Dostarczanie CRISPR za pośrednictwem wirusa za pośrednictwem adenowirusa do edycji genów serca u myszy

Technologia CRISPR (ang. clustered, regularly interspace, short palindromic repeats) stanowi najnowszy postęp w inżynierii genomu i zrewolucjonizowała obecną praktykę genetyki w komórkach i organizmach. Edycja genomu oparta na CRISPR wykorzystuje pojedynczy przewodnik RNA (gRNA) do kierowania endonukleazy związanej z CRISPR, takiej jak białko 9 (Cas9) i Cpf1 związane z CRISPR, do celu genomowego DNA, który jest komplementarny w sekwencji do protospaceru kodowanego przez gRNA ze specyficznym motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM)^1,2. PAM różni się w zależności od gatunku bakterii genu Cas9 lub Cpf1. Najczęściej stosowana nukleaza Cas9 pochodząca ze Streptococcus pyogenes (SpCas9) rozpoznaje sekwencję PAM NGG, która znajduje się bezpośrednio za sekwencją docelową w genomowym DNA, na nici niedocelowej. W miejscu docelowym białka Cas9 i Cpf1 generują pęknięcie dwuniciowe (DSB), które jest następnie naprawiane przez wewnętrzne mechanizmy naprawy DNA komórkowego, w tym niehomologiczne szlaki łączenia końców (NHEJ) i naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR)^3,4. W przypadku braku matrycy DNA do rekombinacji homologicznej, DSB jest przede wszystkim naprawiany przez podatny na błędy szlak NHEJ, co może powodować insercje lub delecje (indele) nukleotydów powodujące mutacje przesunięcia ramki odczytu, jeśli DSB zostały utworzone w regionie kodującym genu ^5,6. W związku z tym system CRISPR jest szeroko stosowany do inżynierii mutacji powodujących utratę funkcji w różnych modelach komórkowych i całych organizmach w celu zbadania funkcji genu. Co więcej, katalitycznie nieaktywne Cas9 i Cpf1 zostały opracowane w celu transkrypcyjnego i epigenetycznego modulowania ekspresji docelowych genów^7,8.

Niedawno, zarówno SpCas9, jak i SaCas9 (pochodzące od Staphylococcus aureus) zostały zapakowane w rekombinowane wektory wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) w celu poporodowej korekty genów w zwierzęcym modelu chorób ludzkich, w szczególności dystrofii mięśniowej Duchenne'a (DMD)^{9,10,11,12,13,14,15}. DMD jest śmiertelną chorobą recesywną sprzężoną z chromosomem X, spowodowaną mutacjami w genie DMD, który koduje białko dystrofiny^16,17, dotykającą około jednego na 3500 urodzeń płci męskiej według badań przesiewowych noworodków^18,19. Charakteryzuje się postępującym osłabieniem i zanikiem mięśni. Pacjenci z DMD zwykle tracą zdolność chodzenia między 10 a 12 rokiem życia i umierają z powodu niewydolności oddechowej i/lub serca w wieku 20-30 lat²⁰. Warto zauważyć, że kardiomiopatia rozwija się u >90% pacjentów z DMD i stanowi główną przyczynę zgonów u pacjentów z DMD^21,22. Chociaż Deflazacort (lek przeciwzapalny) i Eteplirsen (lek na pomijanie eksonów do pomijania eksonu 51) zostały niedawno zatwierdzone do leczenia DMD przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA)^23,24, żadna z tych metod leczenia nie koryguje wady genetycznej na poziomie genomowego DNA. Mysz mdx, która jest nosicielem mutacji punktowej w eksonie 23 genu dystrofiny, była szeroko stosowana jako model DMD²⁵. Ponadto wcześniej wykazaliśmy, że funkcjonalna ekspresja dystrofiny została przywrócona przez delecję w ramce genomowego DNA obejmującego eksony 21, 22 i 23 w mięśniach szkieletowych myszy mdx przy użyciu domięśniowego dostarczania Ad-SpCas9 / gRNA⁹, oraz w mięśniu sercowym myszy mdx / utrophin ^+/- przy użyciu dożylnego i dootrzewnowego dostarczania rAAVrh.74-SaCas9 / gRNA²⁶.

W tym protokole szczegółowo opisujemy każdy krok w poporodowej edycji genów serca w celu przywrócenia dystrofiny u myszy mdx/utropin^+/- za pomocą wektorów rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, od projektowania gRNA do analizy dystrofiny w sekcjach mięśnia sercowego.

Zwierzęta użyte w tym protokole były utrzymywane w Laboratorium Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu Stanowego Ohio zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania zwierząt. Wszystkie badania na zwierzętach zostały autoryzowane przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki, Użytkowania i Przeglądu Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio.

1. Projektowanie i klonowanie gRNA do wektora CRISPR

1. Wybierz 2 gRNA ukierunkowane na dystrofinę intron 20 i intron 23 (i20 i i23) dla SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT i i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (sekwencja PAM jest podkreślona i zapisana kursywą).
   UWAGA: Miejsca docelowe dla i20 i i23 są oddalone o około 23 kilo pary zasad (kbp). Aby zakłócić gen kodujący, zaleca się umieszczenie dwóch gRNA celujących w wspólne egzony z sekwencją NNGRRT PAM dla SaCas9 (najlepiej NNGAAT, NNGGGT i NNGAGT) i odległością w granicach 20 kbp.
2. Do wyżarzania oligonukleotydów gRNA (100 μmol/L) należy użyć następujących parametrów PCR w 1x buforze do wyżarzania (5x zapas buforowy do wyżarzania zawiera 0,5 mol/L K-octanu, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-octanu, pH 7,4): 95 °C 10 min, 90 cykli od 95 do 59 °C ze spadkiem o 0,4 °C na cykl przez 20 s, 90 cykli po 59 do 32 °C ze spadkiem o 0,3 °C na cykl przez 20 s, 20 cykli po 32 do 26 °C ze spadkiem o 0,3 °C na cykl przez 20 s.
3. Zligować wyżarzone oligonukleotydy gRNA do pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA przy użyciu ligazy DNA BsaI i T4 w jednej reakcji (1 μL 50 ng/μL pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 μL wyżarzonych oligonukleotydów, 1,5 μL 10x bufor ligazy DNA T4, 0,5 μl ligazy DNA T4, 1 μL BsaI, 10 μL ddH₂O), w następujących warunkach reakcji w cyklerze PCR: 5 cykli [37 °C 5 min i 16 °C 10 min]; 37 °C 20 min; 80 °C 5 min.
4. Przekształć 15 μl produktu ligacji w 30 μl kompetentnych komórek, pokryć komórki na płytce agarowej 100 μg/ml ampicyliny i hodować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
5. Zebrać 5-10 kolonii i wyhodować je w pożywce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C, 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką przez 3-4 godziny.
6. Przesiewać kolonie metodą PCR: 10 μL 2x PCR master mix, 8 μL ddH₂O, 1 μL kultury E. Coli, 1 μL 10 μmol/L U6-forward starter, 1 μL i20 lub i23 gRNA reverse starter. Parametry cykliczne PCR: 95 °C 5 min, 35 cykli 95 °C 30 s, 61 °C 30 s, 72 °C 30 s.
7. Przygotować 5 ml kultury dodatnich klonów, dodając 4 ml świeżej pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i hodować przez noc w temperaturze 37 °C, 250 obr./min.
8. Oczyść DNA plazmidu za pomocą odpowiedniego zestawu do ekstrakcji plazmidu i zweryfikuj plazmid przez sekwencjonowanie Sangera ze starterem U6-forward.
9. Hodowla komórek C2C12 w DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% Pen-Strep aż do osiągnięcia ~70% konfluencji w celu zbadania skuteczności edycji genów plazmidów.
10. Elektroportować łącznie 5 μg mieszaniny plazmidów SaCas9/gRNA w stosunku molowym 1:1 do 1 x 10⁶ komórek C2C12 zgodnie z protokołem producenta.
11. Po 48 godzinach od transfekcji zbierz komórki C2C12 i wyekstrahuj genomowe DNA.
12. Użyj 100 ng genomowego DNA jako matrycy do przeprowadzenia reakcji PCR dla locus dystrofiny myszy: starter do przodu 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 μL 10 μmol/L), starter odwrotny 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 μL 10 μmol/L), 10 μL 2x zielona mieszanka główna PCR, 7 μL ddH2O, 1 μL genomowego DNA (100 ng). Stosować warunki cykliczne PCR jako 95 °C 5 min, 35 cykli [95 °C 30 s, 61 °C 30 s, 72 °C 30 s], 72 °C 2 min.

2. Produkcja rAAV

1. Aby wyhodować komórki, wysiewaj komórki AD293 na 20 do 40 15-centymetrowych szalkach i utrzymuj w DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% Pen-Strep, aż osiągniesz ~ 90% konfluencji w celu transfekcji.
2. Rozcieńczyć 3 plazmidy 200 μl zredukowanej pożywki surowicy (na miskę): 1)10 μg pHelper; 2) 5 μg pXR (rh.74 lub inne serotypy) oraz 3) łącznie 5 μg mieszaniny pX601-i20 i pX601-i23 (stosunek 1:1). Przeprowadzić transfekcję polietyleneniminy (PEI) mieszając z 80 μl PEI i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać mieszaninę do kultur komórkowych AD293 kroplami.
3. W przypadku produkcji wirusa AAV, po 72 godzinach od transfekcji, należy użyć skrobaka do komórek, aby zebrać zarówno pożywkę, jak i granulki komórek AD293 przez odwirowanie przy 1100 x g przez 10 minut.
4. Zawiesić osady komórkowe w 15 ml buforu do lizy rAAV (50 mmol/l Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5), a następnie wykonać 3 cykle zamrażania i rozmrażania z naprzemienną inkubacją w ciekłym azocie i łaźni wodnej o temperaturze 42 °C. Przechowywać lizaty komórkowe w temperaturze -80 °C do przyszłego przetwarzania, jeśli nie są one przetwarzane natychmiast.
5. Przefiltrować pożywkę hodowlaną za pomocą filtra 0,45 μm i dodać 40% PEG8000 w 2,5 mol/L NaCl do końcowego stężenia 8%. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę i odwirowywać przy 1100 x g przez 15 minut.
6. Zawiesić osady w buforze do lizy rAAV i połączyć z lizatami komórkowymi z kroku 2.3, a następnie poddać działaniu benzonazy (50 U/ml) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
7. Odwirować mieszaninę 1100 x g zawierającą rAAV poddaną działaniu benzonazy przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zachować supernatant (surowy preparat rAAV).

3. Oczyszczanie i zagęszczanie rAAV

1. Załaduj surowy preparat rAAV na gradient jodiksanolu w probówce ultrawirówkowej w następującej kolejności od góry do dołu: surowy lizat AAV (~15 ml), 8 ml 15% jodiksanolu, 6 ml 25% jodiksanolu, 5 ml 40% jodiksanolu, 5 ml 58% jodiksanolu. Napełnij pozostałą pustą objętość probówki do góry za pomocą 1x DPBS.
2. Odwirować próbki o masie 230 000 x g w wirniku ultrawirówki przez 120 minut w temperaturze 10 °C i zebrać 3 - 4 ml frakcji o 40% gradiencie zawierającej cząstki rAAV za pomocą igły 18 G.
3. Rozcieńczyć cząstki rAAV za pomocą 1x DPBS i odwirować za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego (MWCO 100 kDa). Powtórz ten krok 3-5 razy i na koniec zagęścić preparat rAAV do 300-500 μL.

4. Mianowanie rAAV

1. Wyekstrahować genomowe DNA z 2 μl stężonego rAAV, wytrącić 3 M NaOAc w etanolu i ponownie zawiesić w 20 μl ddH₂O.
2. Otrzymać krzywą wzorcową do oznaczania ilościowego rAAV przez szeregowe rozcieńczanie plazmidu pX601: 1 x 10⁹, 1 x 10^8, 1 x 10⁷, 1 x 10⁶, 1 x 10⁵ kopii w każdych 10 μL ddH₂O. Rozcieńczyć próbki rAAV poddane działaniu DNAazy w stosunku 1:10, 1:50, 1:100 i 1:1000.
3. Oznaczyć miano rAAV metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) przy użyciu zestawu qPCR zgodnie z instrukcją producenta w systemie Real-Time PCR: 1 μL 10 μmol/L każdego startera (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC i 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 μL 2x PCR master mix, 1 μL rozcieńczone próbki rAAV i 2 μL ddH₂O. Przeprowadzić reakcję z następującymi parametrami cyklicznymi: 95 °C 3 min, 45 cykli [95 °C 5 s i 61 °C 20 sek].

5. Dożylne i dootrzewnowe wstrzyknięcie rAAVrh.74-CRISPR do noworodków mdx/utropin^+/- myszy

1. Unieruchomić młode myszy mdx/^utrofiny+/- (dzień 3), umieszczając je na lodzie na 1 minutę, a następnie podawać z 1 x 10¹² cząstkami wirusa w 50 μl na mysz ogólnoustrojowo przez dostęp zadoczodołowy lub wstrzyknięcie dootrzewnowe.
2. Pozwól myszom dojść do siebie i umieść je z powrotem w klatkach domowych. Po dziesięciu tygodniach od podania rAAV należy poddać myszy eutanazji przez ekspozycję na CO₂ w celu pobrania tkanek.
3. Błyskawiczne zamrażanie tkanek w celu ekstrakcji genomowego DNA i RNA oraz stosowanie chłodzącego izopentanu w ciekłym azocie do zamrażania tkanek za pomocą związku o optymalnej temperaturze cięcia do kriosekcji.

6. Analiza wyników edycji genów docelowych

1. Analiza genomowego DNA PCR
   1. Wyizoluj całkowite genomowe DNA z tkanek serca myszy mdx/utropin+^/- leczonych rAAV lub bez.
   2. Użyj tego samego protokołu w kroku 1.12 do analizy PCR.
2. Analiza RT-PCR ekspresji dystrofiny
   1. Wyodrębnij całkowite RNA z tkanek serca za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcją producenta.
   2. Aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, należy wstępnie potraktować całkowity RNA DNazą wolną od RNaz i użyć 5 μg potraktowanego RNA jako matrycy do syntezy pierwszej nici cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji.
   3. Użyj produktu do odwrotnej transkrypcji do analizy RT-PCR ekspresji dystrofiny za pomocą starterów cDNA dystrofiny: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT i 5'- TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
3. Oszacowanie skuteczności edycji genów za pomocą analizy qPCR
   1. Oszacuj skuteczność edycji genów za pomocą ilościowego RT-PCR w celu wykrycia redukcji transkryptów zawierających ekson 22 za pomocą startera do przodu (ekson 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAAA i startera odwrotnego (ekson 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Użyj Gapdh jako genu referencyjnego ze starterem do przodu: 5'- AGGTTGTCTCCTGCGACTTC i starterem odwrotnym: 5'- GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
   2. Przeprowadzić ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) za pomocą zestawu qPCR zgodnie z instrukcją producenta w systemie Real-Time PCR i 2-etapowymi warunkami reakcji: 95 °C 3 min, 45 cykli 95 °C 5 s i 61 °C 30 sek.
4. Barwienie immunofluorescencyjne w celu analizy ekspresji dystrofiny
   1. Zamrożone tkanki pociąć za pomocą kriostatu o grubości 10 μm. Zamrożone skrawki utrwalić 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   2. Przemyć 2x PBS i inkubować z roztworem blokującym (10% surowicy końskiej) przez 1 godzinę.
   3. Inkubować pierwszorzędowe przeciwciało antydystrofiny w temperaturze 4 °C przez noc.
   4. Przemyć szkiełka PBS 3 x 5 min i inkubować z fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi (1:500) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   5. Zamontuj szkiełka za pomocą medium montażowego z DAPI i obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego.

7. Analiza off-target za pomocą testu T7E1

1. Przewiduj potencjalne witryny niedocelowe, korzystając z internetowych narzędzi do projektowania CRISPR, takich jak .
2. Amplifikować regiony genomu obejmujące 5-10 górnych potencjalnych miejsc poza celem za pomocą PCR: genomowe DNA 200 ng, 1 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności, 5 μl 10x mieszanina buforowa PCR, 1,5 μl 10 μmol/L specyficznych dla miejsca starterów do przodu i do tyłu, dostosowując całkowitą objętość do 50 μl z ddH₂O.
3. Uruchom produkty PCR za pomocą elektroforezy, wyekstrahuj i oczyść DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometrów.
4. Promuj tworzenie heterodupleksu poprzez denaturację i ponowne wyżarzanie oczyszczonych amplikonów powoli w buforze 2.1 przy użyciu cyklera PCR. Stosuj te same warunki jazdy na rowerze, jak opisano w kroku 1.2.
5. Ponownie wyżarzone produkty trawić przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą 0,5 μl enzymu T7E1 i analizować reakcję za pomocą elektroforezy przy użyciu 1-2% żelu agarozowego.
   UWAGA: Amplikony mogą być również analizowane za pomocą ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania.

Skuteczność gRNA w wywoływaniu delecji docelowego regionu genomowego DNA powinna być oceniana w hodowlach komórkowych przed umieszczeniem w rAAV do badań in vivo. W tym celu gRNA i konstrukty eksprymujące SaCas9 zostały elektroporowane w komórkach C2C12, a genomowe DNA przeanalizowano metodą PCR ze starterami flankującymi miejsca docelowe (Ryc. 1). Produkt PCR o wartości ~ 500 pz wskazuje na pomyślną delecję docelowego genomowego DNA wynikającą z edycji genów, podczas gdy komórki kontrolne nie powinny dawać prążka ze względu na duży rozmiar genomowego DNA.

Po potwierdzeniu skuteczności gRNA w hodowlach komórkowych, można je zapakować do rAAVrh.74 lub innych serotypów (takich jak AAV6, 8 lub 9, wszystkie wykazujące silne dostarczanie genów sercowych) za pomocą kotransfekcji trzech plazmidów do komórek AAV293. Odkryliśmy, że nie jest konieczne wykonanie dwóch indywidualnych preparatów rAAV dla dwóch gRNA, zamiast tego zmieszaliśmy dwa konstrukty gRNA w równym stosunku molowym i wyprodukowaliśmy pojedynczy preparat rAAV. Cząstki wirusa rAAV oczyszczono za pomocą ultrawirowania w gradiacji gęstości, a czystość przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE. Wysoce oczyszczony preparat rAAV dałby tylko trzy prążki odpowiadające białkom kapsydu VP1, VP2 i VP3, odpowiednio, na SDS-PAGE, jak pokazano na Rysunek 2.

Oczyszczone cząsteczki wirusa rAAVrh.74 zostały wstrzyknięte noworodkom mdx/utropin+/- za pomocą iniekcji zaoczodołowej lub dootrzewnowej. Odkryliśmy, że obie metody działały dobrze w przypadku dostarczania rAAVrh.74-CRISPR do serca. Myszy, którym wstrzyknięto implanty, mogą być analizowane pod kątem ekspresji dystrofiny za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (Rycina 3) w wieku 10 tygodni.

Rysunek 1: Walidacja gRNA do edycji genów za pośrednictwem SaCas9 w komórkach C2C12. Reprezentatywna elektroforeza w żelu agarozowym wykazała produkty PCR genomowego DNA wyekstrahowanego z elektroporowanego C2C12 z lub bez SaCas9 / gRNA. Strzałka wskazuje, że produkt PCR powstał w wyniku edycji genów. Gapdh posłużył jako punkt odniesienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza cząstek rAAVrh.74 za pomocą SDS-PAGE. Oczyszczone cząstki wirusa rAAVrh.74 przeprowadzone na SDS-PAGE wykazały trzy prążki, odpowiadające trzem białkom kapsydu AAV, VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) i VP3 (62 kDa). Obecność tylko tych 3 prążków wskazuje na wysoką czystość preparatu rAAV bez zanieczyszczania innych białek komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Barwienie immunofluorescencyjne skrawków serca myszy mdx / utrofiny + / - po 10 tygodniach po leczeniu AAV-SaCas9 / gRNA. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne wykazały ekspresję dystrofiny (czerwonej) i kaweoliny-3 (zielonej) w odcinkach serca myszy WT, mdx / utropina +/- i mdx / utrofiny +/- leczonych 1 x10 12 vg AAV-SaCas9 / gRNA ogólnoustrojowo. DAPI użyto do oznaczania jąder (kolor niebieski). Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nie występuje konflikt interesów.