Artykuł metodologiczny

Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo

DOI:

10.3791/57554

⸱

11 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Disease Immunology, Center for Vaccine Research, Statens Serum Institut, 2Department of Infectious Diseases, Hvidovre Hospital, 3Institute of Clinical Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Division of Infection and Immunity, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy demonstrację modelu przywołania pęcherza ssącego na skórę. Model ten umożliwia prosty dostęp do badania in vivo adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych u ludzi, na przykład w kontekście opracowywania szczepionek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skórne modele przypominania antygenu pozwalają na badanie reakcji ludzkiej pamięci in vivo. W połączeniu z indukcją pęcherzy ssących przez skórę (SB), model ten zapewnia dostęp do rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu reprezentatywnych dla odpowiedzi pamięci komórkowej, a także mikrośrodowiska cytokin in situ.

Ten raport opisuje praktyczną procedurę pobierania komórek T od skóry, indukcji SB i pobierania limfocytów T specyficznych dla antygenu. Aby zilustrować tę metodę, tuberkulinową próbę skórną stosuje się do przypominania antygenowego u osób, które przed tym badaniem przeszły szczepienie Bacillus Calmette-Guérin przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis. Na koniec przedstawiono przykłady analiz multipleksowych i cytometrycznych przepływowych próbek SB, ilustrujące wysokie frakcje wielofunkcyjnych limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu dostępnych tą metodą pobierania próbek w porównaniu z komórkami wyizolowanymi z krwi.

Opisana tutaj metoda jest bezpieczna i minimalnie inwazyjna, daje unikalną okazję do badania zarówno wrodzonych, jak i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych in vivo, i może być korzystna dla szerokiej społeczności badaczy zajmujących się odpornością komórkową i reakcjami ludzkiej pamięci, w kontekście opracowywania szczepionek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skóra SB to sztucznie wywołany pęcherz, który pozwala na pobieranie komórek i płynów bezpośrednio ze skóry. Technika podnoszenia SB za pomocą próżni jest dobrze znanym narzędziem w dziedzinie dermatologii używanym do badania immunologii skóry w zdrowiu i chorobie1,2,3,4,5,6,7,8. Niniejszy raport pokazuje, w jaki sposób technika SB w połączeniu ze skórnym przypominaniem antygenowym (metoda przypominania skórnego SB) może zapewnić bezpośredni wgląd w adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne in vivo.

Zasada stojąca za indukcją SB jest prosta: lekka próżnia jest stosowana na małym obszarze skóry. Podciśnienie ostatecznie zmusi naskórek do oddzielenia się od skóry właściwej, tworząc miejscowy pęcherz wypełniony płynem i komórkami1,2,9. Płyn z pęcherzy można pobrać za pomocą aspiracji cienkoigłowej, a jego zawartość można wykorzystać do dalszych badań in vitro.

W ostatnich latach obserwuje się rosnące zainteresowanie metodą SB do badania in vivo odpowiedzi immunologicznych innych niż choroby ograniczone do skóry10,11. Badania nad odpornością nabytą u ludzi są ograniczone przez fakt, że interesujące nas komórki i cytokiny są pobierane z krwi obwodowej, ponieważ inwazyjne pobieranie próbek z węzła chłonnego lub tkanki błony śluzowej przewodu pokarmowego może być niedopuszczalne i nieetyczne. Przykładem jest badanie długowiecznych odpowiedzi limfocytów T ludzkiej pamięci po szczepieniu12. W takich badaniach pobieranie próbek odpowiednich limfocytów T może być dużym wyzwaniem, ponieważ odpowiednia populacja komórek pośredniczących w odporności znajduje się w tkance limfatycznej, a tylko bardzo ograniczona liczba specyficznych limfocytów T krąży we krwi obwodowej.

Technika SB oferuje unikalną okazję do badania limfocytów T pamięci i innych specyficznych populacji komórek. Po skórnym zaszczepieniu antygenu, limfocyty T specyficzne dla antygenu są rekrutowane z ich kryjówek limfatycznych do skóry i można je łatwo pobrać z SB. Metodologia i zastosowania badawcze tego skórnego modelu przypominania zostały opisane przez Akbara i wsp. w 20132. Powszechnie stosowanym antygenem do przywoływania skóry jest dostępna na rynku oczyszczona pochodna białkowa (PPD) prątków używana do przeprowadzania tuberkulinowego testu skórnego (TST)13, gdzie PPD jest wstrzykiwany do warstwy skórnej skóry. U osób z istniejącą pamięcią immunologiczną w kierunku PPD [np. osoby z zakażeniem Mycobacterium tuberculosis (Mtb) lub wcześniejszym szczepieniem przeciwko Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], depozycja antygenu powoduje reakcję przywoławczą z migracją do skóry i klonalną ekspansją in vivo limfocytów T CD4+ specyficznych dla PPD2,11,14,15. W rezultacie, w skórze gromadzą się wysokie frakcje polifunkcyjnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla PPD, gotowych do pobrania próbki SB. Limfocyty T pobrane tą metodą okazały się wytrzymałe i są wystarczająco liczne, aby można je było scharakteryzować za pomocą szeregu testów immunologicznych i długoterminowej hodowli in vitro15. W związku z tym model przypominania skórnego i indukcja SB mogą okazać się cenną metodą badania odpowiedzi limfocytów T in vivo za pomocą analiz ex vivo, a zwiększona wiedza na temat tego podejścia może przynieść korzyści naukowcom zainteresowanym immunologią komórkową i wakcynologią.

Ten raport zawiera pierwszy krok po kroku, jak wywołać pęcherze ssące ludzkiej skóry w skórze wstrzykniętej PPD. Model przypominania antygenu skórnego zademonstrowano przy użyciu TST u ochotników zaszczepionych BCG. Na koniec przedstawiono odpowiednią analizę ex vivo komórek i cytokin wyizolowanych przez SB. Fenotypowe i funkcjonalne cechy limfocytów T specyficznych dla PPD uzyskanych metodą SB są dokładnie opisane w innym miejscu2,10,11,16,17,18,19. Niniejszy raport ma na celu omówienie praktycznych i immunologicznych aspektów metodologii, aby ułatwić stosowanie tej techniki przez inne grupy badawcze.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane poniżej metody, w tym wykorzystanie ochotników, zostały zatwierdzone przez Duński Komitet Etyki Badań Zdrowotnych (H-15002988) oraz Duńską Agencję Ochrony Danych (jr.nr. 2015-57-0102). PPD musi być certyfikowanym produktem dopuszczonym do stosowania u ludzi i podawanym w odpowiedniej dawce dostarczonej przez producenta. Wszelkie odchylenia w dawkowaniu lub podawaniu mogą wymagać dodatkowych zgód etycznych, a ochotnicy muszą wyrazić świadomą zgodę.

1. Test skórny tuberkuliny

  1. Uzyskaj ustną i pisemną świadomą zgodę od wolontariusza. Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że ochotnik rozumie i akceptuje procedurę, w tym możliwe działania niepożądane.
    UWAGA: Kryteria włączenia specyficzne dla tego protokołu to wiek > 18 lat i udokumentowane szczepienie BCG. Kryteria włączenia mogą się różnić w zależności od pytania badawczego (tj. dodatkowym kryterium włączenia mogą być dowody na dodatnie TST).
  2. Należy użyć gotowego roztworu PPD do stosowania u ludzi [20 jednostek tuberkulinowych (TU)/ml]. Zdezynfekować gumowe wieczko fiolki za pomocą wacika nasączonego alkoholem.
  3. Przygotować miejsce wstrzyknięcia
    1. Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia po brzusznej stronie przedramienia ochotnika.
    2. Połóż rękę dłonią do góry na gładkiej powierzchni i wybierz obszar w górnej jednej trzeciej przedramienia, około 5-10 cm od stawu łokciowego. Trzymaj się z dala od blizn, żył lub uszkodzonej skóry.
    3. Zdezynfekuj obszar za pomocą wacika nasączonego alkoholem.
  4. Przygotowanie roztworu PPD
    1. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml ze stałą igłą o gramaturze 27 - 30 G/krótką (np. 12 mm).
    2. Delikatnie wymieszaj i zaaspiruj 0,1 ml roztworu PPD. Upewnij się, że nie ma widocznych bąbelków.
  5. Śródskórne wstrzyknięcie PPD
    UWAGA: W tym kroku opisano, jak wykonać pojedyncze osadzanie PPD, ale możliwe jest wielokrotne osadzanie PPD w tym samym ramieniu. Może to jednak wymagać szczególnej zgody etycznej.
    1. Rozciągnąć skórę i skierować igłę pod kątem 5 - 15° do skóry, skosem skierowanym do góry.
    2. Włóż końcówkę igły w warstwę skórną skóry i upewnij się, że końcówka jest prawie widoczna przez naskórek.
    3. Powoli wstrzyknąć 0,1 ml roztworu PPD.
      UWAGA: Przy prawidłowym podaniu natychmiast pojawi się blada grudka o wielkości 6 - 10 mm. Grudka znika po około 10 minutach.
    4. W przypadku wykonywania dwóch lub więcej osadów należy dążyć do maksymalnego odstępu (5 - 10 cm) od miejsc wstrzyknięcia, zachowując odpowiednią odległość od okolicy łokcia i nadgarstka.
      UWAGA: Zapobiega to potencjalnemu zbieganiu się odpowiedzi testu skórnego i umożliwia nieprzerwane ustawienie dwóch komór ssących.

2. Ocena reakcji skórnej - Dzień 3

  1. Po 48 - 72 godzinach zwróć uwagę na wielkość reakcji skórnej. Zmierz stwardnienie (obrzęk), a nie rumień (zaczerwienienie) reakcji.
  2. Palcami obmacać twardy obrzęk, a następnie zaznaczyć krawędzie stwardnienia za pomocą długopisu. Użyj linijki, aby zmierzyć średnicę stwardnienia i zanotuj wynik w mm.
    UWAGA: Odczyt wielkości stwardnienia może pomóc w wyborze średnicy otworu komory ssącej.

3. Indukcja pęcherza ssącego - Dzień 7

  1. Zamontuj jednostkę ssącą.
    Uwaga: Urządzenia ssące to pompy próżniowe z dołączonymi komorami do indukcji pęcherza ssącego. Urządzenie użyte w tej demonstracji jest wykonane na zamówienie, ale na rynku dostępne są również urządzenia ssące. Pompa musi być regulowana w zakresie od -20 do -40 kPa i zapewniać stałe i niezawodne podciśnienie. Przed przeprowadzeniem eksperymentów z użyciem tej metody należy uzyskać regionalną zgodę etyczną.
    1. Najpierw przygotuj komorę ssącą, montując dolną kryzę i płytę okienka z komorą i wężem łączącym. Mocno przymocuj wąż łączący komorę do pompy próżniowej.
      Uwaga: Komory powinny zawierać dolną płytkę z otworem do indukcji blistra, która powinna być przystosowana do kontaktu z ludzką skórą, oraz górną płytkę z okienkiem, pozwalającą na wizualne monitorowanie blistra.
  2. Określ optymalną średnicę otworu płytki otworu w stosunku do wielkości reakcji skórnej; im większy rozmiar otworu, tym większy pęcherz.
  3. Zdezynfekuj kryzę i skórę ochotnika za pomocą wacików nasączonych alkoholem.
  4. Przymocuj komorę ssącą do skóry.
    1. Upewnij się, że ręka wolontariusza wygodnie odpoczywa
      2. .
    2. Upewnij się, że otwór w dolnej płycie komory ssącej znajduje się nad reakcją PPD, tak aby widoczny był środek reakcji skórnej.
    3. Zabezpiecz komorę luźno za pomocą pasków: po zastosowaniu podciśnienia komora będzie przylegać do skóry i utrzymywać swoją pozycję.
  5. Włącz urządzenie ssące i wyreguluj ciśnienie na -20 kPa.
  6. Po 30 minutach zwiększyć podciśnienie do -25 kPa.
  7. Po 60 minutach należy jeszcze bardziej zwiększyć podciśnienie do -30 kPa.
  8. Utrzymywać ciśnienie na poziomie -30 kPa aż do całkowitego uformowania się pęcherza. Upewnij się, że podciśnienia podane w tym protokole są specyficzne dla dostosowanego instrumentu. Może być konieczne nieznaczne dostosowanie ciśnienia podczas stosowania protokołu w innych ustawieniach.
    UWAGA: Faza indukcji pęcherza trwa od 60 do 180 minut (1 - 3 h), przy czym rzeczywiste tworzenie się pęcherzy następuje w ciągu ostatnich 30 minut. Pęcherze często wiążą się ze swędzeniem. Blistry mogą występować jako pojedyncze lub wielokrotne łączące się blistry. Jeśli dojdzie do pęknięcia pęcherza lub krwotoku, zaleca się przerwanie indukcji pęcherza poprzez powolne zmniejszanie ciśnienia.
  9. Po całkowitym uformowaniu blistra zwolnij ciśnienie i ostrożnie wyjmij komorę ssącą ze skóry, nie rozrywając blistra.
  10. Nałóż miękki opatrunek na otaczającą skórę i umieść twardą nakrętkę (np. z plastikowej tubki o pojemności 50 ml) na blistrze .
  11. Zabezpiecz nakrętkę niealergiczną taśmą chirurgiczną, a następnie miękkim, rozciągliwym bandażem.
  12. Poinstruuj ochotnika, aby unikał nadmiernego wysiłku fizycznego w okolicy pęcherza przez następne 12 - 24 godziny.

4. Zbiór płynu do pęcherzy - Dzień 8

  1. W 8 dniu delikatnie zdjąć opatrunek ochronny i zdezynfekować blister sprayem do dezynfekcji skóry.
  2. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 2 ml z igłą 23G, aby pobrać zawartość blistra. Wbić igłę w górną/boczną stronę dachu blistra i powoli zassać płyn. Unikaj dotykania podłogi jamy, ale upewnij się, że zebrałeś cały płyn.
  3. Nałóż opatrunek na zapadnięty pęcherz
    4. .
  4. Przenieść płyn z blistra do sterylnej probówki. Zwróć uwagę na głośność.
  5. Odwirować płyn blistrowy o masie 600 x g za pomocą wirówki stołowej przez 4 minuty.
  6. Przenieść supernatant do innej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki komórkowej.
    UWAGA: Komórki są teraz gotowe do zliczania i dalszej analizy. Supernatanty mogą być przechowywane w temperaturze od -20 do -80 °C do czasu użycia.

5. Analizy pęcherzy ssących i płynów

UWAGA: Dostarczanie instrukcji do analizy komórek i płynów uzyskanych z pęcherzy odsysających skórę nie wchodzi w zakres tego protokołu. Jednak w celu uzyskania reprezentatywnych wyników dla niniejszego raportu przeprowadzono wewnątrzkomórkową cytometrię przepływową i analizy multipleksowe. Metodologia została opisana pokrótce poniżej.

  1. Cytometria przepływowa
    1. Stymulować zawiesiny 1 x 105 świeżych komórek wyizolowanych z pęcherzy ssących od 1 ochotnika zaszczepionego BCG z 10 μg/ml PPD i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Dołącz niestymulowane komórki do równoległej inkubacji.
    2. Stymulować zawiesiny 1 x 106 PBMC otrzymanych od 1 ochotnika zaszczepionego BCG za pomocą 10 μg/ml PPD i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Dołącz niestymulowane komórki do równoległej inkubacji.
    3. Po 2 godzinach potraktować wszystkie komórki preparatem Brefaldin A i monenzyną i inkubować je przez 6 godzin w temperaturze 37°C.
    4. Zabarwić komórki panelem Live/Dead-stain-BV510, anty-CD4-AF780, anty-CD3-BV421, anty-CD8-PerCP-Cy5.5, anty-CCR7-PE, anty-CD45RA-BV786, anty-IFN-γ-AF700, anty-TNF-α-PE-Cy7 i anty-IL-2-FITC.
    5. Uwzględnij formanty FMO w panelu PBMC.
    6. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego i przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    7. Bramka na podzbiorach CD3 + CD4 + CD8- wytwarzających cytokiny przy użyciu następującej strategii bramkowania: singlelets - > żywotne CD3 + - > CD4 + CD8- - > IFN-γ+, TNF-α+ lub IL-2+.
    8. Bramka na populacjach komórek pamięci efektorowej przy użyciu następującej strategii bramkowania: singlelety - > żywotne CD3+ - > CD4+CD8- - > CCR7-CD45RA-.
    9. Obliczanie indywidualnych profili cytokin za pomocą bramkowania logicznego.
  2. Demonstracje uwalniania cytokin
    1. Aby wykazać uwalnianie cytokin in vivo, należy użyć analizy multipleksowej w celu ilościowego określenia poziomów IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 i IL-13 w rozmrożonym płynie ssącym z blistra uzyskanym od 4 ochotników.
    2. W celu wykazania uwalniania cytokin przez komórki uzyskane z pęcherzy ssących ex vivo, należy użyć świeżych komórek pęcherza ssącego i PBMC uzyskanych od 1 ochotnika zaszczepionego BCG.
    3. Zainfekuj PBMC i odsysanie komórek pęcherza 100 jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) Mtb H37Rv i inkubuj je przez 4 dni.
    4. Użyj analizy multipleksowej, aby określić ilościowo poziomy IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 i IL-13 we wszystkich supernatantach hodowlanych.
    5. Dostosuj pomiary powyżej zakresu obliczeń testu do górnej granicy obliczeń.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwzględniono ośmiu zdrowych dorosłych ochotników (mediana wieku: 30 lat, zakres: 26 - 43 lata) z udokumentowanym wcześniejszym szczepieniem BCG (mediana czasu od szczepienia BCG: 5,5 roku, zakres: 1 - 30 lat). Uczestnicy zostali śródskórnie prowokowani 2 TU PPD, a następnie ocenie TST w 3 dniu. SB indukowano w 7 dniu i zbierano w 8 dniu, a wszystkie pęcherze hodowano za pomocą komór ssących o średnicy otworu 10 mm. Siedmiu osobom podano jednocześnie 2 oddzielne szczepienia PPD w tym samym ramieniu, a następnie 2 równoległe indukcje SB (proszę zapoznać się z uwagą dotyczącą wielokrotnych depozycji PPD poniżej kroku 1.4 w Protokole). Krew obwodową pobrano w 7 dniu w celu izolacji osocza i PBMC przez wirowanie w gradiacji gęstości. Supernatanty osocza i płynów z SB przechowywano w temperaturze -20 °C. Świeże komórki SB (SBC) zliczono za pomocą barwienia nigrozyną i mikroskopii.

Kliniczne odpowiedzi TST i wydajność SBC są przedstawione w Rysunek 1. Mediana wielkości stwardnienia TST wynosiła 10,25 mm (zakres: 0 - 20 mm), a mediana liczby komórek na blister wynosiła 50 000 (zakres: 15 000 - 210 000 komórek, liczba blistrów: 15). Dwóch ochotników nie miało odpowiedzi klinicznej w żadnym z 2 TST i odpowiadającej jej niskiej całkowitej wydajności komórek wynoszącej 15 000 komórek/blister. Wydajność komórek była związana ze średnią odpowiedzią kliniczną TST (r Spearmana = 0,643, p = 0,094).

figure-results-1
Rysunek 1: Wydajność komórek blistrowych ssania. (a) Ten panel pokazuje reprezentatywną mikroskopię komórek barwionych nigrozyną wyizolowanych z SB wyhodowanych 7 dni po TST. (b) Panel ten pokazuje zależności między średnim stwardnieniem TST (mm) a średnią wydajnością komórek (n/blister) u 8 ochotników zaszczepionych BCG (liczba pęcherzy = 15). Kropki reprezentują poszczególne średnie pomiary. Należy pamiętać, że 2 kropki nakładają się na siebie, ponieważ 2 ochotników miało stwardnienie TST wynoszące 0 mm i wydajność komórek 15 000. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby zademonstrować charakterystykę SB metodą cytometrii przepływowej, SBC uzyskano od 43-letniego ochotnika, który został zaszczepiony BCG 30 lat wcześniej i nie miał znanego kontaktu z Mtb. SBC zostały wyizolowane po indukcji pojedynczego blistra (stwardnienie: 1,4 mm/100 000 SBC). Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wykresy wewnątrzkomórkowego barwienia cytokinami SBC w porównaniu z PBMC.

U tego ochotnika frakcja CD3+CD4+CD8- SBC wzrosła z 67% w komórkach niestymulowanych do > 90% po restymulacji >PPD in vitro, podczas gdy frakcja CD3+CD4+CD8- PBMCs pozostała stała (~ 51%, Rysunek 2). Ponad 92% PPD-in vitro, jak również niestymulowanych CD3+CD4+CD8- SBC, było typu pamięci efektorowej (CCR7-CD45RA-, dane nie pokazane). Ogólne frakcje specyficznych komórek CD3 + CD4 + CD8- indukowanych stymulacją PPD były wyższe w SBC w porównaniu z PBMC (33,1 vs. 0,2%, odjęte próbki niestymulowane). W PBMC frakcje wielofunkcyjnych komórek CD3 + CD4 + CD8 specyficznych dla PPD wynosiły < 0,05%.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej SBC w porównaniu z PBMC. Panele a i b pokazują reprezentatywne wykresy gęstości populacji CD8+ i CD4+ w (a) niestymulowanych vs. PBMC stymulowane PPD i (c) SBC. Panele b i d powolne wykresy wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w stymulowanych PPD komórkach CD3 + CD4 + CD8 dla (b) PBMC i (d) SBC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zgodnie z oczekiwaniami, CD3+CD4+CD8- SBC zostały aktywowane in vivo, co ilustruje wysoki odsetek komórek barwiących się pod kątem cytokin o podwyższonej regulacji (12%), przy czym dominującymi cytokinami były TNF-α i IFN-γ. Jednak po stymulacji PPD komórki wydzielające cytokiny przesunęły się w kierunku potrójnie lub podwójnie dodatniego profilu IFN-γ + TNF-α + IL-2 + (17%) i IFN-γ + TNF-α + (15%) (Rysunek 3b, profile PBMC od tego samego dawcy są uwzględnione do porównania w Figura 3a). Profile ekspresji cytokin dla stymulowanych przez PPD podzbiorów limfocytów T CD4 + pamięci efektorowej (CD3 + CD4 + CD8-CCR7-CD45RA-) były porównywalne z populacją CD3 + CD4 + CD8- przedstawioną na rycinach 2 i 3 (dane nie pokazane).

figure-results-3
Rysunek 3: Profile cytokin dla SBC stymulowanych i niestymulowanych CD4+ PPD w porównaniu z PBMC. Panele te pokazują indywidualne profile dla komórek PBMC wytwarzających cytokiny (a) CD3 + CD4 + CD8 - PBMCs i (b) CD3 + CD4 + CD8 - SBC. Słupki reprezentują frakcje profili cytokin specyficznych dla antygenu w komórkach niestymulowanych (białe paski) oraz po stymulacji in vitro za pomocą PPD (kolorowe paski).

Aby zbadać płyn SB jako źródło informacji o mikrośrodowisku cytokin w miejscu testów skórnych, zmierzono poziomy cytokin w płynie pobranym z SB indukowanych 7 dni po TST (Rysunek 4a). Mediana poziomów IFN-γ, TNF-α i IL-2 wynosiła odpowiednio 339 pg/ml, 19 pg/ml i 1 pg/ml (n = 6). Stężenia w osoczu były na ogół bardzo małe. Komórki wyizolowane z SB wytwarzały wysokie poziomy cytokin prozapalnych ex vivo (Ryc. 4b). Miareczkowanie SBC od 1 ochotnika hodowano przez 4 dni w obecności zjadliwych M. tuberculosis ± autologicznych PBMC. Poziomy IFN-γ były > 30-krotnie wyższe w kulturach zawierających SBC, niezależnie od obecności PBMC.

figure-results-4
Rysunek 4: Poziomy cytokin w płynie SB, osoczu i supernatantach zakażonych Mtb. (a) Ten panel pokazuje poziomy cytokin w supernatantach płynu SB i osoczu od 6 ochotników zaszczepionych BCG. Słupki reprezentują średni poziom cytokin; Słupki błędów reprezentują zakres. (b) Ten panel pokazuje poziomy cytokin w supernatantach z 4 równoległych 4-dniowych kultur ex vivo o wielkości 600 μl 1 x 106 PBMC (czarne paski), 1,75 x 105 SBC (białe paski) i 1 x 106 PBMC wzbogaconych 0,5 lub 1,75 x 105 SBC (szare paski) zakażonych Mtb. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy manuskrypt opisuje praktyczną procedurę badania odpowiedzi ludzkiej pamięci immunologicznej in vivo, wykorzystującą przywoływanie antygenu skórnego i pobieranie komórek przez indukcję pęcherzy ssących. TST wykorzystano jako przykład śródskórnego odkładania antygenu i wycofania szczepionki BCG. Na koniec przedstawiono przykład charakterystyki próbki SB za pomocą cytometrii przepływowej i analizy cytokin multipleksowych, wykazując, że około jedna trzecia komórek SB to specyficzne dla antygenu wielofunkcyjne limfocyty T fenotypu pamięci efektorowej.

Kluczowe etapy tego protokołu obejmują technikę wstrzyknięcia śródskórnego, indukcję pęcherza ssącego i nakłucie blistra. Po pierwsze, prawidłowe osadzanie śródskórne wymaga przeszkolonego personelu. Nieprawidłowe osadzanie może prowadzić do nieoptymalnych wyników. PPD jest ogólnie dobrze znanym i bezpiecznym antygenem skórnym, ale jego skład może się różnić w zależności od producenta, co ogranicza porównywalność 13,20. Niniejszy raport zawiera instrukcje dotyczące pojedynczego osadzania śródskórnego 2 TU i opcjonalnie dwóch równoległych osadzania (2 x 2 TU), które mogą wymagać dodatkowego zatwierdzenia etycznego. Jednak w innych badaniach stosowano 10 TU, które zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia silnej reakcji skórnej10,21. Podczas etapu indukcji SB niewielki stopniowy wzrost podciśnienia zmniejszy ryzyko krwotoku i pęknięcia pęcherza. Szanse na zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi lub leukocytami z krwiobiegu są na ogół niskie2. Technika aseptycznego nakłuwania zapobiega skażeniu mikrobiologicznemu, a unikanie kontaktu między igłą do nakłuwania a dnem pęcherza skórnego zmniejsza zanieczyszczenia zanieczyszczeń lub zalegających komórek skóry. Jednak niektórzy badacze wolą zbierać płyn SB poprzez wywieranie nacisku na przebity pęcherz10. Może być konieczne nakłucie przegród w blistrze. Sama technika SB jest minimalnie inwazyjna; Zapadnięte SB goją się bez blizn, a infekcje są bardzo rzadkie. 2 Jednak może wystąpić pewien stopień hipopigmentacji i prawdopodobnie należy unikać indukcji SB u osób z historią bliznowacenia koloidalnego.

Ograniczenia techniczne obejmują niską całkowitą wydajność komórek, a co za tym idzie ograniczone możliwości długoterminowego przechowywania. Zależności między wydajnością leukocytów, klinicznymi odpowiedziami TST, rozmiarem pęcherza i zanieczyszczeniem erytrocytów zostały dokładnie opisane w innym miejscu 2,10. W przedstawionych tutaj eksperymentach BCG-recall (ryc. 1) mediana całkowitej wydajności z każdego blistra wynosiła 50 000, co sugeruje eksperyment na małą skalę z użyciem tych komórek, zwłaszcza jeśli SBC są badanesamodzielnie15. Jednak specyficzna populacja limfocytów T w próbce SB w większości przekracza to, co znajduje się w próbkach PBMC zarówno pod względem względnej, jak i bezwzględnej liczby komórek. W przykładzie przedstawionym na rysunku 2 liczba potrójnie dodatnich limfocytów T specyficznych dla PPD w próbce 100 000 komórek SB była ponad 2 razy większa niż liczba stwierdzona w 1 x 106 PBMC od tego samego dawcy (dane nie pokazane). Wizualna ocena reakcji TST jest najpowszechniejszą metodą kliniczną oceny pamięci M. tuberculosis. Warto zauważyć, że podstawowa adaptacyjna reakcja immunologiczna nie osiąga szczytu w tym samym czasie, co kliniczna reakcja skórna 2,21. Nie u wszystkich osób zaszczepionych BCG lub narażonych na Mtb rozwiną się silne reakcje TST i strategie klasyfikacji, a postępowanie z próbkami od osób niereagujących na TST, a także wcześniejsze uczulenie na prątki w badanej populacji, muszą być brane pod uwagę przed rozpoczęciem badania wycofania przy użyciu tej metody. Ponadto, zarówno w próbkowaniu SB, jak i ocenie wizualnej, istnieje możliwość teoretycznego błędu systematycznego u osób ze zmniejszoną reakcją skórną z powodu globalnej lub związanej ze skórą upośledzenia odporności, co obserwuje się na przykład w zakażeniu wirusem HIV i niektórych grupach wiekowych 2,13,18,20. Ponadto dobrze znane jest immunologiczne wzmocnienie reakcji TST za pomocą wielokrotnych testów20,22. Jednak fenotypy komórek SB pozostają raczej stałe, gdy TST są powtarzane10. Obserwacja ta potwierdza rolę przypominania SB w badaniach podłużnych komórkowych odpowiedzi immunologicznych.

W przypadku immunologów z komórek T wycofanie SB pozwala na pobranie dużych frakcji komórek specyficznych dla antygenu. Jednak czas SB dla próbki z osadzania PPD ma kluczowe znaczenie, ponieważ zarówno skład komórkowy, jak i mikrośrodowisko cytokin zmieniają się w czasie. W tym protokole pęcherze indukowano 7 dni po prowokacji, a izolowane komórki były głównie limfocytami T pamięci efektorowej CD4 +, w tym wysokimi frakcjami komórek z koekspresją IFN-γ, TNF-α i IL-2. Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi badaniami opisującymi, w jaki sposób aktywacja, proliferacja i różnicowanie limfocytów T zachodzi w skórze przygotowanej PPD 2,15,21. Kinetyczne badania SB u osób uczulonych na PPD sugerują, że bardzo wczesna reakcja skóry jest niespecyficzna; jednak już w ciągu pierwszych dni po prowokacji PPD odpowiedź zostaje zdominowana przez limfocyty T CD4 + (opisano zarówno fenotypy pamięci centralnej, jak i pamięci efektorowej), a po 3 dniach odpowiedź jest zdominowana przez wysokie frakcje cytokin specyficznych dla PPD wytwarzających limfocyty T CD4 + 2,8,10,15,21. Ta adaptacyjna odpowiedź cytokin pozostaje wykrywalna przez ponad 2 tygodnie 2,8,10,23. Dzień 7 po TST wydaje się być najbardziej optymalnym punktem czasowym dla zbierania limfocytów T pamięci CD4 +wytwarzających cytokiny 2. Jednak inne punkty czasowe mogą być oczywiście istotne w zależności od antygenu i odpowiedzi będącej przedmiotem zainteresowania. Warto zauważyć, że w jednym z badań stwierdzono, że adaptacyjna odpowiedź PPD osiąga szczyt nieco wcześniej ze spadkiem wydzielania cytokin prozapalnych już 5 dni po TST10.

Płyn SB zawiera wysoki poziom zarówno cytokin prozapalnych, jak i innych białek, które okazały się reprezentatywne dla mikrośrodowiska skóry15,24. Badania kinetyczne wykazały, że poziomy TNF-α i IFN-γ w płynie SB osiągają szczyt po 3 dniach, podczas gdy poziomy IL-2 osiągają szczyt po 7 dniach 2,10, co prawdopodobnie odzwierciedla dominację reakcji adaptacyjnych na tym późniejszym etapie. Ponieważ komórki SB zostały aktywowane in vivo, wykazują wysokie spontaniczne uwalnianie cytokin, a także potencjał do specyficznego uwalniania po ponownej stymulacji (ryc. 3 i 4).

Niniejszy raport koncentruje się na odporności limfocytów T CD4 +. Jak wykazano na rycinie 2, większość izolowanych limfocytów T była rzeczywiście CD4 +, podczas gdy w płynie ssącym nie było prawie żadnych limfocytów T CD8 +. Jest to zgodne z innymi badaniami SB PPD-recall wykazującymi niskie proporcje i gorszą zdolność migracyjną limfocytów T CD8 + w porównaniu z limfocytami T CD4 + 2,8,10,23. Preferowana byłaby dalsza charakterystyka wkładu CD8+; Wykracza to jednak poza zakres niniejszego sprawozdania.

Limfocyty T są uważane za niezbędne do kontroli immunologicznej Mtb; Jednak trudno było zidentyfikować wiarygodny korelat ochrony odzwierciedlonej w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej z krwi25,26. Ta przeszkoda poważnie utrudnia opracowywanie nowych szczepionek przeciwko gruźlicy, ponieważ obecnie nie ma alternatywy dla dużych i bardzo kosztownych badań klinicznych nad skutecznością27. Twórcy szczepionki przeciw gruźlicy określają immunogenność szczepionki, oceniając małe i przejściowe zmiany w populacjach limfocytów T specyficznych dla szczepionkiwe krwi 28,29. Wątpliwe jest jednak, czy niewielka frakcja krążących limfocytów T specyficznych dla antygenu znajdująca się we krwi jest istotna (tj. zdolna do migracji do miejsca infekcji i reprezentatywna dla bogatego w limfocyty T mikrośrodowiska kontrolującego Mtb)27,30,31.

Opierając się na wcześniejszych badaniach i danych przedstawionych w niniejszym dokumencie, model przypominania skóry SB stanowi niewykorzystany potencjał w badaniu limfocytów T specyficznych dla szczepionki. Model ten nie tylko umożliwia przypomnienie sobie odpowiedzi na szczepionkę wygenerowanej kilkadziesiąt lat temu, ale także umożliwia ocenę prawdziwego potencjału pamięciowego w kontekście specyficznym dla tkanki 15,18,19,21. Nowatorskie, specyficzne testy skórne, które obejmują antygeny składające się również z kandydujących podjednostek szczepionek przeciw gruźlicy, sugerują nowe możliwości oceny szczepionek przy użyciu tego modelu28,32. Co więcej, analizy transkryptomiczne sugerują, że komórkowa odpowiedź immunologiczna generowana w skórze z prowizją PPD jest podobna do odpowiedzi znalezionej w płucu18 zakażonym Mtb.

Podczas gdy biopsje stemplujące skórę pozwalają również na pobranie komórek ze skóry i dostarczają informacji przestrzennych, w porównaniu z próbkowaniem SB, metoda ta jest bardziej inwazyjna i wymaga przetwarzania enzymatycznego lub mechanicznego w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych33. Pomiary cytokin i markerów komórkowych są porównywalne między tymi dwiema metodami 2,10.

Metoda blistrów ssących została już zastosowana w wielu dziedzinach badań medycznych poza dermatologią, samodzielnie lub w połączeniu z ogólnoustrojowym lub miejscowym wyzwaniem skórnym. Przykłady obejmują badania nad sepsą, chorobą limfoproliferacyjną związaną z wirusem Epsteina-Barr, neuropatią cukrzycową, wpływem glikokortykosteroidów na spożycie oraz badaniami na ludziach testującymi przeciwciała terapeutyczne lub modele terapii ukierunkowanych na limfocyty T 10,34,35,36,37,38.

Z terapeutycznego punktu widzenia, metoda przypominania skórnego SB oferuje wyjątkowe korzyści w badaniu potencjału pamięci centralnych limfocytów T i - zarówno z biologicznego, jak i technicznego punktu widzenia - skóra wydaje się zapewniać odpowiedni przedział do pobierania próbek 2,15,18,19,21 . W szczególności, w porównaniu z tradycyjnym, biernym pobieraniem próbek krążących PBMC, metoda przypominania skórnego SB pozwala na badanie limfocytów T, które udowodniły zdolność do migracji z węzła chłonnego w odpowiedzi na odpowiedni antygen i zakończenia lokalnej ekspansji i różnicowania w specyficznym dla tkanki kontekście in vivo 15,18,19,21.

Podsumowując, zademonstrowany tutaj model może być istotny dla badaczy zajmujących się ludzką odpornością adaptacyjną i czynnikami ukierunkowanymi na limfocyty T (tj. w wakcynologii chorób zakaźnych lub badaniach nad rakiem). Model TST zastosowany w tym protokole ma oczywiście szczególne znaczenie w dziedzinie wakcynologii gruźlicy. Jednak podstawowa koncepcja tego modelu ma szerokie zastosowanie w innych dziedzinach badań.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Madsowi Radmerowi Jensenowi za jego praktyczne i akademickie rady; Lau Lindqvist i Kaare Svejstrup za dostarczenie fachowej wiedzy technicznej; Helene Bæk Juel, Jonathanowi Filskovowi, Signe T. Schmidt i Solveig W. Harpøth za pomoc techniczną; personelowi poradni gruźliczej w Gentofte w celu odbycia szkolenia w zakresie podawania PPD; oraz wszystkim ochotnikom do udziału w badaniu. Projekt ten jest finansowany przez Komisję Europejską w ramach programu H2020 [numer grantu TBVAC2020 643381], a partnerom konsorcjum serdecznie dziękujemy za owocne dyskusje.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rękawice do użytku laboratoryjnegoImtex, Dania1013
Spray do dezynfekcji Apotek, Dania82% alkohol, z gliceryną, do ludzkiej skóry 
Swapy alkoholoweMediq, Dania1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0,1ml)AJ Vaccines
  Strzykawka Myjector ze stałą igłą TerumoA2361 ml/29G/12mm
Linijka Nie dotyczy  do oceny reakcji skórnej
Długopisnie dotyczy  do oceny reakcji skórnych
Przenośne urządzenie do odsysania płucLaerdal Medical, Dania78000011UWAGA.  Zmodyfikowany dla zakresów poniżej -40kPa i dostarczany z manometrem  (ref. 1031107) przez Dział Techniczny
Zespół komory podciśnieniowej szpitala Hvidovre, nieogrzewany z rurkami łączącymiElectronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Kryza, 47 mm, 10 mm OtwórElectronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Zestaw uszczelek przyrządu podciśnieniowegoElectronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Pasek do komory podciśnieniowej Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA12-calowa
taśma chirurgiczna Micropore  3M1533-12,5 cm x 9,1 m
Nakrętka z plastikowej tubki 15 mlSarstedt, Niemcy62,547,254
Bandaż TubigripMö lnlycke Health Care, Szwecja1443
Cosmopor sterylny opatrunek samoprzylepnyHartmann90083377,2 x 5 cm
2ml Strzykawka Koncentryczny Luer Slip Becton Dickinson 
Igła Microlance 23G/30mmBecton Dickinson300700
Safe-Lock (autoklawowane)Eppendorf  0030120086Autoklawizowana
wirówka Minispin plusEppendorf5453000011
Gibco AIM V MediumLife Technologies12055-091
, 300185 Probówki do mikrowirówek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kiistala, U. Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis. Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).
  2. Akbar, A. N., et al. Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo. Clinical & Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).
  3. Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).
  4. Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response. Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).
  5. Maranda, E. L., et al. Surgical management of leukoderma after burn: A review. Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).
  6. Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea. Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
  7. Maini, A. A., et al. A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  8. Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo. Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).
  9. Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).
  10. Belson, A., et al. Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).
  11. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  12. Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses. Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).
  13. CDC. TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , https://www.cdc.gov/tb/publications/factsheets/testing/skintesting.htm (2018).
  14. Vukmanovic-Stejic, M., et al. Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans. The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).
  15. Reed, J. R., et al. Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).
  16. Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery. The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).
  17. Bond, E., et al. Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).
  18. Bell, L. C. K., et al. In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis. PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469(2016).
  19. Tomlinson, G. S., et al. Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test. European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).
  20. Nayak, S., Acharjya, B. Mantoux test and its interpretation. Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).
  21. Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans. Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).
  22. Menzies, D. Interpretation of Repeated Tuberculin Tests. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).
  23. Pitzalis, C., et al. Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies. European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).
  24. Kool, J., et al. Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins. Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).
  25. Flynn, J. L., Chan, J. Immunology of tuberculosis. Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).
  26. Kagina, B. M. N., et al. Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Guérin vaccination of newborns. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).
  27. García-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints. Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).
  28. Luabeya, A. K. K., et al. First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults. Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).
  29. Tameris, M., et al. The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses. PloS One. 9 (2), e87340(2014).
  30. Woodworth, J. S., et al. Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung. Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).
  31. Gideon, H. P., et al. Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization. PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603(2015).
  32. Ruhwald, M., et al. Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon γ release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial. The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).
  33. He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).
  34. Koskela, M., et al. Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).
  35. Wada, T., et al. Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease. The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).
  36. Andersson, C., Rajala, T., Särkkä, A. Hierarchical models for epidermal nerve fiber data. Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).
  37. Ramshanker, N., et al. Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).
  38. Bouma, G., et al. CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

T limfocyty swoiste dla antygenucytometria przep ywowaanaliza cytokinwstrzykni cie PPDszczepienie BCGindukcja sk rnapobieranie p cherzyanaliza in vivo

Powiązane artykuły