Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Podsumowanie

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Streszczenie

Padaczka skroniowa (TLE) jest najczęstszym częściowym złożonym zespołem padaczkowym i najmniej reagującym na leki. Głęboka stymulacja mózgu (DBS) jest obiecującym podejściem, gdy leczenie farmakologiczne zawodzi lub neurochirurgia nie jest zalecana. Ostre wycinki mózgu sprzężone z układami mikroelektrod (MEA) stanowią cenne narzędzie do badania interakcji sieci neuronalnych i ich modulacji przez stymulację elektryczną. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami zapisu zewnątrzkomórkowego zapewniają one dodatkowe zalety w postaci większej liczby punktów obserwacyjnych i znanej odległości między elektrodami, co pozwala na badanie ścieżki propagacji i prędkości sygnałów elektrofizjologicznych. Jednak natlenienie tkanek może być znacznie upośledzone podczas rejestracji MEA, co wymaga wysokiej szybkości perfuzji, co odbywa się kosztem zmniejszonego stosunku sygnału do szumu i wyższych oscylacji temperatury eksperymentalnej. Stymulacja elektryczna dodatkowo obciąża tkankę mózgową, utrudniając dążenie do długotrwałych epok nagrywania/stymulacji. Co więcej, elektryczna modulacja aktywności wycinka mózgu musi być ukierunkowana na określone struktury/ścieżki w obrębie wycinka mózgu, co wymaga, aby mapowanie elektrod było łatwe i szybkie wykonywane na żywo podczas eksperymentu. Tutaj pokazujemy, jak przeprowadzić rejestrację i modulację elektryczną aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę (4AP) w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą płaskich MEA. Pokazujemy, że tkanka mózgowa uzyskana od myszy przewyższa tkankę mózgową szczura i dlatego lepiej nadaje się do eksperymentów MEA. Protokół ten gwarantuje wygenerowanie i utrzymanie stabilnego wzorca padaczkowego, który wiernie odtwarza cechy elektrofizjologiczne obserwowane przy konwencjonalnym rejestrowaniu potencjału pola, utrzymuje się przez kilka godzin i trwa dłużej niż trwała stymulacja elektryczna przez dłuższe epoki. Żywotność tkanek przez cały czas trwania eksperymentu osiąga się dzięki zastosowaniu niestandardowej komory rejestracyjnej o małej objętości, pozwalającej na przepływ laminarny i szybką wymianę roztworu nawet przy niskich (1 ml/min) szybkościach perfuzji. Szybkie mapowanie MEA w celu monitorowania w czasie rzeczywistym i wyboru elektrod stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika (GUI).

Wprowadzenie

Epilepsja jest zagrażającym życiu postępującym zaburzeniem powodującym niekontrolowaną aktywność mózgu¹; jest jednym z największych obciążeń chorobowych i znaczącym stygmatyzacją społeczną^2,3. TLE jest najczęstszym zespołem (40%) i najczęściej (~ 30%) opornym na leki przeciwpadaczkowe⁴. Podczas gdy chirurgiczna ablacja tkanki padaczkowej może poprawić stan pacjenta, nie jest ona możliwa do wykonania u wszystkich pacjentów i może nie gwarantować całkowitego życia wolnego od napadów⁵. Modulacja padaczkowych sieci limbicznych za pomocą elektrycznego DBS jest obiecującym podejściem, gdy leczenie farmakologiczne lub neurochirurgia nie są odpowiednie.

Wycinki mózgu gryzoni są cennym narzędziem do badania, jak sieci neuronowe funkcjonują w zdrowiu i chorobie⁶ za pomocą technik elektrofizjologii in vitro, ponieważ zachowują, przynajmniej częściowo, oryginalną architekturę i łączność obszaru mózgu (ROI). W szczególności poziome połączone warstwy hipokampa i kory śródwęchowej (hipokamp-EC) obejmują podstawowe sieci neuronalne zaangażowane w TLE i dlatego są rutynowo wykorzystywane w badaniach TLE in vitro⁷.

Aktywność podobna do napadu może być ostro wywołana w wycinkach mózgu poprzez zmianę składu jonowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF), np. zmniejszenie zawartości magnezu przy jednoczesnym zwiększeniu potasu^8,9,10, lub za pomocą manipulacji farmakologicznych, takich jak blokowanie hamującej aktywności GABAergiczne (patrz¹¹ w celu uzyskania kompleksowej recenzji). Jednak modele te opierają się na niezrównoważonej zmianie wzbudzenia i hamowania; W związku z tym nie pozwalają na badanie interakcji i skoordynowanego udziału sieci pobudzających i hamujących w iktogenezie. Ciągła perfuzja wycinków mózgu za pomocą leku kondrgawkowego 4AP wzmacnia zarówno pobudzające, jak i hamujące neuroprzekaźnictwo, umożliwiając w ten sposób badanie ostrej iktogenezy przy jednoczesnym utrzymaniu ogólnej aktywności synaptycznej w stanie nienaruszonym¹².

MEA pozwalają na rejestrowanie aktywności elektrycznej generowanej przez sieci neuronowe z większej liczby punktów obserwacyjnych w porównaniu do konwencjonalnego rejestrowania potencjału pola zewnątrzkomórkowego, gdzie ograniczenia przestrzenne ograniczają liczbę elektrod, które mogą być umieszczone na powierzchni wycinka mózgu. Co więcej, chipy MEA oferują dodatkową zaletę w postaci znanej odległości między elektrodami, co jest bardzo przydatne do śledzenia propagacji i oceny prędkości przemieszczania się zarejestrowanych sygnałów. Chociaż początkowo stworzono je do rejestracji z hodowanych neuronów^13,14, MEA są obecnie używane również do charakteryzowania cech elektrofizjologicznych ostrych wycinków mózgu uzyskanych od gryzoni¹⁵ i ludzie¹⁶. Tak więc, w kontekście badań nad padaczką, MEA stanowią cenne narzędzie do określania interakcji sieci neuronalnych w centrum ictogenezy^16,17,18.

Jednakże, zapis MEA z natury niesie ze sobą techniczne wyzwania w uzyskaniu lub utrzymaniu stabilnego wzorca padaczkowego przez długie (kilka godzin) protokoły eksperymentalne. Po pierwsze, natlenienie tkanek może nie być wystarczające w dużej i okrągłej komorze zapisu typu zanurzonego^19,20 typowe dla dostępnych na rynku MEA, podczas gdy słaby stosunek sygnału do szumu i niestabilność temperatury mogą wpływać na jakość zapisu, gdy stosuje się wysoką szybkość perfuzji (6 - 10 ml / min) w celu poprawy dopływu tlenu do wycinka mózgu (patrz na przykład uwagi techniczne dotyczące urządzeń grzewczych i perfuzyjnych²¹). Po drugie, powtarzające się wyładowania o wysokiej częstotliwości, takie jak wyładowania padaczkowe, są prawie nieobserwowane podczas korzystania z zanurzonych komór nagraniowych¹⁹; Dzieje się tak szczególnie w przypadku, gdy ostry wzór padaczkowy jest indukowany chemicznie i obejmuje mechanizmy efaztyczne, jak ma to miejsce w przypadku modelu 4AP²² (zobacz¹¹ dla kompleksowego przeglądu). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, naukowcy zaproponowali kilka strategii. Na przykład, zwiększenie współczynnika perfuzji^19,20 przy jednoczesnym zmniejszeniu grubości warstwy mózgu (≤300 μM) i obszaru^17,18 są kluczowymi czynnikami do osiągnięcia odpowiedniego dopływu tlenu do tkanki. Ponadto, poprawa żywotności wycinków mózgu może być również osiągnięta poprzez zastosowanie perforowanych MEA (pMEA), które umożliwiają perfuzję tkanki mózgowej z obu stron¹⁸.

Podczas gdy opisane podejścia znacznie poprawiły wykonalność zapisu MEA z wycinków mózgu, nie zostały one przetestowane przeciwko długotrwałym (kilka godzin) sesjom nagrywania i stymulacji elektrycznej, które stanowią znaczne obciążenie dla tkanki mózgowej. Przedłużone sesje nagraniowe mogą być wymagane do zbadania ewolucji w czasie specyficznych cech wzorców padaczkowych, które nie byłyby możliwe do zdemaskowania za pomocą krótkoterminowych pomiarów. W kontekście badań DBS mogą być wymagane przedłużone protokoły eksperymentalne w celu oceny i porównania efektów kilku paradygmatów stymulacji w tym samym wycinku mózgu.

Gdy tylko spontaniczna aktywność elektryczna musi być rejestrowana, mapowanie elektrod w odniesieniu do ROI jest zwykle wykonywane a posteriori, tj. podczas analizy danych; zamiast tego, badanie wywołanych reakcji lub paradygmatów elektrycznej neuromodulacji wymaga, aby stymulacja była dostarczana do określonych ROI, dyktując potrzebę szybkiego i łatwego mapowania elektrod na żywo podczas eksperymentu.

Tutaj ilustrujemy prosty protokół eksperymentalny, który pozwala na indukcję i utrzymanie stabilnego wzorca epileptiform indukowanego przez 4AP w wycinkach mózgu dorosłych gryzoni. Obserwowana aktywność wiernie odwzorowuje cechy elektrofizjologiczne tego modelu, scharakteryzowane przy użyciu konwencjonalnych technik elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej. Utrzymuje się przez kilka godzin i trwa dłużej niż długotrwała stymulacja elektryczna przez powtarzające się przedłużone epoki. Komory używane do utrzymywania i inkubacji wycinków mózgu można łatwo zmontować przy użyciu standardowych materiałów laboratoryjnych (ryc. 1A), natomiast niestandardową komorę rejestracyjną pozwalającą na optymalną szybkość wymiany roztworu i przepływ laminarny (ryc. 1B) można uzyskać ze źródeł komercyjnych lub przy użyciu technologii druku 3D w przystępnej cenie. Szybkie mapowanie ROI w celu monitorowania w czasie rzeczywistym i wyboru elektrod stymulujących jest możliwe dzięki niestandardowemu, przyjaznemu dla użytkownika graficznemu interfejsowi użytkownika o nazwie mapMEA, który jest dostępny bezpłatnie na żądanie.

Rysunek 1: Sprzęt niestandardowy używany w tym protokole. (A) Komory do odzysku, wstępnego ogrzewania i wstępnej inkubacji w 4AP są montowane za pomocą zlewki i szalki Petriego. Szalka Petriego powinna mieć mniejszą średnicę niż młot i jest utrzymywana na miejscu za pomocą tłoka strzykawki. Dno szalki Petriego jest zastąpione nylonową siatką (z miękkich pończoch) przyklejoną cyjanoakrylanem do krawędzi szalki Petriego. Tlen jest dostarczany przez zgiętą igłę rdzeniową (22 G), umieszczoną między ściankami szalki Petriego a zlewką. Bąbelki powinny wyłaniać się z boku zlewki i nigdy nie docierać do nylonowej siatki, aby uniknąć przemieszczenia plastra mózgu. Górna część szalki Petriego może być używana jako pokrywka, aby uniknąć parowania ACSF i utrzymać nasycenie tlenem. (B) Niestandardowa komora nagraniowa. W: Zbiornik wlotowy do umieszczenia kaniuli grzewczej i elektrody odniesienia. Na zewnątrz: Zbiornik wylotowy do umieszczenia igły ssącej. Rec:Komora nagraniowa. (C) Szklana pipeta Pasteura, zwinięta przez polerowanie ogniowe, używana do manipulowania tkanką i regulacji jej położenia w komorze zapisu. (D) Niestandardowa kotwica dociskowa do cięcia. (E) Montaż końcowy komory rejestracyjnej zamontowanej na chipie MEA. Plasterek mózgu spoczywa na dnie, przytrzymywany przez kotwicę. Czerwona strzałka wskazuje rurkę PTFE zakrywającą kaniulę grzewczą, podczas gdy czerwone kółko oznacza elektrodę odniesienia, nasyconą granulkę KCl zanurzoną przez ACSF w zbiorniku wlotowym. Niebieska strzałka wskazuje igłę ssącą w zbiorniku wylotowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (autoryzacja nr 860/2015-PR) zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/WE w sprawie dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie MEA/Zgromadzenia Izby Celnej

Uwaga: Rozpocznij 2 dni przed eksperymentem. Użyj MEA bez pierścienia (patrz Tabela materiałów).

1. Wyczyść MEA (czas trwania: 35 - 40 min).
   1. Rozpuść enzymatyczny środek czyszczący w proszku w ciepłej wodzie destylowanej. Nanieś ciepły roztwór czyszczący na powierzchnię MEA, a następnie zanurz MEA w ciepłym roztworze czyszczącym na co najmniej 3 godziny.
   2. Dokładnie spłucz MEA wodą destylowaną i wysusz go za pomocą niestrzępiącej się chusteczki bez zarysowań.
2. Zmontować MEA z komorą nagrywającą (czas trwania: 10 min + noc).
   1. Równomiernie rozprowadzić elastomerowy uszczelniacz na dolnej powierzchni komory nagrywania. Upewnij się, że nie ma bąbelków.
   2. Zamontuj komorę nagrywającą na MEA za pomocą pęsety i delikatnie dociśnij. Jeśli są jakieś bąbelki, delikatnie przesuwaj komorę po okręgu, delikatnie dociskając palcami, aż wszystkie bąbelki znikną. Rozprowadź warstwę uszczelniacza na całej długości wokół zewnętrznej krawędzi komory nagrywania.
      Uwaga: KRYTYCZNE! Nie zakrywaj styków MEA szczeliwem.
   3. Umieść zespół MEA/komora wewnątrz szalki Petriego o średnicy 15 cm. Umieścić szalkę Petriego o pojemności 5 ml lub zlewkę o pojemności 10 ml wypełnioną wodą destylowaną w pobliżu MEA. Przykryj wszystko, aby utrzymać wilgotne środowisko. Pozostaw do utwardzenia w temperaturze pokojowej przez noc.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
3. Posmaruj MEA, aby był hydrofilowy (czas trwania: 5 - 10 min + noc).
   1. Umieścić MEA na szalce Petriego o średnicy 15 cm. Wlać 50 μl poli-D-lizyny na obszar zapisu MEA. Zamknąć szalkę Petriego, zamknąć ją folią uszczelniającą i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Dokładnie wypłukać MEA wodą destylowaną i przechowywać MEA w temperaturze 4 °C w wodzie destylowanej.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Powlekane MEA mogą być przechowywane i ponownie wykorzystywane do wielu eksperymentów. Rutynowe czyszczenie i ponowne powlekanie MEA pomaga usunąć zanieczyszczenia tkankowe i poprawić stosunek sygnału do szumu.

2. Przygotowanie roztworów podstawowych

Uwaga: Rozpocznij 1 dzień przed eksperymentem (czas trwania: ~2 godziny). Roztwory podstawowe pomagają przyspieszyć eksperyment w dniu eksperymentu. Można je przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać. Patrz tabela 1 dla współczynnika stężenia i składu. Patrz Tabela 2 w celu zapoznania się ze składem roztworów końcowych.

1. Rozpuść chemikalia w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Przefiltrować roztwory podstawowe za pomocą butelki filtrującej (średnica filtra: 0,22 μm).
2. Przechowywać w temperaturze 4 °C (zalecany maksymalny czas przechowywania znajduje się w Tabeli 1).
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Przygotowanie agaru

Uwaga: Rozpocznij 1 dzień przed eksperymentem (czas trwania: ~1 h).

1. Wlej 250 ml wody destylowanej do zlewki o pojemności 500 ml i zacznij mieszać z prędkością 350 obr./min. Dodaj 5 g agaru i poczekaj, aż całkowicie się rozpuści.
2. Podgrzać roztwór w temperaturze 250 - 300 °C. Pozwól wodzie odparować, aż roztwór osiągnie ~ 200 ml, aby uzyskać 2,5% w/v roztworu agarowego.
   UWAGA: Temperatura powinna być na tyle wysoka, aby woda mogła odparować bez bulgotania.
3. Wlej roztwór agaru na plastikowe kwadratowe pudełko o pojemności 200 ml o ściankach o wysokości ~1,5 cm i pozwól mu ostygnąć w temperaturze pokojowej, aż stanie się twardy.
4. Przykryj pudełko i przechowuj je w temperaturze 4 °C. Blok agarowy jest dobry przez kilka tygodni.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Przygotowanie zamrożonego samolotu

Uwaga: Rozpocznij 1 dzień przed eksperymentem.

1. Napełnij płaską miskę ze stali nierdzewnej wodą destylowaną do 0,5 - 1 cm poniżej krawędzi.
2. Przechowywać przez noc w temperaturze -20 °C.

5. Przygotowanie Neuroprotekcyjnego Cięcia ACSF

Uwaga: Rozpocznij 1 dzień przed eksperymentem lub tego samego dnia eksperymentu (zobacz Tabelę 1 i Tabelę 2) (czas trwania: 30 min).

1. Wlej 200 ml wody destylowanej do zlewki o pojemności 500 ml i zacznij mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego przy 350 obr./min.
2. Dodać 50 ml bulionu B i 50 ml bulionu C (patrz Tabela 1).
3. Dodaj 3 mM kwasu pirogronowego, 208 mM sacharozy, 10 mM D-glukozy i 1 mM kwasu L-askorbinowego.
   UWAGA: Rzeczywista objętość kwasu pirogronowego zależy od gęstości i czystości i może się różnić w zależności od partii. Zawsze obliczaj wymaganą objętość podczas otwierania nowej partii.
4. Przykryj folią uszczelniającą i mieszaj przez 30 minut.
5. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 500 ml i dodać wodę destylowaną w celu napełnienia kolby.
6. Uszczelnić kolbę miarową folią uszczelniającą i delikatnie odwrócić 3 - 5 razy, aż roztwór będzie równomiernie klarowny.
7. Przenieś cięty ACSF do szklanej butelki z nakrętką.
8. Przechowuj cięty ACSF w temperaturze -80 °C przez 20 - 30 minut lub w temperaturze 4 °C przez noc, aby ostygł do 4 °C.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, jeśli preferowane jest chłodzenie przez noc. W przeciwnym razie czas potrzebny na schłodzenie cięcia ACSF może zostać wykorzystany do wykonania kroku 6.

6. Przygotowanie holdingu ACSF

Uwaga: Przygotuj roztwór na świeżo w dniu eksperymentu (czas trwania: 5 - 10 min). Trzymający ACSF będzie używany do płukania wycinków mózgu z cięcia ACSF podczas procedury krojenia (patrz krok 8.16) oraz do długotrwałego przechowywania i wstępnego podgrzewania wycinków mózgu. Aby wypłukać plastry mózgu, wystarczy 100 ml ACSF. Komory do podgrzewania i podgrzewania wstępnego użyte w tym protokole są wykonane na zamówienie i zawierają odpowiednio objętość 300 ml i 100 ml (por. Rysunek 1A). Przy tym ustawieniu wystarczy 500 ml ACSF do przechowywania. Komory pozyskane ze źródeł komercyjnych mogą zawierać różną objętość, w takim przypadku należy odpowiednio dostosować całkowitą ilość ACSF do przygotowania.

1. Wlać 200 ml wody destylowanej do kolby miarowej o pojemności 500 ml.
2. Dodaj 50 ml bulionu A, 50 ml bulionu B, 6,5 ml bulionu M i 1 ml kwasu L-askorbinowego. Delikatnie mieszać ruchami obrotowymi, aż kwas L-askorbinowy całkowicie się rozpuści.
3. Dodaj wodę destylowaną, aby osiągnąć ostateczną objętość, uszczelnij kolbę miarową folią uszczelniającą i delikatnie odwróć 3 - 5 razy, aż roztwór będzie równomiernie klarowny. Patrz Tabela 2, aby zapoznać się ze składem ACSF gospodarstwa.

7. Przygotowanie stanowisk doświadczalnych

Uwaga: Wymaga to 15 minut, plus 30 minut, aby uzyskać stałą temperaturę ciepłej kąpieli.

1. Ławka do nagrywania
   1. Rozpocznij ciepłą kąpiel, ustaw ją na 32 °C i przykryj, aby utrzymać temperaturę.
      UWAGA: Ciepła kąpiel używana w tym protokole może być wykonana na zamówienie przy użyciu twardego plastikowego pudełka i termostatu akwariowego wstępnie ustawionego na żądaną temperaturę. Stałą żądaną temperaturę można osiągnąć w ciągu ~30 minut, zaczynając od temperatury pokojowej. Ponieważ komory wstępnego podgrzewania i inkubacji znajdują się na dnie plastikowego pudełka, poziom wody powinien być wystarczający do zakrycia termostatu, aby komory nie unosiły się na wodzie.
   2. Zmontuj komorę trzymania i komory podgrzewania wstępnego (por. Rysunek 1A) i wlej do nich ACSF trzymający. Utrzymuj komorę trzymania w temperaturze pokojowej i umieść komorę wstępnego podgrzewania w ciepłej kąpieli. Rozpocznij bulgotanie roztworów mieszaniną gazów 95% O₂/5% CO₂ i usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Trzymaj się pod przykryciem.
2. Ławka do krojenia i wibratom
   1. Przyklej mały blok agaru do środka krążka próbki za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
   2. Włóż zlewkę o pojemności 250 ml do wiaderka na lód i wlej do niej pokrojony ACSF.
   3. Weź dwie zlewki o pojemności 100 ml i wlej do każdej z nich 50 ml ACSF. Pozostaw zlewki w temperaturze pokojowej. To są zlewki do płukania.
   4. Rozpocznij bulgotanie roztworów za pomocą mieszaniny gazów 95% O₂/5% CO_{2 .}
   5. Zamontuj tackę buforową na wibratomie i otocz ją pokruszonym lodem. Wlej trochę etanolu na pokruszony lód, aby pomóc w utrzymaniu niskich temperatur podczas procedury krojenia. Po nalaniu etanolu dodaj więcej lodu w razie potrzeby.
      UWAGA: Optymalna jest temperatura 2 °C.
   6. Umieść bełkotkę w tacy buforowej, a następnie zmontuj i zamontuj blok ostrzy wibratomu.
      UWAGA: Upewnij się, że ostrze jest zamontowane pod kątem prześwitu ~10°.
   7. Umieść pokruszony lód w zlewce o pojemności 500 ml do 2/3 objętości i napełnij wodą destylowaną.
   8. Wyjmij zamrożoną miskę z zamrażarki, połóż ją do góry nogami na stole do krojenia i przykryj ręcznikiem papierowym i krążkiem z bibuły filtracyjnej.
3. Ławka anestezjologiczna
   1. Umieść małą miskę w tacce wypełnionej lodem i wlej do niej pokrojony ACSF. Rozpocznij bulgotanie z mieszaniną 95% O₂/5% CO_{2 .}

8. Przygotowanie i utrzymanie wycinka mózgu

Uwaga: Ten protokół wykorzystuje dorosłe (4 - 6 tygodniowe) samce myszy CD1, ale inne szczepy (np. c57/bl6^17,18) mogą być używane. Później porównujemy również wyniki eksperymentalne uzyskane przy użyciu wycinków mózgu myszy z tymi uzyskanymi przez wycinki mózgu uzyskane od samców szczurów Sprague-Dawley w tym samym wieku. Poniższe kroki odnoszą się do przygotowania częściowo rozłączonych wycinków mózgu, w których szybka aktywność międzygrupowa napędzana przez CA3 jest ograniczona do właściwego hipokampa i nie może rozprzestrzeniać się do kory przyhipokampowej, jak opisano w ²³. Rozłączenie hipokampa i kory mózgowej jest warunkiem wstępnym do prowadzenia badań nad modulacją elektryczną przy użyciu preparatu wycinka mózgu hipokamp-EC. Zastosowany wibratomem odnosi się do modelu wymienionego w Tabeli Materiałów. Inne modele mogą wymagać innej procedury.

1. Znieczulić gryzonia za pomocą izofluranu 5% w mieszaninie gazów karbogenicznych dostarczanej do komory indukcyjnej znieczulenia z prędkością 2 l/min.
2. W głębokim znieczuleniu (brak odruchów w odpowiedzi na uszczypnięcie stopy i łapy) wyprowadź mózg w ciągu 1 minuty, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami, takimi jak w²³. Umieść mózg w małej misce zawierającej zrównoważone cięcie na zimno ACSF i pozostaw do schłodzenia na 90 - 120 s.
   UWAGA: Nie pozwól, aby mózg wychładzał się zbyt długo, w przeciwnym razie może zamarznąć.
3. Wlej lodowaty ACSF do tacki buforowej. Rozprowadź tnący ACSF na bibule filtracyjnej umieszczonej na zamrożonej misce. Umieść mózg na bibule filtracyjnej i wyizoluj wymagany blok tkanki mózgowej, usuwając móżdżek i przecinając prosty biegun czołowy.
4. Za pomocą wygiętej szpatułki przyklej grzbietową stronę mózgu do krążka próbki z przeciętą przednią stroną skierowaną w stronę bloku agarowego, a biegunem potylicznym skierowanym w stronę ostrza wibratomu. Użyj cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego. Natychmiast umieść krążek z próbką w tacy buforowej i zabezpiecz go.
5. Dostosuj zakres cięcia tak, aby przesunąć ostrze wibratomu przez całą tkankę aż do bloku agaru. Dostosuj wysokość tarczy próbki, aby osiągnąć poziom ostrza z blokiem tkanki mózgowej.
6. Wyrzuć skrawki tkanki, aż hipokamp będzie wyraźnie widoczny (zwykle ~ 900 μm). Następnie ustaw grubość plastra na 400 μm i rozpocznij krojenie, aby zachować skrawki tkanki. Dla każdej sekcji mózgu podziel dwie półkule i przytnij niepotrzebną tkankę, aby uzyskać dwa wycinki mózgu. W miarę podnoszenia tacki buforowej podczas kolejnych sekcji, należy napełnić tacę buforową lodowatą wodą destylowaną (patrz krok 7.2.7).
7. Za pomocą odwróconej pipety Pasteura delikatnie przenieść wycinki mózgu do pierwszej zlewki do płukania, opróżnić pipetę Pasteura i przenieść wycinki mózgu do drugiej zlewki do płukania. Następnie przenieś wycinki mózgu do komory przetrzymywania i pozwól im dojść do siebie przez co najmniej 60 minut.
   UWAGA: Zazwyczaj możliwe jest uzyskanie w sumie 6 - 8 plasterków mózgu. W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany.

9. Przygotowanie ACSF zawierającego 4-AP (4AP-ACSF)

Uwaga: To wymaga 10 minut na przygotowanie, plus 20 minut rozgrzewki. ostrożność! 4-AP jest lekiem drgawkowym i jest toksyczny. Trzymaj w rękawiczkach i unikaj rozlania.

1. Wlać 200 ml wody destylowanej do kolby miarowej o pojemności 500 ml.
2. Dodaj 50 ml bulionu A, 50 ml bulionu B, 5 ml bulionu M i 1 ml kwasu L-askorbinowego. Delikatnie mieszać ruchami obrotowymi, aż kwas L-askorbinowy całkowicie się rozpuści.
3. Dodaj 500 μl bulionu 4AP.
4. Dodać wodę destylowaną, aby osiągnąć ostateczną objętość, uszczelnić kolbę miarową folią uszczelniającą i delikatnie odwrócić ją 3 - 5 razy, aż roztwór będzie równomiernie klarowny.
5. Zmontuj komorę inkubacyjną 4AP (por. Rysunek 1A) i wlej do niej ~80 ml 4AP-ACSF. Przykryj komorę, przenieś ją do ciepłej łaźni i zacznij bulgotać mieszaniną gazów 95% O₂/5% CO_{2 .} Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki za pomocą odwróconej pipety Pasteura. Trzymaj się pod przykryciem.
6. Poczekaj, aż temperatura 4AP-ACSF osiągnie 30 - 32 °C (~20 min).
   UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu, jeśli wycinki mózgu nadal się regenerują.

10. Wstępne podgrzewanie i inkubacja plastrów w 4AP (Czas trwania: 90 min)

1. Sprawdź, czy temperatura ACSF i 4AP-ACSF wynosi 30 - 32 °C.
2. Użyj pipety Pasteura z odwróconym szkłem, aby przenieść 1 plasterek mózgu do komory do wstępnego podgrzewania i pozwól tkance odpocząć przez 25 - 30 minut. Następnie przenieś wycinek mózgu do komory inkubacyjnej 4AP-ACSF i pozostaw go na 60 minut.

11. Przygotowanie Konfiguracji MEA

Uwaga: Rozpocznij 15 minut przed nagraniem.

1. Przenieść pozostałą objętość 4AP-ACSF do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml.
2. Umieścić kolbę Erlenmeyera na półce nad wzmacniaczem MEA i użyć rurek, aby umożliwić ciągłe podawanie roztworu do strzykawki o pojemności 60 ml. Wyregulować wysokość kolby Erlenmeyera i strzykawki tak, aby umożliwić grawitacyjne podawanie z szybkością 1 ml/min.
   Uwaga: Prawidłowa wysokość zależy od średnicy wewnętrznej rurki (ID). W przypadku rurek o średnicy wewnętrznej 5/32 cala wystarczy 30 cm.
3. Rozpocząć bulgotanie 4AP-ACSF w kolbie Erlenmeyera i w strzykawce z mieszaniną 95% O₂/5% CO_{2 .}
4. Pozwól, aby 4AP-ACSF przepłynął przez rurkę perfuzyjną do zlewki, aż w środku nie będzie powietrza; następnie zatrzymaj przepływ roztworu.
5. Podłącz element grzejny u podstawy MEA do termostatu. Umieść suchy chip MEA wewnątrz MEA amplifier i zabezpiecz amplifier głowica. Użyj plastikowej pipety Pasteura, aby przenieść 4AP-ACSF do wlotu i zewnętrznego zbiornika komory rejestracyjnej.
6. Przymocuj kaniulę grzewczą do uchwytu magnetycznego i umieść jej końcówkę w porcie wlotowym komory nagrywania; przymocuj uchwyt magnetyczny do paska magnetycznego na głowicy wzmacniacza MEA; podłącz rurkę perfuzyjną do kaniuli; podłącz kaniulę do termostatu.
   UWAGA: Kaniula grzewcza powinna być pokryta skośnym rurkiem z politetrafluoroetylenu (PTFE), aby dotrzeć do portu wlotowego komory nagrywania i zminimalizować hałas spowodowany metalowym materiałem kaniuli. Gdy zbiornik wlotowy jest odpowiednio napełniony 4AP-ACSF, krople spadające z systemu perfuzyjnego nie powinny być widoczne.
7. Umieść igłę ssącą w zbiorniku i sprawdź, czy występuje podciśnienie, zanurzając igłę ssącą w ACSF; sprawdź, czy słychać stały hałas ssania o niskiej częstotliwości.
   Uwaga: Igła ssąca powinna być umieszczona tak, aby 4AP-ACSF mógł przepływać tuż nad powierzchnią wycinka mózgu. Można użyć linii próżniowej lub cichej pompy próżniowej.
8. Ustaw regulator przepływu tak, aby natężenie przepływu wynosiło 1 ml/min i rozpocznij perfusing.
   UWAGA: Perfuzja zasilana grawitacyjnie eliminuje hałas, który może być powodowany przez pompy perystaltyczne; Jeśli preferowane są pompy perystaltyczne, modele o niskim poziomie hałasu są obowiązkowe.
9. Gdy 4AP-ACSF przepłynie przez kaniulę, włącz termostat. Ustaw kaniulę grzewczą na 37 °C, a podstawę MEA na 32 °C, aby osiągnąć temperaturę 32 - 34 °C wewnątrz komory nagrywającej.
   UWAGA: UWAGA! Nigdy nie podgrzewaj kaniuli bez znajdującego się w niej roztworu, ponieważ może ona zostać nieodwracalnie uszkodzona. Ustaw temperaturę kaniuli wyższą niż temperatura zapisu (tj. 32 - 34 °C), aby uwzględnić przesunięcie temperatury wewnętrznej między wartością ustawioną a wartością rzeczywistą na końcówce kaniuli grzewczej i w komorze rejestrującej. Natężenie przepływu, temperatura otoczenia i objętość komory zapisu mają wpływ na temperaturę roztworu rejestrującego. Ustawienia zgłoszone w kroku 11.9 są zoptymalizowane pod kątem opisanego protokołu i sprzętu. Zawsze sprawdzaj rzeczywistą temperaturę nagrywania za pomocą termopary i dostosuj ustawienia w razie potrzeby. Nie podgrzewaj podstawy MEA powyżej 34 °C, aby uniknąć przegrzania wycinka mózgu.
10. Umieścić zewnętrzną elektrodę odniesienia w zbiorniku wlotowym komory rejestracyjnej.
    UWAGA: Chociaż chipy MEA są wyposażone w wewnętrzną elektrodę referencyjną, jest ona pokryta przez niestandardową komorę nagrywającą. W związku z tym należy użyć zewnętrznej elektrody referencyjnej. Nasycony granulat KCl jest najbardziej praktyczny, ponieważ jest gotowy do użycia bez konieczności chlorowania.

12. Mapowanie na żywo MEA

1. Gdy poziom 4AP-ACSF i temperatura nagrywania ustabilizują się zgodnie z potrzebami, przekręć kurki perfuzyjne i ssące do pozycji wyłączonej, aby tymczasowo je zatrzymać.
   1. Szybko przenieś jeden wycinek mózgu do komory zapisu MEA za pomocą pipety Pasteura z odwróconym szkłem. W razie potrzeby dostosuj jego położenie w obszarze nagrywania MEA za pomocą polerowanej na ogniowo, zwijanej pipety Pasteura (Rysunek 1C) lub miękkiej, kompaktowej małej szczoteczki. Umieść kotwicę przytrzymującą (Rysunek 1D) na wycinku mózgu. Ponownie uruchom perfuzję i ssanie, przekręcając ich kurki z powrotem do pozycji włączonej.
      UWAGA: KRYTYCZNE! Wycinek należy przenieść, a perfuzję wznowić w ciągu 60 sekund, w przeciwnym razie tkanka może umrzeć. Kotwica dociskowa plastra powinna być przechowywana w 4AP-ACSF, aby zapobiec przesuwaniu się wycinka mózgu podczas umieszczania kotwicy na wycinku mózgu z powodu różnic w napięciu powierzchniowym. Kotwica do mocowania wycinka mózgu na MEA może być wykonana na zamówienie przy użyciu drutu ze stali nierdzewnej i nici nylonowej (Rysunek 1D) lub uzyskana ze źródeł komercyjnych. Rysunek 1E pokazuje ostateczną konfigurację eksperymentalną z chipem MEA podłączonym do głowicy wzmacniacza: wycinek mózgu spoczywający na chipie MEA w komorze nagraniowej jest przytrzymywany przez niestandardową kotwicę. Elektroda referencyjna (czerwone kółko) i rurka PTFE pokrywająca kaniulę grzewczą (czerwona strzałka) są umieszczone w zbiorniku wlotowym, natomiast igła ssąca (niebieska strzałka) jest umieszczona w zbiorniku wylotowym.
2. Zrób zdjęcie wycinka mózgu za pomocą kamery zamontowanej na stoliku z odwróconym mikroskopem.
3. Uruchom skrypt mapMEA w oprogramowaniu komputerowym, aby uruchomić graficzny interfejs użytkownika w celu mapowania elektrod.
   UWAGA: Oprogramowanie wykonane na zamówienie pozwala użytkownikowi wybrać elektrody, które odpowiadają określonym strukturom wycinka mózgu. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla aktywacji prawidłowego szlaku i stłumienia aktywności ictal za pomocą stymulacji elektrycznej.

Rys. 2: GUI do mapowania elektrod MEA na żywo.(A) Schematyczne przedstawienie połączonego wycinka hipokampa-EC umieszczonego na MEA. Domyślne struktury używane w tym protokole to cornu ammonis 3 (CA3), kora enhorinalna (EC), kora okołożołądkowa (PC) i subiculum (SUB). Elektroda referencyjna jest schematycznie przedstawiona jako znacznik trójkątny. Elektrody otoczone przerywanymi liniami reprezentują współrzędne XY do prostowania obrazu. (B) Zrzut ekranu graficznego interfejsu użytkownika podczas mapowania MEA na żywo. Schemat blokowy po lewej stronie zrzutu wskazuje procedurę krok po kroku, którą należy wykonać. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Kliknij przycisk Przeglądaj, aby załadować obraz wycinka mózgu. Upewnij się, że elektroda referencyjna znajduje się w górnym rzędzie lewej połowy MEA (Rysunek 2A, znak trójkąta). Kliknij przycisk Activate Pointer (Aktywuj wskaźnik), a następnie wybierz górną i dolną elektrodę w skrajnym lewym rzędzie matrycy, aby zaznaczyć współrzędne XY do prostowania obrazu i mapowania elektrod.
5. Z menu rozwijanego typu plasterka wybierz opcję Poziomy. Zaznacz pole wyboru Struktury domyślne.
   UWAGA: Możliwe jest dostosowanie struktur poprzez wybranie przycisku Wprowadź nowe struktury. Domyślne struktury dla poziomego wycinka mózgu są przedstawione w Rysunek 2A.
6. Korzystając z ponumerowanych przycisków pod obrazem wycinka mózgu, wybierz elektrody odpowiadające ROI i kliknij odpowiedni przycisk w panelu struktur, aby je przypisać (Rysunek 2B); powtórz ten krok dla każdego ROI.
7. Naciśnij przycisk Zapisz: oprogramowanie generuje folder wyników o nazwie #EXP_LabelledElectrodes zawierający tabelę przedstawiającą wybrane elektrody i ROI.

13. Rejestracja i modulacja elektryczna aktywności padaczkowej

1. Pozwól wycinkowi mózgu ustabilizować się w komorze nagrywającej przez 5 - 10 minut przed nagraniem.
2. Włącz jednostkę bodźca co najmniej 10 minut przed protokołem stymulacji, aby umożliwić samokalibrację i stabilizację. Uruchom oprogramowanie sterujące bodźcem i sprawdź, czy stymulator i MEA amplifier są prawidłowo połączone, jak wskazuje zielona dioda LED w głównym panelu oprogramowania sterującego bodźcem. Aby uzyskać dodatkowe informacje, zapoznaj się z instrukcjami obsługi poszczególnych przyrządów i oprogramowania, por. Tabela materiałów.
3. Ustaw stymulację w konfiguracji dwubiegunowej. Wybierz pary elektrod stykające się z piramidalną warstwą komórkową CA1 / proksymalnego subiculum (por. ^24,25) spośród tych zmapowanych za pomocą skryptu mapMEA (por. sekcja 12). Użyj przewodu, aby podłączyć jedną z wybranych elektrod do ujemnej wtyczki stymulatora, a drugą elektrodę do dodatniej wtyczki tego samego kanału stymulatora. Użyj innego przewodu, aby podłączyć masę stymulatora do masy amplifier.
4. Uruchom oprogramowanie do nagrywania. Aby uzyskać dane, naciśnij przycisk PLAY w głównym panelu oprogramowania do nagrywania. Zanotować co najmniej 4 zrzuty ictal.
   UWAGA: Częstotliwość próbkowania 2 kHz pozwala na pozyskiwanie potencjałów pola z odpowiednią rozdzielczością przy jednoczesnym zminimalizowaniu zużycia miejsca na dysku twardym. 5-minutowy plik nagrania zajmuje ~80 MB. Wyższe częstotliwości próbkowania mogą być wymagane, np. w celu rejestrowania artefaktów bodźca lub aktywności wielu jednostek. Aby obserwować tylko potencjały pola, użyj filtra dolnoprzepustowego pod napięciem przy 300 Hz, aby odciąć aktywność wielu jednostek.
5. Określ intensywność bodźca.
   1. W oprogramowaniu do sterowania bodźcami użyj panelu głównego, aby zaprojektować kwadratowy dwufazowy dodatnio-ujemny impuls prądowy o czasie trwania 100 μs/fazę.
      UWAGA: UWAGA! Stymulacja prądem stałym wymaga zrównoważonego impulsu ładowania, aby uniknąć uszkodzenia sprzętu.
   2. Uruchom szybki test wejścia/wyjścia (I/O), aby określić najlepszą intensywność bodźca. Dostarczyć impuls stymulacyjny zaprojektowany w kroku 13.5.1 o częstotliwości 0,2 Hz lub niższej, dodając interwał między impulsami wynoszący 5 s lub dłuższy w odpowiedniej formie oprogramowania sterującego bodźcem. W zakładce amplituda impulsu wprowadź początkową amplitudę impulsu 100 μA/fazę i zwiększaj ją o 50 - 100 μA przy każdej próbie, aż stymulacja będzie w stanie niezawodnie wywołać zdarzenia podobne do międzynapadowych w korze przyhipokampa (sprawdź sygnały wizualizowane przez oprogramowanie rejestrujące).
6. Elektryczna modulacja iktogenezy limbicznej
7. Zaprogramuj jednostkę bodźca tak, aby dostarczała interesujący Cię protokół stymulacji. Użyj amplitudy bodźca zidentyfikowanej podczas testu I/O.
   UWAGA: Wskaźnik niepowodzeń wywołanych odpowiedzi powinien wynosić ≤20%.
8. Po ustaniu stymulacji sprawdź, czy sieć wraca do stanu sprzed bodźca, rejestrując co najmniej 4 wyładowania ictal (jak w kroku 13.4).

Wyniki

Planarne MEA o układzie 6 x 10 i odstępach między elektrodami 500 μm są idealnym urządzeniem rejestrującym dla opisanego tutaj protokołu eksperymentalnego, ponieważ ich obszar nagrywania rozciąga się na cały wycinek mózgu (Rysunek 3A, zobacz także¹⁷). Chociaż perforowane MEA (pMEA) byłyby preferowane w celu poprawy natlenienia tkanek, ich obszar zapisu jest zbyt mały (średnica ~2 mm). Nie pozwala to na jednoczesną wizualizację sygnałów elektrycznych generowanych przez hipokamp i korę przyhipokampową (dane nie pokazane; patrz¹⁸).

Obserwowany wzorzec epileptyczny wywołany przez 4AP (Rysunek 3A) wiernie odtwarza to, co jest zwykle obserwowane w tym modelu in vitro przy użyciu konwencjonalnego zapisu potencjału pola i obejmuje trzy rodzaje aktywności^7,26: (i) zdarzenia podobne do ICTAL (Rysunek 3B, groty strzałek) są solidnymi, długotrwałymi (>20 s, zakres: 20 - 60 s) zdarzeniami przypominającymi elektrograficzne cechy aktywności napadowej ze składnikami tonicznymi i klonicznymi (Rysunek 3C); są one generowane w korze przyhipokampowej co 3 - 5 minut i ponownie wchodzą do formacji hipokampa przez zakręt zębaty (Rysunek 3D, strzałka); (ii) powolne wyładowania międzynapadowe (Rysunek 3B, ślad EC, kreska; rozszerzone w Rycina 3E) są krótkimi (<1 s) zdarzeniami populacyjnymi generowanymi pomiędzy zdarzeniami ictal wszechobecnymi w preparacji hipokampa-EC wycinka mózgu i zachodzą w wolnym tempie (zakres 10 - 30 s); (iii) szybkiewyładowania międzynapadowe (Rysunek 3B, ślad CA3, pasek; rozszerzony w Rysunek 3E) to powtarzające się krótkie (<1 s) zdarzenia populacyjne generowane przez subpole hipokampa CA3; gdy zabezpieczenia Schaffera są zachowane, szybkie zdarzenia międzynapadowe sterowane przez CA3 rozprzestrzeniają się wzdłuż pętli hipokampa i wywierają efekt anty-iktogenny²⁴ (dane nie pokazane); Aby zapobiec wyczerpaniu aktywności ictal, na potrzeby opisanego protokołu, wyjście CA3 jest zakłócane (por. Rysunek 3B, E). Należy zauważyć, że szybka aktywność międzynapadowa sterowana przez CA3 zarejestrowana za pomocą MEA zachodzi w wolniejszym tempie (~ 0,4 Hz) niż to, co obserwuje się przy użyciu konwencjonalnego zapisu potencjału pola za pomocą szklanych pipet (~ 1 Hz, zakres: 0,5 - 2,0 Hz, dane nie pokazane).

Pomyślny wynik neuromodulacji elektrycznej w wycinkach mózgu gryzoni zależy od aktywacji określonych ścieżek neuronalnych²⁷ wraz z wewnętrzną łącznością między regionami zawartymi w przygotowaniu²⁴. Przetestowaliśmy plastry uzyskane od dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley i myszy CD1 i stwierdziliśmy, że wycinki mózgu myszy zamiast szczurów oferują najlepszy kompromis między rozmiarem, grubością i wewnętrzną łącznością. Po pierwsze, dzięki mniejszym rozmiarom, lepiej pasują do małego obszaru nagrywania dostępnych na rynku MEA (Rysunek 4A, po lewej: szczur, po prawej: mysz); po drugie, są bardziej odporne na niekorzystny stan, który jest nieodłącznym elementem zapisu MEA (por. Wprowadzenie): chociaż wyładowania podobne do ictal generowane przez te dwie tkanki (Rysunek 4B) mają podobny czas trwania (Rysunek 4C po lewej), ich tempo występowania jest znacznie krótsze w wycinkach mózgu myszy (n = 10 wycinków każdego gatunku; 2-ogoniasty niesparowany test t, p < 0.001; Rysunek 4C po prawej). To ostatnie pozwala na przyspieszenie protokołów eksperymentalnych, umożliwiając przetestowanie większej liczby wycinków mózgu w ciągu jednego dnia eksperymentalnego: dla tego zestawu reprezentatywnych wyników mogliśmy przetestować podobną liczbę wycinków mózgu z dwóch gatunków (szczur: n = 58; mysz: n = 52), ale liczba myszy (n = 18) była 2-krotnie mniejsza niż liczba szczurów (n = 42).

Ponadto, wycinki mózgu myszy wydają się mieć gęstsze połączenia i dlatego są bardziej skłonne do lepszego reagowania na długotrwałą neuromodulację elektryczną (Rysunek 4D). Tak więc, w tym modelu iktogenezy in vitro, żywotność stymulacji elektrycznej mającej na celu kontrolowanie aktywności ictal jest znacznie większa dla tkanki mózgowej myszy niż dla szczura. Ten aspekt znajduje również odzwierciedlenie w znacznie wyższym wskaźniku sukcesu eksperymentów stymulacyjnych przeprowadzonych przy użyciu wycinków mózgu myszy i szczura, nawet w przypadku stosowania kilku protokołów trwałej stymulacji (Rysunek 4E). W rzeczywistości tkanka mózgowa myszy wydaje się lepiej wytrzymywać długotrwałą stymulację elektryczną, co sugeruje wyższy wskaźnik przeżycia w testowanym eksperymentalnym przedziale czasowym wynoszącym 4 godziny (Rysunek 4F). Tak więc mniejszy rozmiar wraz z lepszym zachowaniem wewnętrznej łączności sprawia, że wycinki mózgu myszy są najlepszym kandydatem do wykonywania zapisu MEA mającego na celu badanie interakcji sieci hipokamp-parahipokamp i ocenę protokołów neuromodulacji elektrycznej, które są istotne dla TLE.

Okresowe stymulację dostarczaną w CA1/subiculum jest znane z kontrolowania limbicznej ictogenezy w preparacie plastrów hipokampa-EC traktowanych 4AP^24,25,27, z 1 Hz jako najbardziej efektywną częstotliwością²⁷. W związku z tym jest również przydatny jako kontrola pozytywna do oceny skuteczności i efektywności innych polityk neuromodulacji (zobacz na przykład²⁵). Jak wspomniano powyżej, impulsy elektryczne dostarczane bezpośrednio przez MEA (tj. bez potrzeby stosowania zewnętrznej elektrody stymulującej) mogą wywoływać reakcje populacji w tkance mózgowej gryzoni (zobacz także²⁸). Wystarczające zachowanie połączeń sieci neuronalnej w obrębie wycinka mózgu, dokładne ustawienie wycinka mózgu na MEA oraz odpowiedni dobór stymulujących par elektrod pozwalają na prowadzenie eksperymentów z neuromodulacją elektryczną, które skutecznie kontrolują iktogenezę. Jak pokazano w Rysunek 5A, możliwe jest odtworzenie kanonicznego protokołu okresowej stymulacji 1 Hz przy użyciu płaskich MEA zarówno jako zapisu, jak i jako urządzenia stymulującego, z dodatkową korzyścią, że efekt stymulacji elektrycznej może być wizualizowany w całym przekroju tkanki mózgowej z większą liczbą równomiernie rozmieszczonych punktów obserwacyjnych w porównaniu do konwencjonalnego zapisu potencjału pola. Rysunek 5B pokazuje kwantyfikację wyników uzyskanych dla n = 9 wycinków mózgu, co wskazuje na znaczne skrócenie całkowitego czasu chwytania (całkowity czas trwania aktywności ictal/czas obserwacji²⁵) podczas stymulacji (jednokierunkowo-ANOVA, F(df): 6.84(2), p <0.01, test post hoc LSD Fishera, chroniony). Wyniki są zgodne z literaturą dotyczącą zewnętrznych elektrod stymulujących^24,25.

Aby obliczyć całkowity czas zaboru, czas obserwacji zależy od odstępu między zdarzeniami ictal, a także określa minimalny czas trwania protokołu stymulacji wymaganego do pewnej oceny efektów neuromodulacji. Stwierdziliśmy, że zarejestrowanie co najmniej 4 zrzutów ictal (a zatem co najmniej 3 przerw między zdarzeniami ictal) jest dobrym kompromisem między pobranymi próbkami a wymaganym czasem pobrania. W warunkach kontrolnych (tj. brak stymulacji) czas obserwacji jest opóźnieniem między wystąpieniem pierwszego mierzonego zdarzenia ictal a zakończeniem ostatniego. Podczas neuromodulacji czas obserwacji jest równy czasowi trwania protokołu bodźca, ponieważ celem pomiaru jest ilościowe określenie zjawisk zachodzących w czasie, w którym perturbacja jest wprowadzana do systemu. Obliczanie i porównywanie całkowitego czasu zaboru, a nie czasu trwania i interwału zdarzeń ictal, jest najwłaściwszym parametrem pozwalającym uniknąć błędu typu II. W rzeczywistości, wraz z całkowitym zahamowaniem aktywności ictal, możliwe jest również, że tylko jedno zdarzenie ictal jest generowane podczas stymulacji elektrycznej, w przeciwieństwie do kilku zdarzeń obserwowanych w warunkach kontrolnych. W tym przypadku, podczas gdy pomiar odstępu czasu między zdarzeniami nie jest możliwy, pomiar czasu trwania ictal jako estymator skuteczności stymulacji nie reprezentuje rzeczywistego wyniku neuromodulacji (tj. zmniejszenia aktywności ictal).

Ogólnie rzecz biorąc, przedstawione tutaj wyniki wskazują, że wycinki mózgu myszy sprzężone z MEA są cennymi narzędziami do badań nad padaczką i do przeprowadzania wiarygodnych badań neuromodulacyjnych, które są istotne dla rozwoju dziedziny DBS w leczeniu padaczki. Ponadto opisany tutaj protokół poprawia żywotność wycinków mózgu i pozwala na przeprowadzanie sesji eksperymentalnych przez kilka godzin (Rysunek 6), które mogą być wymagane na przykład w celu porównania efektów różnych paradygmatów stymulacji elektrycznej.

Rysunek 3: Typowy wzór epileptiform wywołany przez 4AP wizualizowany za pomocą płaskich MEA. (A) Wycinek mózgu myszy umieszczony na płaskim 6 x 10 MEA (odstęp między elektrodami: 500 μm) i przegląd obok siebie wzorca epileptowego wywołanego przez 4AP wizualizowany za pomocą zapisu MEA. Każdy kwadrat w siatce mieści aktywność zarejestrowaną w odpowiednim miejscu w wycinku mózgu. Przerywane niebieskie linie odnoszą się do rzędów elektrod dla większej przejrzystości. Numer elektrody rejestrującej jest oznaczony kolorem niebieskim w lewym górnym rogu każdego kwadratu. Szary przekreślony kwadrat reprezentuje elektrodę referencyjną. (B) Reprezentatywne segmenty śladowe wzorców EC i CA3 wizualizowane w szybszej skali czasowej. Groty strzałek wskazują zdarzenia ictal. W śladzie EC można docenić występowanie powolnych wyładowań międzynapadowych (pasek), podczas gdy podpole CA3 generuje typowy trwały wzór fastinterictal (pasek). (C) Rozszerzony zapis wyładowania ictal ukazującego typowy wzór toniczno-kloniczny. (D) Szybka wizualizacja przejścia pre-ictal-i-ictal odpowiadającego segmentom śladu EC (czerwony) i CA3 () oznaczonym czerwonym paskiem w (B). Strzałka wskazuje początek wyładowania ictal. Nałożone na siebie ślady podkreślają, że zdarzenie ictal ma swój początek w EC, a następnie rozprzestrzenia się do podpola CA3. (E) Rozszerzony widok okresów międzynapadowych oznaczonych czarnymi paskami w (B) podkreśla brak korelacji pomiędzy powolnymi i szybkimi wzorcami internapadowymi generowanymi odpowiednio przez EC (czerwony) i CA3 (). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wycinki mózgu myszy oferują wyższą wydajność eksperymentalną niż wycinki mózgu szczura. (A) Wycinek mózgu szczura (po lewej) i myszy (po prawej) w tym samym wieku. Wycinek mózgu szczura jest znacznie większy niż obszar zapisu MEA i jego aktywność elektryczna nie może być w pełni zobrazowana. (B) Bezpośrednie wizualne porównanie nawracającej aktywności ictal generowanej przez korę enhorinalną myszy i szczura (EC). oraz Wycinki mózgu myszy i szczura generują wyładowania o podobnym czasie trwania, ale odstęp między tymi zdarzeniami jest prawie 2-krotny w tkance mózgowej szczura. * p <0,05. (D) W porównaniu ze szczurami, myszy oferują 2-krotnie wyższą wydajność wycinków mózgu nadających się do eksperymentów stymulacji elektrycznej mających na celu kontrolowanie iktogenezy. Elektryczna stymulacja subiculum może wywołać reakcje populacji w korze przyhipokampa tylko w 20 z 58 (34%) wycinków mózgu szczura, w przeciwieństwie do 33 z 52 (63%) wycinków mózgu myszy (Chi²: 9,22; p = 0,002). * p <0,05. (E) Wśród żywotnych wycinków, wskaźnik sukcesu w kontrolowaniu aktywności ictal jest 2-krotny w przypadku wycinków mózgu myszy w porównaniu z plastrami mózgu szczura (mysz: 20 z 33 wycinków mózgu, 60%: szczur: 6 z 20 wycinków mózgu, 30%; Chi²: 4.67; p = 0,03). * p <0,05. (F) Wycinki mózgu myszy mogą wytrzymać powtarzające się długie epoki długotrwałej stymulacji elektrycznej (obszary o szarym odcieniu). Po odstawieniu bodźca, tkanka mózgowa myszy wykazuje pełną regenerację wzorca padaczkowego, podczas gdy żywotność tkanki mózgowej szczura dramatycznie spada po 3 godzinach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywny eksperyment elektrycznej modulacji ictogenezy za pomocą wycinków mózgu sprzężonych z MEAs. (A) Zapisy indukowanej przez 4AP aktywności ictal w EC i PC w warunkach kontrolnych (brak stymulacji), okresowej stymulacji (PP) przy 1 Hz (artefakt bodźca jest obcinany) oraz podczas odzyskiwania po odstawieniu bodźca. (B) Kwantyfikacja wpływu PP przy 1 Hz na całkowity czas pochłaniania. * p <0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywny długoterminowy zapis aktywności ictal wywołanej przez 4AP. (A) Ślady segmentów zarejestrowanych 8 godzin po procedurze cięcia mózgu i po 2 godzinach od aplikacji 4AP. (B) Rozszerzone segmenty śladowe odpowiadające pudełkowym wyładowaniom ictal oznaczonym literami a, b i c w panelu (A) pokazują spójność generowanej aktywności ictal przez cały przedłużony okres obserwacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. szt. pkt. pkt. . szt. pkt. szt. . pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. szt. pkt. szt.

Magazyn A	chemiczny	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)
	Zawartość NaCl	Klasa 58,44	1150
Rozpuszczalnik: woda destylowana	Kcl	Klasa 74,55	20
Koncentrat: 10x	KH2PO4	136,1	Rozdział 12,5
Temperatura przechowywania: 4 °C	CaCl2*2 H2O	147.02	20
Maksymalny czas przechowywania: 1 tydz	D-glukoza	Poziom 180,2	Z kolei 250
UWAGA: Filtruj za pomocą filtra membranowego 50 mm
Magazyn B	chemiczny	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)
	NaHCO3	84,01	260
Rozpuszczalnik: woda destylowana
Koncentrat: 10x
Temperatura przechowywania: 4 °C
Maksymalny czas przechowywania: 1 tydz
UWAGA: Filtruj za pomocą filtra membranowego 50 mm
Stock C	chemiczny	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)
	Kcl	Klasa 74,55	20
Rozpuszczalnik: woda destylowana	KH2PO4	136,1	Rozdział 12,5
Koncentrat: 10x	MgCl2*6 H2O	203,3	50
Temperatura przechowywania: 4 °C	MgSO4*6 H2O	246,47	20
Maksymalny czas przechowywania: 2 tygodnie	CaCl2*2 H2O	147.02	5
UWAGA: Filtruj za pomocą filtra membranowego 50 mm
Stock M	chemiczny	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)
	MgSO4*6 H2O	246,47	100
Rozpuszczalnik: woda destylowana
Koncentrat: 100x
Temperatura przechowywania: 4 °C
Maksymalny czas przechowywania: 4 tygodnie
4AP kolby	chemiczny	Masa cząsteczkowa	Stężenie (mM)
	4-aminopirydyna	94,11	Z kolei 250
Rozpuszczalnik: woda destylowana
Koncentrat: 1000x
Temperatura przechowywania: 4 °C
Maksymalny czas przechowywania: 2 tygodnie
Uwaga: wirować przez 2 - 3 minuty lub mieszać przez 30 - 60 minut
Uwaga: UWAGA! 4-AP jest toksyczny i szkodliwy. Używaj rękawiczek i unikaj rozlewania lub rozlania.

Tabela 1: Roztwory podstawowe.

TRZYMANIE ACSF			NAGRYWANIE ACSF			CIĘCIE ACSF
chemiczny	C [mM]		chemiczny	C [mM]		chemiczny	C [mM]
Zawartość NaCl	Rozdział 115		Zawartość NaCl	Rozdział 115		sacharoza	Rozdział 208
Kcl	cyfra arabska		Kcl	cyfra arabska		Kcl	cyfra arabska
KH 2POZ.4	Wydanie orzeczenia 1,25		KH 2POZ.4	Wydanie orzeczenia 1,25		KH 2POZ.4	Wydanie orzeczenia 1,25
MgSO4	1.3		MgSO4	1		MgCl2	5
CaCl2	cyfra arabska		CaCl2	cyfra arabska		MgSO4	cyfra arabska
D-glukoza	25		D-glukoza	25		CaCl2	0,5
NaHCO3	26		NaHCO3	26		D-glukoza	10
Kwas L-askorbinowy	1		Kwas L-askorbinowy	1		NaHCO3	26
						Kwas L-askorbinowy	1
ph	7,4		ph	7,4		Kwas pirogronowy	3
Osmolalność	300 mOsm/kg		Osmolalność	300 mOsm/kg
						ph	7,4
						Osmolalność	300 mOsm/kg

Tabela 2: Skład rozwiązań.

Rozwiązywanie problemów
PROBLEM			ŚRODKI ZARADCZE
Wyładowania Ictal wyglądają na 'pokawałkowane'			Zmniejsz szybkość perfuzji i/lub zmniejsz objętość ACSF powyżej wycinka mózgu, dostosowując położenie igły ssącej.
Brak aktywności ictal			(1) Sprawdź, czy szybkie zdarzenia międzygrupowe sterowane przez CA3 nie rozprzestrzeniają się do kory mózgowej. Użyj małego ostrza skalpela (np. nr 10) lub igły, aby w razie potrzeby odciąć zabezpieczenia Schaffera, ale uważaj, aby nie przeciąć nylonowych nici kotwy przytrzymującej plasterki. Najlepiej nadaje się mikroskop stereoskopowy lub pionowy, podczas gdy mikroskop odwrócony bardzo utrudnia to zadanie.
			(2) Sprawdź żywotność wycinka: czy silna stymulacja elektryczna może wywołać aktywność ictal? Poczekaj do około 2 godzin aplikacji 4AP, a następnie zmień wycinek mózgu, jeśli aktywność ictal nie występuje.
Wycinek mózgu porusza się podczas umieszczania kotwicy przytrzymującej			(1) Delikatnie usuń kotwicę wycinka i zmień położenie wycinka mózgu.
			(2) Sprawdź, czy kotwica plasterka jest równomiernie mokra z 4AP-ACSF.
			(3) Usuń 4AP-ACSF z komory nagrywającej, aby sprzyjać przyleganiu wycinka mózgu do MEA.
			(4) Zmień położenie kotwicy przytrzymującej plasterek.
Wycinek mózgu unosi się na chipie MEA po przeniesieniu			(1) Delikatnie odessać nadmiar ACSF za pomocą pipety Pasteura.
			(2) Układ MEA może wymagać ponownego powlekania.
Stymulacja elektryczna nie wywołuje reakcji sieci			Zwiększ intensywność bodźca, zmień pary elektrod.
Stymulacja elektryczna może wywołać reakcje populacji w proksymalnych, ale nie dystalnych obszarach kory mózgowej			Problem jest spowodowany słabą łącznością lub zbyt niską intensywnością bodźców. Stymulacja elektryczna może być nieskuteczna lub skuteczna tylko w niektórych obszarach kory mózgowej. Zaleca się zmianę wycinka mózgu.
Sygnał jest głośny			(1) Sprawdź elektrodę referencyjną: hałaśliwa linia bazowa może czasami być spowodowana niepełnym napełnieniem zbiornika wlotowego, tak że elektrody odniesienia nie wchodzą całkowicie głęboko w ACSF.
			(2) Sprawdź ogólne uziemienie sprzętu.
			(3) Dostosuj pozycję igły ssącej tak, aby słyszeć stały, miękki dźwięk ssania. Zmielić igłę ssącą.
			(4) Wyczyść zewnętrzne styki MEA etanolem za pomocą bawełnianego wacika.
			(5) Układ MEA może być uszkodzony: zmień układ MEA i sprawdź artefakty oraz stosunek sygnału do szumu.

Tabela 3: Rozwiązywanie problemów.

Dyskusja

MEA są nieocenionym narzędziem do badań neurofizjologicznych i osiągnęły dojrzałość w ostatnich latach dzięki dziesięcioleciom badań i rozwoju. W porównaniu z konwencjonalnym rejestrowaniem potencjału pola, MEA oferują ogromną zaletę w postaci większej liczby punktów obserwacyjnych i znanej odległości między elektrodami, które mają kluczowe znaczenie dla dokładnego określenia interakcji sieci neuronalnych.

Technikę rejestracji MEA można również połączyć z innymi podejściami elektrofizjologicznymi, takimi jak zapis patch-clamp¹⁵, w celu zbadania związku między aktywnością pojedynczego neuronu a aktywnością sieci neuronalnej. Co więcej, możliwość jednoczesnej wizualizacji potencjałów pola i aktywności wielu jednostek może dostarczyć cennych informacji na temat korelacji między aktywnością małych zespołów neuronalnych a zbiorowymi sieciami neuronalnymi. Połączenie z barwnikami wrażliwymi na napięcie, obrazowaniem wapnia i optogenetyką²⁹ pozwala na wnioskowanie o zjawiskach neurofizjologicznych przy użyciu podejść wielościennych. Oprócz badań farmakologicznych, możliwość wykonywania zarówno rejestracji, jak i stymulacji za pomocą tego samego systemu sprawia, że technika rejestracji MEA jest bardzo potężna i wszechstronna: na przykład możliwe jest badanie zjawisk plastyczności synaptycznej u podstaw tworzenia pamięci³⁰, przy użyciu przedstawionych tutaj protokołów neuromodulacji, które są istotne dla DBS w leczeniu padaczki i wielu różnych zaburzeń mózgu. Niedawny dowód na to, że technika rejestracji MEA może być z powodzeniem zastosowana do ludzkiej tkanki mózgowej z padaczką16, pokazuje jej nieocenioną przydatność w badaniach nad padaczką, zarówno w celu zrozumienia podstawowych mechanizmów leżących u podstaw tej wyniszczającej choroby, jak i dostrojenia algorytmów DBS w celu jej złagodzenia.

Jednak MEA wymuszają przeprowadzanie eksperymentów elektrofizjologicznych w warunkach "granicznych" dla wycinków mózgu, ze względu na wymóg zanurzonej komory rejestracyjnej i konieczność pozostawienia wycinka mózgu na stałym podłożu, na którym zintegrowane są mikroelektrody. W związku z tym tkanka mózgowa może nie otrzymać odpowiedniego dopływu tlenu, co z kolei może wpłynąć na jakość nagrań.

Opisany tutaj protokół pozwala na wiarygodne rejestrowanie i badanie iktogenezy w sieciach limbicznych gryzoni sprzężonych z MEA przy użyciu modelu ostrej 4AP in vitro oraz na prowadzenie długotrwałych epok stymulacji elektrycznej, które dostarczają istotnych informacji do oceny polityki DBS.

Wcześniejsze badania nad elektryczną neuromodulacją padaczkowych sieci limbicznych oparte na wykorzystaniu konwencjonalnego zapisu potencjału pola wykorzystywały wycinki mózgu myszy lub szczura z podobnymi wynikami^24,25; Jednak wykorzystanie tkanki mózgowej szczura okazało się trudniejsze, ze względu na słabsze połączenie w porównaniu z tkanką mózgową uzyskaną od myszy⁷. Jeśli chodzi o technikę MEA, wycinki mózgu myszy najlepiej nadają się ze względu na ich mniejszy rozmiar. Co więcej, biorąc pod uwagę wyższy wskaźnik występowania wyładowań podobnych do ictal w tkance mózgowej myszy w porównaniu ze szczurami, możliwe jest przetestowanie znacznie większej liczby wycinków mózgu w ciągu jednego dnia eksperymentalnego, co z kolei sprawia, że gromadzenie danych jest szybsze i bardziej wydajne, a także może zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:

Wyładowania ictal zarejestrowane przy użyciu opisanej tutaj komory niestandardowej wydają się być podobne pod względem czasu trwania i szybkości występowania do tych obserwowanych przy użyciu konwencjonalnej komory pierścieniowej MEA i tego samego typu MEA (mikroelektrody płaskie, por. ¹⁷). Należy jednak podkreślić, że grubość wycinka mózgu musi być znacznie zmniejszona przy użyciu konwencjonalnej okrągłej komory rejestracyjnej wraz z niską szybkością perfuzji (1 ml / min), co może utrudnić pomyślne przeprowadzenie eksperymentów neuromodulacyjnych ze względu na słabą łączność.

W tym protokole niestandardowa komora nagraniowa o małej objętości, inspirowana konstrukcją komory zapisu z zaciskiem krosowym, zapewnia stabilny i niezawodny przepływ laminarny, który ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego dążenia do nagrań MEA; Pozwala również na zwiększenie grubości wycinka mózgu do 400 μm w celu osiągnięcia sprawiedliwego kompromisu między żywotnością tkanki a wewnętrzną łącznością. Rzeczywiście uznaje się, że przepływ laminarny roztworu rejestrującego w komorze jest wysoce pożądany dla elektrofizjologii wycinków mózgu, ponieważ nie mają na niego wpływu gradienty temperatury, tlenu i pH, które obserwuje się w okrągłych komorach rejestrujących o przepływie kołowym 19,20,31 (takich jak te dostarczane z komercyjnie dostępnym MEA). Takie gradienty wprowadzają błąd eksperymentalny i są również szkodliwe dla wycinka mózgu. Komory rejestracyjne o stosunkowo małej objętości (~1,5 ml) wraz z dużą szybkością perfuzji (5 - 6 ml/min)^16,31 pozwalają na odpowiednią wymianę medium perfuzyjnego (≥3 razy/min). Niestandardową komorę można łatwo uzyskać ze źródeł komercyjnych w przystępnej cenie lub wyprodukować we własnym zakresie przy użyciu technologii druku 3D. Inne badania wykazały zapisy MEA z wycinków ludzkiego mózgu o grubości 400 μm¹⁶ przy użyciu konwencjonalnej komory pierścieniowej MEA, przy jednoczesnym utrzymaniu objętości ACSF na poziomie 1 ml i egzekwowaniu wysokiej szybkości perfuzji (5 - 6 ml / min) za pomocą pompy perystaltycznej o niskim poziomie hałasu. Autorzy zastosowali jednak inny model iktogenezy, tj. niski poziom^Mg2+, na który prawdopodobnie w mniejszym stopniu niż na model 4AP wpływają mechanizmy ehaptyczne polegające na znacznym wzroście zewnątrzkomórkowego stężenia K^{+ 11,22}. Odkryliśmy, że wysoka szybkość perfuzji nie jest pożądana w modelu 4AP, prawdopodobnie ze względu na szybkie wypłukiwanie nagromadzonego zewnątrzkomórkowego K⁺, który może wymagać znacznego zwiększenia w zapisie ACSF¹⁶. W rzeczywistości zdarzenia ictal wydawały się bardziej "fragmentaryczne", gdy prędkość perfuzji ASCF została zwiększona do 2 - 3 ml / min, a wycinek mózgu był zanurzony w grubej warstwie ACSF, podczas gdy pełnoobjawowe wyładowania wykazujące silne składniki toniczno-kloniczne można było przywrócić po powrocie do niższej szybkości perfuzji (1 ml / min) i cieńszej warstwy ACSF na poziomie powierzchni tkanki (dane nie pokazane). Niestandardowa komora rejestracyjna opisana w tym protokole pozwala na wymianę medium perfuzyjnego 3 - 5 razy/min przy natężeniu przepływu 1 mL/min. W ten sposób ogólny dopływ tlenu do wycinków mózgu jest znacznie poprawiony nawet przy stosunkowo niskich szybkościach perfuzji, gwarantując jednocześnie stabilną temperaturę nagrywania i wysoki stosunek sygnału do szumu. Co najważniejsze, możliwe jest utrzymanie zewnątrzkomórkowego stężenia K⁺ na poziomie wartości fizjologicznej.

Model iktogenezy 4AP nie wymaga żadnych znaczących modyfikacji składu jonowego ACSF, takich jak obniżenie Mg^{2 +} lub zwiększenie K ⁺ i oferuje unikalną zaletę utrzymania nienaruszonych zarówno transmisji pobudzających, jak i hamujących¹², aspekt, który jest bardzo istotny w badaniach nad padaczką w świetle kluczowej roli zarówno sieci glutaminergicznej, jak i GABA-ergicznej w synchronizacji padaczkowej (por. ⁷). 4AP-ACSF zastosowany w tym protokole zawiera fizjologiczne stężenie K⁺ (3,25 mM) i nieco niższe stężenie^Mg2+ niż ACSF trzymający (1 mM w porównaniu z 1,3 mM). Stężenie to nadal mieści się w podanych wartościach fizjologicznych stężenia^Mg2+ w płynie mózgowo-rdzeniowym gryzoni i jest stosowane w wielu laboratoriach (patrz na przykład^17,18). Dla celów opisanego protokołu stwierdziliśmy, że ten niewielki spadek jest preferowany jako pomoc w efekcie 4AP.

W poprzednich pracach 4AP został zastosowany do wycinka mózgu, gdy był on już umieszczony w komorze zapisu^17,18. O ile eksperymentator nie musi obserwować opóźnienia czasowego między aplikacją 4AP a wystąpieniem wzorców padaczkowych, stwierdzamy, że takie podejście jest raczej czasochłonne i nie nadaje się do kontynuowania przedłużonych sesji nagrywania i stymulacji opisanych w tym protokole. Wstępna inkubacja wycinków mózgu w 4AP w temperaturze 32 °C pozwala zaoszczędzić dużo czasu doświadczalnego, ponieważ wycinki mózgu mogą być wstępnie traktowane szeregowo, podczas gdy eksperyment jest kontynuowany przy użyciu innych skrawków tkanki.

Przedłużona żywotność wycinków mózgu może być przydatna do analizy funkcji sieci w dłuższej perspektywie. Co więcej, ich zwiększona odporność na powtarzającą się stymulację elektryczną jest bardzo korzystna, jeśli eksperymentator chce porównać kilka protokołów stymulacji, które muszą być wykonane w tym samym wycinku mózgu, aby uzyskać statystyczną solidność. W naszych rękach, przy testowaniu 3 protokołów stymulacji, z których każdy poprzedzony jest fazą kontrolną, a następnie fazą regeneracji, eksperyment może trwać 3 - 5 godzin. W tym kontekście, mapowanie MEA na żywo ma kluczowe znaczenie dla aktywacji prawidłowego szlaku i tłumienia, a nie faworyzowania iktogenezy poprzez stymulację elektryczną. Nasz przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika stanowi szybkie, proste i elastyczne narzędzie do mapowania elektrod różnych struktur mózgu. W przeciwieństwie do oprogramowania komercyjnego, możliwe jest dodawanie niestandardowych układów MEA nawet przy podstawowych umiejętnościach programowania. Obrazy można uzyskiwać w jasnym polu; Tak więc odpowiednia jest każda kamera ogólnego przeznaczenia, która ma dobrą rozdzielczość i mieści się w mikroskopie. Mikroskop odwrócony jest niezbędny do wizualizacji położenia mikroelektrod względem wycinka mózgu, ponieważ byłyby one ukryte pod tkanką, gdyby używano mikroskopu pionowego. Jednak mikroskop stereoskopowy jest zalecany jako dodatek do typu odwróconego, jeśli eksperymentator musi wykonać cięcia nożem, aby zakłócić określone ścieżki neuronalne.

Wreszcie, kolejną zaletą proponowanego podejścia jest tani i stosunkowo łatwy montaż większości wymaganych narzędzi, takich jak niestandardowa komora nagrywająca i komory przytrzymujące, ciepła kąpiel i kotwica warstwowa, a także niepotrzebne stosowanie kosztownej pompy perystaltycznej o niskim poziomie hałasu.

Ograniczenia techniki:

Zapis MEA nie pozwala na wizualizację bardzo wolnych fal, czyli przesunięć DC w sygnale. Takie odchylenia linii bazowej mogą pomóc w asymptotycznym pomiarze czasu trwania wyładowania i, co najważniejsze, mają fundamentalne znaczenie dla badania depresji rozprzestrzeniającej się w korze mózgowej (zjawisko, które odnosi się do nagłej nieoczekiwanej śmierci w padaczce³² i jest wspólne dla padaczki i migreny³³).

Jeśli chodzi o neuromodulację elektryczną, opisany tutaj protokół pozwala na wykonanie kilku sesji stymulacji bez wpływu na żywotność wycinków mózgu. Z powodzeniem mogliśmy wykonać do 3 sesji stymulacji po 20 - 45 minut, podobnie jak w poprzedniej pracy²⁵. Chociaż wycinki mózgu mogą prawdopodobnie wytrzymać większą liczbę sesji stymulacji lub dłuższe protokoły stymulacji, nie testowaliśmy wycinków mózgu pod tym względem. Zalecamy ograniczenie liczby protokołów stymulacji do 3 i unikanie długotrwałych (≥60 min) sesji stymulacji, które mogą znacznie obciążyć tkankę mózgową utrzymywaną w tych warunkach granicznych, aż do braku regeneracji po odstawieniu bodźca.

Kluczowe kroki w ramach protokołu:

Kilka krytycznych czynników może utrudniać skuteczne dążenie do rejestrowania i modulowania aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu sprzężonych z MEA. Oprócz użytych gatunków gryzoni i jakości wycinków mózgu, szybkości perfuzji podczas nagrywania i dynamiki przepływu ACSF (tj. laminarnego kontra kołowego) w komorze rejestrującej, stwierdziliśmy, że najbardziej krytycznymi krokami są warunki regeneracji i długoterminowego utrzymania wycinków mózgu, a także tryb aplikacji 4AP.

Podczas korzystania z zanurzonej komory przetrzymywania ważne jest, aby przechowywać plastry mózgu w temperaturze pokojowej, aby zachować aktywność sieci tkanki mózgowej i sprzyjać indukcji wyładowań podobnych do ictalu przez aplikację 4AP. W naszych rękach regeneracja i konserwacja w temperaturze 32 °C pogorszyła stan tkanki mózgowej w ciągu 3 - 4 godzin od krojenia.

Inkubacja wycinków mózgu w 4AP-ACSF w temperaturze pokojowej i rejestrowanie w temperaturze 32 °C nie jest jednak pożądane. Stwierdziliśmy wiele trudności w zaobserwowaniu silnych nawracających wyładowań w tym stanie. Rzeczywiście, doniesiono, że niskie temperatury w zakresie 20–24 °C tłumią lub nawet zapobiegają iktogenezie indukowanej przez 4AP zarówno in vitro³⁴ , jak i in vivo³⁵. W związku z tym temperatury inkubacji i rejestracji 4AP muszą mieścić się w zakresie 30 - 34 °C i muszą być dopasowane. Aby uniknąć narażenia tkanki mózgowej na zbyt duży stres z powodu jednoczesnego wywołania nadpobudliwości przez 4AP i nagłego wystawienia wycinków mózgu z temperatury pokojowej na ciepły (32 °C) 4AP-ACSF, ważne jest, aby wykonać pośredni etap wstępnego ogrzewania i pozwolić plasterkom mózgu przyzwyczaić się do ACSF w temperaturze 32 °C przez 20 - 30 minut. Pominięcie tego kroku może wpłynąć na indukcję iktogenezy przez 4AP.

Kolejnym aspektem, o którym należy wspomnieć, jest znaczenie stężenia D-glukozy w ACSF po pokrojeniu. Stężenie 25 mM zachowuje wycinki mózgu lepiej niż stężenie 10 mM stosowane w wielu laboratoriach, a także poprawia tempo występowania aktywności ictal, która jest 2-krotnie szybsza (ułatwiając w ten sposób realizację długiej serii protokołów eksperymentalnych w kilku wycinkach mózgu każdego dnia).

Na koniec należy wspomnieć o kilku ważnych drobnych szczegółach podczas procedury krojenia. Po pierwsze, nie pozwól, aby nienaruszony mózg i plasterki mózgu zamarzły w cięciu na zimno ACSF. Schładzanie mózgu przez <2 minuty jest wystarczające, biorąc pod uwagę mały rozmiar mózgu myszy. Skrawki tkanek należy przenieść natychmiast z tacki buforowej do zlewek płuczkowych w temperaturze pokojowej. Płukanie cięcia ACSF jest bardzo ważne, w przeciwnym razie wysokie stężenie sacharozy spowoduje, że plastry mózgu przykleją się do nylonowej siatki komory trzymania. Aby skutecznie wypłukać tkankę, ważne jest, aby zminimalizować zawartość ACSF w pipecie transferowej, aby nie zanieczyszczać nadmiernie trzymającego ACSF. 2-stopniowe płukanie pomaga w minimalizacji zanieczyszczeń. Po zakończeniu procedury krojenia, skrawki tkanek powinny zostać natychmiast przeniesione ze zlewek do płukania do komory przetrzymywania, gdzie miękka nylonowa siatka zawieszona do połowy w pomieszczeniu ACSF umożliwia natlenienie tkanek po obu stronach. Ta sama zasada powinna być stosowana na wszystkich etapach następujących po procedurze krojenia: plastry mózgu nigdy nie powinny znajdować się na dnie zlewki, nie powinny stykać się z bokami komór do przechowywania i nigdy nie powinny stykać się ze sobą ani nachodzić na siebie.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:

Skład ACSF może być modyfikowany w zależności od potrzeb eksperymentatora. Na przykład, leki mogą być dodawane w celu zbadania udziału określonych neuroprzekaźników lub kanałów jonowych w skuteczności neuromodulacji elektrycznej. Co więcej, kwas pirogronowy i askorbinowy (por. tabela 2) można pominąć, chociaż stwierdzamy, że odgrywają one potężną rolę neuroprotekcyjne. W Tabeli 3 przedstawiamy najczęstsze problemy, które można napotkać w tym protokole oraz sposoby ich rozwiązywania.

Wnioski:

Zapis MEA jest niewątpliwie nieocenioną techniką zajmowania się interakcjami sieci neuronalnych w zdrowiu i chorobie. Oprócz badań farmakologicznych możliwa jest również ocena protokołów neuromodulacji elektrycznej, które są istotne dla DBS stosowanych w padaczce i innych zaburzeniach neurologicznych. W tym protokole wykazaliśmy, że możliwe jest odtworzenie typowych eksperymentów stymulacji okresowej z podobnymi wynikami do tych uzyskanych przy konwencjonalnym rejestrowaniu potencjału pola zewnątrzkomórkowego i zewnętrznych elektrodach stymulujących. Rosnąca dostępność komercyjnego, przyjaznego dla użytkownika sprzętu i zaawansowanych narzędzi programowych sprawia, że technika nagrywania MEA nadaje się również do eksperymentów stymulacji w pętli zamkniętej, w celu zapewnienia doraźnej stymulacji tkanki mózgowej oraz zbadania udziału mechanizmów sprzężenia zwrotnego w odpowiedziach sieci neuronowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Poli-D-lizyna	Sigma-Adrich	P7886	Potrzebny do powlekania MEA
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	Chemiczny
KCl	Sigma-Adrich	P9541	Chemiczny
KH2PO4	Sigma-Adrich	795488	Chemical
CaCl2*2 H2O	Sigma-Adrich	C3306	Chemiczny
D-Glukoza	Sigma-Adrich	RDD016	Chemiczny
NaHCO3	Sigma-Adrich	S5761	Chemiczny
MgCl2*6 H2O	Sigma-Adrich	M2670	Chemiczny
MgSO4*6 H2O	Sigma-Adrich	M5921	Chemiczny
Sacharoza	Sigma-Adrich	RDD023	Chemiczny
kwas pirogronowy, 98%	Sigma-Adrich	107360	Chemiczna
4-aminopirydyna	Sigma-Adrich	A78403	Lek drgawkowy
STG-2004	System wielokanałowy	STG4004-1,6mA	4-kanałowy generator bodźców z napięciem (± 8 V) i wyjście prądowe (± 1,6 mA)
MEA1060	System wielokanałowy	Nie dotyczy	wzmacniacz MEA
planarny	system wielokanałowy	60MEA500/30iR-Ti bez pierścienia	Musi być bez pierścienia, aby umożliwić korzystanie z niestandardowej komory nagrywania
Oprogramowanie do nagrywania	systemu wielokanałowego		McRack
STG4004 systemem	wielokanałowym		McStimulus II
TC02	System wielokanałowy	TC02	Termostat 2-kanałowy
PH01	System wielokanałowy	PH01	Ogrzewanie perfuzyjne
MPH	System wielokanałowy	MPH	Uchwyt magnetyczny do PH01 i igły ssącej
Elastostil E43	Wacker	E43	Elastomerowy uszczelniacz stosowany do montażu niestandardowej komory zapisu na MEA
MEA Custom	Chamber Crisel Instrument	SKE-chamber MEA	Niestandardowa komora nagraniowa
Ag/AgCl elektroda, granulka, 1.0 mm	Crisel Instrument	64-1309	Elektroda referencyjna do niestandardowej komory nagraniowej
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	Enzymatyczny środek czyszczący
MATLAB	Mathworks		do mapowania elektrod
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	Vibratome
	Warner Instruments	64-1309	Ag-AgCl Elektroda w postaci granulki 1,0 mm (E205). Elektroda referencyjna.