Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57526

⸱

20 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience, Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology, Université de Montréal, 4Department of Pediatrics, Université de Montréal

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Streszczenie

Interneurony GABAergiczne (INs) są kluczowymi składnikami sieci neuronowych, które napędzają poznanie i zachowanie. IN, które mają zasiedlić korę mózgową, migrują stycznie ze swojego miejsca pochodzenia w brzusznej kresomózgowiu (w tym z wypukłości przyśrodkowych i ogonowych zwojów (MGE, CGE)) do grzbietowej płytki korowej w odpowiedzi na różne sygnały wewnętrzne i zewnętrzne. Na przestrzeni lat opracowano różne metodologie w celu genetycznego manipulowania określonymi szlakami i zbadania, w jaki sposób regulują one dynamiczne zmiany cytoszkieletu wymagane do prawidłowej migracji IN. Elektroporacja in utero jest szeroko stosowana do badania wpływu represji lub nadekspresji genów w określonych podtypach IN, jednocześnie oceniając wpływ na morfologię i ostateczną pozycję. Jednakże, chociaż podejście to jest chętnie stosowane do modyfikowania promieniście migrujących komórek piramidowych, jest ono trudniejsze technicznie w przypadku celowania w IN. Elektroporacja w macicy generuje niską wydajność, biorąc pod uwagę zmniejszone wskaźniki przeżywalności młodych, gdy elektroporacja jest przeprowadzana przed e14.5, jak to zwykle bywa podczas badania INs pochodzących z MGE. W alternatywnym podejściu, eksplantaty MGE zapewniają łatwy dostęp do MGE i ułatwiają obrazowanie genetycznie modyfikowanych IN. Jednak w tych eksplantatach INs migrują do sztucznej matrycy, pozbawionej endogennych wskazówek naprowadzających i wejść wzgórzowych. To skłoniło nas do optymalizacji metody, w której INs mogą migrować w bardziej naturalistycznym środowisku, jednocześnie omijając wyzwania techniczne związane z podejściem in utero. W tym artykule opisujemy kombinację elektroporacji ex utero embrionalnych mózgów myszy, a następnie organotypowych kultur warstwowych, aby łatwo śledzić, obrazować i rekonstruować genetycznie zmodyfikowane IN migrujące wzdłuż swoich naturalnych ścieżek w odpowiedzi na endogenne sygnały. Podejście to pozwala zarówno na ilościowe określenie dynamicznych aspektów migracji IN za pomocą poklatkowego obrazowania konfokalnego, jak i na szczegółową analizę różnych parametrów morfologicznych za pomocą rekonstrukcji neuronalnych na utrwalonej tkance znakowanej immunologicznie.

Wprowadzenie

Korowe interneurony GABAergiczne (INs) są zróżnicowane pod względem właściwości biochemicznych, fizjologicznych i łączności, a także pośredniczą w różnych funkcjach w dojrzałych sieciach1,2,3,4,5. Specyfikacja różnych podtypów korowych IN jest ściśle regulowana przez kaskady genetyczne, które zostały szeroko zbadane1,2. Większość (70%) korowych GABAergicznych IN pochodzi od przodków w przyśrodkowej wyniosłości zwojowej (MGE), brzusznie zlokalizowanej strukturze embrionalnej, i musi migrować na stosunkowo duże odległości, aby dotrzeć do płytki korowej1,2,6. Podczas gdy korowe komórki piramidalne migrują promieniście ze strefy komorowej (VZ) do płytki korowej wzdłuż promieniowego rusztowania glejowego, styczna migracja IN, które nie są przymocowane do takiego rusztowania, wymaga różnych wewnętrznych i zewnętrznych wskazówek, aby przyciągnąć migrujące neurony w kierunku płytki korowej, jednocześnie kierując je z dala od struktur niekorowych2, 7,8. Po wyjściu z cyklu komórkowego, INs są odpychane od MGE przez sygnały chemo-odpychające wyrażone w VZ MGE, co wyzwala styczną migrację w kierunku płytki korowej9,10. Migrujące INs omijają prążkowie za pomocą różnych odpychających sygnałów11, a po dotarciu do płytki korowej przełączają się z trybu migracji stycznej na radialną i osiągają swoją ostateczną pozycję laminarną, częściowo w odpowiedzi na sygnały z komórek piramidalnych12 i innych populacji komórkowych13. Migracja IN, podobnie jak w przypadku innych populacji neuronów, obejmuje różne dynamiczne zmiany morfologiczne, aby umożliwić rzeczywisty ruch neuronu. Ta tak zwana lokomocja neuronalna charakteryzuje się powtarzającymi się cyklami składającymi się z trzech następujących po sobie etapów: wydłużenia procesu wiodącego, aktywnego ruchu następczego jądra (nukleokinezy) i wycofania procesu końcowego14. Migracja IN jest regulowana przez liczne wewnętrzne i zewnętrzne wskazówki, które napędzają rozgałęzianie i aktywne przemodelowanie procesu wiodącego, aby skierować IN-y we właściwym kierunku, określając zarówno orientację, jak i szybkość migracji14,15,16.

Determinanty regulujące migrację kory mózgowej IN były szeroko badane w ostatnich latach1,2,7,17,18,19,20Postulowano, że zakłócenia u niektórych z tych czynników molekularnych prowadzą do zaburzeń neurorozwojowych, takich jak padaczka oporna na leczenie u dzieci lub zaburzenia ze spektrum autyzmu1,2,21,22,23,24. W związku z tym kontynuowano rozwój różnych podejść in vitro i in vivo, aby znacznie zwiększyć naszą zdolność do badania tego dynamicznego procesu, jak wcześniej recenzowano25. Metody in vitro, w tym test komorowy Boydena i test Stripe Choice, zapewniają najszybszy i najbardziej powtarzalny sposób oceny zapotrzebowania i autonomicznego wpływu określonych genów lub białek na komórkę podczas migracji neuronów, bez wpływu innych czynników25. Testy te są szczególnie przydatne w połączeniu z obrazowaniem na żywo8,26,27. Dzięki tym technikom IN można łatwo pobrać z e13.5 MGE i wyizolować przez dysocjację enzymatyczną i mechaniczną, po czym można zbadać różne szlaki sygnałowe i wskazówki naprowadzające, jak pokazano wcześniej8,28. Jednak testy te odbywają się w sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej przy braku trójwymiarowej architektury tkanki, która może zmieniać zachowanie neuronów i właściwości komórek, potencjalnie wpływając na migrację komórek i/lub przeżycie25. Aby obejść te ograniczenia, eksplantaty MGE ex vivo zostały opracowane jako alternatywne narzędzie do ilościowego określania dynamicznych zmian morfologicznych zachodzących podczas migracji wraz z parametrami takimi jak prędkość i orientacja14,29. Generowanie eksplantatów MGE jest stosunkowo proste i zostało obszernie opisane w innym miejscu30. Polega to na posiewaniu małego ekstraktu MGE na monowarstwie mieszanych komórek korowych lub w mieszaninie matrigelu i kolagenu w obecności atrakcyjnych lub odpychających wskazówek25, chociaż te ostatnie są opcjonalne31. Eksplantaty MGE pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości słabo znakowanych komórek, upraszczając badanie procesów wewnątrzkomórkowych, takich jak przebudowa cytoszkieletu podczas rozgałęziania się procesu wiodącego, jak pokazano wcześniej32,33,34 oraz w niniejszym badaniu. Eksplantaty MGE są z powodzeniem stosowane do oceny dynamicznych zmian cytoszkieletu podczas migracji IN w środowisku 2D, na przykład po określonych manipulacjach farmakologicznych lub chemotaktycznych (patrz na przykład Tielens i in. 201633). Jednak przy takim podejściu IN migrują w obrębie sztucznej matrycy, co może zmienić zachowanie IN oraz odtwarzalność i znaczenie wyników eksperymentalnych.

Dla kontrastu, elektroporacja in utero umożliwia manipulację genetyczną INs w ich naturalnym środowisku i jest szeroko stosowaną metodą szybkiej i efektywnej oceny wpływu zysków i strat funkcji genów, przy jednoczesnym obejściu ograniczeń kosztownych i czasochłonnych strategii nokautowania i knock-in25,35. Elektroporacja in utero może być stronnicza w kierunku progenitorów IN za pomocą promotorów specyficznych dla typu komórki i poprzez ustawienie elektrod w kierunku struktur brzuszno-przyśrodkowych, w tym klasy MGE36. Co więcej, elektroporacja in utero pozwala na terminową ekspresję konstruktów eksperymentalnych w ciągu 1 - 2 dni, w porównaniu do 7 - 10 dni wymaganych do ekspresji konstruktu przy użyciu wektorów wirusowych25. Jednak elektroporacja in utero przodków IN ma tendencję do niskiej wydajności. Rzeczywiście, chociaż komórki progenitorowe piramid zlokalizowane w strefie grzbietowej komory mogą być skutecznie transfekowane za pomocą elektroporacji in utero, celowanie w struktury bardziej brzusznie położone, takie jak MGE, jest trudniejsze technicznie, szczególnie w małych zarodkach e13.5, a wysoki wskaźnik śmiertelności zarodków dodatkowo zmniejsza wydajność eksperymentalną25.

Aby obejść niektóre ograniczenia techniczne związane z eksperymentami in vitro z eksplantatami MGE i elektroporacją in vivo in utero, opracowano organiczne kultury warstwowe ex vivo8,37,38,39. Organotypowe kultury warstwowe mózgu mają tę zaletę, że naśladują warunki in vivo, a jednocześnie są tańsze i bardziej czasochłonne niż generowanie modeli zwierzęcych25. Rzeczywiście, preparaty te umożliwiają łatwy dostęp do MGE, wraz ze specyficzną wizualizacją IN, i mogą być połączone z elektroporacją ogniskową w celu zbadania określonych szlaków molekularnych w INs migrujących w bardziej fizjologicznym środowisku8,39,40,41. W związku z tym zoptymalizowaliśmy podejście do kultur organotypowych38, które połączyliśmy z elektroporacją ex utero i poklatkowym obrazowaniem konfokalnym, aby dokładniej ocenić morfologiczny i dynamiczny proces zachodzący podczas migracji stycznej MGE-IN. Obecny protokół został zaadaptowany i zoptymalizowany na podstawie innych, którzy używali elektroporacji mózgu ex utero lub in utero i organotypowych kultur warstwowych do badania migracji komórek piramidalnych42,43 and cortical INs36,39,44. W szczególności zarodki myszy są dekapitacjonowane, a MGE jest elektropostowany ex vivo po dokomorowym wstrzyknięciu eksperymentalnych plazmidów, co pozwala na bardziej efektywne i precyzyjne celowanie w progenitory MGE niż to, co można osiągnąć za pomocą elektroporacji w macicy. Mózgi są następnie ekstrahowane i dzielone na całe wycinki koronalne mózgu, które można hodować przez kilka dni, umożliwiając w ten sposób ciągłe śledzenie i obrazowanie transfekowanych IN. Podejście to zazwyczaj oznacza od 5 do 20 stycznie migrujących INs na wycinek mózgu, minimalizując liczbę iteracji eksperymentalnych wymaganych do osiągnięcia istotności statystycznej, jednocześnie oznaczając wystarczająco rzadką populację neuronów, aby zapewnić łatwą separację poszczególnych neuronów w celu rekonstrukcji i dokładnej oceny morfologicznej. Ponadto, w porównaniu z eksplantatami MGE, kultury organotypowe zapewniają, że migrujące INs są narażone na bardziej naturalne środowisko, w tym lokalnie wydzielane chemokiny i dane wejściowe ze wzgórza aferentnego. Podejście to jest zatem dobrze przystosowane do ilościowego określenia kierunkowości i ścieżki migracji przyjętej przez transfekowane IN, oferując jednocześnie wystarczające szczegóły anatomiczne, aby umożliwić scharakteryzowanie drobniejszych procesów dynamicznych, takich jak rozgałęzianie się procesu wiodącego, nukleokineza i retrakcja procesu końcowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) w Centrum Badawczym CHU Sainte-Justine i zostały przeprowadzone zgodnie z przewodnikiem Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Ed. 2) Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Ed. 2).

Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem elektroporacji zarodków w dniu embrionalnym (e) 13,5, w czasie, gdy aktywnie generowane są INs pochodzące z MGE, przed szczytem produkcji INs pochodzących z CGE45,46. Ponadto, aby skierować elektroporację w kierunku GABAergicznych IN, używamy promotora selektywnie wyrażanego w INs (na przykład promotor Dlx5/6 z minimalnym wzmacniaczem)47.

1. Przygotowanie roztworów do elektroporacji i organotypowych kultur warstwowych

  1. Przygotuj 125 ml sterylnej pożywki hodowlanej.
    1. Odmierz 125 ml zwykłej pożywki hodowlanej specyficznej dla neuronów (patrz Tabela materiałów dla formulacji) w wysterylizowanej butelce w uprzednio wysterylizowanej promieniami UV komorze bezpieczeństwa biologicznego, spryskanej 70% etanolem. Dodaj 2,25 ml 50-krotnego suplementu specyficznego dla neuronów bez surowicy, 1,75 ml 200 ml glutaminy (końcowe stężenie 0,5 mM) i 6,25 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, wcześniej podanej w sterylnych warunkach. Dokładnie wymieszać, podwielokrotność porcji w sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Przygotowaną pożywkę hodowlaną można przechowywać do 3 tygodni w temperaturze 4 °C.
    2. Podzielić 100-krotny roztwór podstawowy preparatu N-2 Botteinsteina48 na 150 μl porcji w sterylnych warunkach i zamrozić w temperaturze -20°C do momentu użycia.
  2. Przygotuj 1 l sterylnego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF).
    1. Odmierz 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 l. Dodać 25,67 g sacharozy, 5,08 g chlorku sodu (NaCl), 2,18 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 1,80 g glukozy, 0,19 g chlorku potasu (KCl), 0,15 g jednozasadowego bezwodnego fosforanu sodu (NaH2PO4), 1 ml 1M zapasu CaCl2,2H 2O i 2 ml 1M zapasu MgSO4,7H 2O. Mieszać do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej. Dodaj wodę destylowaną, aby osiągnąć całkowitą objętość 1 l.
    2. Za pomocą filtra 0,22 μm przefiltrować roztwór do sterylnej butelki w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Przed każdym eksperymentem przygotuj świeży roztwór 4% agarozy w ACSF.
    1. Odmierz 25 ml wcześniej przygotowanego ACSF w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 1 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
    2. Podgrzewaj przez 45 s w kuchence mikrofalowej. Aby uniknąć rozlania, przerywaj ogrzewanie co 3 - 4 sekundy, gdy zacznie się gotowanie, otwórz rurkę, aby wypuścić ciśnienie, zamknij ją ponownie i zamieszaj ręcznie, aby wymieszać agarozę. Powtarzaj, aż roztwór agarozy będzie jednorodny. Roztwór agarozy należy przechowywać w temperaturze 42 °C przez pozostałą część doświadczenia, aby uniknąć zestalenia.
      UWAGA: Wyższe temperatury uszkadzają tkanki mózgowe.

2. Przygotowanie plazmidów do iniekcji

  1. Wyciągnij szklaną pipetę do mikroiniekcji
    1. Ustaw ściągacz do mikropipet na odpowiednie parametry, zabezpiecz szklaną kapilarnę w przewidzianym do tego miejscu i upewnij się, że jest wyśrodkowana z filamentem.
    2. Naciśnij przycisk ciągnięcia.
    3. Ostrożnie wyjmij nowo wykonane pipety do mikroiniekcji ze ściągacza ciepła i umieść je w pudełku lub czystej szalce Petriego do czasu dalszego użycia, aby uniknąć uszkodzenia końcówki.
  2. Ustaw szafę bezpieczeństwa biologicznego ze wszystkimi instrumentami potrzebnymi do tego eksperymentu (patrz Rysunek 1A), obficie spryskaj wszystkie narzędzia w komorze bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i sterylizuj narzędzia i otoczenie światłem UV przez 15 - 20 minut.
  3. Na etapie sterylizacji rozmrozić plazmidy na lodzie (4 °C).
  4. Odmierzyć 10 μl plazmidu z roztworu podstawowego (4 μg/μl) do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 0,01% Fast Green FCF. Delikatnie wymieszaj, krótko odwiruj i trzymaj na lodzie do użycia.
    UWAGA: Maxi-prep DNA powinno być przygotowane zgodnie z protokołem producenta przy użyciu zestawu maxi-prep wolnego od endotoksyn. DNA można rozpuszczać w buforze TE lub H2Owolnym od nukleaz, a przygotowanie plazmidu roztworem barwnika może, ale nie musi być wykonywane w sterylnych warunkach. Plazmidy z Maxi-prep powinny być porcjowane, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Hiperidy należy mieszać z barwnikiem nie później niż 2 godziny przed użyciem i nie należy ich ponownie zamrażać do dalszego użycia.
  5. Po sterylizacji przygotuj nano-wtryskiwacz w następujący sposób.
    1. Wybierz jedną z wcześniej przygotowanych szklanych pipet do mikroiniekcji przechowywanych w czystym pudełku lub na szalce Petriego i za pomocą małej pęsety przeciąć końcówkę pipety w ukośny sposób, aby uzyskać średnicę zewnętrzną około 15 μm.
      UWAGA: Podana tutaj średnica zewnętrzna jest przybliżoną miarą, która daje użytkownikowi wyobrażenie o tym, czego używamy w naszych eksperymentach i została zoptymalizowana w celu ułatwienia przekłucia czaszki w celu wstrzyknięcia plazmidu bez uszkadzania mózgu, jednocześnie umożliwiając ładowanie płynem i uwalnianie DNA. Średnicę zewnętrzną można zmierzyć, patrząc na odciętą końcówkę szklanej pipety do mikroiniekcji przymocowaną do skali mikrometrycznej pod mikroskopem jasnego pola.
    2. Za pomocą strzykawki napełnić mikropipetę olejem mineralnym z jej niewyciągniętego końca (aby usunąć całe powietrze).
    3. Włóż napełnioną szklaną mikropipetę do nanowtryskiwacza, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Opróżnij 2/3 szklanej mikropipety (zachowując wystarczającą ilość oleju, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza).
  6. Ostrożnie włożyć przygotowaną mikropipetę do probówki zawierającej roztwór plazmidu/barwnika i napełnić szklaną mikropipetę roztworem plazmidu/barwnika.

3. Pobieranie embrionów myszy od ciężarnych samic

  1. Codziennie monitoruj samice hodowlane, aby ocenić ich obecność w pochwie, najlepiej codziennie o tej samej porze (wczesnym popołudniem). Dzień e0,5 odpowiada pierwszemu dniu, w którym obserwuje się czop pochwowy.
    UWAGA: Opisane tutaj eksperymenty można przeprowadzić na myszach typu dzikiego. Jednakże, aby ułatwić identyfikację MGE i oznaczyć wszystkie GABA-ergiczne INs (lub określone podzbiory, takie jak INs pochodzące z MGE), można wykorzystać zwierzęta transgeniczne (np.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre z allelem Cre-reporter itd.47,49). W takiej sytuacji wstrzyknięty eksperymentalny plazmid powinien wyrażać inny fluorofor (na przykład mCherry lub TdTomato), aby umożliwić wizualizację transfekowanych INs (żółty), które można porównać z nietransfekowanymi INs (zielony).
  2. Złożyć w ofierze samicę w dniu embrionalnym e13.5, przez zwichnięcie szyi.
    UWAGA: Środki znieczulające podawane w momencie składania ofiary mogą mieć wpływ na migrację IN i przeżycie50,51 i należy ich unikać.
  3. Pobrać zarodki przez cesarskie cięcie w następujący sposób.
    1. Obficie spryskaj kobiecy brzuch 70% etanolem. Podciągnij skórę brzucha za pomocą wysterylizowanych kleszczy, a drugą ręką użyj wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć skórę od brzucha.
    2. Za pomocą drugiej pary wysterylizowanych kleszczy i nożyczek pociągnij powięź brzuszną do góry i przetnij ją, ostrożnie omijając macicę.
    3. Za pomocą trzeciej pary wysterylizowanych kleszczy i nożyczek wyciągnij rogi macicy i wytnij je z jamy miednicy. Umieść wypreparowane rogi macicy na sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej pożywką hodowlaną na bazie neuronów uzupełnioną aminokwasami, witaminami i solami nieorganicznymi (patrz tabela materiałów dla produktu dostępnego na rynku).
  4. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj dwóch par cienkich pęset (po jednej w każdej ręce), aby wypreparować zarodki z łożyska i odizolować głowy przez ścięcie.
  5. Odetnij ukośnie końcówkę sterylnej plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml, odessaj głowice i przenieś je na nową, sterylną 60-milimetrową szalkę Petriego, pokrytą zestalonym czarnym woskiem i wypełnioną tą samą pożywką z uzupełnieniem na bazie neuronów, jak powyżej.
    UWAGA: Ten krok minimalizuje przenoszenie zanieczyszczeń (włosów myszy, krwi). wosk służy do stabilizacji głowy podczas sekcji. Pożywki hodowlane nie muszą być natleniane podczas tych procedur.

4. Dokomorowe iniekcje plazmidu i elektroporacja ex vivo MGE

UWAGA: Następujące kroki muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w wcześniej przygotowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Umieść 60-milimetrową szalkę Petriego pokrytą czarnym woskiem i zawierającą ścięte głowy w pożywce z uzupełnionymi kulturami na bazie neuronów pod lornetką w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Ustabilizuj głowę, część rostralną skierowaną w prawo, za pomocą cienkiej pęsety lewą ręką i użyj nano-wstrzykiwacza w prawej ręce, aby wstrzyknąć 1 - 2 μl roztworu plazmidu/barwnika do prawej bocznej komory.
    UWAGA: Eksperymenty z koekspresją można przeprowadzić poprzez koelektroportację plazmidu ratunkowego i plazmidu eksprymującego shRNA poprzez zmieszanie obu plazmidów w stężeniach równomolowych.
  3. Elektroporuj wstrzyknięty mózg.
    1. Umieść głowę między elektrodami z elektrodą ujemną umieszczoną grzbietowo i równolegle do głowy, a elektrodą dodatnią w kierunku brzusznej strony głowy, aby celować w MGE.
    2. Gdy elektrody są dobrze ustawione, dostarczaj 4 impulsy kwadratowe o napięciu 40 V przez 50 ms w odstępach międzyimpulsowych 500 ms.
    3. Usuń wszelkie resztki tkanki z elektrod za pomocą pęsety już umieszczonej w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Parametry te zostały zoptymalizowane specjalnie dla elektroporatora używanego w naszych eksperymentach. Zalecamy, aby użytkownicy wykonali wcześniej testy optymalizacyjne w przypadku korzystania z innego typu elektroporatora.
    4. Powtórz kroki od 4.1 do 4.3 dla wszystkich pozostałych mózgów.
      UWAGA: Chociaż ten protokół opisuje manipulacje wymagane dla jednego mózgu, możliwe jest wstrzyknięcie do 4 mózgów sekwencyjnie przed elektropolacją każdego mózgu, zwiększając w ten sposób wydajność. Strategia ta jest szczególnie korzystna, gdy 2 lub więcej różnych plazmidów jest wstrzykiwanych sekwencyjnie (np. plazmid kontrolny lub eksperymentalny) podczas tego samego eksperymentu (co pozwala na porównanie między rodzeństwem z miotu). Ponadto możliwe jest wstrzykiwanie i elektroportowanie jednocześnie po obu stronach mózgu w celu zwiększenia wydajności, poprzez ustawienie elektrod całkowicie równolegle do powierzchni mózgu.

5. Sekcja mózgu i organotypowe kultury plastrów

  1. Nadal manipulując w sterylnym środowisku kabiny bezpieczeństwa biologicznego, wypreparuj mózg z czaszki.
    1. Ustabilizuj głowę na warstwie czarnego wosku, wkładając igłę do każdego oka, ostrożnie omijając mózg.
    2. Użyj cienkiej pęsety, aby przytrzymać lewą stronę szyi i drugiej pary cienkich pęset, aby oderwać skórę od czaszki, od tyłu do przodu.
    3. Trzymając głowę z boku za pomocą pęsety w jednej ręce, użyj drugiej pęsety w drugiej ręce, aby ostrożnie przeciąć czaszkę na poziomie pnia mózgu i delikatnie pociągnij czaszkę do góry. Każdą pęsetą przetnij czaszkę w płaszczyźnie strzałkowej (linii środkowej) do przodu, a następnie naciąć bocznie, aby uwolnić fragmenty czaszki.
    4. Podnieś pień mózgu i ostrożnie przetnij opony mózgowe i nerwy czaszkowe, aż mózg całkowicie wyjdzie z czaszki.
      UWAGA: Wszystkie czynności opisane w ppkt 5.1 powinny być wykonywane w rygorystycznych sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Osadź mózg w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w celu przekrojenia.
    1. Napełnić szalkę Petriego o średnicy 35 mm przygotowanym powyżej roztworem agarozy (w płynie prowadzonym w temperaturze 42 °C).
    2. Szybko przenieś elektroporowany mózg do naczynia wypełnionego agarozą za pomocą wcześniej przeciętej pipety transferowej. Przechowuj naczynie w temperaturze pokojowej.
    3. Wymieszaj agarozę metalowym patyczkiem, aby utrzymać mózg w środku studzienki (aby zapobiec zatonięciu) i ustaw mózg w płaszczyźnie rostro-ogonowej równolegle do naczynia. Przestań mieszać, gdy agaroza zacznie krzepnąć, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.
    4. Użyj żyletki, aby przeciąć agarozę otaczającą mózg, aby utworzyć prostokątny blok, pozostawiając margines 1-2 milimetrów wokół mózgu. Upewnij się, że rostralna część mózgu jest prostopadła do przedniej granicy bloku, aby ułatwić orientację w kolejnych krokach sekcji.
    5. Powtórz te czynności dla każdego mózgu.
      UWAGA: Możliwe jest cięcie więcej niż jednego mózgu na raz (maksymalnie 3) poprzez formowanie oddzielnych bloków agarozy, ustawiając każdy mózg na różnych wysokościach.
  3. Wibratome, przekroje koronalne i kultura plastrowa.
    1. Rozmrozić jedną porcję 100X suplementu N-2 (150 μl) na lodzie i dodać do 15 ml podzielonej pożywki hodowlanej w sterylnych warunkach.
    2. Przenieś 750 μl pożywki hodowlanej (z 1X dodatkiem N2) do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej.
    3. Za pomocą zakrzywionej pęsety umieść jedną wkładkę do hodowli komórkowej (średnica 30 mm, wielkość porów 0,4 μm, PTFE) w każdym dołku wypełnionym pożywką.
    4. Napełnij wannę wibratomową stale natlenionym ACSF. Schłodzić do 4 °C z lodem otaczającym wannę lub użyć wibratomu w lodówce.
    5. Ustaw prędkość wibratomu na 0,150 mm/s, a częstotliwość na 80 Hz.
    6. Przyklej blok agarozy na platformie wibratomu, krawędzią rostralną skierowaną w dół i krawędzią brzuszną skierowaną w stronę użytkownika.
    7. Przeciąć mózg na skrawki czołowe, aby uzyskać skrawki o grubości 250 μm (w temperaturze 4 °C).
    8. Za pomocą wysterylizowanych szpatułek zbierz 2-3 sekcje zawierające MGE i umieść wszystkie skrawki mózgu jednego zwierzęcia na jednej 30-milimetrowej wkładce membranowej, ostrożnie unikając nakładania się na sekcje. Umieścić wkładkę w jednym dołku 6-dołkowej płytki hodowlanej (zawierającej 750 μl uzupełnionej pożywki hodowlanej, jak opisano powyżej). Alternatywnie, każdą sekcję można umieścić na oddzielnej membranie o średnicy 13 mm na 12-dołkowej płytce hodowlanej wypełnionej 500 μl uzupełnionej pożywki hodowlanej. Ilość pożywki zalecana dla każdej studzienki pozwala na odżywianie części mózgu przez pożywkę bez zanurzania.
      UWAGA: Czynności opisane w ppkt 5.3.6 i 5.3.7 nie są wykonywane w całkowicie sterylnych warunkach, chyba że wibratom można wysterylizować i użyć w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dlatego ważne jest, aby wykonać te kroki ostrożnie, aby uniknąć zanieczyszczenia. Odpowiedni sprzęt ochronny (czysta maska, rękawice chirurgiczne i fartuch laboratoryjny) powinien być noszony przez cały czas, a części ciała, nawet zakryte, takie jak włosy, twarz i dłonie, nigdy nie powinny przechodzić przez płytki hodowlane (z pożywką hodowlaną lub bez). Zaleca się również częste rozpylanie 70% etanolu na rękawice i szpatułki używane do pobierania skrawków mózgu.
    9. Umieścić płytkę hodowlaną w wentylowanym, sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy wilgotności 60% i 5% CO2 przez 48 lub 72 godziny
      UWAGA: Te czasy inkubacji zostały zoptymalizowane odpowiednio pod kątem obrazowania poklatkowego INs pochodzących z MGE i obrazowania konfokalnego stałych plasterków. Optymalne czasy inkubacji powinny być wcześniej przetestowane dla każdego projektu eksperymentalnego. Ponadto, jeśli wybrana inkubacja trwa 72 godziny i mniej, nie ma potrzeby zmiany pożywki hodowlanej. W przypadku dłuższych czasów inkubacji pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 2 - 3 dni.
    10. Po pożądanym czasie inkubacji przenieść interesujące nas skrawki do 8-komorowego szkiełka nakrywkowego i dodać 3 - 5 μl pożywki hodowlanej. Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze środowiskowej (37 °C, 60% wilgotności, 5% CO2) połączonej z odwróconym konfokalnym dyskiem wirującym wyposażonym w oprogramowanie do akwizycji wspomaganej komputerowo w celu skonfigurowania sesji obrazowania poklatkowego.
      UWAGA: Alternatywnie, skrawki można utrwalić za pomocą 4% paraformaldehydu (przez noc w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej), a następnie wybarwić immunologicznie różnymi przeciwciałami w celu wizualizacji cech morfologicznych elektropostowanych INs pod mikroskopem konfokalnym. Chociaż eGFP i mCherry można uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej bez żadnej procedury barwienia przeciwstawnego, zalecamy wykonanie immunohistochemii przeciwko GFP i mCherry w celu wzmocnienia sygnału, ponieważ proces fiksacji może zmniejszyć fluorescencję, zmniejszając wykrywanie drobniejszych składników neuronów embrionalnych, takich jak mniejsze gałęzie w procesach wiodących lub końcowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiamy reprezentatywne wyniki uzyskane po elektroporacji ex utero plazmidu kontrolnego lub plazmidu eksperymentalnego nakierowanego na wybrany gen w MGE embrionów myszy w stadium e13.5, a następnie w organotypowych kulturach skrawków inkubowanych w temperaturze 37 °C przez 48 h (do obrazowania time-lapse) lub 72 h (do fiksacji i znakowania immunohistochemicznego) (schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1B). Dla porównania z op...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiamy wiarygodną metodę wykonywania elektroporacji ex utero myszy MGE w temperaturze e13.5 oraz generowania kultur organotypowych embrionalnych wycinków mózgu. Chociaż metody in vitro, takie jak test komory Boydena, są stosunkowo łatwe do wykonania i mogą być stosowane do oceny specyficznych ról różnych genów i białek bez ingerencji innych czynników, wykluczają one badanie dynamiki migracji IN w odniesieniu do kierunkowości i ścieżki migracji25. Eksplantaty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Poglądy wyrażone w niniejszym dokumencie niekoniecznie reprezentują poglądy Ministra Zdrowia lub Rządu Kanady.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty operacyjne z Fundacji Savoy i Fundacji CURE Epilepsy oraz przez dotacje sprzętowe od Kanadyjskiej Fundacji Innowacji dla E.R (mikroskop konfokalny) i G.H (mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem). E.R. otrzymuje nagrodę za karierę od Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Nagroda dla klinicysty-naukowca), a także od Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR; Nagroda dla Młodego Badacza). G.H. jest starszym pracownikiem naukowym FRQ-S. L.E jest laureatem nagrody Steriade-Savoy w zakresie stażu podoktorskiego przyznawanej przez Fundację Savoy, nagrody za staż podoktorski Fundacji CHU Sainte-Justine oraz nagrody za staż podoktorski FRQ-S we współpracy z Fundacją Gwiazd. Projekt ten był możliwy dzięki Brain Canada za pośrednictwem Kanadyjskiego Funduszu Badań nad Mózgiem, przy wsparciu finansowym Health Canada, przyznanym L.E.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka neuropodstawowaThermoFisher Scientific21103049Dostępna na rynku pożywka hodowlana specyficzna dla neuronów. Kompletna formuła dostępna na tej stronie internetowej: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
Suplement bez surowicy B-27ThermoFisher Scientific1750404450X Bezemisyjny suplement specyficzny dla neuronów
15 ml sterylne probówki wirówkoweSarstedt62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-glutamina)ThermoFisher Scientific11415064Dostępna w handlu pożywka do hodowli neuronów uzupełniona aminokwasami, witaminami i solami nieorganicznymi. Kompletny preparat dostępny na stronie dystrybutora 
L-GlutaminaInvitrogen25030-081
Surowica końska, inaktywowana termicznieMillipore-SigmaH1138-500ML
Suplement Neurocell N-2 100XŻubr305-016Preparat Botteinsteina N-2 Kwadratowe
butelki na podłoża VWR PETG 125 mlVWR89132-062
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu ANuaireNU-540
SacharozaBioShopSUC700.1
Chlorek soduBioShopSOD001.1
Wodorowęglan soduThermoFisher ScientificS233-500
D+ glukozaMillipore-SigmaG7528-250G
Chlorek potasuThermoFisher ScientificP217-500
Fosforan sodu jednozasadowy bezwodnyBioShopSPM400.500
Chlorek wapnia dwuwodny ThermoFisher ScientificC79-500
Siarczan magnezu siedmiowodnyBiosShopMAG522
AgarozaBioShopAGA002.500
50 ml sterylne probówki wirówkoweSarstedt62.547.004
1,5 ml probówki wirówkoweSarstedt72.690.001
P-97 Flaming/Brown Ściągacz do mikropipetSutter Instrumenty Co.Model P-97
0,4 mm ID x 75 mm Rurka kapilarnaDrummond scientific1-000-800/12
EtanolVWRE193
Strzykawka 5 mlBecton Dickinson & Co309646
Olej mineralny (ciężki)Pęseta szwajcarska Rougier Pharma
WPI #5World Precision Instruments50451111 cm, prosta, końcówki 0,06x0,07mm, antymagnetyczna. Będziesz potrzebował 2 z nich.
Pęseta szwajcarska WPI #7World Precision Instruments50450411,5 cm, 0,18x0,2mm, zakrzywione końcówki,
PęsetaHTC World Precision Instruments50461711 cm, prosta, płaska
Nożyczki operacyjneWorld Precision Instruments50122516 cm, Ostra/ostra, prosta. Będziesz potrzebował 3 z nich.
Kleszcze opatrunkoweWorld Precision Instruments50121712,5 cm, proste, ząbkowane
Kleszcze do tęczówkiWorld Precision Instruments50447810,2 cm, pełna krzywa, ząbkowana
Kleszcze do tkanek DeBakeyWorld Precision Instruments50199615 cm, kąt 45 stopni, delikatna szczęka, szerokość 1,5 mm
Mikroszpatułka Fisherbran z zaokrąglonymi końcamiFisherScientific21-401-5Będziesz potrzebował 2 z nich.
Nanoject II Auto-Nanolitr InjectorDrummond scientific3-000-204
TC Dish 60, StandardSarstedt83.3901Talerz 60 mm
Naczynie do hodowlitkankowych Sarstedt83.1800Talerz 35 mm
Black WaxFisherScientificS17432
Pipety transferowe Ultident170-CTB700-2123 mL, mała żarówka
Mikroskop stereoskopowyLeica BiosystemsLeica M80W zamienniku naszego mikroskopu stereoskopowego, który został wycofany przez producenta (StereoMaster od FisherScientific)
Electro Square PoratorBTX Harvard ApparatusECM 830
Pęseta, platerowana plattyną, 3mmBTX Harvard Apparatus45-0487
25G 1 1/2Becton Dickinson & Co305127
Leica VT1000S Mikrotom z wibrującymi ostrzamiLeica BiosystemsVT1000S
GEM - Jednoostrzowa żyletkaMikroskopia elektronowa Nauki71952-10Usuń koniec przed włożeniem do ostrza wyznaczonego miejsca wibratomu
&mikro;-Slide 8 wellIbidi80827Zestaw 15
Wkładkado hodowli komórek milikomórkowychMillipore-SigmaPICM0RG5030 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 i mikro; m pore, opakowanie 50 szt.;
Mikroskop Leica DMi6000Leica MicrosystemsN/A Głowica
konfokalna z wirującym dyskiem Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Oprogramowanie do akwizycji Volocity 6.0Improvision/Perkin ElmerN/A
LiveCell Stage system inkubacji TopUrządzenia patologiczneLC30030Zapewnia kontrolę temperatury, CO2 i wilgotności. 
Mikroskop konfokalny SP8Leica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491Prezent od Michaela Davidsona
Butelka Fast GreenFCF Millipore-SigmaF7258-25G25G, certyfikowana przez Komisję ds. Barwień Biologicznych
sztuk

Bibliografia

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325(2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834(2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031(2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524(2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865(2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897(2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656(2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Migracja interneuronów GABAergicznychzarodkowy mózg myszyobrazowanie konfokalne time-lapserekonstrukcja neuronalnaprzyśrodkowe eminencje zwojowesekcjonowanie koronalnezatapianie w agaroziesekcjonowanie w wibratomie
Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.