Artykuł metodologiczny

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

16.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57548

⸱

15 maja 2018

 ,  , 
1Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Rehab Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia

W tym artykule

Podsumowanie

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Streszczenie

Padaczka skroniowa (TLE) jest najczęstszym częściowym złożonym zespołem padaczkowym i najmniej reagującym na leki. Głęboka stymulacja mózgu (DBS) jest obiecującym podejściem, gdy leczenie farmakologiczne zawodzi lub neurochirurgia nie jest zalecana. Ostre wycinki mózgu sprzężone z układami mikroelektrod (MEA) stanowią cenne narzędzie do badania interakcji sieci neuronalnych i ich modulacji przez stymulację elektryczną. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami zapisu zewnątrzkomórkowego zapewniają one dodatkowe zalety w postaci większej liczby punktów obserwacyjnych i znanej odległości między elektrodami, co pozwala na badanie ścieżki propagacji i prędkości sygnałów elektrofizjologicznych. Jednak natlenienie tkanek może być znacznie upośledzone podczas rejestracji MEA, co wymaga wysokiej szybkości perfuzji, co odbywa się kosztem zmniejszonego stosunku sygnału do szumu i wyższych oscylacji temperatury eksperymentalnej. Stymulacja elektryczna dodatkowo obciąża tkankę mózgową, utrudniając dążenie do długotrwałych epok nagrywania/stymulacji. Co więcej, elektryczna modulacja aktywności wycinka mózgu musi być ukierunkowana na określone struktury/ścieżki w obrębie wycinka mózgu, co wymaga, aby mapowanie elektrod było łatwe i szybkie wykonywane na żywo podczas eksperymentu. Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić rejestrację i modulację elektryczną aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę (4AP) w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą płaskich MEA. Pokazujemy, że tkanka mózgowa uzyskana od myszy przewyższa tkankę mózgową szczura i dlatego lepiej nadaje się do eksperymentów MEA. Protokół ten gwarantuje wygenerowanie i utrzymanie stabilnego wzorca padaczkowego, który wiernie odtwarza cechy elektrofizjologiczne obserwowane przy konwencjonalnym rejestrowaniu potencjału pola, utrzymuje się przez kilka godzin i trwa dłużej niż trwała stymulacja elektryczna przez dłuższe epoki. Żywotność tkanek przez cały czas trwania eksperymentu osiąga się dzięki zastosowaniu niestandardowej komory rejestracyjnej o małej objętości, pozwalającej na przepływ laminarny i szybką wymianę roztworu nawet przy niskich (1 ml/min) szybkościach perfuzji. Szybkie mapowanie MEA w celu monitorowania w czasie rzeczywistym i wyboru elektrod stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika (GUI).

Wprowadzenie

Epilepsja jest zagrażającym życiu postępującym zaburzeniem powodującym niekontrolowaną aktywność mózgu1; wiąże się z jednym z najwyższych obciążeń chorobowych oraz znacznym piętnem społecznym2,3. TLE jest najczęstszym zespołem (40%) i najczęściej (~ 30%) wykazuje oporność na leki przeciwpadaczkowe4. Choć chirurgiczna ablacja tkanki epileptogennej może poprawić stan pacjenta, nie jest ona możliwa do zastosowania u wszystkich chorych i nie może zagwarantować życia całkowicie wolnego od napadów5. Modulacja sieci limbicznych w epilepsji za pomocą elektrycznej DBS jest obiecującym podejściem w przypadkach, gdy leczenie farmakologiczne lub neurochirurgia nie są odpowiednie.

Przekroje mózgu gryzoni są cennym narzędziem do badania funkcjonowania sieci neuronalnych w warunkach zdrowia i choroby6 przy użyciu technik elektrofizjologii in vitro, ponieważ zachowują one, przynajmniej częściowo, oryginalną architekturę i łączność interesującego regionu (ROI) mózgu. W szczególności poziome połączone przekroje hipokampa i kory entorynalnej (hipokamp-EC) obejmują kluczowe sieci neuronalne zaangażowane w TLE i sąTherefore rutynowo wykorzystywane w badaniach nad TLE in vitro7.

Aktywność przypominającą napady drgawkowe można wywołać w preparatach przekrojów mózgu poprzez zmianę składu jonowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), na przykład poprzez zmniejszenie stężenia magnezu przy jednoczesnym zwiększeniu stężenia potasu8,9,10, lub za pomocą manipulacji farmakologicznych, takich jak blokowanie hamującej aktywności GABAergicznej (szczegółowy przegląd patrz w11). Jednak modele te opierają się na niezrównoważonej zmianie pobudzenia i hamowania, przez co nie pozwalają na badanie interakcji i wspólnego wkładu sieci pobudzających i hamujących w iktogenezę. Ciągła perfuzja przekrojów mózgu lekiem konwulsyjnym 4AP nasila zarówno pobudną, jak i hamującą neurotransmisję, co pozwala na badanie ostrej iktogenezy przy zachowaniu ogólnej nienaruszonej aktywności synaptycznej12.

Układy MEA umożliwiają rejestrację aktywności elektrycznej generowanej przez sieci neuronowe z większej liczby punktów obserwacyjnych w porównaniu do konwencjonalnej rejestracji potencjałów polowych z przestrzeni pozakomórkowej, gdzie ograniczenia przestrzenne limitują liczbę elektrod, które można umieścić na powierzchni skrawka mózgu. Co więcej, chipy MEA oferują dodatkową zaletę w postaci znanej odległości międzyelektrodowej, co jest bardzo przydatne do śledzenia propagacji i oceny prędkości przemieszczania się rejestrowanych sygnałów. Chociaż początkowo zaprojektowano je do rejestracji z hodowli neuronów13,14, obecnie MEA są również wykorzystywane do charakterystyki cech elektrofizjologicznych ostrych skrawków mózgu uzyskanych od gryzoni15 i ludzi16. Zatem w kontekście badań nad epilepsją, MEA stanowią cenne narzędzie do precyzyjnego określania oddziaływań sieci neuronowych leżących u podstawy iktogenezy16,17,18.

Rejestracja za pomocą MEA wiąże się jednak z immanentnymi wyzwaniami technicznymi w zakresie uzyskania lub utrzymania stabilnego wzorca epileptiformnego podczas długich (kilkugodzinnych) protokołów eksperymentalnych. Po pierwsze, natlenienie tkanek może być niewystarczające w dużych, okrągłych komorach rejestracyjnych typu zanurzeniowego19,20, typowych dla komercyjnie dostępnych układów MEA, podczas gdy niski stosunek sygnału do szumu oraz niestabilność temperatury mogą wpływać na jakość rejestracji przy zastosowaniu wysokiego przepływu perfuzji (6 - 10 mL/min) w celu poprawy dopływu tlenu do skrawka mózgu (patrz np. uwagi techniczne dotyczące sprzętu do ogrzewania i perfuzji21). Po drugie, wyładowania nawracające charakteryzujące się komponentami o wysokiej częstotliwości, takimi jak wyładowania epileptiformne, są rzadko obserwowane przy użyciu komór rejestracyjnych typu zanurzeniowego19; dotyczy to w szczególności sytuacji, gdy ostry wzorzec epileptiformny jest indukowany chemicznie i angażuje mechanizmy efaptyczne, co ma miejsce w modelu 4AP22 (patrz11 w celu uzyskania szczegółowego przeglądu). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, badacze zaproponowali kilka strategii. Na przykład zwiększenie szybkości perfuzji19,20 przy jednoczesnym zmniejszeniu grubości (≤300 µM) i powierzchni skrawka mózgu17,18 są kluczowymi czynnikami w celu zapewnienia odpowiedniego dopływu tlenu do tkanki. Ponadto poprawę żywotności skrawka mózgu można osiągnąć stosując perforowane MEA (pMEA), które umożliwiają perfuzję tkanki mózgowej z obu stron18.

Choć opisane podejścia znacząco poprawiły wykonalność rejestracji MEA z plastrów mózgu, nie zostały one przetestowane w warunkach długotrwałych (wielogodzinnych) sesji rejestracji i stymulacji elektrycznej, z których ta druga stanowi istotny stres dla tkanki mózgowej. Długotrwałe sesje rejestracji mogą być niezbędne do badania ewolucji w czasie specyficznych cech wzorców epileptiformnych, których nie udałoby się ujawnić podczas pomiarów krótkoterminowych. W kontekście badań nad DBS długotrwałe protokoły eksperymentalne mogą być wymagane w celu oceny i porównania efektów kilku paradygmatów stymulacji w tym samym plastrze mózgu.

W przypadku, gdy konieczny jest jedynie zapis spontanicznej aktywności elektrycznej, mapowanie elektrod względem ROI wykonuje się zazwyczaj a posteriori, t.j. podczas analizy danych; natomiast badanie odpowiedzi wywołanych lub paradygmatów elektrycznej neuromodulacji wymaga dostarczenia stymulacji do konkretnych ROI, co wymusza potrzebę szybkiego i łatwego mapowania elektrod w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu.

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół eksperymentalny, który umożliwia indukcję i utrzymanie stabilnego wzorca epileptiformnego indukowanego 4AP w skrawkach mózgu dorosłych gryzoni. Obserwowana aktywność wiernie odtwarza cechy elektrofizjologiczne tego modelu, scharakteryzowane przy użyciu konwencjonalnych technik elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej. Utrzymuje się ona przez kilka godzin i trwa dłużej niż ciągła stymulacja elektryczna w powtarzalnych, przedłużonych epokach. Komory służące do utrzymywania i inkubacji skrawków mózgu można łatwo złożyć, korzystając ze standardowych materiałów laboratoryjnych (Rycina 1A), natomiast specjalistyczną komorę rejestracyjną zapewniającą optymalną szybkość wymiany roztworu i przepływ laminarny (Rycina 1B) można nabyć z komercyjnych źródeł lub wykonać za pomocą technologii druku 3D w przystępnej cenie. Szybkie mapowanie obszarów ROI w celu monitorowania w czasie rzeczywistym oraz wyboru elektrod stymulujących jest możliwe dzięki intuicyjnemu, autorskiemu interfejsowi GUI o nazwie mapMEA, który jest dostępny bezpłatnie na żądanie.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego z wlotami/wylotami; układ wieloogniskowy do analizy dynamiki płynów.
Rysunek 1: Specjalistyczny sprzęt użyty w tym protokole. (A) Komory do rekonwalescencji, wstępnego ogrzewania i wstępnej inkubacji w 4AP, złożone z zlewki i szalki Petriego. Szalka Petriego powinna mieć mniejszą średnicę niż zlewka i być utrzymywana w miejscu za pomocą tłoka strzykawki. Dno szalki Petriego zastąpiono nylonową siatką (z miękkich pończoch) przyklejoną cyjanoakrylanem do krawędzi szalki. Tlen jest dostarczany przez zgiętą igłę rdzeniową (22 G), wprowadzoną między ścianki szalki Petriego a zlewkę. Pęcherzyki powinny wydobywać się z boku zlewki i nigdy nie osiągać nylonowej siatki, aby uniknąć przemieszczenia skrawka mózgu. Górna część szalki Petriego może służyć jako pokrywa, aby zapobiec odparowaniu ACSF i utrzymać saturację tlenem. (B) Specjalistyczna komora rejestracyjna. in: zbiornik wlotowy przeznaczony na kaniulę grzewczą i elektrodę odniesienia. out: zbiornik wylotowy przeznaczony na igłę ssącą. rec: komora rejestracyjna. (C) Szklana pipeta Pasteura, wygięta poprzez polerowanie ogniowe, używana do manipulowania tkanką i korygowania jej pozycji w komorze rejestracyjnej. (D) Specjalistyczny kotwiczka do przytrzymywania skrawka. (E) Końcowy montaż komory rejestracyjnej osadzonej na chipie MEA. Skrawek mózgu spoczywa na dnie, będąc utrzymywanym w miejscu przez kotwiczkę. Czerwona strzałka wskazuje rurkę PTFE pokrywającą kaniulę grzewczą, natomiast czerwone koło wskazuje elektrodę odniesienia, czyli nasycony pellet KCl zanurzony w ACSF w zbiorniku wlotowym. Niebieska strzałka wskazuje igłę ssącą w zbiorniku wylotowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (zezwolenie nr 860/2015-PR) zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE dotyczącą dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie zestawu MEA/dedykowanej komory

Uwaga: Rozpocząć 2 dni przed eksperymentem. Należy użyć MEA bez pierścienia (patrz Tabela materiałów).

  1. Czyszczenie MEA (czas trwania: 35 - 40 min).
    1. Rozpuścić proszek enzymatycznego środka czyszczącego w ciepłej wodzie destylowanej. Nanieść pędzlem ciepły roztwór czyszczący na powierzchnię MEA, a następnie namoczyć MEA w ciepłym roztworze przez co najmniej 3 h.
    2. Dokładnie wypłukać MEA wodą destylowaną i osuszyć za pomocą niepozostawiającej kłaczków i nierysującej chusteczki.
  2. Montaż MEA z komorą rejestracyjną (czas trwania: 10 min + przez noc).
    1. Równomiernie rozprowadzić elastomerowy uszczelniacz na dolnej powierzchni komory rejestracyjnej. Upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
    2. Zamontować komorę rejestracyjną na MEA za pomocą pęsety i przyłożyć delikatny nacisk. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, lekko przesuwać komorę okrężnie, jednocześnie delikatnie naciskając palcami, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Nałożyć warstwę uszczelniacza wzdłuż całej zewnętrznej krawędzi komory rejestracyjnej.
      Uwaga: KRYTYCZNE! Nie zakrywać uszczelniaczem styków MEA.
    3. Umieścić zestaw MEA/komora w szalce Petri o średnicy 15 cm. Obok MEA postawić szalkę Petri 5 mL lub zlewkę 10 mL wypełnioną wodą destylowaną. Przykryć całość, aby utrzymać wilgotne środowisko. Pozostawić do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez noc.
      UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
  3. Powlekanie MEA w celu nadania mu właściwości hydrofilowych (czas trwania: 5 - 10 min + przez noc).
    1. Umieścić MEA w szalce Petri o średnicy 15 cm. Nalać 50 µL poli-D-lizyny na obszar rejestracyjny MEA. Zamknąć szalkę Petri, uszczelnić ją folią uszczelniającą i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Dokładnie wypłukać MEA wodą destylowaną i przechowywać MEA w wodzie destylowanej w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół. Powlekane MEA można przechowywać i wykorzystywać ponownie w kilku eksperymentach. Regularne czyszczenie i ponowne powlekanie MEA pomaga usunąć resztki tkankowe i poprawić stosunek sygnału do szumu.

2. Przygotowanie roztworów stokowych

Uwaga: Rozpocząć 1 dzień przed eksperymentem (czas trwania: ~2 h). Roztwory zapasowe pomagają przyspieszyć przebieg eksperymentu w dniu właściwych badań. Mogą być one przygotowane wcześniej i przechowywane. Współczynnik stężenia oraz skład podano w Tabeli 1. Skład roztworów końcowych przedstawiono w Tabeli 2.

  1. Rozpuścić odczynniki w wodzie destylowanej w temperaturze pokojowej. Przefiltrować roztwory zapasowe za pomocą butelki filtrującej (średnica filtra: 0.22 µm).
  2. Przechowywać w temperaturze 4 °C (zalecany maksymalny czas przechowywania znajduje się w Tabeli 1).
    UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.

3. Przygotowanie agaru

Uwaga: Rozpocząć 1 dzień przed eksperymentem (czas trwania: ~1 h).

  1. Wlej 250 mL wody destylowanej do zlewki o pojemności 500 mL i rozpocznij mieszanie z prędkością 350 rpm. Dodaj 5 g agaru i poczekaj do jego całkowitego rozpuszczenia.
  2. Podgrzej roztwór w temperaturze 250 - 300 °C. Pozostaw wodę do odparowania, aż objętość roztworu wyniesie ~200 mL, aby uzyskać 2,5% w/v roztwór agaru.
    UWAGA: Temperatura powinna być wystarczająco wysoka, aby woda odparowała bez wrzenia.
  3. Wlej roztwór agaru do plastikowego kwadratowego pojemnika o pojemności 200 mL i ściankach o wysokości ~1,5 cm i pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej, aż zgęstnieje.
  4. Przykryj pojemnik i przechowuj w temperaturze 4 °C. Blok agaru zachowuje trwałość przez kilka tygodni.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę.

4. Przygotowanie płaszczyzny zamrożonej

Uwaga: Rozpocząć 1 dzień przed eksperymentem.

  1. Napełnij stalową miskę o płaskim dnie wodą destylowaną do poziomu 0,5 - 1 cm poniżej krawędzi.
  2. Przechowuj w temperaturze -20 °C przez noc.

5. Przygotowanie neuroprotekcyjnego ACSF do wycinania

Uwaga: Rozpocząć 1 dzień przed eksperymentem lub w dniu eksperymentu (patrz Tabela 1 oraz Tabela 2) (czas trwania: 30 min).

  1. Wlać 200 ml wody destylowanej do zlewki o pojemności 500 ml i rozpocząć mieszanie za pomocą mieszadła magnetycznego przy prędkości 350 obr./min.
  2. Dodać 50 ml roztworu zapasowego B oraz 50 ml roztworu zapasowego C (patrz Tabela 1).
  3. Dodać 3 mM kwasu pirowgronowego, 208 mM sacharozy, 10 mM D-glukozy oraz 1 mM kwasu L-askorbinowego.
    UWAGA: Rzeczywista objętość kwasu pirogronowego zależy od jego gęstości oraz czystości i może się różnić w zależności od partii. Przy otwieraniu nowej partii zawsze należy obliczyć wymaganą objętość.
  4. Przykryć folią uszczelniającą i mieszać przez 30 min.
  5. Przenieś roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml i uzupełnij ją wodą destylowaną do kreski.
  6. Zamknąć kolbę miarową folią uszczelniającą i delikatnie odwrócić 3–5 razy, aż roztwór stanie się jednorodny i przejrzysty.
  7. Przenieś ACSF użyty do wycincania do szklanej butelki z nakrętką.
  8. Przechowywać przygotowany roztwór ACSF w temperaturze -80 °C przez 20–30 min lub w 4 °C przez noc, aby schłodzić do 4 °C.
    UWAGA: Na tym etapie protokół można przerwać, jeśli preferowane jest chłodzenie przez noc. W przeciwnym razie czas potrzebny na schłodzenie ACSF do cięcia można wykorzystać na realizację kroku 6.

6. Przygotowanie płynu ACSF do utrzymania tkanek

Uwaga: Roztwór należy przygotować na świeżo w dniu eksperymentu (czas trwania: 5 - 10 min). ACSF do utrzymania zostanie wykorzystany do płukania plastrów mózgu z ACSF do cięcia podczas procedury krojenia (patrz krok 8.16) oraz do długoterminowego przechowywania i wstępnego ogrzewania plastrów mózgu. Do opłukania plastrów mózgu wystarczy 100 mL ACSF do utrzymania. Komory do utrzymania i wstępnego ogrzewania użyte w tym protokole są wykonane na zamówienie i mają objętość odpowiednio 300 mL i 100 mL (por. Rysunek 1A). Przy takiej konfiguracji wystarczające jest 500 mL ACSF do utrzymania. Komory pochodzące z źródeł komercyjnych mogą mieć inną objętość, w takim przypadku całkowitą ilość przygotowanego ACSF do utrzymania należy odpowiednio dostosować.

  1. Wlać 200 mL wody destylowanej do kolby miarowej o pojemności 500 mL.
  2. Dodać 50 mL roztworu stokowego A, 50 mL roztworu stokowego B, 6,5 mL roztworu stokowego M oraz 1 mM kwasu L-askorbinowego. Delikatnie mieszać ruchami obrotowymi do całkowitego rozpuszczenia kwasu L-askorbinowego.
  3. Dopełnić kolbę wodą destylowaną do końcowej objętości, zamknąć kolbę miarową folią uszczelniającą i delikatnie odwrócić 3–5 razy, aż roztwór stanie się jednorodny i klarowny. Skład ACSF do utrzymania tkanek znajduje się w Tabeli 2.

7. Przygotowanie stanowisk eksperymentalnych

Uwaga: Czynność ta wymaga 15 min, plus 30 min na uzyskanie stabilnej temperatury kąpieli wodnej.

  1. Stanowisko do rejestracji
    1. Uruchom łaźnię wodną, ustaw temperaturę na 32 °C i przykryj ją, aby utrzymać stałą temperaturę.
      UWAGA: Łaźnia wodna stosowana w tym protokole może być wykonana samodzielnie z twardego plastikowego pojemnika i termostatu akwariowego ustawionego na pożądaną temperaturę. Stabilna, docelowa temperatura zostaje osiągnięta w ok. 30 min, zaczynając od temperatury pokojowej. Ponieważ komory do wstępnego ogrzewania i utrzymywania znajdują się na dnie plastikowego pojemnika, poziom wody powinien być na tyle niski, aby zaledwie zakrywać termostat, co zapobiegnie wypływaniu komór na powierzchnię.
    2. Zmontuj komory do utrzymywania i wstępnego ogrzewania (por. Rysunek 1A), a następnie wlej do nich ACSF do utrzymywania. Komorę do utrzymywania pozostaw w temperaturze pokojowej, a komorę do wstępnego ogrzewania umieść w łaźni wodnej. Rozpocznij napowietrzanie roztworów mieszaniną gazową 95% O2/5% CO2 i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Przykryj komory.
  2. Stanowisko do krojenia i wibratom
    1. Przyklej mały blok agaru do środka tarczy pod próbkę, używając kleju cyjanoakrylowego.
    2. Wstaw zlewkę o pojemności 250 mL do wiaderka z lodem i wlej do niej ACSF do krojenia.
    3. Przygotuj dwie zlewki o pojemności 100 mL i wlej do każdej 50 mL ACSF do utrzymywania. Pozostaw zlewki w temperaturze pokojowej. Są to zlewki do płukania.
    4. Rozpocznij napowietrzanie roztworów mieszaniną gazową 95% O2/5% CO2 .
    5. Zamontuj tackę z buforem w wibratomie i otocz ją kruszonym lodem. Wlej nieco etanolu na kruszony lód, aby pomóc w utrzymaniu niskiej temperatury podczas procedury krojenia. Po wlaniu etanolu dodaj więcej lodu w razie potrzeby.
      UWAGA: Optymalna temperatura to 2 °C.
    6. Umieść napowietrzacz w tackce z buforem, a następnie zmontuj i zamontuj blok noża wibratomu.
      UWAGA: Upewnij się, że nóż jest zamontowany pod kątem prześwitu ok. 10°.
    7. Wypełnij zlewkę o pojemności 500 mL kruszonym lodem do 2/3 objętości i dolej wody destylowanej.
    8. Wyjmij mrożoną miseczkę z zamrażarki, ustaw ją dnem do góry na stanowisku do krojenia i przykryj ręcznikiem papierowym oraz dyskiem z papieru filtrowanego.
  3. Stanowisko do znieczulenia
    1. Umieść małą miseczkę w tacy wypełnionej lodem i wlej do niej ACSF do krojenia. Rozpocznij napowietrzanie mieszaniną gazową 95% O2/5% CO2 .

8. Przygotowanie i utrzymanie skrawków mózgu

Uwaga: W niniejszym protokole wykorzystano dorosłe (4–6 tygodniowe) samce myszy CD1, jednak można zastosować inne szczepy (np. c57/bl617,18). W dalszej części porównujemy wyniki eksperymentalne uzyskane zykorzystując skrawki mózgu myszy z wynikami uzyskanymi ze skrawków mózgu samców szczurów Sprague-Dawley w tym samym wieku. Poniższe kroki odnoszą się do przygotowania częściowo odłączonych skrawków mózgu, w których szybka aktywność typu interictal napędzana przez obszar CA3 jest ograniczona do właściwego hipokampa i nie może rozprzestrzeniać się do kory parahipokampalnej, zgodnie z opisem w23. Odłączenie hipokampa od kory jest warunkiem koniecznym do przeprowadzenia badań nad modulacją elektryczną z wykorzystaniem preparatu skrawka mózgu hipokamp-EC. Wspomniany w tekście wibrotom to model wymieniony w tabeli materiałów. Inne modele mogą wymagać odmiennej procedury.

  1. Zanurz gryzonia w narkozie, stosując isofluran 5% w mieszaninie gazowej carbogen podawanej do komory indukcyjnej z prędkością 2 L/min.
  2. Przy głębokiej narkozie (brak odruchów w odpowiedzi na uciskanie stóp i łap), wyjmij mózg w ciągu 1 min zgodnie ze standardowymi procedurami opisanymi w23. Umieść mózg w małej miseczce zawierającej zrównoważony, lodowaty ACSF do cięcia i schładzaj przez 90 - 120 s.
    UWAGA: Nie schładzaj mózgu zbyt długo, w przeciwnym razie może on zamarznąć.
  3. Wlej lodowaty ACSF do cięcia do kuwety z buforem. Rozprowadź ACSF do cięcia na papierze filtracyjnym umieszczonym na zamrożonej miseczce. Połóż mózg na papierze filtracyjnym i wyizoluj wymagany blok tkanki mózgowej, usuwając móżdżek i odcinając prosto biegun czołowy.
  4. Za pomocą wygiętej szpatułki przyklej grzbietową stronę mózgu do dysku do preparatów, tak aby odcięta strona czołowa była skierowana w stronę bloku agaru, a biegun potyliczny w stronę ostrza wibratomu. Użyj cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego. Natychmiast umieść dysk do preparatów w kuwecie z buforem i zabezpiecz go.
  5. Ustaw zakres cięcia tak, aby ostrze wibratomu przesuwało się przez całą tkankę aż do bloku agaru. Dostosuj wysokość dysku do preparatów, aby poziom bloku tkanki mózgowej pokrywał się z poziomem ostrza.
  6. Odrzucaj przekroje tkanki, aż hipokamp stanie się wyraźnie widoczny (zazwyczaj ~ 900 µm). Następnie ustaw grubość plastra na 400 µm i rozpocznij cięcie w celu zachowania przekrojów tkanki. Dla każdego przekroju mózgu rozdziel dwie półkule i odetnij zbędną tkankę, aby uzyskać dwa plastry mózgu. Ponieważ kuweta z buforem jest podnoszona podczas kolejnych przekrojów, wypełnij gniazdo kuwety lodową wodą destylowaną (patrz krok 7.2.7).
  7. Używając odwróconej pipety Pasteura, delikatnie przenieś plastry mózgu do pierwszego zlewka płuczącego, opróżnij pipetę Pasteura, a następnie przenieś plastry mózgu do drugiego zlewka płuczącego. Następnie przenieś plastry mózgu do komory holdingowej i pozostaw je do regeneracji na co najmniej 60 min.
    UWAGA: Zazwyczaj możliwe jest uzyskanie łącznie 6 - 8 plastrów mózgu. W tym miejscu protokół można przerwać.

9. Przygotowanie ACSF zawierającego 4-AP (4AP-ACSF)

Uwaga: Przygotowanie zajmuje 10 min, plus 20 min na ogrzewanie. OSTRZEŻENIE! 4-AP jest lekiem wywołującym drgawki i jest toksyczny. Należy go obsługiwać w rękawiczkach i unikać rozlania.

  1. Wlej 200 mL wody destylowanej do kolby miarowej o pojemności 500 mL.
  2. Dodaj 50 mL roztworu stokowego A, 50 mL roztworu stokowego B, 5 mL roztworu stokowego M oraz 1 mM kwasu L-askorbiniowego. Delikatnie mieszaj ruchami obrotowymi, aż kwas L-askorbiniowy całkowicie się rozpuści.
  3. Dodaj 500 µL roztworu stokowego 4AP.
  4. Dopełnij kolbę wodą destylowaną do końcowej objętości, szczelnie zamknij ją folią uszczelniającą i delikatnie odwróć 3 - 5 razy, aż roztwór stanie się jednorodny i klarowny.
  5. Zmontuj komorę inkubacyjną 4AP (patrz Rysunek 1A>) i wlej do niej ~80 mL 4AP-ACSF. Przykryj komorę, przenieś ją do łaźni wodnej i rozpocznij napowietrzanie mieszaniną gazów 95% O2/5% CO2 . Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Pozostaw przykryte.
  6. Odczekaj, aż temperatura 4AP-ACSF osiągnie 30 - 32 °C (~20 min).
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać, jeśli skrawki mózgu wciąż przechodzą proces rekonwalescencji.

10. Podgrzewanie wstępne i inkubacja skrawków w 4AP (Czas trwania: 90 min)

  1. Upewnij się, że temperatura wstępnie podgrzewanego ACSF oraz 4AP-ACSF wynosi 30 - 32 °C.
  2. Używając odwróconej szklanej pipety Pasteura, przenieś 1 plaster mózgu do komory wstępnego podgrzewania i pozostaw tkankę na 25 - 30 min. Następnie przenieś plaster mózgu do komory inkubacyjnej z 4AP-ACSF i pozostaw go na 60 min.

11. Przygotowanie układu MEA

Uwaga: Rozpocząć 15 min przed nagrywaniem.

  1. Przenieś pozostałą objętość 4AP-ACSF do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 mL.
  2. Umieść kolbę Erlenmeyera na półce nad wzmacniaczem MEA i użyj drenów, aby roztwór mógł w sposób ciągły zasilać strzykawkę 60 mL. Dostosuj wysokość kolby Erlenmeyera oraz strzykawki, aby uzyskać natężenie przepływu grawitacyjnego na poziomie 1 mL/min.
    Uwaga: Prawidłowa wysokość zależy od średnicy wewnętrznej (ID) drenów. Dla drenów o ID 5/32 cala wystarczająca jest wysokość 30 cm.
  3. Rozpocznij napowietrzanie 4AP-ACSF w kolbie Erlenmeyera oraz w strzykawce mieszaniną gazów 95% O2/5% CO2 .
  4. Pozwól, aby 4AP-ACSF przepływał przez dreny perfuzyjne do zlewki, aż wewnątrz nie będzie powietrza; następnie zatrzymaj przepływ roztworu.
  5. Podłącz element grzejny w podstawie MEA do termostatu. Umieść suchy chip MEA we wzmacniaczu MEA i zabezpiecz głowicę wzmacniacza. Użyj plastikowej pipety Pasteura, aby przenieść 4AP-ACSF do wlotu i zewnętrznego zbiornika komory rejestracyjnej.
  6. Przymocuj kaniulę grzejną do uchwytu magnetycznego i umieść jej końcówkę w porcie wlotowym komory rejestracyjnej; przymocuj uchwyt magnetyczny do paska magnetycznego na głowicy wzmacniacza MEA; podłącz dreny perfuzyjne do kaniuli; podłącz kaniulę do termostatu.
    UWAGA: Kaniula grzejna powinna być osłonięta ściętym drenem z politetrafluoroetylenu (PTFE), aby dotrzeć do portu wlotowego komory rejestracyjnej i zminimalizować szumy wynikające z metalowego materiału kaniuli. Gdy zbiornik wlotowy jest odpowiednio wypełniony 4AP-ACSF, krople spadające z systemu perfuzyjnego nie powinny być widoczne.
  7. Umieść igłę ssącą w zbiorniku i sprawdź obecność podciśnienia, zanurzając igłę ssącą w ACSF; sprawdź, czy słyszalny jest stały szum ssania o niskiej częstotliwości.
    Uwaga: Igła ssąca powinna być rozmieszczona tak, aby 4AP-ACSF przepływał tuż nad powierzchnią skrawka mózgu. Można zastosować linię próżniową lub niskoszumową pompę próżniową.
  8. Ustaw regulator przepływu, aby uzyskać natężenie przepływu 1 mL/min, i rozpocznij perfuzję.
    UWAGA: Perfuzyjność grawitacyjna eliminuje szumy, które mogłyby być generowane przez pompy perystaltyczne; jeśli preferowane są pompy perystaltyczne, konieczne jest stosowanie modeli niskoszumowych.
  9. Gdy 4AP-ACSF zacznie przepływać przez kaniulę, włącz termostat. Ustaw temperaturę kaniuli grzejnej na 37 °C, a podstawy MEA na 32 °C, aby uzyskać temperaturę 32 - 34 °C wewnątrz komory rejestracyjnej.
    UWAGA: OSTRZEŻENIE! Nigdy nie nagrzewaj kaniuli bez zawartego w niej roztworu, ponieważ może ona ulec nieodwracalnemu uszkodzeniu. Ustaw temperaturę kaniuli wyższą niż temperatura rejestracji (t.j. 32 - 34 °C), aby uwzględnić wewnętrzne przesunięcie temperatury między wartością ustawioną a rzeczywistą wartością na końcówce kaniuli grzejnej oraz wewnątrz komory rejestracyjnej. Natężenie przepływu, temperatura otoczenia i objętość komory rejestracyjnej wpływają na temperaturę roztworu rejestracyjnego. Ustawienia opisane w kroku 11.9 są zoptymalizowane dla opisanego protokołu i sprzętu. Zawsze sprawdzaj rzeczywistą temperaturę rejestracji za pomocą termopary i dostosuj ustawienia w razie potrzeby. Nie nagrzewaj podstawy MEA powyżej 34 °C, aby uniknąć przegrzania skrawka mózgu.
  10. Umieść zewnętrzną elektrodę referencyjną w zbiorniku wlotowym komory rejestracyjnej.
    UWAGA: Chociaż chipy MEA są wyposażone w wewnętrzną elektrodę referencyjną, jest ona zasłonięta przez specjalistyczną komorę rejestracyjną. W związku z tym należy użyć zewnętrznej elektrody referencyjnej. Najbardziej praktyczny jest nasycony pelet KCl, ponieważ jest on gotowy do użycia bez konieczności chlorowania.

12. Mapowanie na żywo za pomocą MEA

  1. Po ustabilizowaniu poziomu 4AP-ACSF i temperatury rejestracji do pożądanych wartości, przekręć kurki perfuzji i ssania do pozycji zamkniętej, aby tymczasowo je zatrzymać.
    1. Szybko przenieś jeden skrawek mózgu do komory rejestracyjnej MEA za pomocą odwróconej szklanej pipety Pasteura. Dostosuj jego położenie na obszarze rejestracyjnym MEA w razie potrzeby, używając wypalonej i zagiętej pipety Pasteura (Rysunek 1C) lub miękkiego, małego pędzelka. Umieść kotwicę przytrzymującą (Rysunek 1D) na skrawku mózgu. Wznów perfuzję i ssanie, przekręcając ich kurki z powrotem do pozycji otwartej.
      UWAGA: KRYTYCZNE! Przeniesienie skrawka i wznowienie perfuzji musi nastąpić w ciągu 60 s, w przeciwnym razie tkanka może obumrzeć. Kotwicę przytrzymującą skrawki należy przechowywać w 4AP-ACSF, aby zapobiec przesuwaniu się skrawka mózgu podczas umieszczania kotwicy, co może być spowodowane różnicami w napięciu powierzchniowym. Kotwica do mocowania skrawka mózgu na MEA może być wykonana na zamówienie z drutu ze stali nierdzewnej i nici nylonowej (Rysunek 1D) lub zakupiona z komercyjnych źródeł. Rysunek 1E przedstawia końcową konfigurację eksperymentalną z chipem MEA podłączonym do głowicy wzmacniacza: skrawek mózgu spoczywający na chipie MEA wewnątrz komory rejestracyjnej jest przytrzymywany przez specjalną kotwicę. Elektroda odniesienia (czerwone koło) oraz rurka PTFE pokrywająca kaniulę grzewczą (czerwona strzałka) znajdują się w zbiorniku wlotowym, natomiast igła ssąca (niebieska strzałka) znajduje się w zbiorniku wylotowym.
  2. Wykonaj zdjęcie skrawka mózgu za pomocą kamery zamontowanej na stole mikroskopu odwróconego.
  3. Uruchom skrypt mapMEA w oprogramowaniu komputerowym, aby uruchomić interfejs GUI do mapowania elektrod.
    UWAGA: Specjalistyczne oprogramowanie pozwala użytkownikowi wybrać elektrody odpowiadające konkretnym strukturom skrawka mózgu. Ten krok jest kluczowy dla aktywacji właściwej ścieżki i tłumienia aktywności ictalnej za pomocą stymulacji elektrycznej.

Umiejscowienie elektrod w skrawku mózgu; schemat, konfiguracja oprogramowania, metoda mapowania neuronalnego, wybór elektrod.
Rys. 2: Interfejs GUI do mapowania elektrod MEA w czasie rzeczywistym. (A) Schematyczne przedstawienie połączonego skrawka hipokampa i kory entorynalnej (EC) umieszczonego na MEA. Domyślne struktury wykorzystane w tym protokole to cornu ammonis 3 (CA3), kora entorynalna (EC), kora perirhinalna (PC) oraz subiculum (SUB). Elektroda odniesienia przedstawiona jest w formie markera trójkąta. Elektrody otoczone liniami przerywanymi reprezentują współrzędne XY służące do prostowania obrazu. (B) Zrzut ekranu interfejsu GUI podczas mapowania MEA w czasie rzeczywistym. Schemat blokowy po lewej stronie zrzutu wskazuje procedurę krok po kroku, którą należy wykonać. Aby wyświetlić ten rysunek w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

  1. Kliknij przycisk Browse, aby wczytać obraz przekroju mózgu. Upewnij się, że elektroda referencyjna znajduje się w górnym rzędzie lewej połowy MEA (Rycina 2A, oznaczenie trójkątem). Kliknij przycisk Activate Pointer, a następnie zaznacz górną i dolną elektrodę w skrajnie lewym rzędzie macierzy, aby wyznaczyć współrzędne XY służące do prostowania obrazu i mapowania elektrod.
  2. Z menu rozwijanego slice type wybierz opcję Horizontal. Zaznacz pole wyboru Default structures.
    UWAGA: Można dostosować struktury, wybierając przycisk Enter New Structures. Domyślne struktury dla poziomego przekroju mózgu przedstawiono na Rycini 2A.
  3. Używając ponumerowanych przycisków pod obrazem przekroju mózgu, wybierz elektrody odpowiadające ROI, a następnie kliknij odpowiedni przycisk w panelu struktur, aby je przypisać (Rycina 2B); powtórz ten krok dla każdego ROI.
  4. Naciśnij przycisk Save: oprogramowanie wygeneruje folder z wynikami o nazwie #EXP_LabelledElectrodes zawierający tabelę z zestawieniem wybranych elektrod i ROI.

13. Rejestracja i elektryczna modulacja aktywności epileptiformnej

  1. Pozostawć skrawek mózgu w komorze rejestracyjnej na 5 - 10 min w celu stabilizacji przed rozpoczęciem rejestracji.
  2. Włącz jednostkę stymulującą co najmniej 10 min przed rozpoczęciem protokołu stymulacji, aby umożliwić samokalibrację i stabilizację. Uruchom oprogramowanie do sterowania stymulacją i zweryfikuj, czy stymulator oraz wzmacniacz MEA są prawidłowo połączone, co powinno być sygnalizowane zieloną diodą LED w głównym panelu oprogramowania. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcjach obsługi konkretnych urządzeń i oprogramowania, por. Tabela materiałów.
  3. Skonfiguruj stymulację w układzie bipolarnym. Spośród elektrod zmapowanych za pomocą skryptu mapMEA (por. sekcja 12), wybierz pary elektrod znajdujących się w kontakcie z warstwą komórek piramidalnych obszaru CA1/proksymalnego subiculum (por.24,25). Użyj przewodu, aby połączyć jedną z wybranych elektrod z ujemnym złączem stymulatora, a drugą elektrodę z dodatnim złączem tego samego kanału stymulatora. Użyj innego przewodu, aby połączyć masę stymulatora z masą wzmacniacza.
  4. Uruchom oprogramowanie do rejestracji. Aby rozpocząć akwizycję danych, naciśnij przycisk PLAY w głównym panelu oprogramowania. Zarejestruj co najmniej 4 wyładowania iktalne.
    UWAGA: Częstotliwość próbkowania 2 kHz pozwala na akwizycję potencjałów polowych z odpowiednią rozdzielczością przy jednoczesnym minimalizowaniu zajętości miejsca na dysku twardym. Plik z 5-minutową rejestracją zajmuje ~80 MB. Wyższe częstotliwości próbkowania mogą być wymagane, np. w celu rejestracji artefaktów stymulacji lub aktywności wielojednostkowej. Aby obserwować wyłącznie potencjały polowe, zastosuj aktywny filtr dolnoprzepustowy o częstotliwości 300 Hz w celu odcięcia aktywności wielojednostkowej.
  5. Określ natężenie stymulacji.
    1. W oprogramowaniu do sterowania stymulacją, korzystając z głównego panelu, zaprogramuj kwadratowy, dwufazowy impuls prądowy (dodatni-ujemny) o czasie trwania 100 µs/faza.
      UWAGA: OSTROŻNIE! Stymulacja prądem stałym wymaga zrównoważonego impulsu ładunku, aby uniknąć uszkodzenia sprzętu.
    2. Przeprowadź szybki test wejścia/wyjścia (I/O), aby zidentyfikować optymalne natężenie stymulacji. Podawaj impuls stymulujący zaprogramowany w kroku 13.5.1 z częstotliwością 0,2 Hz lub niższą, dodając odstęp międzyimpulsowy wynoszący 5 s lub więcej w odpowiedniej formie oprogramowania do sterowania stymulacją. W karcie pulse amplitude wprowadź początkową amplitudę impulsu 100 µA/faza i zwiększaj ją w krokach 50 - 100 µA w każdej próbie, aż stymulacja będzie mogła niezawodnie wywoływać zdarzenia typu interiktalnego w korze parahipokampalnej (sprawdź sygnały wizualizowane przez oprogramowanie do rejestracji).
  6. Elektryczna modulacja limbicznej iktogenezy
  7. Zaprogramuj jednostkę stymulującą tak, aby realizowała wybrany protokół stymulacji. Użyj amplitudy stymulacji określonej podczas testu I/O.
    UWAGA: Wskaźnik niepowodzeń w wywoływaniu odpowiedzi powinien wynosić ≤20%.
  8. Po zakończeniu stymulacji zweryfikuj powrót sieci do stanu sprzed stymulacji, rejestrując co najmniej 4 wyładowania iktalne (analogicznie do kroku 13.4).

Wyniki

Planarne MEA z układem 6 x 10 i odstępami między elektrodami wynoszącymi 500 µm są optymalnym urządzeniem rejestrującym dla opisanego tutaj protokołu eksperymentalnego, ponieważ obszar rejestracji obejmuje cały przekrój mózgu (Rycina 3A, patrz również17). Choć MEA perforowane (pMEA) byłyby preferowane w celu poprawy natlenienia tkanki, ich obszar rejestracji jest zbyt mały (średnica ~2 mm). Uniemożliwia to jednoczesną wizualizację sygnałów elektrycznych generowanych przez hipokamp oraz korę parahipokampalną (dane nie pokazano; patrz18).

Zaobserwowany wzorzec epileptiformny wywołany przez 4AP (Rycina 3A) wiernie odtwarza to, co zazwyczaj obserwuje się w tym in vitro model wykorzystujący konwencjonalną rejestrację potencjałów polowych, obejmujący trzy rodzaje aktywności7,26: (i) zdarzenia przypominające napady (Rycina 3B, groty strzałek) są wytrzymałe i trwałe (>20 s, zakres: 20–60 s) zdarzenia przypominające cechy elektrograficzne aktywności drgawkowej z komponentami tonicznymi i klonicznymi (Rycina 3C); są one generowane w korze parahipokampalnej co 3–5 min i ponownie wnikają do formacji hipokampa poprzez zakręt zębaty (Rycina 3D, strzałka); (ii) powolne wyładowania przypominające okresy międzydrgawkowe (Rysunek 3B, ślad EC, czarny pasek; powiększenie w Rycina 3E) są krótkie (<1 s) zdarzenia populacyjne generowane pomiędzy zdarzeniami iktalnymi powszechnie w preparacie skrawka mózgu obejmującego hipokamp i korę entorynalną (EC) i występują w wolnym tempie (zakres 10–30 s); (iii) szybkiwyładowania typu interictalnego (Rycina 3B, ślad CA3, czarny pasek; powiększenie w Rycina 3E) są powtarzającymi się krótkimi (<1 s) zdarzenia populacyjne generowane przez podpole CA3 hipokampa; gdy kolaterale Schaffera są zachowane, szybkie interiktalne zdarzenia napędzane przez CA3 propagują wzdłuż pętli hipokampa i wywierają efekt antyiktogenny24 (dane nie zostały przedstawione); aby zapobiec zanikowi aktywności napadowej, na potrzeby opisanego protokołu, wyjście CA3 zostaje przerwane (por. Rysunek 3B, E). Należy zauważyć, że szybka aktywność interictalna indukowana przez obszar CA3, zarejestrowana za pomocą MEA, występuje z mniejszą częstotliwością (~ 0,4 Hz) niż ta obserwowana podczas konwencjonalnej rejestracji potencjałów polowych z użyciem pipet szklanych. (~ 1 Hz, zakres: 0,5–2,0 Hz, dane nie pokazano).

Skuteczność elektrycznej neuromodulacji w skrawkach mózgu gryzoni zależy od aktywacji specyficznych szlaków neuronalnych27 oraz od wewnątrzpochodnej łączności pomiędzy obszarami wchodzącymi w skład preparatu24. Przebadaliśmy skrawki pobrane od dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley oraz myszy CD1 i stwierdziliśmy, że skrawki mózgu myszy, a nie szczura, oferują najlepszy kompromis pomiędzy rozmiarem, grubością a wewnątrzpochodną łącznością. Po pierwsze, dzięki mniejszemu rozmiarowi, lepiej dopasowują się one do niewielkiego obszaru rejestracji komercyjnie dostępnych MEA (Ryc. 4A, lewo: szczur, prawo: mysz); po drugie, wykazują większą odporność na niekorzystne warunki właściwe dla rejestracji MEA (por. Wstęp): choć wyładowania typu ictalnego generowane przez obie tkanki (Ryc. 4B) mają podobny czas trwania (Ryc. 4C lewo), częstotliwość ich występowania jest znacznie krótsza w skrawkach mózgu myszy (n = 10 skrawków dla każdego gatunku; dwustronny nieparzysty test t, p < 0,001; Ryc. 4C prawo). To ostatnie pozwala na przyspieszenie protokołów eksperymentalnych, umożliwiając przetestowanie większej liczby skrawków mózgu w ciągu jednego dnia eksperymentalnego: dla tego zestawu reprezentatywnych wyników mogliśmy przebadać podobną liczbę skrawków mózgu obu gatunków (szczur: n = 58; mysz: n = 52), jednak liczba myszy (n = 18) była dwukrotnie mniejsza niż liczba szczurów (n = 42).

Ponadto skrawki mózgu myszy wydają się charakteryzować gęstszymi połączeniami, przez co są bardziej podatne na lepszą odpowiedź na długotrwałą elektryczną neuromodulację (Rysunek 4D). Zatem w tym modelu ictogenezy in vitro możliwość zastosowania stymulacji elektrycznej nakierowanej na kontrolę aktywności napadowej jest znacznie większa w przypadku tkanki mózgowej myszy niż szczura. Aspekt ten odzwierciedla również znacznie wyższy odsetek sukcesu eksperymentów stymulacyjnych przeprowadzonych na skrawkach mózgu myszy w porównaniu ze skrawkami mózgu szczura, nawet przy zastosowaniu kilku protokołów stymulacji długotrwałej (Rysunek 4E). W rzeczywistości tkanka mózgowa myszy wydaje się lepiej znosić długotrwałą stymulację elektryczną, co sugeruje wyższy wskaźnik przeżywalności w badanym ramach czasowych eksperymentu wynoszących 4 h (Rysunek 4F). W związku z tym mniejszy rozmiar wraz z lepszym zachowaniem wewnętrznej łączności sprawiają, że skrawki mózgu myszy są najlepszym kandydatem do rejestracji MEA mającej na celu badanie oddziaływań w sieci hipokampalno-parahipokampalnej oraz ocenę protokołów neuromodulacji elektrycznej istotnych dla TLE.

Wiadomo, że okresowe stymulowanie (pacing) dostarczane do obszaru CA1/subiculum kontroluje iktogenezę układu limbicznego w preparacie skrawka hipokampa-Kory Entorynalnej (EC) traktowanego 4AP24,25,27, przy czym najskuteczniejszą częstotliwością jest 1 Hz27. W związku z tym metoda ta jest również przydatna jako kontrola pozytywna do oceny skuteczności i wydajności innych strategii neuromodulacji (patrz na przykład25). Jak wspomniano powyżej, impulsy elektryczne dostarczane bezpośrednio przez MEA (t.j. bez konieczności stosowania zewnętrznej elektrody stymulującej) mogą wywoływać odpowiedzi populacyjne w tkance mózgowej gryzoni (patrz również28). Odpowiednie zachowanie łączności sieci neuronowej wewnątrz skrawka mózgu, precyzyjne rozmieszczenie skrawka mózgu na MEA oraz właściwy dobór par elektrod stymulujących pozwalają na prowadzenie eksperymentów z neuromodulacją elektryczną, która skutecznie kontroluje iktogenezę. Jak pokazano na Rysunku 5A, możliwe jest odtworzenie kanonicznego protokołu okresowego stymulowania 1 Hz przy użyciu planarnych MEA zarówno jako urządzenia rejestrującego, jak i stymulującego, z dodatkową korzyścią w postaci możliwości wizualizacji efektu stymulacji elektrycznej w całym przekroju tkanki mózgowej dzięki większej liczbie równomiernie rozmieszczonych punktów obserwacyjnych w porównaniu do konwencjonalnego zapisu potencjałów polowych. Rysunek 5B przedstawia ilościową analizę wyników uzyskanych dla n = 9 skrawków mózgu, wskazując na istotną redukcję całkowitego czasu napadów (całkowity czas trwania aktywności iktalnej/czas obserwacji25) podczas stymulacji (jednoczynnikowa ANOVA, F(df): 6.84(2), p <0.01, test post hoc Fisher's LSD, chroniony). Wyniki są zgodne z literaturą dotyczącą zewnętrznych elektrod stymulujących24,25.

Aby obliczyć całkowity czas napadów, czas obserwacji zależy od odstępu między zdarzeniami ictalnymi, co jednocześnie określa minimalny czas trwania protokołu stymulacji niezbędny do wiarygodnej oceny efektów neuromodulacji. Ustaliliśmy, że zarejestrowanie co najmniej 4 wyładowań ictalnych (a tym samym co najmniej 3 odstępów między zdarzeniami ictalnymi) stanowi optymalny kompromis między liczbą zebranych próbek a wymaganym czasem pomiaru. W warunkach kontrolnych (i.e., brak stymulacji) czas obserwacji to opóźnienie między początkiem pierwszego zmierzonego zdarzenia ictalnego a zakończeniem ostatniego. Podczas neuromodulacji czas obserwacji jest równy czasowi trwania protokołu stymulacji, ponieważ celem pomiaru jest ilościowe określenie zjawisk występujących przez cały czas wprowadzania zaburzenia do systemu. Obliczanie i porównywanie całkowitego czasu napadów, zamiast czasu trwania i odstępów między zdarzeniami ictalnymi, jest najodpowiedniejszym parametrem pozwalającym uniknąć błędu typu II. W rzeczywistości, obok całkowitego stłumienia aktywności ictalnej, możliwe jest, że podczas stymulacji elektrycznej wystąpi tylko jedno zdarzenie ictalne, w przeciwieństwie do kilku zdarzeń obserwowanych w warunkach kontrolnych. W takim przypadku, podczas gdy pomiar odstępu między zdarzeniami jest niemożliwy, pomiar czasu trwania zdarzenia ictalnego jako estymatora skuteczności stymulacji nie oddaje rzeczywistego rezultatu neuromodulacji (i.e., redukcji aktywności ictalnej).

Podsumowując, przedstawione tutaj wyniki wskazują, że skrawki mózgu myszy sprzężone z MEA są wartościowymi narzędziami w badaniach nad epilepsją oraz w przeprowadzaniu wiarygodnych badań nad neuromodulacją, które mają istotne znaczenie dla rozwoju metody DBS w leczeniu epilepsji. Ponadto opisany tutaj protokół poprawia żywotność skrawków mózgu i pozwala na prowadzenie sesji eksperymentalnych przez kilka godzin (Rysunek 6), co może być wymagane na przykład w celu porównania efektów różnych paradygmatów stymulacji elektrycznej.

Analiza danych neurofizjologicznych; rejestracja siatką elektrod; sygnały elektrofizjologiczne; wykresy napięcia.
Rysunek 3Typowy wzorzec epileptiformny indukowany 4AP, zwizualizowany za pomocą płaskich macierzy mikroelektrod (MEA). (A) Przekrój mózgu myszy umieszczony na płaskiej matrycy MEA 6 x 10 (odstępy między elektrodami: 500 µm) oraz zestawienie obok siebie wzorca epileptiformnego indukowanego przez 4AP, zwizualizowanego za pomocą rejestracji MEA. Każdy kwadrat w siatce odpowiada aktywności zarejestrowanej w odpowiednim miejscu w skrawku mózgu. Dla większej przejrzystości zaznaczono rzędy elektrod niebieskimi przerywanymi liniami. Numer elektrody rejestrującej jest podany na niebiesko w lewym górnym rogu każdego kwadratu. Szary kwadrat z krzyżykiem oznacza elektrodę odniesienia. (B) Reprezentatywne fragmenty zapisów wzorców z EC i CA3 zwizualizowane w szybszej skali czasowej. Groty strzałek wskazują zdarzenia iktalne. Na zapisie z EC można dostrzec występowanie wolnych wyładowania międynapadowe (czarny pasek), podczas gdy podpole CA3 generuje typowy, utrwalony szybki wzorzec międynapadowy (czarny pasek). (C) Powiększony zapis wyładowania w trakcie napadu, wykazujący typowy wzorzec toniczno-kloniczny. (DSzybka wizualizacja przejścia z fazy przeddrgawkowej do drgawkowej, odpowiadająca segmentom śladów z EC (czerwony) i CA3 (czarny) zaznaczonym czerwonym paskiem w (B). Strzałka wskazuje moment rozpoczęcia wyładowania drgawkowego. Nałożone na siebie ślady podkreślają, że zdarzenie drgawkowe rozpoczyna się w EC, a następnie rozprzestrzenia się do podpola CA3.E) Powiększony widok okresów interiktalnych, zaznaczonych czarnymi paskami w (B), podkreśla brak korelacji między wolnymi oraz szybkie wzorce interiktalne generowane odpowiednio przez korę entorynalną (czerwony) i obszar CA3 (czarny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza zapisów neuronalnych; elektrody w skrawkach mózgu; wykresy porównujące wskaźniki napadów u myszy i szczura.
Rycina 4: Skrawki mózgu myszy oferują wyższą wydajność eksperymentalną niż skrawki mózgu szczura. (A) Skrawki mózgu szczura (lewo) i myszy (prawo) w tym samym wieku. Skrawek mózgu szczura jest znacznie większy niż obszar rejestracji MEA, przez co jego aktywność elektryczna nie może zostać w pełni zwizualizowana. (B) Bezpośrednie porównanie wizualne nawracającej aktywności ictalnej generowanej przez korę entorynalną (EC) myszy i szczura. (C) Skrawki mózgu myszy i szczura generują wyładowania ictalne o podobnym czasie trwania, jednak odstęp między tymi zdarzeniami w tkance mózgowej szczura jest prawie 2-krotnie dłuższy. * p <0.05. (D) W porównaniu do szczurów, myszy oferują 2-krotnie wyższą wydajność skrawków mózgu nadających się do eksperymentów ze stymulacją elektryczną nakierowanych na kontrolowanie iktogenezy. Stymulacja elektryczna subiculum wywołała odpowiedzi populacyjne w korach parahipokampalnych tylko w 20 z 58 (34%) skrawków mózgu szczura, w przeciwieństwie do 33 z 52 (63%) skrawków mózgu myszy (Chi2: 9.22; p = 0.002). * p <0.05. (E) Wśród skrawków nadających się do badań, wskaźnik sukcesu w kontrolowaniu aktywności ictalnej jest 2-krotnie wyższy w przypadku skrawków mózgu myszy w porównaniu do szczura (mysz: 20 z 33 skrawków mózgu, 60%; szczur: 6 z 20 skrawków mózgu, 30%; Chi2: 4.67; p = 0.03). * p <0.05. (F) Skrawki mózgu myszy mogą wytrzymać powtarzające się, przedłużone okresy ciągłej stymulacji elektrycznej (obszary zacienione na szaro). Po zaprzestaniu stymulacji, tkanka mózgowa myszy wykazuje pełny powrót wzorca epileptiformnego, podczas gdy żywotność tkanki mózgowej szczura gwałtownie spada po 3 h. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.

Dane elektrofizjologiczne wykazujące stany iktalne; wykres słupkowy porównujący EC i PC w różnych warunkach.
Rysunek 5: Reprezentatywny eksperyment dotyczący elektrycznej modulacji iktogenezy z wykorzystaniem skrawków mózgu sprzężonych z MEA. (A) Rejestracje aktywności iktalnej indukowanej 4AP w EC i PC w warunkach kontrolnych (brak stymulacji), podczas periodycznego stymulowania (PP) z częstotliwością 1 Hz (artefakt stymulacji został ucięty) oraz podczas regeneracji po wycofaniu stymulacji. (B) Ilościowe określenie wpływu PP przy 1 Hz na całkowity czas napadów. * p <0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza sygnału elektrofizjologicznego, serie czasowe EC i PC, porównanie kształtów fal, wykres, dane z 3 godzin.
Rysunek 6: Reprezentatywny długoterminowy zapis aktywności ictalnej indukowanej 4AP. (A) Segmenty zapisów zarejestrowane 8 h po procedurze krojenia mózgu i po 2 h aplikacji 4AP. (B) Powiększone segmenty zapisów odpowiadające zaznaczonym ramkami wyładowaniom ictalnym oznaczonym literami a, b i c na panelu (A) pokazują spójność generowanej aktywności ictalnej w całym przedłużonym oknie obserwacyjnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Roztwór zapasowy AChemicznyMasa cząsteczkowaStężenie (mM)
NaCl58.441150
Rozpuszczalnik: woda destylowanaKCl74.5520
Koncentrat: 10x KH2PO4136.112.5
Temperatura przechowywania: 4 °CCaCl22*2 H2O147.0220
Maksymalny czas przechowywania: 1 tydz.D-glukoza180.2250
uwaga: filtrować przez membranowy filtr o średnicy 50 mm
Roztwór zapasowy BChemicznyMasa cząsteczkowaStężenie (mM)
NaHCO3384.01260
Rozpuszczalnik: woda destylowana
Koncentrat: 10x 
Temperatura przechowywania: 4 °C
Maksymalny czas przechowywania: 1 tyg.
uwaga: przefiltrować przy użyciu membrany filtracyjnej o średnicy 50 mm
Roztwór zapasowy CChemicznyMasa cząsteczkowaStężenie (mM)
KCl74.5520
Rozpuszczalnik: woda destylowanaKH2PO4136.112.5
Koncentrat: 10x MgCl₂2*6 H2O203.350
Temperatura przechowywania: 4 °CMgSO₄4*6 H2O246.4720
Maksymalny czas przechowywania: 2 tyg.CaCl₂2*2 H2O147.025
uwaga: przefiltrować przez membranę filtracyjną o średnicy 50 mm
Roztwór zapasowy MChemicznyMasa cząsteczkowaStężenie (mM)
MgSO₄4*6 H2O246.47100
Rozpuszczalnik: woda destylowana
Koncentrat: 100x
Temperatura przechowywania: 4 °C
Maksymalny czas przechowywania: 4 tyg.
roztwór zapasowy 4APChemicznyMasa cząsteczkowaStężenie (mM)
4-aminopirydyna94.11250
Rozpuszczalnik: woda destylowana
Koncentrat: 1000x
Temperatura przechowywania: 4 °C
Maksymalny czas przechowywania: 2 tyg.
uwaga: mieszać w wstrząsarku wirówkowym (vortex) przez 2–3 min lub mieszać magnetycznie przez 30–60 min
Uwaga: OSTROŻNIE! 4-AP jest toksyczny i wywołuje drgawki. Należy stosować rękawice oraz unikać rozprzestrzeniania i rozlewania substancji.

Tabela 1: Roztwory stokowe.

Utrzymywanie w ACSFREJESTRACJA w ACSFWYCINANIE W ACSF
ChemicznyC [mM]ChemicznyC [mM]ChemicznyC [mM]
NaCl115NaCl115Sacharoza208
KCl2KCl2KCl2
KH2PO41.25KH2PO41.25KH2PO41.25
MgSO₄41.3MgSO441MgCl225
CaCl222CaCl222MgSO₄42
D-glukoza25D-glukoza25CaCl220.5
NaHCO₃326NaHCO₃326D-glukoza10
Kwas L-askorbinowy1Kwas L-askorbinowy1NaHCO₃326
Kwas L-askorbinowy1
pH7.4pH7.4Kwas pirogronowy3
Osmolalność300 mOsm/kgOsmolalność300 mOsm/kg
pH7.4
Osmolalność300 mOsm/kg

Tabela 2: Skład roztworów.

Rozwiązywanie problemów
WYDANIEŚRODKI PRZECIWDZIAŁANIA
Wyładowania napadowe mają charakter „skupiony”Zmniejszyć szybkość perfuzji i/lub zmniejszyć objętość ACSF nad skrawkiem mózgu poprzez regulację położenia igły ssącej. 
Brak aktywności napadowej(1) Należy zweryfikować, czy indukowane przez obszar CA3 szybkie zdarzenia interiktalne nie rozprzestrzeniają się do kory. W razie potrzeby należy użyć małego ostrza skalpela (np. nr 10) lub igły, aby przeciąć kolaterale Schaffera, zachowując przy tym ostrożność, by nie przeciąć nylonowych nici kotwicy stabilizującej skrawek. Do tego zadania najlepiej nadają się mikroskopy stereoskopowe lub biologiczne (pionowe), podczas gdy mikroskop odwrócony znacznie utrudnia wykonanie tej czynności.
(2) Sprawdź żywotność skrawka: czy silna stymulacja elektryczna może wywołać aktywność iktalną? Odczekaj do około 2 h aplikacji 4AP, a następnie wymień skrawki mózgu, jeśli aktywność iktalna nie wystąpi.
Przekrój mózgu przemieszcza się podczas umieszczania kotwicy stabilizującej(1) Ostrożnie usuń uchwyt do plastra i ponownie ustaw plaster mózgu.
(2) Upewnij się, że uchwyt do przekrojów jest równomiernie zwilżony roztworem 4AP-ACSF.
(3) Usuń 4AP-ACSF z komory rejestracyjnej, aby ułatwić przyleganie skrawka mózgu do MEA.
(4) Zmień położenie uchwytu mocującego przekrój.
Przezniesiony plasterek mózgu unosi się na chipie MEA(1) Ostrożnie odessać nadmiar ACSF za pomocą pipety Pasteura.
(2) Konieczne może być ponowne pokrycie chipa MEA.
Stymulacja elektryczna nie wywołuje odpowiedzi sieciowychZwiększyć intensywność bodźca, zmienić pary elektrod.
Stymulacja elektryczna może wywołać odpowiedzi populacyjne w proksymalnych, ale nie w dystalnych obszarach kory mózgowej Problem wynika prawdopodobnie ze słabej łączności lub zbyt niskiej intensywności bodźca. Stymulacja elektryczna może być nieskuteczna lub skuteczna tylko w niektórych obszarach kory. Zaleca się wymianę skrawka mózgu.
Sygnał jest zaszumiony(1) Należy sprawdzić elektrodę odniesienia: niestabilna linia bazowa może być czasami spowodowana niepełnym napełnieniem zbiornika wlotowego, w wyniku czego elektroda odniesienia nie jest całkowicie zanurzona w ACSF.
(2) Sprawdzić ogólne uziemienie urządzeń.
(3) Dostosuj położenie igły ssącej tak, aby słyszeć stały, cichy dźwięk zasysania. Osadź igłę ssącą w podłożu.
(4) Oczyścić zewnętrzne styki MEA etanolem za pomocą patyczka higienicznego.
(5) Chip MEA może być uszkodzony: należy wymienić chip MEA oraz sprawdzić obecność artefaktów i stosunek sygnału do szumu.

Tabela 3: Rozwiązywanie problemów.

Dyskusja

MEA są nieocenionym narzędziem do badań neurofizjologicznych i osiągnęły dojrzałość w ostatnich latach dzięki dziesięcioleciom badań i rozwoju. W porównaniu z konwencjonalnym rejestrowaniem potencjału pola, MEA oferują ogromną zaletę w postaci większej liczby punktów obserwacyjnych i znanej odległości między elektrodami, które mają kluczowe znaczenie dla dokładnego określenia interakcji sieci neuronalnych.

Technikę rejestracji MEA można również połączyć z innymi podejściami elektrofizjologicznymi, takimi jak zapis patch-clamp15, w celu zbadania związku między aktywnością pojedynczego neuronu a aktywnością sieci neuronalnej. Co więcej, możliwość jednoczesnej wizualizacji potencjałów pola i aktywności wielu jednostek może dostarczyć cennych informacji na temat korelacji między aktywnością małych zespołów neuronalnych a zbiorowymi sieciami neuronalnymi. Połączenie z barwnikami wrażliwymi na napięcie, obrazowaniem wapnia i optogenetyką29 pozwala na wnioskowanie o zjawiskach neurofizjologicznych przy użyciu podejść wielościennych. Oprócz badań farmakologicznych, możliwość wykonywania zarówno rejestracji, jak i stymulacji za pomocą tego samego systemu sprawia, że technika rejestracji MEA jest bardzo potężna i wszechstronna: na przykład możliwe jest badanie zjawisk plastyczności synaptycznej u podstaw tworzenia pamięci30, przy użyciu przedstawionych tutaj protokołów neuromodulacji, które są istotne dla DBS w leczeniu padaczki i wielu różnych zaburzeń mózgu. Niedawny dowód na to, że technika rejestracji MEA może być z powodzeniem zastosowana do ludzkiej tkanki mózgowej z padaczką16, pokazuje jej nieocenioną przydatność w badaniach nad padaczką, zarówno w celu zrozumienia podstawowych mechanizmów leżących u podstaw tej wyniszczającej choroby, jak i dostrojenia algorytmów DBS w celu jej złagodzenia.

Jednak MEA wymuszają przeprowadzanie eksperymentów elektrofizjologicznych w warunkach "granicznych" dla wycinków mózgu, ze względu na wymóg zanurzonej komory rejestracyjnej i konieczność pozostawienia wycinka mózgu na stałym podłożu, na którym zintegrowane są mikroelektrody. W związku z tym tkanka mózgowa może nie otrzymać odpowiedniego dopływu tlenu, co z kolei może wpłynąć na jakość nagrań.

Opisany tutaj protokół pozwala na wiarygodne rejestrowanie i badanie iktogenezy w sieciach limbicznych gryzoni sprzężonych z MEA przy użyciu modelu ostrej 4AP in vitro oraz na prowadzenie długotrwałych epok stymulacji elektrycznej, które dostarczają istotnych informacji do oceny polityki DBS.

Wcześniejsze badania nad elektryczną neuromodulacją padaczkowych sieci limbicznych oparte na wykorzystaniu konwencjonalnego zapisu potencjału pola wykorzystywały wycinki mózgu myszy lub szczura z podobnymi wynikami24,25; Jednak wykorzystanie tkanki mózgowej szczura okazało się trudniejsze, ze względu na słabsze połączenie w porównaniu z tkanką mózgową uzyskaną od myszy7. Jeśli chodzi o technikę MEA, wycinki mózgu myszy najlepiej nadają się ze względu na ich mniejszy rozmiar. Co więcej, biorąc pod uwagę wyższy wskaźnik występowania wyładowań podobnych do ictal w tkance mózgowej myszy w porównaniu ze szczurami, możliwe jest przetestowanie znacznie większej liczby wycinków mózgu w ciągu jednego dnia eksperymentalnego, co z kolei sprawia, że gromadzenie danych jest szybsze i bardziej wydajne, a także może zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:

Wyładowania ictal zarejestrowane przy użyciu opisanej tutaj komory niestandardowej wydają się być podobne pod względem czasu trwania i szybkości występowania do tych obserwowanych przy użyciu konwencjonalnej komory pierścieniowej MEA i tego samego typu MEA (mikroelektrody płaskie, por. 17). Należy jednak podkreślić, że grubość wycinka mózgu musi być znacznie zmniejszona przy użyciu konwencjonalnej okrągłej komory rejestracyjnej wraz z niską szybkością perfuzji (1 ml / min), co może utrudnić pomyślne przeprowadzenie eksperymentów neuromodulacyjnych ze względu na słabą łączność.

W tym protokole niestandardowa komora nagraniowa o małej objętości, inspirowana konstrukcją komory zapisu z zaciskiem krosowym, zapewnia stabilny i niezawodny przepływ laminarny, który ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego dążenia do nagrań MEA; Pozwala również na zwiększenie grubości wycinka mózgu do 400 μm w celu osiągnięcia sprawiedliwego kompromisu między żywotnością tkanki a wewnętrzną łącznością. Rzeczywiście uznaje się, że przepływ laminarny roztworu rejestrującego w komorze jest wysoce pożądany dla elektrofizjologii wycinków mózgu, ponieważ nie mają na niego wpływu gradienty temperatury, tlenu i pH, które obserwuje się w okrągłych komorach rejestrujących o przepływie kołowym 19,20,31 (takich jak te dostarczane z komercyjnie dostępnym MEA). Takie gradienty wprowadzają błąd eksperymentalny i są również szkodliwe dla wycinka mózgu. Komory rejestracyjne o stosunkowo małej objętości (~1,5 ml) wraz z dużą szybkością perfuzji (5 - 6 ml/min)16,31 pozwalają na odpowiednią wymianę medium perfuzyjnego (≥3 razy/min). Niestandardową komorę można łatwo uzyskać ze źródeł komercyjnych w przystępnej cenie lub wyprodukować we własnym zakresie przy użyciu technologii druku 3D. Inne badania wykazały zapisy MEA z wycinków ludzkiego mózgu o grubości 400 μm16 przy użyciu konwencjonalnej komory pierścieniowej MEA, przy jednoczesnym utrzymaniu objętości ACSF na poziomie 1 ml i egzekwowaniu wysokiej szybkości perfuzji (5 - 6 ml / min) za pomocą pompy perystaltycznej o niskim poziomie hałasu. Autorzy zastosowali jednak inny model iktogenezy, tj. niski poziomMg2+, na który prawdopodobnie w mniejszym stopniu niż na model 4AP wpływają mechanizmy ehaptyczne polegające na znacznym wzroście zewnątrzkomórkowego stężenia K+ 11,22. Odkryliśmy, że wysoka szybkość perfuzji nie jest pożądana w modelu 4AP, prawdopodobnie ze względu na szybkie wypłukiwanie nagromadzonego zewnątrzkomórkowego K+, który może wymagać znacznego zwiększenia w zapisie ACSF16. W rzeczywistości zdarzenia ictal wydawały się bardziej "fragmentaryczne", gdy prędkość perfuzji ASCF została zwiększona do 2 - 3 ml / min, a wycinek mózgu był zanurzony w grubej warstwie ACSF, podczas gdy pełnoobjawowe wyładowania wykazujące silne składniki toniczno-kloniczne można było przywrócić po powrocie do niższej szybkości perfuzji (1 ml / min) i cieńszej warstwy ACSF na poziomie powierzchni tkanki (dane nie pokazane). Niestandardowa komora rejestracyjna opisana w tym protokole pozwala na wymianę medium perfuzyjnego 3 - 5 razy/min przy natężeniu przepływu 1 mL/min. W ten sposób ogólny dopływ tlenu do wycinków mózgu jest znacznie poprawiony nawet przy stosunkowo niskich szybkościach perfuzji, gwarantując jednocześnie stabilną temperaturę nagrywania i wysoki stosunek sygnału do szumu. Co najważniejsze, możliwe jest utrzymanie zewnątrzkomórkowego stężenia K+ na poziomie wartości fizjologicznej.

Model iktogenezy 4AP nie wymaga żadnych znaczących modyfikacji składu jonowego ACSF, takich jak obniżenie Mg2 + lub zwiększenie K + i oferuje unikalną zaletę utrzymania nienaruszonych zarówno transmisji pobudzających, jak i hamujących12, aspekt, który jest bardzo istotny w badaniach nad padaczką w świetle kluczowej roli zarówno sieci glutaminergicznej, jak i GABA-ergicznej w synchronizacji padaczkowej (por. 7). 4AP-ACSF zastosowany w tym protokole zawiera fizjologiczne stężenie K+ (3,25 mM) i nieco niższe stężenieMg2+ niż ACSF trzymający (1 mM w porównaniu z 1,3 mM). Stężenie to nadal mieści się w podanych wartościach fizjologicznych stężeniaMg2+ w płynie mózgowo-rdzeniowym gryzoni i jest stosowane w wielu laboratoriach (patrz na przykład17,18). Dla celów opisanego protokołu stwierdziliśmy, że ten niewielki spadek jest preferowany jako pomoc w efekcie 4AP.

W poprzednich pracach 4AP został zastosowany do wycinka mózgu, gdy był on już umieszczony w komorze zapisu17,18. O ile eksperymentator nie musi obserwować opóźnienia czasowego między aplikacją 4AP a wystąpieniem wzorców padaczkowych, stwierdzamy, że takie podejście jest raczej czasochłonne i nie nadaje się do kontynuowania przedłużonych sesji nagrywania i stymulacji opisanych w tym protokole. Wstępna inkubacja wycinków mózgu w 4AP w temperaturze 32 °C pozwala zaoszczędzić dużo czasu doświadczalnego, ponieważ wycinki mózgu mogą być wstępnie traktowane szeregowo, podczas gdy eksperyment jest kontynuowany przy użyciu innych skrawków tkanki.

Przedłużona żywotność wycinków mózgu może być przydatna do analizy funkcji sieci w dłuższej perspektywie. Co więcej, ich zwiększona odporność na powtarzającą się stymulację elektryczną jest bardzo korzystna, jeśli eksperymentator chce porównać kilka protokołów stymulacji, które muszą być wykonane w tym samym wycinku mózgu, aby uzyskać statystyczną solidność. W naszych rękach, przy testowaniu 3 protokołów stymulacji, z których każdy poprzedzony jest fazą kontrolną, a następnie fazą regeneracji, eksperyment może trwać 3 - 5 godzin. W tym kontekście, mapowanie MEA na żywo ma kluczowe znaczenie dla aktywacji prawidłowego szlaku i tłumienia, a nie faworyzowania iktogenezy poprzez stymulację elektryczną. Nasz przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika stanowi szybkie, proste i elastyczne narzędzie do mapowania elektrod różnych struktur mózgu. W przeciwieństwie do oprogramowania komercyjnego, możliwe jest dodawanie niestandardowych układów MEA nawet przy podstawowych umiejętnościach programowania. Obrazy można uzyskiwać w jasnym polu; Tak więc odpowiednia jest każda kamera ogólnego przeznaczenia, która ma dobrą rozdzielczość i mieści się w mikroskopie. Mikroskop odwrócony jest niezbędny do wizualizacji położenia mikroelektrod względem wycinka mózgu, ponieważ byłyby one ukryte pod tkanką, gdyby używano mikroskopu pionowego. Jednak mikroskop stereoskopowy jest zalecany jako dodatek do typu odwróconego, jeśli eksperymentator musi wykonać cięcia nożem, aby zakłócić określone ścieżki neuronalne.

Wreszcie, kolejną zaletą proponowanego podejścia jest tani i stosunkowo łatwy montaż większości wymaganych narzędzi, takich jak niestandardowa komora nagrywająca i komory przytrzymujące, ciepła kąpiel i kotwica warstwowa, a także niepotrzebne stosowanie kosztownej pompy perystaltycznej o niskim poziomie hałasu.

Ograniczenia techniki:

Zapis MEA nie pozwala na wizualizację bardzo wolnych fal, czyli przesunięć DC w sygnale. Takie odchylenia linii bazowej mogą pomóc w asymptotycznym pomiarze czasu trwania wyładowania i, co najważniejsze, mają fundamentalne znaczenie dla badania depresji rozprzestrzeniającej się w korze mózgowej (zjawisko, które odnosi się do nagłej nieoczekiwanej śmierci w padaczce32 i jest wspólne dla padaczki i migreny33).

Jeśli chodzi o neuromodulację elektryczną, opisany tutaj protokół pozwala na wykonanie kilku sesji stymulacji bez wpływu na żywotność wycinków mózgu. Z powodzeniem mogliśmy wykonać do 3 sesji stymulacji po 20 - 45 minut, podobnie jak w poprzedniej pracy25. Chociaż wycinki mózgu mogą prawdopodobnie wytrzymać większą liczbę sesji stymulacji lub dłuższe protokoły stymulacji, nie testowaliśmy wycinków mózgu pod tym względem. Zalecamy ograniczenie liczby protokołów stymulacji do 3 i unikanie długotrwałych (≥60 min) sesji stymulacji, które mogą znacznie obciążyć tkankę mózgową utrzymywaną w tych warunkach granicznych, aż do braku regeneracji po odstawieniu bodźca.

Kluczowe kroki w ramach protokołu:

Kilka krytycznych czynników może utrudniać skuteczne dążenie do rejestrowania i modulowania aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu sprzężonych z MEA. Oprócz użytych gatunków gryzoni i jakości wycinków mózgu, szybkości perfuzji podczas nagrywania i dynamiki przepływu ACSF (tj. laminarnego kontra kołowego) w komorze rejestrującej, stwierdziliśmy, że najbardziej krytycznymi krokami są warunki regeneracji i długoterminowego utrzymania wycinków mózgu, a także tryb aplikacji 4AP.

Podczas korzystania z zanurzonej komory przetrzymywania ważne jest, aby przechowywać plastry mózgu w temperaturze pokojowej, aby zachować aktywność sieci tkanki mózgowej i sprzyjać indukcji wyładowań podobnych do ictalu przez aplikację 4AP. W naszych rękach regeneracja i konserwacja w temperaturze 32 °C pogorszyła stan tkanki mózgowej w ciągu 3 - 4 godzin od krojenia.

Inkubacja wycinków mózgu w 4AP-ACSF w temperaturze pokojowej i rejestrowanie w temperaturze 32 °C nie jest jednak pożądane. Stwierdziliśmy wiele trudności w zaobserwowaniu silnych nawracających wyładowań w tym stanie. Rzeczywiście, doniesiono, że niskie temperatury w zakresie 20–24 °C tłumią lub nawet zapobiegają iktogenezie indukowanej przez 4AP zarówno in vitro34 , jak i in vivo35. W związku z tym temperatury inkubacji i rejestracji 4AP muszą mieścić się w zakresie 30 - 34 °C i muszą być dopasowane. Aby uniknąć narażenia tkanki mózgowej na zbyt duży stres z powodu jednoczesnego wywołania nadpobudliwości przez 4AP i nagłego wystawienia wycinków mózgu z temperatury pokojowej na ciepły (32 °C) 4AP-ACSF, ważne jest, aby wykonać pośredni etap wstępnego ogrzewania i pozwolić plasterkom mózgu przyzwyczaić się do ACSF w temperaturze 32 °C przez 20 - 30 minut. Pominięcie tego kroku może wpłynąć na indukcję iktogenezy przez 4AP.

Kolejnym aspektem, o którym należy wspomnieć, jest znaczenie stężenia D-glukozy w ACSF po pokrojeniu. Stężenie 25 mM zachowuje wycinki mózgu lepiej niż stężenie 10 mM stosowane w wielu laboratoriach, a także poprawia tempo występowania aktywności ictal, która jest 2-krotnie szybsza (ułatwiając w ten sposób realizację długiej serii protokołów eksperymentalnych w kilku wycinkach mózgu każdego dnia).

Na koniec należy wspomnieć o kilku ważnych drobnych szczegółach podczas procedury krojenia. Po pierwsze, nie pozwól, aby nienaruszony mózg i plasterki mózgu zamarzły w cięciu na zimno ACSF. Schładzanie mózgu przez <2 minuty jest wystarczające, biorąc pod uwagę mały rozmiar mózgu myszy. Skrawki tkanek należy przenieść natychmiast z tacki buforowej do zlewek płuczkowych w temperaturze pokojowej. Płukanie cięcia ACSF jest bardzo ważne, w przeciwnym razie wysokie stężenie sacharozy spowoduje, że plastry mózgu przykleją się do nylonowej siatki komory trzymania. Aby skutecznie wypłukać tkankę, ważne jest, aby zminimalizować zawartość ACSF w pipecie transferowej, aby nie zanieczyszczać nadmiernie trzymającego ACSF. 2-stopniowe płukanie pomaga w minimalizacji zanieczyszczeń. Po zakończeniu procedury krojenia, skrawki tkanek powinny zostać natychmiast przeniesione ze zlewek do płukania do komory przetrzymywania, gdzie miękka nylonowa siatka zawieszona do połowy w pomieszczeniu ACSF umożliwia natlenienie tkanek po obu stronach. Ta sama zasada powinna być stosowana na wszystkich etapach następujących po procedurze krojenia: plastry mózgu nigdy nie powinny znajdować się na dnie zlewki, nie powinny stykać się z bokami komór do przechowywania i nigdy nie powinny stykać się ze sobą ani nachodzić na siebie.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:

Skład ACSF może być modyfikowany w zależności od potrzeb eksperymentatora. Na przykład, leki mogą być dodawane w celu zbadania udziału określonych neuroprzekaźników lub kanałów jonowych w skuteczności neuromodulacji elektrycznej. Co więcej, kwas pirogronowy i askorbinowy (por. tabela 2) można pominąć, chociaż stwierdzamy, że odgrywają one potężną rolę neuroprotekcyjne. W Tabeli 3 przedstawiamy najczęstsze problemy, które można napotkać w tym protokole oraz sposoby ich rozwiązywania.

Wnioski:

Zapis MEA jest niewątpliwie nieocenioną techniką zajmowania się interakcjami sieci neuronalnych w zdrowiu i chorobie. Oprócz badań farmakologicznych możliwa jest również ocena protokołów neuromodulacji elektrycznej, które są istotne dla DBS stosowanych w padaczce i innych zaburzeniach neurologicznych. W tym protokole wykazaliśmy, że możliwe jest odtworzenie typowych eksperymentów stymulacji okresowej z podobnymi wynikami do tych uzyskanych przy konwencjonalnym rejestrowaniu potencjału pola zewnątrzkomórkowego i zewnętrznych elektrodach stymulujących. Rosnąca dostępność komercyjnego, przyjaznego dla użytkownika sprzętu i zaawansowanych narzędzi programowych sprawia, że technika nagrywania MEA nadaje się również do eksperymentów stymulacji w pętli zamkniętej, w celu zapewnienia doraźnej stymulacji tkanki mózgowej oraz zbadania udziału mechanizmów sprzężenia zwrotnego w odpowiedziach sieci neuronowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

G.P. jest stypendystką Marie Skłodowska-Curie finansowaną przez Unię Europejską projektu MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, w ramach programu ramowego H2020. Graficzny interfejs użytkownika mapMEA jest dostępny bezpłatnie na żądanie dla autorów ilaria.colombi@iit.it.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Poli-D-lizyna Sigma-AdrichP7886Potrzebny do powlekania MEA
NaClSigma-AdrichS9888Chemiczny
KClSigma-AdrichP9541Chemiczny
KH2PO4Sigma-Adrich795488Chemical
CaCl2*2 H2OSigma-AdrichC3306Chemiczny
D-GlukozaSigma-AdrichRDD016Chemiczny
NaHCO3Sigma-AdrichS5761Chemiczny
MgCl2*6 H2OSigma-AdrichM2670Chemiczny
MgSO4*6 H2OSigma-AdrichM5921Chemiczny
SacharozaSigma-AdrichRDD023Chemiczny
kwas pirogronowy, 98% Sigma-Adrich107360Chemiczna
4-aminopirydynaSigma-AdrichA78403Lek drgawkowy
STG-2004System wielokanałowySTG4004-1,6mA4-kanałowy generator bodźców z napięciem (± 8 V) i wyjście prądowe (± 1,6 mA)
MEA1060System wielokanałowyNie dotyczywzmacniacz MEA
planarnysystem wielokanałowy60MEA500/30iR-Ti bez pierścieniaMusi być bez pierścienia, aby umożliwić korzystanie z niestandardowej komory nagrywania
Oprogramowanie do nagrywaniasystemu wielokanałowegoMcRack
STG4004 systememwielokanałowymMcStimulus II
TC02System wielokanałowyTC02Termostat 2-kanałowy
PH01System wielokanałowyPH01Ogrzewanie perfuzyjne
MPH System wielokanałowyMPH Uchwyt magnetyczny do PH01 i igły ssącej
Elastostil E43WackerE43Elastomerowy uszczelniacz stosowany do montażu niestandardowej komory zapisu na MEA
MEA CustomChamber Crisel InstrumentSKE-chamber MEANiestandardowa komora nagraniowa
Ag/AgCl elektroda, granulka, 1.0 mm Crisel Instrument64-1309Elektroda referencyjna do niestandardowej komory nagraniowej
TergazymeSigma-AdrichZ273287-1EAEnzymatyczny środek czyszczący
MATLABMathworksdo mapowania elektrod
VT1000SLeica BiosystemsVT1000SVibratome
Warner Instruments64-1309Ag-AgCl Elektroda w postaci granulki 1,0 mm (E205). Elektroda referencyjna.
MEA Oprogramowanie sterujące Środowisko programistyczne

Bibliografia

  1. Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
  2. WHO. Epilepsy Facts Sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs999/en/ (2017).
  3. Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444(2014).
  4. Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
  5. Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
  6. Dingledine, R. Brain slices. , Plenum Press. (1984).
  7. Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
  8. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
  9. Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
  10. Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
  11. Pitkanen, A. Models of seizures and epilepsy. , (2017).
  12. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
  13. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
  14. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
  15. Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71(2014).
  16. Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
  17. Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
  19. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  20. Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9(2011).
  21. MultichannelSystems. Manual PH01. , Available from: https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/PH01_Manual.pdf (2018).
  22. Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
  23. Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
  24. Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
  25. Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
  26. Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
  27. D'Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
  28. Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
  29. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701(2016).
  30. Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
  31. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925(2009).
  32. Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246(2015).
  33. MA, R., et al. Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies . Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A., et al. , 4th, National Center for Biotechnology Information (US). Bethesda (MD). (2012).
  34. Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
  35. Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stymulacja elektryczna4 aminopirydynaywotno tkanekmapowanie elektrodszybko perfuzjistosunek sygna u do szumurejestracja elektrofizjologiczna
Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.