Artykuł metodologiczny

Ocena inkluzji eksonów indukowanej przez oligonukleotydy antysensowne przełączające splicing w fibroblastach pacjentów z SMA

DOI:

10.3791/57530

⸱

11 maja 2018

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że różne oligonukleotydy antysensowne (AON) indukują inkluzję eksonów (modulacja splicingu) i ratują ekspresję SMN w rdzeniowym zaniku mięśni (SMA). W tym miejscu opisujemy protokół lipotransfekcji AON w celu indukcji inkluzji eksonu w genie SMN2 oraz metody oceny w celu określenia skuteczności w fibroblastach pacjentów z SMA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rdzeniowy zanik mięśni (SMA), śmiertelna choroba neurologiczna spowodowana utratą SMN1, stanowi unikalny przypadek w dziedzinie terapii za pośrednictwem oligonukleotydów antysensownych (AON). Podczas gdy mutacje SMN1 są odpowiedzialne za chorobę, wykazano, że AON ukierunkowane na miejsca tłumika intronicznego splicingu (ISS) w SMN2, w tym nusinersen zatwierdzony przez FDA, przywracają ekspresję SMN i łagodzą objawy. Obecnie wiele badań obejmujących terapię AON w SMA koncentruje się na badaniu nowych substancji chemicznych AON ukierunkowanych na SMN2, które mogą być bardziej skuteczne i mniej toksyczne niż nusinersen. W tym miejscu opisujemy protokół oceny inkorporcji eksonów in vitro za pomocą lipotransfekcji AON, a następnie reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) i Western blot. Metoda ta może być stosowana do różnych rodzajów chemii AON. Za pomocą tej metody wykazujemy, że AON złożone z naprzemiennie zablokowanych kwasów nukleinowych (LNA) i nukleotydów DNA (mieszańców LNA / DNA) prowadzą do efektywnej inkluzji eksonu SMN2 i odbudowy białka SMN w bardzo niskim stężeniu, a zatem oligonukleotydy antysensowne na bazie LNA / DNA mogą być atrakcyjną strategią terapeutyczną w leczeniu defektów splicingu spowodowanych chorobami genetycznymi. Opisana tutaj metoda oceny in vitro jest wystarczająco szybka, łatwa i czuła, aby można było testować różne nowe AON.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rdzeniowy zanik mięśni (SMA) jest śmiertelnym zaburzeniem nerwowo-mięśniowym dziedziczonym autosomalnie recesywnie. Charakteryzuje się degradacją neuronów ruchowych i postępującym paraliżem mięśni tułowia i kończyn1,2. Większość występowania SMA jest spowodowana homozygotyczną mutacją w genie przeżycia neuronu ruchowego 1 (SMN1) 3. Gen SMN2 (survival of motor neuron 2) jest odwrotnym duplikatem genu SMN1 i ma prawie identyczną sekwencję różniącą się tylko o pięć zasad4,5. Przejście C-do-T w SMN2 zlokalizowanym w eksonie 7 sprawia, że gen jest prawie niefunkcjonalny, ponieważ mutacja prowadzi do wykluczenia niezbędnego eksonu 7 w prawie 90% transkryptów SMN2 (Figura 1a). MRNA SMN2 pozbawione eksonu 7 nie mogą skompensować funkcji SMN1, ponieważ jego produkt białkowy jest niestabilny i ulega szybkiej degradacji.

Terapia antysensowna okazała się ostatnio bardzo obiecującą strategią leczenia SMA6. Niedawne zatwierdzenie nusinersenu przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) sprawiło, że stał się on pierwszym lekiem dostępnym w leczeniu SMA7. Nusinersen jest 18-merowym oligonukleotydem antysensownym (AON) z modyfikacją 2′-O-metoksyetylu (MOE) i szkieletem fosforotionianowym. Lek jest ukierunkowany na tłumik intronowy splicingowy N1 (ISS-N1) znajdujący się w intronie 7 genu SMN2. Wiązanie nusinersenu z ISS-N1 sprzyja odzyskiwaniu funkcjonalnej ekspresji białka SMN o pełnej długości z endogennego genu SMN2 poprzez indukcję inkluzji eksonu 7 (Rysunek 1a)8,9,10. Obecnie wiele badań obejmujących terapię AON w SMA koncentruje się na badaniu nowych substancji chemicznych AEN, które mogą być bardziej skuteczne i mniej toksyczne niż nusinersen. Wykazano, że AON-y z innymi substancjami chemicznymi również skutecznie indukują inkluzję eksonów w eksonie 7 SMN2 zarówno in vitro, jak i in vivo11,12,13.

Zablokowane kwasy nukleinowe (LNA) to chemicznie modyfikowane analogi RNA zawierające mostek metylenowy łączący 4′-węgiel z 2′-tlenem w strukturze furanozy (Rysunek 1b)14,15. W porównaniu z DNA lub RNA, LNA mają zwiększone powinowactwo do wiązania się z komplementarnymi sekwencjami RNA i mają dodatkową zaletę w postaci wysokiej odporności na endogenne nukleazy. Chemia LNA została zastosowana do użycia jako sondy do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) oraz w qPCR16,17. Jest również wykorzystywany do regulacji ekspresji genów zarówno in vitro, jak i in vivo. GapmeR AON to połączenie jednoniciowych cząsteczek DNA otoczonych kilkoma LNA na końcach 5′ i 3′. Obniżają ekspresję genów poprzez wiązanie komplementarne z docelowymi mRNA, powodując ich degradację przez aktywowaną RNazę H18. Mieszalniki LNA/DNA to AON, które składają się z nukleotydów DNA zintegrowanych pomiędzy LNA. Przedstawione w tej orientacji mogą wiązać miRNA, aby zahamować jego funkcję (LNA-antymiR)19. Niektóre antymiR LNA osiągnęły stadium rozwoju klinicznego. Na przykład mirawirsen (AntimiR-122) jest LNA-antymiR, który hamuje miR-122 w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C, a obecnie trwa kilka badań klinicznych fazy II19,20. Ostatnio wykazano, że mieszalniki LNA/DNA mogą również modulować splicing RNA21. Może wiązać określoną sekwencję mRNA i indukować pomijanie eksonów w mRNA dystrofiny i włączenie eksonów do mRNA SMN2 in vitro13,22.

W tym artykule przedstawiamy metodologię indukcji inkluzji eksonów za pomocą AONs oraz ocenę skuteczności na poziomie RNA i białka. Aby zilustrować tę metodę, użyliśmy mieszaczy LNA/DNA ukierunkowanych na ISS-N1 w intronie 7 SMN2. AON transfekowane do komórek pacjentów z SMA przez lipotransfekcję indukowaną inkluzją eksonu 7 do końcowego transkryptu SMN2 i regulacją w górę produkcji białka SMN. Jedną z zalet stosowania mieszaczy LNA/DNA do indukcji inkluzji eksonów jest to, że efektywne stężenie dla transfekcji jest znacznie niższe niż w przypadku innych substancji chemicznych13. Metoda ta może być stosowana do wielu innych AON, z wyjątkiem fosforodiamidianowych oligomerów morfolinooligomerów (PMO), które ze względu na swój neutralny ładunek muszą wnikać do komórek przez endocytozę indukowaną przez odczynnik kotransfekcji Endo-Porter.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Posiew fibroblastów pacjenta z SMA w pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco 1:1 F-12 (szynka) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 0,5% penicyliny/streptomycyny) w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Określ stężenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i rozcieńcz komórki do 1 x 105 komórek/ml w pożywce wzrostowej, a następnie wysiewaj na odpowiedniej płytce. Użyj płytek 12-dołkowych (1 ml na dołek) do RT-PCR lub qPCR.
  3. Inkubować płytki przez 24 godziny w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.

2. Transfekcja mieszacza LNA/DNA

  1. Zapewnij konfluencję komórek około 65 - 80%, aby uzyskać optymalną wydajność transfekcji.
  2. Rozmrażaj powoli 10 μM mieszalników LNA/DNA na lodzie.
  3. W probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj 20-krotny roztwór mieszalnika, dodając mieszalniki do pożywki pozbawionej surowicy, tak aby końcowa objętość osiągnęła 50 μl.
  4. Roztwór mieszalnika zmieszać z 50 μl pożywki pozbawionej surowicy zawierającej 3% odczynnik do transfekcji (stosunek 1:1).
  5. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Do każdej probówki dodać 900 μl pożywki pozbawionej surowicy z 5% FBS.
  7. Odessać starą pożywkę z płytki i zastąpić ją 1 ml roztworu mieszającego LNA/DNA zawierającego odczynnik do transfekcji.
  8. Inkubować komórki przez 24–48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorzeCO2
    9. .

3. Ekstrakcja RNA

  1. Usunąć pożywkę i dodać 1 ml odczynnika tiocyjanianianu guanidyny-fenolu-chloroformu do komórek. Umyj dno studzienki kilkakrotnie tiocyjanianem guanidyny-fenolem-chloroformem i zbierz go do probówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Wirować z dużą prędkością przez 30 s i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę lub przez noc.
  3. Rozmrozić próbki w temperaturze pokojowej i dobrze zawirować.
  4. Dodać 200 μl chloroformu, energicznie wstrząsać przez 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  5. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zebrać górną klarowną fazę wodną do nowej probówki. Upewnij się, że nie zbierasz żadnej białej interfazy, która tworzy się między górną i dolną fazą.
  7. Dodać 500 μl izopropanolu i 1 μl 8 μg/μl glikogenu (klasa RNA). Wirować przez 10 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut lub w temperaturze -20 °C przez noc.
  8. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć cały sklarowany sklarowany osad. Na dnie rurki utworzy się biała granulka.
  9. Dodać 1 ml zimnego 75% etanolu i odwirowywać przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Usuń cały etanol i wysusz granulki w temperaturze pokojowej, aż w probówce nie pozostanie etanol.
  11. Rozpuścić osad w 30 μl wody wolnej od DNazy/RNaz i inkubować przez 10 minut w temperaturze 60 °C.
  12. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru (przy 260 nm) i dostosować stężenie RNA do 50 ng/μl.

4. Jednoetapowy RT-PCR do pomiaru wskaźnika inkluzji eksonów SMN2

  1. Wymieszać 12,5 μl 2x buforu reakcyjnego RT-PCR, 1,0 μl jednoetapowej mieszanki enzymów RT-PCR, 0,5 μl każdego startera (SMN2 do przodu: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 do tyłu: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH do przodu: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH do tyłu: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 μL całkowitego RNA (50 ng/μL), i 8,5 μl wody destylowanej wolnej od RNaz/DNaz.
  2. Po zsyntetyzowaniu cDNA w temperaturze 50 °C przez 15 minut należy rozpocząć reakcję PCR. Amplifikować ekson SMN2 6-8 za pomocą 30 cykli PCR (94 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 68 °C przez 25 s). Wzmocnić GAPDH w 20 cyklach PCR (94 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 68 °C przez 20 s).
  3. Dodać 5 μl 6-krotnie obciążającego barwnika do produktu PCR, a następnie załadować 5 μl mieszaniny do 2% żelu agarozowego i uruchomić przez 40 minut przy napięciu 100 V.
  4. Zobrazuj żel i przeanalizuj go za pomocą oprogramowania ImageJ.
  5. Zmierz intensywność pasm o pełnej długości i pasm Δ7. Obliczyć szybkość inkluzji eksonu 7 przez wartość intensywności (pełnej długości)/ (pełnej długości + Δ7 SMN2).

5. Ilościowy PCR (qPCR) do pomiaru wskaźnika inkluzji eksonów SMN2

  1. Do syntezy cDNA zmieszaj 1 μl Oligo dT, 1 μl 10 mM dNTP i 11 μl całkowitego RNA (50 ng / μL). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut.
  2. Umieść próbki na lodzie i dodaj 4 μl 5x buforu, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy do każdej próbki.
  3. Inkubować w temperaturze 50 °C przez 60 minut i podgrzewać do 80 °C przez 10 minut, aby zatrzymać reakcję. cDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C.
  4. Rozcieńczyć cDNA wodą wolną od RNaz (rozcieńczenie 1:5). Wymieszaj 10 μL 2x SYBR Zielona mieszanka enzymatyczna qPCR, 0,8 μL 10 μM każdy starter (SMN2 o pełnej długości do przodu: 5′-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTT-3′, pełnej długości SMN2 do tyłu: 5′-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3′, Δ7 SMN2 do przodu: 5′-TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 do tyłu: 5′-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3′, GAPDH do przodu: 5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, GAPDH odwrotny: 5′-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3′), 3 μl rozcieńczonego cDNA i 5,4 μl wody wolnej od RNazy.
  5. Rozpocznij reakcję qPCR. Stosować warunki: 95 °C przez 30 s, następnie powtórzyć 40 cykl w temperaturze 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 20 s.
  6. Obliczyć względną ekspresję SMN2 o pełnej długości do GAPDH lub Δ7 SMN2 i znormalizować do komórek niepoddanych działaniu środka za pomocą algorytmu ΔΔCt.

6. Western blotting

  1. Usunąć pożywkę transfekcyjną z komórek i raz przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
  2. Dodać 100 μl buforu do lizy z inhibitorem proteazy.
  3. Odłącz komórki od dna każdej studzienki za pomocą sterylnego skrobaka do komórek i zbierz do probówek o pojemności 1,5 ml. Próbki inkubować na lodzie przez 30 minut.
  4. Przepuść lizat komórkowy przez igłę 21-G 10 razy, aby zmiażdżyć komórki.
  5. Odwirować przy 20 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Próbka może być przechowywana w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  6. Określ stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA i dostosuj stężenie do 1,0 μg/μl.
  7. Zmieszać 5 μl próbek i 5 μl 2x bufor próbki dodecylosiarczanu sodu (SDS) (10% SDS; 14% 0,5M roztwór Tris-HCl, pH 6,7; 1% 0,5M roztwór podstawowy EDTA-2Na, pH 8,0; 20% glicerolu; 0,004% niebieskiego barwnika bromofenolowego, 5% β-merkaptoetanolu) i ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min.
  8. Załaduj próbki do 4-12% żelu białkowego Bis-Tris i uruchom przez 1 godzinę pod napięciem 150 V.
  9. Namocz grubą bibułę filtracyjną w każdym buforze: (Skoncentrowany bufor anodowy: 0,3 M Tris-HCl, 20% metanolu; bufor anodowy: 0,03 M Tris-HCl, 20% metanol; bufor katodowy: 25 mM Tris, 20% metanol, 40 mM kwas 6-amino-n-heksanowy, 0,01% SDS).
  10. Namocz membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w metanolu przez 20 s, a następnie przenieś ją do buforu anodowego.
  11. Zrównoważyć żel po SDS-PAGE z buforem katodowym przez 5 - 10 minut pod mieszaniem.
  12. Umieścić bibułę filtracyjną, membrany PVDF i żel na półsuchej bibułce w następujący sposób: skoncentrowany papier buforowy anody/bibuła buforowa anodowa/membrana PVDF/żel białkowy/bibuła buforowa katody (Rysunek 2).
  13. Przykryj komin i rozpocznij transfer przy napięciu 20 V przez 30 minut.
  14. Po transferze należy jednokrotnie przepłukać membranę PVDF środkiem PBST (PBS z 0,05% Tween 20).
  15. Zablokuj membranę w temperaturze pokojowej na 30 minut w 5% odtłuszczonym mleku w proszku rozpuszczonym w PBST lub w temperaturze 4 °C na noc.
  16. Rozcieńczyć oczyszczone mysie przeciwciało anty-SMN i królicze przeciwciało anty-kofilinowe w stosunku 1:10 000 w 5% odtłuszczonym mleku w proszku w PBST. Inkubować w nim membranę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  17. Umyć 3 razy PBST przez 10 min.
  18. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (kozie przeciwciała anty-mysie i anty-królicze IgG (H + L)) sprzężone z HRP do 1:10 000 w 5% odtłuszczonym mleku w proszku w PBST. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  19. Umyj membranę 3 razy PBST przez 10 min.
  20. Wykryj sygnał pasma za pomocą zestawu do wykrywania blottingu Western blotting chemiluminescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z fibroblastów pacjentów z SMA, celowaliśmy w region tłumika ISS-N1 w intronie 7 genu SMN2 za pomocą ośmiu różnych antysensownych mieszanek LNA/DNA, które były transfekowane przy stężeniu 5 nM (Rysunek 3). Każdy z mieszalników zawierał zmodyfikowany fosforopianowany szkielet, który umożliwiał im odporność na degradację nukleazy. Aby ocenić skuteczność mieszańców, szybkość inkluzji eksonu 7 SMN2 określono ilościowo za pomocą RT-PCR i qPCR p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda oceny in vitro jest wystarczająco szybka, łatwa i czuła, aby można było testować różne AON. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do pomijania eksonów i włączania innych genów i różnych typów komórek. Ponadto większość substancji chemicznych AON (z wyjątkiem PMO) może być transfekowana przy użyciu tej metody. AON mogą regulować splicing pre-mRNA zarówno z endogennych, jak i sztucznie wprowadzonych genów i mogą być współtransfekowane z wektorami plazmidowymi przenoszącymi docelowe geny.

<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Nicole McRorie za pomoc w eksperymentach. Prace te były wspierane przez Wydział Medycyny i Stomatologii Uniwersytetu Alberty, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR), Friends of Garrett Cumming Research Funds, HM Toupin Neurological Science Research Funds, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation, Alberta Enterprise and Advanced Education oraz Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SMA FibroblastyRepozytorium ludzkich komórek genetycznych Coriell NIGMSGM03813
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11320033
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF1051
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher15140122
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwieńfenolowaThermo Fisher25300062
Pożywka pozbawiona surowicyThermo Fisher31985070
Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher15338100
tiocyjanian guanidyny-fenol-chloroform (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
StarterySekwencja od 5' do 3'SMN2
do przodu: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 odwrócenie: TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH naprzód: TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH odwrócenie: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Startery
pełnej długości SMN2 do przodu:GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
pełnej długości SMN2 odwrócony: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH naprzód: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH odwrócenie:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
ChloroformSigma-AldrichP3803
Glikogen, klasa RNA ThermoFisherR0551
ImageJ Oprogramowanie
Inhibitor koktajlu proteazy 
mM Kwas 6-aminokapronowy + 20%
Buformetanolu 0,03 M Baza Tris + 20%
Bufor0,3 M Baza Tris + 20% Metanol
Beta merkaptoetanol MilliporeES-007-E
 GE10600021
Bufor do ładowania/pobierania próbek do Western blottingNuPage InvitrogenNP007
Jednoetapowy zestaw RT-PCR Qiagen 210210
dNTPClontech3040
RT-PCR Bufor katodowy Roche 11836153001 0,025 M podstawa Tris + 40  anodowy anodowy skoncentrowany metanolu Membrana PVDF

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4(2015).
  2. Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
  3. Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
  4. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
  5. Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
  6. Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
  7. Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
  8. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
  9. Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73(2007).
  10. Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
  11. Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
  12. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
  13. Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672(2017).
  14. Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
  15. Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
  16. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
  17. Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
  18. Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
  19. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
  20. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  21. Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
  22. Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
  23. Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13(2017).
  24. Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
  25. Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239(2010).
  26. Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
  27. Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
  28. Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
  29. Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
  30. Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena inkluzji eksonuekson 7 SMN2protok lipotransfekcjianaliza RT PCRilo ciowa PCRWestern blottingmiksy LNA DNAterapia oligosukwasami antysensownymi

Powiązane artykuły