji regulujących patogenezę określonego stanu, jak również w opracowywaniu strategii zapobiegania lub leczenia chorób¹. Pomimo licznych zalet wykorzystania modeli zwierzęcych do badania różnych chorób, pojawiają się obawy etyczne dotyczące tej praktyki. Naukowcy muszą zminimalizować wykorzystanie zwierząt, uzyskując jednocześnie znaczące i ważne wyniki. Koncepcja zasad 3 R (Zamień, Zmniejsz i Udoskonal) została opracowana w celu zapewnienia, że kwestie dobrostanu zostaną poruszone w takich badaniach. W badaniach nad martwiczym zapaleniem jelit u kurcząt modele kurczaków in vivo są wykorzystywane do badania etiologii, zapobiegania i leczenia tego schorzenia^2,3,4,5. Chorobotwórcze szczepy C. perfringens przenoszące określone czynniki wirulencji, takie jak toksyna NetB⁶, są podawane w celu wywołania martwiczego zapalenia jelit u kurcząt⁷. Zasada zastąpienia jest zatem trudna do osiągnięcia w takim przypadku, ponieważ te czynniki wirulencji mogą nie być tak krytyczne u innych gatunków zwierząt. Większość modeli martwiczego zapalenia jelit u kurcząt wykorzystuje kombinację czynników ryzyka, takich jak kokcydioza i zmieniona dieta, w celu wywołania martwiczego zapalenia jelit, a następnie zgłębnika hodowli bulionu zawierającego dużą liczbę C. perfringens². Modele te wywołają chorobę u dużej liczby kurcząt, a śmiertelność może być istotna w takich próbach⁸, co budzi obawy dotyczące zasad redukcji i udoskonalania w badaniach na zwierzętach.

Modele podwiązanych pętli jelitowych są pożądaną alternatywą dla badania chorób wywołanych przez patogeny jelitowe w odniesieniu do zasady redukcji i udoskonalenia. W tych modelach segmenty jelita zwane "pętlami" są tworzone poprzez umieszczenie ligatur wzdłuż przewodu pokarmowego, tworząc niezależne i hermetyczne przedziały, w których patogeny mogą być wstrzykiwane samodzielnie⁹ lub z innymi cząsteczkami, takimi jak kandydaci na szczepionkę^10,11. Interesujące patogeny są umieszczane w bliskim kontakcie z komórkami jelitowymi i po kilku godzinach infekcji można pobrać próbki jelitowe do dalszej analizy. Pozwala to na zastosowanie wielu grup poddanych działaniu substancji i grup kontrolnych u tego samego zwierzęcia. Analizę statystyczną można przeprowadzić za pomocą modeli powtarzanych pomiarów, co zwiększa siłę dyskryminacji między grupami i zmniejsza liczbę niezbędnych kurcząt w porównaniu z próbami z doustnym zgłębnikiem. Również zabiegi chirurgiczne i późniejsze czasy infekcji są wykonywane w ciągłym znieczuleniu ogólnym i analgezji, co minimalizuje ból zwierzęcia. Ligacje w pętli zamkniętej są idealnym szablonem do zmniejszania liczby gospodarzy i tworzenia bardziej humanitarnego systemu w badaniach na zwierzętach.

Modele podwiązanych pętli jelitowych są dobrze opisane u różnych gatunków, takich jak cielęta, króliki i myszy^2,9, ale słabo opisane w chickens⁷. Aby optymalnie wykorzystać ten model chirurgiczny, niezbędna jest właściwa technika i wykonanie do stworzenia podwiązanych pętli jelitowych, aby uniknąć uszkodzenia integralności jelita. Celem tego manuskryptu jest opisanie metody krok po kroku w tworzeniu wielu pętli jelitowych w modelu kurczaka. Technika ta jest ograniczona umiejętnościami i doświadczeniem chirurga, ponieważ dokładne procedury są niezbędne dla powodzenia projektu.

Protocol

Wszystkie procedury z wykorzystaniem żywych zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d'éthique de l'utilisation des Animaux').

1. Rozważania przed operacją

1. Do operacji wybierz 10-tygodniowe kurczaki leghorn wolne od specyficznych patogenów (SPF).
   UWAGA: Ich waga musi wynosić od 1,0 do 1,2 kg.
2. Karmę należy pobrać na 12 godzin przed zabiegami w celu opróżnienia przewodu pokarmowego.
3. Przed zabiegiem należy umieścić kurczaki w znieczuleniu ogólnym zgodnie z protokołem zweryfikowanym przez anestezjologa. Na 15 minut przed zabiegiem należy poddać premedykację każdemu kurczakowi za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia midazolamu w dawce 1 mg/kg mc. i butorfanolu w dawce 4 mg/kg. Powtarzać wstrzyknięcie butorfanolu w dawce 4 mg/kg domięśniowo co 4 godziny lub gdy zmieni się wzorzec oddychania i częstotliwość zwiększonej podczas znieczulenia. W znieczuleniu ogólnym, podczas wszystkich zabiegów, podawać izofluran w stężeniu od 1,5 do 2,5% za pomocą rurki dotchawiczej.
   UWAGA: Zaleca się stosowanie premedykacji w celu uspokojenia i analgezji, ponieważ znacznie poprawią one głębokość znieczulenia, zmniejszą ilość środków znieczulających niezbędnych podczas wszystkich zabiegów, a także umożliwią badaczom kontrolowanie poziomu bólu.
4. Monitoruj znieczulenie, rejestrując temperaturę ciała, tętno i elektrokardiogram (EKG), częstość i rytm oddechowy, nasycenie tlenem, wydychanym dwutlenkiem węgla (CO₂) i odruchami neurologicznymi.
   UWAGA: Musi być przypisana osoba do monitorowania tych parametrów podczas wszystkich procedur.
5. Przestrzegaj zasad sterylności podczas zabiegów chirurgicznych. Upewnij się, że chirurg i asystent chirurga ubierają się w sterylne fartuchy, rękawiczki, maskę i okulary ochronne zgodnie z instytucjonalnymi protokołami przedoperacyjnymi. Upewnij się, że chirurg szoruje dłonie sterylną szczoteczką nasączoną glukonianem chlorheksydyny aż do łokcia, z naciskiem na paznokcie i każdą powierzchnię palca.
6. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora.

2. Przygotowanie miejsca operacji

1. Po pierwsze, ręcznie usuń pióra z brzucha, delikatnie chwytając.
2. Wyszoruj miejsce operowane sterylną szczotką nasączoną glukonianem chlorheksydyny i detergentem. Delikatnie szoruj skórę od środka na zewnątrz, przez łączny czas kontaktu 5 minut, nie wracając do środka.
3. Wykonaj 3 alternatywne przejścia na polu operacyjnym roztworem glukonianu chlorheksydyny i alkoholu izopropylowego przy użyciu sterylnych gazów.
   UWAGA: Przejście musi zaczynać się od środka pola operacyjnego do granic, aby uniknąć zanieczyszczenia z niezdezynfekowanych obszarów do pola operacyjnego.
4. Umieść sterylną serwetę chirurgiczną na kurczaku.

3. Ekstrakcja jelita cienkiego z jamy brzusznej

1. Naciąć serwetę chirurgiczną nożyczkami, aby odsłonić tylko skórę pola operacyjnego.
2. Naciąć skórę, wykonując nacięcie w kształcie litery "L" z niską linią środkową za pomocą ostrza skalpela #3.
   1. Rozpocznij pierwsze nacięcie 1 cm ogonowo do mostka i zakończ je na 1 cm czaszki do kloaki.
   2. Wykonaj drugie nacięcie prostopadle do pierwszego nacięcia. Zacznij od ogonowego końca pierwszego nacięcia i kontynuuj 5 cm w lewo od brzucha, podążając za linią miednicy.
      UWAGA: Ten otwór utworzy klapkę, która pozwoli na łatwiejsze pobranie jelit.
3. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij otrzewną i mięśnie brzucha w tym samym kształcie litery "L", aby otworzyć jamę brzuszną.
   UWAGA: Spowoduje to odsłonięcie worków powietrznych. Pod tymi strukturami znajdują się jelita. Worki powietrzne należy nawilżać gazami nasączonymi sterylną solą fizjologiczną 0,85%, aby uniknąć wysuszenia i ewentualnego pęknięcia podczas zabiegu.
4. Włóż haczyk do kastracji Snook w jamie brzusznej, podążając za lewą ścianą brzucha i obejdź worki powietrzne w jamie brzusznej.
5. Delikatnie zewnętrzizuj jelita i rozprowadź je na polu operacyjnym.
   UWAGA: Utrzymuj nawilżenie jelit poprzez częste spryskiwanie sterylnego roztworu soli fizjologicznej 0,9% przez cały czas trwania zabiegu. Na jelitach można również umieścić gazy zwilżone sterylną solą fizjologiczną, aby uniknąć wysuszenia.
6. Chwyć jelita za pomocą suchej, sterylnej gazy i delikatnie wyciągnij jelito cienkie za pomocą ręcznego pociągnięcia, aby odsłonić jelito czcze.
   UWAGA: Naczynia krezkowe są kruche i nadmierne napięcie może spowodować ich pęknięcie, co może prowadzić do zmian niedokrwiennych jelit i znacznie pogorszyć wynik zabiegu.

4. Wytwarzanie pętli jelitowych

1. Utworzenie pętli nr 1.
   1. Umieść prostą ligaturę z syntetycznym wchłanialnym materiałem wielowłókienkowym z poliglaktyny w bliższym jeliciu czczym, unikając podwiązania głównych naczyń krezkowych.
   2. Umieść dystalną ligaturę w odległości 2 cm od bliższej ligatury.
      UWAGA: Proste ligatury wykonane z wielowłókienkowego materiału szwowego są umieszczane wzdłuż przewodu pokarmowego, tworząc hermetyczne segmenty. Schemat (Rysunek 1) opisuje położenie wszystkich ligatur. Pętle składają się z bliższej i dalszej ligatury oddalonej od siebie o 2 cm.
2. Budowa pętli nr 1.
   1. Umieść prostą ligaturę 0,5 cm w odstępie od dystalnej ligatury pętli nr 1.
      UWAGA: Pomiędzy kolejnymi pętlami znajdują się pętle o długości 1 cm, czyli segmenty tworzące fizyczną separację między pętlami. Aby prawdopodobnie zmniejszyć możliwe ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego z jednej pętli na drugą, prostą ligaturę umieszcza się w środku pętli (0,5 cm od dystalnej i proksymalnej ligatury 2 sąsiednich pętli). Zmniejsza to ryzyko, że ewentualne zanieczyszczenie wycieknie z pętli i dotrze do ligatury sąsiedniej pętli. Segmenty te nie są obowiązkowe, ale zmniejszą ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego.
3. Tworzenie kolejnych pętli i interloopów.
   1. Powtórz kroki 4.1 i 4.2, aby uzyskać żądaną liczbę pętli.
      UWAGA: W tym eksperymencie utworzono 9 pętli i 8 pętli przesiadkowych. Długość całkowita wynosiła 26 cm. Liczba pętli można dostosować w zależności od badania.

5. Wstrzykiwanie szczepów Clostridium perfringens do pętli

1. Wstrzyknąć sterylną strzykawką i igłą 26 G patogen w pętli nr 1. Delikatnie wprowadzić igłę po stronie antykrezkowej jelita pod kątem 45°.
   UWAGA: W tym eksperymencie wstrzyknięto 0,2 ml naparu z mózgu i serca (BHI) zawierającego 1 x 10⁶ CFU (jednostki tworzące kolonie) C. perfringens w środkowej fazie wzrostu log w każdej pętli. 5 różnych szczepów wstrzyknięto w 5 różnych pętlach, a 4 pozostałym pętlom wstrzyknięto kontrolę negatywną niezawierającą bakterii (sterylne BHI), naprzemienne patogeny i sterylne pętle BHI.
2. Powtórz krok 5.1, aby wstrzyknąć wszystkie pętle.
3. Delikatnie wymień przewód pokarmowy w grzbietowej części jamy brzusznej, pod workami powietrznymi.

6. Zamknięcie jamy brzusznej

1. Szew otrzewnej i mięśni brzucha.
   1. Zszyj otrzewną i mięśnie brzucha wzdłuż miednicy (wykonane w kroku 3.3) za pomocą prostego, ciągłego wzoru szwów przy użyciu syntetycznego materiału wchłanialnego z poliglaktyny wielowłókienkowej.
   2. Zszyj otrzewną i mięśnie brzucha od mostka do kloaki (wykonane w kroku 3.3. z prostym ciągłym wzorem szwów przy użyciu syntetycznego materiału wchłanialnego z multifilamentu poliglaktyny.
2. Szew skóry.
   1. Używając wielowłókienkowego materiału syntetycznego z poliglaktyny i prostego ciągłego wzoru szwów, zamknij nacięcie skóry wzdłuż miednicy wykonane w kroku 3.2.
   2. Używając tego samego wielowłókienkowego materiału ligaturowego i prostego ciągłego wzoru szwów, zamknij nacięcie skóry od mostka do kloaki wykonane w kroku 3.2.

7. Podsumowanie

1. Po zabiegach chirurgicznych trzymaj kurczaka w znieczuleniu ogólnym z odpowiednim użyciem leków przeciwbólowych, aby zminimalizować ból zwierząt w czasie infekcji. Kontynuuj monitorowanie znieczulenia, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia.
2. Po pożądanym czasie infekcji humanitarnie poddaj kurczaka eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu ogólnym.
   UWAGA: W przypadku tych zabiegów wymagany czas do wywołania zmian mikroskopowych szczepami patogennymi C. perfringens wynosił 7 godzin.
3. Za pomocą ostrza skalpela #3 wytnij odcinek pętli o długości od 0,5 cm do 1 cm i umieść go w 10% formalinie w celu utrwalenia przez noc i dalszej analizy histopatologicznej.
4. Tym samym ostrzem skalpela odetnij pozostałą część pętli i umieść ją w sterylnej probówce mikrowirówkowej w celu wyizolowania szczepów C. perfringens w każdej pętli dalszej analizy bakteriologicznej w celu ich charakterystyki genetycznej.
5. Powtórz kroki 7.2 i 7.3 dla wszystkich pętli, zmieniając ostrze skalpela między każdą pętlą.

Results

Schemat 9 pętli jelitowych i 8 pętli międzypętlowych jest pokazany w Rysunek 1. W tym modelu utworzonych jest łącznie 9 pętli i 8 pętli z prostymi ligaturami. Pętla składa się z ligatur bliższych i dystalnych oddalonych od siebie o 2 cm mierzonych od ligatury proksymalnej. Dwie sąsiednie pętle są oddzielone pętlą o długości 1 cm. Aby zmniejszyć możliwe ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego między pętlami przez wyciek z ligatury, ligaturę międzypętlową umieszcza ...

Discussion

Modele pętli jelitowych zostały opisane u wielu gatunków w celu zbadania interakcji gospodarz-patogen i patogenezy chorób wywoływanych przez różne patogeny jelitowe, takie jak Clostridium perfringens, Clostridium difficile i Salmonella enterica ^7,9,13,14,15. Wykorzystano go również do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		4% sterylna szczotka nasączona detergentem z glukonianem chlorheksydyny. Brak numeru katalogowego. Adres internetowy: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
Alkohol izopropylowy 70% USP 4 L	Handlowy alkohol izopropylowy	P016IP70	Adres internetowy: http://www.comalc.com/products/
Chloreksydyna	Sigma-Aldrich	282227-1G	Roztwór glukonianu chlorheksydyny należy rozcieńczyć do 4%. Adres internetowy: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Serweta chirurgiczna mała (27 cali x 24 cale) z 3 x 6 calami Stolarka	Weterynaryjne produkty specjalistyczne	32724	Adres internetowy: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
Ostrza skalpela #3	Swann-Morton	301	Adres internetowy: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Sterylna sól fizjologiczna NaCl 0.9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	Adres internetowy: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Wchłanialny materiał szewny z poliglaktyny wielofilamentowej. Adres internetowy: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Strzykawka 1 ml z igłą 26G	Becton Dickinson and Company	329652	Adres internetowy: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	Adres internetowy: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
probówka Eppendorf	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	Probówka do mikrowirówek. Adres internetowy: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Roztwór formaliny, buforowany neutralny, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	Stosunek tkanki: formalina 1: 10 dla odpowiedniego utrwalenia. Adres internetowy: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens szczepy	Université de Montré al, Chaire en recherche avicole	N/A	Specyficzne dla każdego laboratorium, dostępne na żądanie dla autora korespondencyjnego