Method Article

Wizualizacja nawigacji aksonów ruchowych i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji projekcji neuronów ruchowych i arboryzacji aksonów w transgenicznych zarodkach myszy Hb9::GFP. Po barwieniu immunologicznym neuronów ruchowych użyliśmy mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania zarodków do późniejszej analizy ilościowej. Protokół ten ma zastosowanie do innych procesów nawigacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rdzeniowe neurony ruchowe (MN) rozszerzają swoje aksony, aby komunikować się ze swoimi unerwionymi celami, kontrolując w ten sposób ruch i złożone zadania u kręgowców. Dlatego tak ważne jest odkrycie mechanizmów molekularnych tego, w jaki sposób aksony motoryczne poruszają się, arboryzują i unerwiają swoje cele mięśni obwodowych podczas rozwoju i zwyrodnienia. Chociaż transgeniczne linie myszy Hb9::GFP od dawna służą do wizualizacji trajektorii aksonów ruchowych podczas rozwoju embrionalnego, szczegółowe opisy pełnego spektrum arboryzacji końcowej aksonów pozostają niekompletne ze względu na złożoność wzoru i ograniczenia obecnej mikroskopii optycznej. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół, który łączy mikroskopię fluorescencyjną z arkuszami świetlnymi (LSFM) i solidną analizę obrazu, aby jakościowo i ilościowo wizualizować rozwijające się aksony motoryczne. System ten może być łatwo zaadaptowany do krzyżowania mutantów genetycznych lub modeli choroby MN z liniami Hb9::GFP, ujawniając nowe mechanizmy molekularne, które prowadzą do defektów w nawigacji i arboryzacji aksonów motorycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rdzeniowe MN są częścią ośrodkowego układu nerwowego, ale unerwiają mięśnie obwodowe, aby kontrolować ruch. W rozwijającym się rdzeniu kręgowym komórki progenitorowe MN (pMN) są ustalane zgodnie z sygnałami emanującymi ze struny grzbietowej i sąsiednich somitów. Wszystkie zróżnicowane postmitotyczne MN są następnie generowane z pMN, ostatecznie dając początek serii podtypów MN wzdłuż osi rostrocaudalnej rdzenia kręgowego1,2. Rdzeniowe MN są dobrze zorganizowane topograficznie i anatomicznie. Ich układ morfologiczny koreluje z pozycją odpowiedniego celu na peryferiach3. Po dotarciu do docelowych mięśni aksony otrzymują komórkowe i egzogenne czynniki neurotroficzne, które skłaniają je do rozciągania się i rozgałęziania w głąb mięśni. Wady unerwienia i rozgałęzień mogą przyczyniać się do zaniku tworzenia połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Na przykład Pea3 indukowany przez czynniki neurotroficzne pochodzenia glejowego (GDNF) jest niezbędny do arboryzacji aksonów w mięśnie skórne maksymalne (CM) i najszersze grzbietu (LD)4,5. Ponadto zarodki myszy z nokautem DINE wykazują wadliwą arboryzację nerwów przeponowych w przeponie, powodując niewydolność oddechową i śmiertelność natychmiast po urodzeniu6,7. Dlatego ten ostatni etap dojrzewania MN (tj. projekcja aksonalna i rozgałęzianie) ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia komunikacji między neuronami a komórkami docelowymi.

Aby wyświetlić wzorce arboryzacji, badacze zwykle przeprowadzają obrazowanie konfokalne lub mikroskopię fluorescencyjną dwufotonową próbek podzielonych na sekcje lub w całości zamontowanych8,9,10. Obie te techniki mikroskopowe generują akceptowalną rozdzielczość i penetrację głębokości. Mikroskopia światła fluorescencji dwufotonowej polega na wzbudzeniu fluoroforów poprzez jednoczesną absorpcję dwóch fotonów o niższej energii11. Ponieważ wzbudzenie dwufotonowe wykorzystuje promieniowanie bliskiej podczerwieni, zmniejszona częstotliwość wzbudzenia przyczynia się do zmniejszenia rozpraszania i lepszej penetracji tkanek do 1 mm w tkance, umożliwiając w ten sposób obrazowanie z większą głębokością. Mikroskopia konfokalna usuwa za pomocą filtrów nieostre sygnały i zbiera światło tylko w płaszczyźnie ogniskowej12. Dzięki takiemu podejściu obrazy próbek z różnych płaszczyzn ogniskowych można łączyć w celu uzyskania trójwymiarowego (3D) obrazu za pomocą funkcji Z-stack. Niemniej jednak intensywność sygnału jest zmniejszona, ponieważ większość światła jest blokowana, a duże apertury numeryczne przesłaniają głębię ostrości. Co ważniejsze, obie techniki przyczyniają się do poważnych uszkodzeń fotologicznych i fototoksyczności, ponieważ cała próbka jest oświetlona nawet wtedy, gdy w danym momencie obrazowana jest tylko jedna płaszczyzna.

Aby obejść te niedociągnięcia, LSFM stał się preferowaną alternatywą, z zaletami szybkości, wydajności światła i mniej fototoksyczności13,14. Ponadto LSFM umożliwia obrazowanie w wielu widokach. Podejście to jest szczególnie przydatne do wizualizacji aksonów motorycznych i ich końcówek rozpraszających się w miarę rozprzestrzeniania się w przestrzeni 3D. LSFM przewyższa pozostałe dwie opcje, ponieważ próbki są montowane na stoliku, który umożliwia obrót wokół osi pionowej i ruchy wzdłuż osi x, y i z. Taka konfiguracja pozwala nie tylko na minimalnie zablokowany widok próbki, ale także na wybór pożądanej ścieżki oświetlenia, co jest wadą mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej, które wymagają montażu próbek na płaskim szkiełku. Dlatego LSFM jest najbardziej odpowiednim narzędziem do obrazowania 3D arboryzacji aksonów i do ilościowego oznaczania zakończeń nerwów ruchowych w zarodkach myszy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie żywe zwierzęta były trzymane w obiekcie dla zwierząt wolnym od patogenów (SPF), zatwierdzonym i nadzorowanym przez IACUC Academia Sinica.

1. Fiksacja

  1. Zbierz zarodki z 12,5 dnia embrionalnego (E12,5), a następnie odetnij je i wypatrosz.
  2. Utrwal zarodki pojedynczo na 24-dołkowych płytkach z 1 ml / studzienkę świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu w 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) przez noc. Inkubować w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
  3. Umyj utrwalone zarodki co najmniej 3 razy, każdy przez 5-10 minut, 1 ml 1x PBS i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce w celu usunięcia pozostałości paraformaldehydu.

2. Barwienie immunologiczne w całości

  1. Przepuszczalność każdego zarodka w 1 ml 0,5% PBS-Triton-X-100 (PBST) przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.
  2. Zablokować każdą próbkę 1 ml 10% FBS przygotowanej w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.
  3. Inkubować zarodek z 1 ml pierwszorzędowego przeciwciała anty-GFP (rozcieńczenie 1:1 000 w 10% FBS) w temperaturze 4 °C przez 72 godziny z ciągłym wstrząsaniem w celu zintensyfikowania sygnału GFP nerwów ruchowych.
  4. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć 1 ml 0,5% PBST przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C na shakerze, zmieniając 0,5% PBST co najmniej trzy razy.
  5. Zastosować 1 ml przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczenie 1:1 000 w 10% FBS) i inkubować przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C, stale wstrząsając.
  6. Przemyć 3x 1 ml 0,5% PBST w temperaturze 4 °C na shakerze przez 2-3 dni. Próbki należy przechowywać w 1 PBS w temperaturze 4 °C do dnia poprzedzającego obrazowanie.
    UWAGA: Zarodki można rozciąć na mniejsze segmenty przed oczyszczeniem, w zależności od tego, która część zarodków zostanie zobrazowana. Kończyny przednie są zachowane w tym eksperymentalnym podejściu (Rysunek 1A).
  7. Inkubować zarodek w komercyjnym odczynniku czyszczącym o współczynniku załamania światła 1,49 nD w probówce o pojemności 1,5 ml, chronionym przed światłem w temperaturze pokojowej przez noc, aby zarodek stał się przezroczysty do obrazowania.
    UWAGA: Objętość odczynnika czyszczącego jest około pięciokrotnie większa niż objętość próbki.

3. LSFM (2–3 godziny)

  1. Przykładowa konfiguracja
    1. Ustaw optykę 5X/0,1 oświetlenia i optykę detekcji 5X/0,16. Zmontuj uchwyt na próbkę i kapilar próbki (średnica wewnętrzna 1,5 mm, kolor zielony) i umieść je w mikroskopie.
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby uzyskać szczegółowe procedury konfiguracji.
    2. Zamontuj zarodek w następujący sposób:
      1. Przygotować końcówkę pipety P200, odcinając górną część tak, aby pasowała do średnicy kapilary i usunąć spiczastą część (~ 3 mm) na nasadkę próbki.
      2. Rozpuść stępiony koniec końcówki pipety za pomocą małego płomienia.
      3. Zgaś płomień i szybko przymocuj zarodek pionowo do stopionego końca.
      4. Dopasuj górną część końcówki pipety do kapilary próbki.
    3. Pozwól, aby bufor komory zrównoważył się z zarodkiem przez 1 minutę, aby usunąć zanieczyszczenia lub pęcherzyki.
    4. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wybierz opcję Zlokalizuj kapilarnę na karcie Lokalizacja i dostosuj osie x, y, z, aby ustawić kapilarnę próbki.
    5. Wybierz opcję Zlokalizuj próbkę i powiększ do 0,6x, aby ustawić ostrość na zarodku. Obróć zarodek, aby upewnić się, że długa oś obrazowanej kończyny pokrywa się z torem światła dwóch źródeł światła (Rysunek 1B).
  2. Akwizycja obrazu
    1. Na karcie Akwizycja zdefiniuj parametry ścieżki światła, takie jak cele detekcji, filtr blokujący laser, rozdzielacz wiązki, kamery i lasery.
      UWAGA: W tym eksperymencie używany jest kanał GFP (długość fali wzbudzenia: 488 nm; filtr emisyjny: BP 505 do 545 nm, rozdzielacz wiązki: SPS LP 560).
    2. Zaznacz pole wyboru skanowania w pozycji pivot, aby zmniejszyć cień.
    3. Zdefiniuj ustawienia akwizycji: głębia bitowa, 16 bitów, zoom, 0,36-0,7x, podświetlenie jednostronne (lewy/prawe) lub oświetlenie dwustronne.
    4. Kliknij opcję Ciągły i ustaw intensywność lasera, czas ekspozycji, moc lasera i pozycję arkusza świetlnego, aby uzyskać ostrzejsze obrazy.
      UWAGA: Moc lasera jest utrzymywana na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować fotouszkodzenia.
    5. Naciśnij przycisk STOP, aby zakończyć pobieranie obrazu.
  3. Akwizycja wielowymiarowa
    1. Zdefiniuj stos osi Z, przesuwając pozycję Z dla pierwszego i ostatniego obrazu. Kliknij Optymalny, aby ustawić numer wycinka.
    2. Kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby pobrać wybrany stos z.
    3. Po zakończeniu zapisz obraz w formacie .czi.
  4. Przetwarzanie obrazu (opcjonalnie)
    1. Kontynuuj łączenie dwustronne w kanale przetwarzania Lightsheet, jeśli stosowane jest oświetlenie dwustronne. Przetwarzanie wielu widoków jest konieczne, jeśli multiwidoki są uzyskiwane w celu łączenia obrazów pod różnymi kątami.
    2. Utwórz obraz 2D, korzystając z danych z pikseli o największej intensywności wzdłuż osi projekcji w kanale projekcji maksymalnej intensywności.
    3. W obszarze Kopiuj kanał kliknij opcję Podzestaw, aby wybrać podzbiory obrazów z oryginalnego zestawu.

4. Kwantyfikacja arboryzacji aksonów (30 minut dla każdego pojedynczego nerwu)

  1. Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazowania (domyślnie obraz zawierający dane XYZ jest otwierany w trybie Surpass i jako widok renderowany w 3D).
  2. Dostosuj kolor, jasność i kontrast obrazu za pomocą okna Korekta ekranu (Edycja | Pokaż regulację wyświetlacza), aby wykrywać filamenty na podstawie lokalnego kontrastu intensywności.
  3. Kliknij ikonę Dodaj nowe filamenty i wybierz algorytm Autopath (bez pętli) z menu rozwijanego.
  4. Wybierz obszar zainteresowania (w tym przypadku akson segmentacji zainteresowania). Po zakończeniu kliknij przycisk Dalej.
  5. Zdefiniuj punkty początkowe i początkowe, przypisując największe i najcieńsze wymiary średnicy, które można zmierzyć w trybie Slice.
  6. Przypisz punkt początkowy na krawędzi obszaru zainteresowania. Aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe, najpierw zmień tryb wskaźnika (Nawigacja | Wybierz), a następnie Shift + kliknij prawym przyciskiem myszy w interesujących miejscach.
  7. Wybierz ręczne progi dla punktów wysiewu, aby upewnić się, że cała widoczna arboryzacja jest zaznaczona. Zmienianie trybu wskaźnika (Nawigacja | Wybierz), a następnie Shift + kliknij lewym przyciskiem myszy w interesujących miejscach, aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe.
    UWAGA: Ważne jest, aby ręcznie usunąć szumy tła i sygnały z sąsiednich nerwów.
  8. Zaznacz pole Usuń punkty początkowe wokół punktów początkowych.
  9. Zaznacz opcję Usuń rozłączone segmenty, aby zezwolić na wykluczanie punktów, które znajdują się zbyt daleko i mogą reprezentować szum tła. W następnym kroku wskaż maksymalną długość przerwy, aby zdefiniować górną granicę wykluczenia.
  10. Dostosuj próg odejmowania tła, który wykorzystuje filtr Gaussa do oszacowania intensywności tła każdego woksela.
  11. Ustaw automatyczny próg średnicy dendrytu za pomocą algorytmu Przybliżona powierzchnia przekroju.
  12. Pomiń kroki obliczania kręgosłupa.
  13. Zakończ proces i wybierz żądany styl i kolor.
  14. Usuń zaznaczenie pola głośności w obszarze Właściwości, aby wyświetlić tylko zrekonstruowane aksony.
  15. Na karcie Statystyki wybierz opcję Szczegółowe. Użyj numeru filamentu. Dendrytowe punkty końcowe do ilościowego określenia zakończeń nerwów ruchowych jako wskaźnika arboryzacji aksonów ruchowych.
    UWAGA: W razie potrzeby można dodać adnotację statystyczną.
  16. Wyeksportuj obraz zrekonstruowanego aksonu jako plik .tif.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM dostarcza szczegółową wizualizację 3D trajektorii MN i arboryzacji aksonów w zarodkach myszy. W jasnym polu tkanki wydają się całkowicie przezroczyste po zanurzeniu w komercyjnym odczynniku czyszczącym. Nie zauważono kurczenia się ani pęcznienia próbki po okresie do jednego tygodnia przechowywania w odczynniku do usuwania przed obrazowaniem. W kanale fluorescencyjnym neurony ruchowe są znakowane transgenicznie eksprymowanym GFP (film 1). W niektórych przypadkach szcz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre etapy protokołu mogą ulec zmianie w pewnych okolicznościach. Na przykład czas utrwalenia zależy od wieku zarodków i wynosi od 2 godzin do 1 lub więcej dni przy użyciu świeżo wytworzonego paraformaldehydu. Ponieważ utrwalanie przeprowadza się przed barwieniem immunologicznym całej góry, w przypadku przeciwciał, które są wrażliwe na sieciowanie białek, metanol może być stosowany jako alternatywny środek utrwalający. Aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu po barwieniu, konieczne jest zoptymalizowanie stężenia...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty LSFM i analiza danych zostały częściowo przeprowadzone przy użyciu zaawansowanych mikroskopów optycznych Division of Instrument Service w Academia Sinica i z pomocą Pani Shu-Chen Shen. Dziękujemy Pani Sue-Ping Lee z Imaging Core Facility IMB za znaczącą pomoc techniczną w analizie obrazu Imaris. Naukowy Rdzeń Edytorski Języka Angielskiego IMB zrecenzował manuskrypt. Praca ta jest finansowana przez Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), MoST (104-2311-B-001-030-MY3) i NHRI (NHRI-EX106-10315NC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9::GFPLaboratorium Jacksona005029Zbierz zarodki z dnia embrionalnego 12,5 (E12,5)
4% Paraformaldehydu (PFA)Na 200 ml: Dodaj 20 ml 10X PBS, 8 g PFA w ddH2O. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH (10N). Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Bufor fosforanowy soli fizjologicznej 10X (PBS 10X)Dla 1L: Dodaj 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4 i uzupełnij ddH2O. Autoklaw i przechowywanie w RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher26140079
Owca poliklonalny anty-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 osioł anty-owcaInvitrogenA-110151:1000
Odczynnik czyszczący RapiClear 1.49SunJin LabRC149001
1.5ml micro rurkaSarstedt72.690.001
24-dołkowa płytkaThermoFisher142475
5 SA Pęsetaideal-tek3480641
Iris Nożyczki striaght ostre/ostreAesculapBC110R
Mikrochirurgia Skalpele, jednorazoweAesculapBA365
Mikroskop preparacyjnyNikonSMZ800
WytrząsarkaTKSRS-01
Mikroskop Lightsheet Z.1Carl Zeiss
Oprogramowanie do analizy obrazu Imaris 8.4.0Bitplane, Zurych, Szwajcaria
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP myszy)Laboratorium Jacksona005029
Mikroskopia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
  4. Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
  6. Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
  7. Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
  8. Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
  9. Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
  10. Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
  11. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  12. Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
  13. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
  14. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
  15. Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
  16. De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
  17. Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685(2017).
  18. Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
  19. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
  20. Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor Axon NavigationLight Sheet MicroscopyAxon ArborizationMouse EmbryosHb9 GFP MiceImage Analysis SoftwareFilament QuantificationSample ClearingAntibody IncubationZ Stack Acquisition

Related Articles