Integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu CD1d

Summary

Obrazowanie cytometrii przepływowej stanowi idealne podejście do wykrywania morfologicznych i funkcjonalnych zmian komórek na poziomie indywidualnym i populacyjnym. Zakłóconą funkcję endocytarną w prezentacji antygenu lipidowego w ludzkich komórkach dendrytycznych narażonych na zanieczyszczenia wykazano za pomocą połączonego profilowania transkryptomicznego ekspresji genów i morfologicznej demonstracji transportu białek.

Abstract

Analizy populacyjne morfologicznej i funkcjonalnej zmian białek endocytarnych są trudne ze względu na konieczność przechwytywania obrazów na poziomie pojedynczej komórki i statystycznej analizy obrazu na poziomie populacji. Aby przezwyciężyć tę trudność, zastosowaliśmy obrazowaną cytometrię przepływową i profilowanie transkryptomiczne (RNA-seq) w celu określenia zmienionej subkomórkowej lokalizacji klastra białka różnicowania 1d (CD1d) związanego z upośledzoną ekspresją genów endocytarnych w ludzkich komórkach dendrytycznych (DC), które były narażone na powszechny lipofilowy benzo[a]piren zanieczyszczający powietrze. Kolokalizacja białek CD1d i markera endocytarnego Lamp1 z tysięcy obrazów komórkowych zarejestrowanych za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej została przeanalizowana przy użyciu programów IDEAS i ImageJ-Fiji. Liczne obrazy komórkowe z jednocześnie barwionymi białkami CD1d i Lamp1 wizualizowano po bramkowaniu ^na CD1d⁺Lamp1+ DC za pomocą IDEAS. Zwiększona kolokalizacja CD1d i Lamp1 po ekspozycji na BaP została następnie zademonstrowana przy użyciu progowych wykresów rozrzutu, przetestowanych ze współczynnikami Mandera dla intensywności kolokalizowanej i wykreślonej na podstawie procentu kolokalizowanych obszarów przy użyciu ImageJ-Fiji. Nasze dane dostarczają korzystnego instrumentalnego i bioinformatycznego podejścia do pomiaru kolokalizacji białek zarówno na poziomie pojedynczym, jak i populacyjnym, wspierając upośledzony funkcjonalny wynik zmiany transkryptomicznej w ludzkich DC narażonych na zanieczyszczenia.

Introduction

Prezentacja antygenu zazwyczaj wiąże się z wewnątrzkomórkowym transportem białek, co często było badane za pomocą charakterystyki morfologicznej i profilowania fenotypowego komórek prezentujących antygen^1,2,3. Aby zintegrować zalety metod obrazowania i fenotypowania, opisujemy platformę analizy obrazowania zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji, aby wykazać zmienioną kolokalizację białek w ludzkich komórkach dendrytycznych (DC). W prezentacji antygenu peptydowego cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I wiążą krótki peptyd (8-10 reszt)....

Protocol

Protokoły ludzkie w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Cincinnati, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Próbki krwi od zdrowych dawców pobrano z Hoxworth Blood Center w University of Cincinnati Medical Center.

1. Profilowanie transkryptomiczne narażonych na zanieczyszczenia DC pochodzących z ludzkich monocytów

1. Całkowita ekstrakcja RNA DC narażonych na BaP
   1. Różnicuj ludzkie DC za pomocą cytokin GM-CSF i IL-4 i wystawiaj DC na działanie BaP przez 4 dni¹³.
   2. Sortuj DC narażone na BaP za pomo....

Results

Lipofilowy czynnik zanieczyszczający BaP zmienia klastry genów endocytarnych w ludzkich DC. Ludzkie monocyty pochodzące od każdego dawcy (n=3) były inkubowane z BaP i sortowane pod kątem konwencjonalnych DC, które były dalej wykorzystywane do ekstrakcji RNA i analizy transkryptomicznej, jak opisano. Po normalizacji ekspresji genów, zmienione geny między grupami narażonymi na BaP i nienarażonymi zostały zgrupowane zgodnie z funkcjonalną korelacją genów o zróżnicowanej ekspresji. Wprowadzam.......

Discussion

Funkcjonalne potwierdzenie zmienionego szlaku genowego jest trudne ze względu na duży wpływ ekspresji genów obejmującej wiele szlaków oraz trudności w integracji indywidualnych i populacyjnych aktywności komórkowych. Zastosowaliśmy obrazową cytometrię przepływową, aby przetestować transport CD1d w przedziałach endocytarnych. Obrazowa cytometria przepływowa integruje populacyjny pomiar komórek i indywidualną demonstrację subkomórkowej kolokalizacji wielu białek. Mikroskopia konfokalna wcześniej zapewniała wysoką rozdzielc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transkryptomika	Illumina	HiSeq 2500 v4	System Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	Obrazowanie cytometrii przepływowej
mirVana Zestaw do izolacji miRNA	Thermo Fisher		Ekstrakcja całkowitego RNA
Agilent RNA 6000 Pico Analiza	Agilent		Total RNA
Veriti 96-dołkowy szybki termocykler	Thermo Fisher		PCR, reakcja enzymatyczna
NEBNext Moduł izolacji magnetycznej mRNA poli(A)	Oczyszczanie RNA	New England Biolab
PolyA Zautomatyzowany system SMARTer Apollo	Oczyszczanie RNA	Takara
PolyA Zestaw do przygotowania biblioteki NEBNext Ultra RNA do	przygotowania biblioteki	New England Biolab
Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC, analiza rozkładu wielkości
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent		Library QC, analiza rozkładu wielkości
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)	Kwantyfikacja biblioteki	Thermo Fisher
Zestaw ilościowy biblioteki NEBNext	Kwantyfikacja
	Generacja klastra	cBot Illumina
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – Biblioteka HS	Illumina		Generacja klastrów
HiSeq 1000	Sekwencjonowanie	Illumina
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 cykli)	Sekwencjonowanie	Illumina
	Legend	L161
PE - anty-myszy IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)