Artykuł metodologiczny

Jednorodny, rozdzielczy w czasie test rezonansowy oparty na transferze energii Förstera do wykrywania wydzielania insuliny

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57531

⸱

10 maja 2018

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy jednorodny FRET (HTRF) jako skuteczną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki.

Streszczenie

Wykrywanie wydzielania insuliny jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów regulowanego wydzielania, jak również w badaniach nad metabolizmem. Chociaż od dziesięcioleci istnieje wiele testów insulinowych, niedawne pojawienie się technologii jednorodnego transferu energii rezonansowej Förstera (HTRF) z rozdzielczością czasową znacznie uprościło te pomiary. Jest to szybki, opłacalny, powtarzalny i solidny test optyczny, oparty na przeciwciałach sprzężonych z jasnymi fluoroforami o długotrwałej emisji, co ułatwia czasowo-rozdzielczy transfer energii rezonansu Förstera. Co więcej, wykrywanie insuliny HTRF jest podatne na opracowanie wysokoprzepustowych testów przesiewowych. Tutaj używamy HTRF do wykrywania wydzielania insuliny w komórkach INS-1E, linii komórkowej pochodzącej z insulinoma szczurów. Pozwala to na oszacowanie podstawowych poziomów insuliny i ich zmian w odpowiedzi na stymulację glukozy. Ponadto używamy tego systemu wykrywania insuliny, aby potwierdzić rolę dopaminy jako negatywnego regulatora wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS). W podobny sposób inni agoniści receptora dopaminopodobnegoD2, chinpirol i bromokryptyna, zmniejszają GSIS w sposób zależny od stężenia. Nasze wyniki podkreślają użyteczność formatu testu insulinowego HTRF w określaniu roli wielu leków w GSIS i ich profilach farmakologicznych.

Wprowadzenie

Regulacja metabolizmu energetycznego jest precyzyjnie dostrajana przez główny hormon anaboliczny – insulinę. Insulina jest syntetyzowana i uwalniana przez komórki beta trzustki w odpowiedzi na wzrost poziomu glukozy w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Uwolniona insulina inicjuje pobieranie glukozy przez tkanki wrażliwe na insulinę1,2. Fizjologicznie proces ten jest powiązany z podwyższeniem stężenia glukozy po posiłku, po którym następuje sekrecja insuliny w celu uregulowania poboru glukozy. Zaburzenia homeostazy glukozy prowadzą do upośledzeń metabolicznych, których kulminacją jest insulinooporność, a ostatecznie rozwój cukrzycy typu 22,3,4.

Mimo że wydzielanie insuliny zostało szeroko zbadane, mechanizmy jego regulacji pozostają słabo poznane. Kluczowym obszarem badań była identyfikacja nowych modulatorów wydzielania insuliny przez komórki beta5,6,7,8. Badania te wymagają lepszego zrozumienia związku sprzężenia między stymulacją glukozą a wydzielaniem insuliny. Dlatego niezbędna stała się zdolność do dokładnego monitorowania i ilościowego określania poziomu wydzielania insuliny stymulowanego glukozą (GSIS). Do tej pory jednak dostępna była jedynie ograniczona liczba metod umożliwiających ilościowe oznaczenie GSIS z wykorzystaniem linii komórek wydzielających insulinę i/lub wysepek trzustkowych. Jedną z nich jest test radioimmunologiczny (RIA), który wykorzystuje insulinę znakowaną radioizotopem oraz przeciwciała. Głównymi ograniczeniami tego podejścia są kwestie bezpieczeństwa związane z obchodzeniem się z materiałami promieniotwórczymi i ich utylizacją. Dodatkowo metoda ta jest pracochłonna, wymagając wielu długotrwałych etapów przemywania i inkubacji. Test immunoenzymatyczny (ELISA) to kolejne kosztowne i pracochłonne podejście wykorzystujące przeciwciała do detekcji insuliny. Zmienność powinowactwa przeciwciał oraz efektywności rozpoznawania insuliny są czynnikami ograniczającymi tę metodę i mogą wpływać na powtarzalność wyników. Ani ELISA, ani RIA nie zostały zaprojektowane do eksperymentów wysokoprzepustowych. AlphaScreen to homogeniczny test stosowany do detekcji i pomiaru poziomów wydzielania insuliny. Technologia AlphaScreen opiera się na konwersji tlenu z otoczenia w wzbudzony stan singletowy tlenu, który może reagować z gatunkami chemiluminescencyjnymi, co prowadzi do generowania chemiluminescencji. Ponieważ test jest homogeniczny, wiele etapów przemywania związanych z RIA i ELISA zostaje wyeliminowanych. Jednak niestabilność sygnału wynikająca z natury reakcji jest czynnikiem ograniczającym, który może wpływać na odczyt testu. (TR-PINCER, opracowany przez Heyduka i współpracowników9, to kolejne homogeniczne podejście do pomiaru insuliny, oparte na wiązaniu dwóch osobnych przeciwciał do różnych epitopów cząsteczki insuliny. Przeciwciała są chemicznie połączone z dwuniciowym DNA z krótkimi, komplementarnymi, jednoniciowymi nawisami DNA. Wiązanie przeciwciał do insuliny zbliża je do siebie i prowadzi do powstania dupleksu dwuniciowego DNA. Każde przeciwciało jest również powiązane z odpowiednim fluorophorem donorem lub akceptorem, a powstanie dupleksu DNA zbliża te fluorophorey, generując transfer energii rezonansowej Förstera (FRET). Jednym z potencjalnych ograniczeń TR-PINCER jest jednak sam mechanizm FRET. Brak możliwości szybkiego rozproszenia fluorescencji tła podczas reakcji FRET może prowadzić do stosunkowo wysokich poziomów fluorescencji tła i niskiego stosunku sygnału do szumu w teście. W związku z tym nadal istnieje zapotrzebowanie na niezawodny, odporny i kosztowo efektywny test do ilościowego oznaczania GSIS w sposób wysokoprzepustowy.

Ostatnie postępy w biofizyce doprowadziły do opracowania testu opartego na homogenicznym czasowo rozdzielonym rezonansowym transferze energii fluorescencji (HTRF). W szczególności, choć transfer energii w tym teście można opisać jako oparty na FRET, dokładniej rzecz biorąc HTRF opiera się na rezonansowym transferze energii luminescencji (LRET)10, który polega na nieradiacyjnym transferze energii między donorem a akceptorem11,12,13. Rozróżnienie to jest istotne, ponieważ czas trwania oddziaływania FRET opartego na fluorescencji lub wygaszaniu jest znacznie inny niż w przypadku LRET, mimo że w obu przypadkach można stosować te same rodzaje bramkowania. Ponadto zastosowanie związków kryptatów lantanowców z metali ziem rzadkich, takich jak kryptaty europu lub terbu w HTRF, pozwala na uzyskanie długich okresów półtrwania fluorescencji12,14. Daje to unikalną zaletę w postaci możliwości wprowadzenia opóźnienia czasowego (µsec) między wzbudzeniem donora a pomiarem emisji akceptora (tzn. test czasowo rozdzielony). Opóźnienie to zapewnia wystarczający czas na wygaśnięcie fluorescencji tła przed pomiarem fluorescencji emisyjnej akceptora. W konsekwencji odczyt jest wolny od nieswoistej fluorescencji, co pozwala na uzyskanie wysokiego stosunku sygnału do szumu (Ryc. 1). Co więcej, homogeniczny charakter HTRF eliminuje konieczność etapów płukania w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek, dzięki czemu test jest znacznie szybszy niż metody oparte na ELISA lub RIA.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat mechanizmu detekcji insuliny metodą HTRF. Dwa niezależnie wytworzone przeciwciała monoklonalne specyficznie rozpoznają i wiążą insulinę w oddzielnych miejscach. Przeciwciała te są sprzężone albo z donorem w postaci kryptatu europu, albo z akceptorem XL665. Wzbudzenie donora przy 337 nm skutkuje emisją przy 620 nm. Wynikający z tego transfer energii powoduje, że XL665 emituje światło o dłuższej fali, 665 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół wykorzystujący metodę opartą na HTRF do oznaczania poziomu GSIS w komórkach INS-1E, dobrze poznanej linii komórkowej insulinoma szczura pochodzącej z wydzielających insulinę komórek beta15. Ponadto test ten może być stosowany do identyfikacji profilu farmakologicznego molekularnych regulatorów wydzielania insuliny. Wykorzystujemy ten test insuliny oparty na HTRF do zbadania regulacji GSIS przez receptory dopaminergiczne typu D2. Coraz więcej badań wskazuje, że neuroprzekaźnik dopamina jest istotnym regulatorem GSIS8,16,17,18,19,20,21,22. Dopamina wpływa na GSIS w sposób negatywny, autokrynny/parakrynny, poprzez oddziaływanie na receptory dopaminergiczne typu D2 (receptory D2, D3, D4) eksprymowane na powierzchni komórek beta trzustki8,16,19. Za pomocą tego testu potwierdzamy rolę dopaminy jako negatywnego regulatora GSIS i wykazujemy, że agoniści receptorów dopaminergicznych typu D2 – bromokryptyna i kwinpirol – również redukują GSIS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Komórki INS-1E: utrzymanie i wysiew

  1. Komórki INS-1E utrzymywać w inkubatorze z nawilżoną atmosferą w temperaturze 37 ˚C/5% CO2, hodując je w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 5% (v/v) inaktywowaną ciepłem płodową surowicę bydlęcą, 2 mM L-glutaminy, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/mL roztworu penicyliny/streptomycyny oraz 50 µM β-merkaptoetanolu. Hodować komórki w 10 mL kompletnej pożywki RPMI 1640 (na płytkę), aż osiągną 80 - 90% konfluencji, po czym można je poddać trypsynizacji i pasażowaniu lub wykorzystać do testu wydzielania insuliny.
  2. Dzień 1: Odessać pożywkę i raz przemyć komórki 5 mL uprzednio ogrzanego PBS. Dodać 0,5 mL trypsyny (0,025%) rozcieńczonej 1:1 w 0,5 mL PBS w celu trypsynizacji komórek i inkubować przez 3 - 4 min w temperaturze 37 ˚C. Dezaktywować trypsynę poprzez dodanie 9 mL kompletnej pożywki i przenieść komórki do probówki wirówkowej 15 mL za pomocą pipety.
  3. Ubić komórki w osad przez wirowanie i resuspender osad komórkowy w około 5 mL świeżej pożywki.
  4. Pobrać 10 µL resuspenderowanych komórek i zmieszać z 10 µL barwnika żywotności Trypan Blue w celu sprawdzenia żywotności komórek. Policzyć komórki żywe i martwe w 10 µL tej mieszaniny przy użyciu hemocytometru. Poziom żywotności powinien wynosić powyżej 90%. Rozcieńczyć resuspenderowane komórki w świeżej pożywce do stężenia 1 miliona komórek na mL.
  5. Wysiać 0,5 mL komórek INS-1E na dołek w 24-dołkowej płytce uprzednio pokrytej poli-L-lizyną, z gęstością 500 000 komórek/dołek.
  6. Dzień 2: Usunąć pożywkę 18 - 24 h po wysianiu i dodać 500 µL/dołek świeżej pożywki RPMI 1640. Inkubować komórki przez kolejne 24 h, aby umożliwić im pełną regenerację po poprzednim etapie pasażowania. Ten dodatkowy czas pozwala komórkom na rozprzestrzenienie się na płytce do hodowli tkankowej.

2. Test wydzielania insuliny (dzień 3)

  1. Przygotować bufor KRB: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5 mM NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, oraz 0,001 g/mL albuminy surowicy bydlęcej (BSA), pH 7,4.
  2. Odssać medium z komórek i przemyć dwukrotnie podgrzanym PBS.
  3. W celu przeprowadzenia etapu głodzenia glukozowego dodać 450 µL/studzienkę buforu KRB (zawierającego BSA) bez glukozy na 1 h w temperaturze 37 ˚C/5% CO2.
  4. Podczas etapu głodzenia glukozowego przygotować rozcieńczenia szeregowe leku(ów) w buforze KRB zawierającym 200 mM glukozy (stężenie 10x).
    1. Przygotować lek w stężeniu 10-krotnym względem stężenia końcowego w buforze KRB uzupełnionym o 200 mM glukozy (również 10-krotne stężenie glukozy stosowanej w teście). Jeśli roztwór zapasowy leku (wraz z dodaną glukozą 10x) znajduje się w DMSO, należy upewnić się, że procentowa zawartość DMSO pozostaje stała w całym teście (idealnie końcowe stężenie DMSO poniżej 0,1%).
    2. W przypadku traktowania dopaminą i kwinpironem zastosować zakres stężeń końcowych leku w teście od 100 µM do 100 pM (od najwyższego do najniższego stężenia), przy czym ostatni punkt krzywej zależności od dawki nie powinien zawierać leku. Dla bromokryptyny zastosować zakres stężeń końcowych w teście od 10 µM do 10 pM, gdzie ostatnim punktem zależności od dawki jest kontrola wolna od leku.
  5. Po głodzeniu glukozowym dodać do testu rozcieńczenia szeregowe leku w celu uzyskania odpowiedzi na dawkę.
  6. Dodać 50 µL/studzienkę każdego rozcieńczenia szeregowego do odpowiednich studzienek (całkowita objętość testu 500 µL).
  7. W etapie stymulacji glukozowej inkubować komórki z odpowiednimi rozcieńczeniami szeregowymi leku (w obecności 20 mM glukozy) przez 90 min w temperaturze 37 ˚C/5% CO2. Należy uwzględnić zestaw studzienek kontrolnych: (1) stymulacja samą glukozą 20 mM w obecności braku dodatkowego leku oraz (2) komórki niestymulowane ani lekiem, ani glukozą (co pozwala wyznaczyć podstawowe tempo sekrecji).
  8. Po etapie stymulacji ostrożnie zebrać nadsączniki (użyć bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze 4 ˚C).
    UWAGA: Na tym etapie można wprowadzić dodatkowy 5-minutowy krok delikatnego wirowania (600 x g, 1 min), aby usunąć pozostałe komórki z nadsączników testowych.

3. Metoda HTRF do pomiaru wydzielania insuliny

  1. Rozcieńczyć nadnadkliny z testu w stosunku 1:10 w buforze KRB (bez BSA), najlepiej w przezroczystych płytkach 96-dołkowych.
  2. Przygotować krzywą wzorca insuliny dla testu HTRF z insuliną (Tabela 1).
Standardowy roztwór stokowy 500 ng/mlRozcieńczenia seryjneRobocze stężenie [insuliny] ng/ml
STD 730 µl Roztwór zapasowy + 140 µl KRB150
STD 630 µl STD 7 + 45 µl KRB60
STD 530 µl STD 6 + 45 µl KRB24
STD 430 µl STD 5 + 45 µl KRB9.6
STD 330 µl STD 4 + 45 µl KRB3.84
STD 230 µl STD 3 + 45 µl KRB1.54
STD 130 µl STD 2 + 45 µl KRB0.61
STD 045 µl KRB0
Uwaga: stężenie roztworu zapasu standardu (STD Stock) wynosi 500 ng/ml

Tabela 1. Rozcieńczenia seryjne do przygotowania krzywej wzorcowej dla insuliny.

  1. Nanieś próbki krzywej wzorcowej oraz rozcieńczone supernatanty do analizy na płytkę HTRF. Pomiar wydzielanej insuliny metodą HTRF można przeprowadzić w formacie płytki 96-dołkowej lub 384-dołkowej, pamiętając o konieczności ponownego dostosowania objętości analizy. Należy użyć 10 µL/dołek próbki w białych płytkach 96-dołkowych o zredukowanej powierzchni (half-area) lub 5 µL/dołek w białych płytkach 384-dołkowych o niskiej objętości i okrągłym dnie (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotuj mieszaninę przeciwciał w buforze detekcyjnym (patrz Tabela materiałów) w stosunku 1:2 donor (kryptat)/akceptor (XL-665).
    UWAGA: Dalsze szczegóły dotyczące analizy HTRF są dostępne u producenta.
  3. Dodaj mieszaninę przeciwciał do analizy w ilości 30 µL/dołek (dla formatu płytki 96-dołkowej) lub 15 µL/dołek (dla formatu płytki 384-dołkowej).
  4. Uszczelnij płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej.
  5. Odczytaj płytkę po 2 h, 4 h i/lub inkubacji nocnej z przeciwciałami, używając czytnika płytek i odpowiedniego modułu optycznego HTRF (337 665 620 nm) (patrz Tabela materiałów i instrukcje producenta). Ustaw początek integracji na 60 µs i czas integracji na 400 µs. Użyj 200 błysków na dołek.
    UWAGA: Parametry te oparto na użytkowaniu konkretnego czytnika. Odczyt przy 620 nm i 665 nm może różnić się w zależności od urządzenia. Jest to jeden z powodów, dla których sugerujemy stosowanie stosunku 665/620. Podczas obliczania tego stosunku wszelkie potencjalne różnice między czytnikami zostaną znormalizowane, co zapewni spójne wartości niezależnie od instrumentu użytego do pomiaru HTRF.

4. Analiza i normalizacja danych

  1. Oblicz stężenia insuliny w dołkach testowych poprzez ekstrapolację ratiometrycznych odczytów fluorescencji (665 nm/620 nm) do krzywej wielomianowej drugiego stopnia (Rysunek 2).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Krzywa wzorcowa insuliny. Do wygenerowania krzywej wzorcowej insuliny wykorzystano roztwór stokowy ludzkiej insuliny o znanych stężeniach. Wynikowe stosunki HTRF (665 nm/ 620 nm) wykreślono w funkcji stężeń insuliny. Dane najlepiej dopasowano do krzywej wielomianowej drugiego stopnia (R2 = 0.99996). Jest to reprezentatywna krzywa wzorcowa. Słupki błędów = SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przyjmując ekstrapolowane dane jako ng/mL wydzielonej insuliny, znormalizuj (insulinę wydzieloną w odpowiedzi na zwiększające się stężenia ligandu) do średniej wartości z dołków testowych określających % maksymalnego wydzielania insuliny (warunek z samą glukozą 20 mM).
  2. Wykorzystaj dopasowanie krzywej (R2) z pojedynczego eksperymentu do obliczenia zmienności wewnątrzpłytkowej. W obrębie eksperymentu wyznacz indywidualne wartości R2 z duplikatów wewnątrzeksperymentalnych, co pozwoli na obliczenie błędu standardowego średniej dla dopasowania krzywej.
  3. W celu określenia zmienności międzypłytkowej wykorzystaj dane z co najmniej trzech oddzielnych eksperymentów do obliczenia błędu standardowego średniej dla wartości R2 zbiorczej krzywej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zwalidowaliśmy nasz test HTRF dla insuliny poprzez wyznaczenie krzywej wzorcowej insuliny z wykorzystaniem oczyszczonych wzorców ludzkiej insuliny o określonych stężeniach (Rysunek 2). Wyznaczenie krzywej wzorcowej pozwoliło nam na ekstrapolację ratiometrycznych odczytów fluorescencji, a tym samym na określenie poziomów wydzielanej insuliny w odpowiedzi na zastosowane leki (Rysunek 2). Zmienność wewnątrz płytki dla dopasowania kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj test insuliny HTRF oferuje szybki i wydajny system do pomiaru wydzielania insuliny z systemu opartego na hodowanych komórkach. Jedną z najważniejszych zalet tego testu jest niski sygnał tła ze względu na wysoki stosunek sygnału do szumu. Dodatkowo potwierdziliśmy, że sygnał HTRF jest stabilny przez dłuższy czas (>24 h)7. Niemniej jednak, ponieważ przeciwciała monoklonalne wiążące insulinę szybko osiągają wysycenie wiązania po dodaniu do testu, na kinetykę wiązania przeciwciał może mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dziękujemy Nicolasowi Pierre'owi (Cisbio Bioassays) za pomocne porady i dr Pierre'owi Maechlerowi (Uniwersytet Genewski) za hojne dostarczenie komórek INS-1E. Praca ta była wspierana przez fundusze z Departamentu Obrony (grant PR141292 dla Z.F.) oraz John F. and Nancy A. Emmerling Fund of The Pittsburgh Foundation (dla Z.F.).

Podziękowania

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa biała półpłytkaGreiner Bio-One82050-042
384-dołkowa biała płytka o małej objętości i okrągłym dnieCorning15100157
Insulina High Range KitCisbio Bioassays62IN1PEH 10 000 testowy zestaw do oznaczania insuliny na bazie HTRF
Czytnik płytek PHERAstar FSXBMG LabtechFSXCzytnik płytek przystosowany do odczytów testów opartych na HTRF
Uszczelniacze do płytekFisher ScientificDY992Do uszczelniania płytki podczas inkubacji przeciwciał
HemocytometrHausser Scientific3100
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco 11875-093[+] L-glutamina
Trypsyna 0.05% Corning25-052-CI0,53 mM EDTA, (-) wodorowęglan sodu
DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco)Corning21-031-CVBez wapnia i magnezu
Surowica bydlęca płoduCorning35-010-CV
HEPESGibco 156-30-080
Pirogronian soduGibco 
Roztwór penicyliny/streptomycyny 100xCorning30-002 CT
2-merkaptoetanolSigmaM1348
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco 15250-061
Chlorowodorek dopaminySigma8502
Mesylan bromokryptynyTocris427
(-)-chlorowodorek chinpiroluTocris1061
Albumina surowicy bydlęcejCalbiochem12659
Poli-L-lizynaSigmaP4832
GlukozaSigmaG7021
DMSO (sulcotlenek dimetylu)Sigma276855
11360070

Bibliografia

  1. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
  2. Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).
  3. Despres, J. P., Lemieux, I. Abdominal obesity and metabolic syndrome. Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  5. Barg, S. Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells. Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).
  6. Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. Autocrine regulation of insulin secretion. Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).
  7. Farino, Z. J., et al. Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence. PLoS One. 11 (2), e0148684(2016).
  8. Simpson, N., et al. Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro. Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).
  9. Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets. Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).
  10. Heyduk, T. Measuring protein conformational changes by FRET/LRET. Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).
  11. Degorce, F. HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening. Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).
  12. Degorce, F., et al. HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).
  13. Mathis, G. HTRF(R) Technology. J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).
  14. Daijo, J. E., Sportsman, J. R. A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma. J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).
  15. Merglen, A., et al. Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells. Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).
  16. Ustione, A., Piston, D. W. Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations. Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).
  17. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).
  18. Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet. Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).
  19. Rubi, B., et al. Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion. J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).
  20. Garcia-Tornadu, I., et al. Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance. Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).
  21. Garcia-Tornadu, I., et al. New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse. Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).
  22. Lopez Vicchi, F., et al. Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis. Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).
  23. Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes. Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).
  24. Mahajan, R. Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes. Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).
  25. Caicedo, A. Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye. Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).
  26. Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications. Trends Endocrinol Metab. , (2014).
  27. Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia. Front Neurosci. 11, 432(2017).
  28. de Leeuw van Weenen, E. J., et al. The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells. Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza HTRFstymulacja glukozregulacja dopaminykom rki INS 1EFRET z rozdzielczo ci czasowdetekcja oparta na przeciwcia achwysokoprzepustowy screeningstymulowana glukoz sekrecja insulinyefekty lek w

Powiązane artykuły