Method Article

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bliska interakcja między gospodarzem rośliny a powiązanymi mikroorganizmami jest kluczowa w określaniu kondycji roślin i może sprzyjać poprawie tolerancji na stresy abiotyczne i choroby. Ponieważ mikrobiom roślinny może być bardzo złożony, często preferowane są tanie i wysokoprzepustowe metody, takie jak sekwencjonowanie genu 16S rRNA oparte na amplikonach, w celu scharakteryzowania jego składu mikrobiologicznego i różnorodności. Jednak wybór odpowiedniej metodologii podczas przeprowadzania takich eksperymentów ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia błędów systematycznych, które mogą utrudniać analizę i porównania między próbkami i badaniami. Protokół ten szczegółowo opisuje znormalizowaną metodologię pobierania i ekstrakcji DNA z próbek gleby, ryzosfery i korzeni. Ponadto zwracamy uwagę na dobrze ugruntowaną linię sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA, która pozwala na badanie składu społeczności bakteryjnych w tych próbkach i może być łatwo dostosowana do innych genów markerowych. Rurociąg ten został zatwierdzony dla różnych gatunków roślin, w tym sorgo, kukurydzy, pszenicy, truskawek i agawy, i może pomóc w przezwyciężeniu problemów związanych z zanieczyszczeniem organellami roślinnymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiomy związane z roślinami składają się z dynamicznych i złożonych społeczności mikroorganizmów składających się z bakterii, archeonów, wirusów, grzybów i innych mikroorganizmów eukariotycznych. Oprócz dobrze zbadanej roli w wywoływaniu chorób roślin, mikroorganizmy związane z roślinami mogą również pozytywnie wpływać na zdrowie roślin poprzez poprawę tolerancji na stresy biotyczne i abiotyczne, promowanie dostępności składników odżywczych i wspomaganie wzrostu roślin poprzez produkcję fitohormonów. Z tego powodu istnieje szczególne zainteresowanie charakteryzacją taksonów, które wiążą się z endosferami korzeni roślin, ryzosferami i otaczającą glebą. Podczas gdy niektóre drobnoustroje mogą być hodowane w izolacji na pożywkach laboratoryjnych, wiele z nich nie może, częściowo dlatego, że mogą polegać na symbiotycznych związkach z innymi drobnoustrojami, rosnąć bardzo wolno lub wymagać warunków, których nie można odtworzyć w środowisku laboratoryjnym. Ponieważ pozwala obejść potrzebę hodowli i jest stosunkowo niedroga i ma wysoką przepustowość, profilowanie filogenetyczne oparte na sekwencjach próbek drobnoustrojów środowiskowych i związanych z gospodarzem stało się preferowaną metodą oznaczania składu zbiorowisk drobnoustrojów.

Wybór odpowiednich technologii sekwencjonowania dostarczanych przez różne platformy sekwencjonowania nowej generacji (NGS)1 zależy od potrzeb użytkowników, z ważnymi czynnikami, takimi jak: pożądany zasięg, długość amplikonu, oczekiwana różnorodność społeczności, a także wskaźnik błędów sekwencjonowania, długość odczytu i koszt za przebieg/megabase. Inną zmienną, którą należy wziąć pod uwagę w eksperymentach sekwencjonowania opartych na amplikonach, jest to, jaki gen zostanie amplifikowany i jakie startery zostaną użyte. Projektując lub wybierając startery, naukowcy są często zmuszeni do kompromisów między uniwersalnością amplifikacji a rozdzielczością taksonomiczną możliwą do osiągnięcia dzięki uzyskanym amplikonom. Z tego powodu w tego typu badaniach często wybierano startery i markery, które selektywnie celują w określone podzbiory mikrobiomu. Ocena składu społeczności bakteryjnych jest zwykle dokonywana przez sekwencjonowanie jednego lub więcej hiperzmiennych regionów bakteryjnego genu 16S rRNA2,3. W tym badaniu opisujemy protokół sekwencjonowania oparty na amplikonach opracowany dla platformy NGS, który jest ukierunkowany na region V3-V4 o długości 500 pz genu bakteryjnego 16S rRNA, co pozwala na szeroką amplifikację taksonów bakteryjnych, zapewniając jednocześnie wystarczającą zmienność, aby rozróżnić różne taksony. Ponadto protokół ten można łatwo dostosować do stosowania z innymi zestawami starterów, takimi jak te ukierunkowane na marker ITS2 grzybów lub podjednostkę 18S rRNA eukariontów.

Podczas gdy inne podejścia, takie jak metagenomika typu shotgun, metatranskryptomika i sekwencjonowanie pojedynczych komórek, oferują inne korzyści, w tym rozdzielcze genomy mikrobiologiczne i bardziej bezpośredni pomiar funkcji społeczności, techniki te są zazwyczaj droższe i bardziej intensywne obliczeniowo niż profilowanie filogenetyczne opisane tutaj4. Dodatkowo, przeprowadzanie metagenomiki i metatranskryptomiki shotgun na próbkach korzeniowych daje duży odsetek odczytów należących do genomu rośliny żywicielskiej, a metody przezwyciężenia tego ograniczenia są nadal opracowywane5,6.

Jak w przypadku każdej platformy eksperymentalnej, profilowanie oparte na amplikonach może wprowadzić szereg potencjalnych uprzedzeń, które powinny być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentu i analizy danych. Obejmują one metody pobierania próbek, ekstrakcję DNA, wybór starterów PCR oraz sposób przygotowania biblioteki. Różne metody mogą znacząco wpłynąć na ilość generowanych danych użytkowych, a także mogą utrudniać wysiłki zmierzające do porównania wyników między badaniami. Na przykład wykazano, że metoda usuwania bakterii ryzosfery7 oraz stosowanie różnych technik ekstrakcji lub wybór zestawów do ekstrakcji DNA8,9 znacząco wpływają na dalszą analizę, która prowadzi do różnych wniosków dotyczących tego, które drobnoustroje są obecne i jaka jest ich względna liczebność. Ponieważ profilowanie oparte na amplikonie można dostosować, dokonywanie porównań między badaniami może być trudne. Projekt Earth Microbiome sugeruje, że naukowcy badający złożone systemy, takie jak mikrobiom związany z roślinami, skorzystaliby na opracowaniu standardowych protokołów jako sposobu na zminimalizowanie zmienności spowodowanej zastosowaniem różnych metod między badaniami10,11. W tym miejscu omawiamy wiele z powyższych tematów i w razie potrzeby przedstawiamy sugestie dotyczące najlepszych praktyk.

Protokół demonstruje proces pobierania próbek gleby, ryzosfery i korzeni z dwukolorowego sorgo oraz ekstrakcji DNA za pomocą sprawdzonego zestawu do izolacji DNA11. Dodatkowo, nasz protokół zawiera szczegółowy przepływ pracy sekwencjonowania amplikonów, przy użyciu powszechnie używanej platformy NGS, w celu określenia struktury społeczności bakteryjnych12,13,14. Protokół ten został zatwierdzony do stosowania w szerokim zakresie żywicieli roślinnych w niedawno opublikowanym badaniu korzeni, ryzosfery i powiązanych gleb 18 gatunków jednoliściennych, w tym Sorgo bicolor, Zea mays i Triticum aestivum15. Metoda ta została również zatwierdzona do użytku z innymi genami markerowymi, czego dowodem jest jej udane zastosowanie do badania genu markera ITS2 grzyba w badaniach mikrobiomu agawy16,17 i truskawkowy mikrobiom18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie i oddzielanie próbek endosfery korzeniowej, ryzosfery i gleby

  1. Przed wejściem na pole należy autoklawować ultraczystą wodę (co najmniej 90 ml wody na próbkę) w celu sterylizacji. Przygotować bufor do usuwania epifitów (co najmniej 25 ml na próbkę), dodając 6,75 g KH2PO4, 8,75 g K2HPO4 i 1 ml Triton X-100 do 1 l sterylnej wody. Wysterylizuj bufor za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,2 μm.
    1. W przypadku kroków od 1.2 do 1.5 należy zawsze nosić czyste rękawice wysterylizowane etanolem i wymieniać rękawice między każdą próbką, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Wysterylizuj cały sprzęt 70% etanolem i wytrzyj cały sprzęt do czysta między próbkami. Przed pobraniem próbek należy określić optymalną głębokość pobierania próbek dla eksperymentu i zachować spójność ze wszystkimi pobraniami gleby i korzeni.
  2. Aby pobrać zbiorcze próbki gleby, użyj sterylizowanego etanolem kolektora rdzenia glebowego, aby uzyskać glebę wolną od korzeni roślin, pobierając rdzeń około 23 do 30 cm od podstawy rośliny.
  3. Przenieś glebę do plastikowej torby, homogenizuj glebę przez delikatne potrząsanie i przenieś porcję próbki gleby (około 600 mg) do wypełnienia jednej probówki o pojemności 2 ml. Natychmiast umieść probówkę o pojemności 2 ml na suchym lodzie lub błyskawicznie zamroź probówkę w płynieN2, aż będzie gotowa do przeprowadzenia ekstrakcji DNA (krok 2).
    1. W niektórych środowiskach otaczająca gleba może zawierać materiał roślinny. W takim przypadku użyj wysterylizowanego sitka o średnicy 2 mm, aby oddzielić resztki roślin od gleby przed umieszczeniem ich w plastikowej torbie.
  4. Aby zebrać korzeń i ryzosferę, użyj łopaty wysterylizowanej etanolem, aby wykopać roślinę, uważając, aby uzyskać jak najwięcej korzenia. Głębokość zależy od rośliny. Podczas gdy małe rośliny, takie jak pszenica, można usunąć, kopiąc kilka centymetrów, większe rośliny, takie jak sorgo, mogą wymagać 30 cm lub więcej. Delikatnie strząśnij nadmiar ziemi z korzeni, aż do powierzchni korzeni przylgnie około 2 mm gleby.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pracy z małymi roślinami, z delikatnymi korzeniami lub na suchych glebach o wysokiej zawartości gliny. Idealnie, po wstrząśnięciu na korzeniach powinna pozostać tylko cienka warstwa gleby. Jeśli pozostaną duże agregaty gleby, można użyć gumowego młotka do usunięcia gleby, delikatnie uderzając w podstawę pędu. Jeśli ilość gleby pozostałej po tym procesie przekracza lub jest mniejsza niż 2 mm, należy zanotować przybliżoną grubość.
  5. W przypadku dużych roślin należy użyć sterylnych nożyczek i/lub nożyc, aby przeciąć reprezentatywny podfragment korzeni i umieścić co najmniej 500 mg tkanki korzeniowej w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml. W przypadku mniejszych traw umieść cały system korzeniowy w fiolce. Dodać wystarczającą ilość bufora do usuwania epifitów, aby przykryć korzenie, a następnie natychmiast umieścić próbkę na suchym lodzie lub błyskawicznie zamrozić próbkę w cieczy N2,
    UWAGA: Należy uważać, aby nie przepełnić stożkowej fiolki o pojemności 50 ml, ponieważ utrudni to mycie. Powinno być wystarczająco dużo pustej przestrzeni, aby bufor epifitu był w stanie przepłynąć na dno, otoczyć korzenie w całej fiolce i przykryć górę. Ponieważ niektóre trawy mają więcej biomasy korzeniowej, niż zmieści się w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml, należy zebrać podsekcję korzeni. Należy jednak zauważyć, że cięcie korzeni może prowadzić do wypłukiwania bakterii endofitycznych do frakcji ryzosfery, dlatego należy zminimalizować łamanie korzeni. Jeżeli próbki nie są przetwarzane natychmiast po powrocie do laboratorium, można je przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Aby oddzielić ryzosferę od korzeni, należy rozmrozić próbkę korzenia na lodzie, a następnie poddać próbkę korzeni sonikacji w temperaturze 4 °C przez 10 minut impulsami o mocy 160 W przez 30 s, w odstępie 30 s. Przenieść korzenie do schłodzonej (4 °C), czystej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnych kleszczyków. Nie wyrzucaj oryginalnej rurki z buforem i ziemią, która jest frakcją ryzosfery (Rysunek 1).
  7. Odwirować probówkę zawierającą bufor i ryzosferę przez 10 minut w temperaturze 4 °C, 4 000 x g. Zdekantować supernatant, błyskawicznie zamrozić probówkę zawierającą frakcję ryzosfery w cieczyN2 i przechowywać frakcję ryzosfery w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do przystąpienia do ekstrakcji DNA (etap 2).
  8. Aby umyć korzenie, dodaj około 20 ml schłodzonej (4 °C) sterylnej wody do frakcji korzeniowej. Umyj korzeń, energicznie potrząsając (ręcznie lub mikserem, przez 15 - 30 s), a następnie spuść wodę.
  9. Powtórz ten krok co najmniej dwa razy, aż na powierzchni korzenia nie pozostanie gleba. Jeśli ekstrakcja DNA (krok 2) nie zostanie przeprowadzona natychmiast, owinąć korzenie w sterylną folię aluminiową, błyskawicznie zamrozić korzenie w płynieN2 i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do rozpoczęcia ekstrakcji DNA.

2. Ekstrakcja DNA

UWAGA: Podczas kroków 2 i 3, czyste rękawice wysterylizowane etanolem powinny być noszone przez cały czas, a wszystkie prace powinny być wykonywane na powierzchni sterylizowanej etanolem.

  1. Ekstrakcja DNA z próbek gleby i ryzosfery.
    1. Użyj sterylnej szpatułki, aby szybko przenieść 250 mg gleby i ryzosfery z kroków 1.3 i 1.7 do oddzielnych probówek zbiorczych dostarczonych w komercyjnym zestawie do izolacji DNA przeznaczonym do ekstrakcji z gleby, a następnie przystąp do izolacji DNA zgodnie z protokołem dostawcy zestawu.
    2. Po wylucowaniu DNA w buforze elucyjnym dostarczonym przez zestaw do izolacji DNA, należy przechowywać DNA w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie ono gotowe do przejścia do etapu 3.
  2. Wyodrębnij DNA z próbek korzeni.
    1. Schłodzić wysterylizowany moździerz i tłuczek za pomocą płynu N2. Odmierz od 600 do 700 mg tkanki korzeniowej i umieść tkankę w moździerzu. Ostrożnie dodaj tyle płynu N2, aby przykryć korzenie.
    2. Zmiel korzenie na małe kawałki. Kontynuuj proces dodawania cieczyN2 i mielenia (co najmniej dwa razy, zachowuj spójność między próbkami), aż korzenie staną się drobnym proszkiem. Upewnij się, że tkanka korzeniowa nie rozmraża się podczas tego kroku.
      Uwaga: Podczas pracy z cieczą N2.
      należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice kriogeniczne) UWAGA: W przypadku ekstrakcji DNA niskiej jakości korzystne może być zmielenie nadmiaru korzeni na proszek i przechowywanie proszku w temperaturze -80 °C.
    3. Szybko, zanim proszek korzeniowy zacznie się rozmrażać, użyj sterylnej szpatułki, aby przenieść proszek korzeniowy do wstępnie zważonych probówek o pojemności 1,5 ml na lodzie. Zapisz wagę probówki i proszku. Zazwyczaj przenosi się 300 - 400 mg proszku.
    4. Użyj sterylnej szpatułki, aby szybko przenieść 150 mg proszku korzeniowego do probówki pobranej dostarczonej w komercyjnym zestawie do izolacji DNA przeznaczonym do ekstrakcji z gleby, a następnie kontynuuj izolację DNA zgodnie z protokołem dostawcy zestawu.
      UWAGA: W przypadku niektórych próbek korzeni w granulce DNA może pozostać wysokie stężenie substancji organicznych, co zapobiega amplifikacji DNA podczas PCR, zwłaszcza gdy stosuje się inny protokół ekstrakcji DNA (np. Ekstrakcja CCAB). W razie potrzeby wyczyść DNA, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w zestawie do oczyszczania DNA ze środowiska.
  3. Zmierz stężenie wszystkich próbek DNA za pomocą fluorometru laboratoryjnego o wysokiej czułości.
    1. Dodaj 1 - 20 μl każdej eluowanej próbki DNA do probówek dostarczonych w zestawie do testów o wysokiej czułości dsDNA. Dodać roztwór roboczy fluorometru (barwnik w stosunku 1:200) do 200 μl.
    2. Przygotować dwie dodatkowe probówki zawierające 10 μl DNA wzorca 1 (0 ng/μL DNA) lub 10 μl wzorca 2 (100 ng/μL) i dodać 190 μl roztworu roboczego fluorometru do każdego wzorca.
    3. Zmierzyć stężenie wzorców i każdej próbki. Jeśli nie zostanie to zrobione automatycznie, należy obliczyć stężenie DNA na podstawie wyjściowej absorbancji za pomocą regresji liniowej dwóch wzorców.

3. Przygotowanie i zgłoszenie biblioteki Amplicon

  1. Przygotuj materiały do reakcji amplifikacji.
    1. Próbki DNA należy rozmrozić w temperaturze 4 °C i przechowywać je na lodzie przez cały etap 3. Losowo dobieraj kolejność próbek DNA, aby zminimalizować odchylenia ze względu na lokalizację na płytce PCR (Tabela 2).
    2. Na 96-dołkowej płytce do PCR rozcieńczyć DNA z każdej próbki w wodzie molekularnej do 5 ng/μl w całkowitej objętości 20 μl. Dodać 20 μl wody molekularnej do czterech studzienek narożnych jako kontrolę ujemną do amplifikacji (ślepe próby) (tabela 2).
    3. Ułóż startery z kodami kreskowymi (10 μM) w probówkach paskowych do PCR lub na płytce 96-dołkowej, tak aby można je było dodać za pomocą pipety wielokanałowej (Rysunek 2).
    4. Przygotować wystarczającą ilość głównej mieszanki PCR do amplifikacji każdej próbki DNA w trzech egzemplarzach. Przygotuj 1,5 μl BSA (20 mg / ml), 37,5 μl wstępnie przygotowanej mieszanki 2x master (złożonej z buforu PCR, MgCl2, dNTP i polimerazy Taq DNA), 0,57 μl chloroplastu PNA (100 μM), 0,57 μl mitochondrialnego PNA (100 μM) i 25,86 μl wody molekularnej.
    5. Wlej mieszankę wzorcową do sterylnego zbiornika na pipety wielokanałowej o pojemności 25 ml i rozprowadź 66 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki do PCR za pomocą pipety wielokanałowej.
      UWAGA: Podczas obliczania objętości odczynników dla mieszanki wzorcowej należy również uwzględnić 4 dołki ślepe na płytkę.
    6. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 6 μl DNA o stężeniu 5 ng/μl (z płytki znormalizowanego DNA) do płytki wzorcowej. Następnie dodaj do płytki głównej 1,5 μl startera 10 μM do przodu, tak aby każda kolumna miała inny kod kreskowy do przodu, oraz 1,5 μl startera wstecznego 10 μM, tak aby każdy rząd miał inny odwrócony kod kreskowy (Rysunek 2).
      UWAGA: Przed dodaniem starterów, randomizowane płytki i mieszanka główna mogą być użyte do amplifikacji genów grzyba ITS lub ITS2, jeśli dodano różne startery. W takim przypadku można zastosować podobny projekt podkładu.
    7. Krótko odwirować płytkę przy 3 000 x g. Delikatnie wymieszać pipetą wielokanałową, a następnie podzielić na trzy płytki z 25 μl mieszaniny reakcyjnej.
      UWAGA: Chociaż trzy powtórzenia nie są bezwzględnie konieczne, zmniejsza to wpływ zmienności technicznej.
  2. Amplifikować DNA w każdej płytce za pomocą termocyklera ustawionego na następujące warunki: 180 s w 98 °C, 30 cykli: 98 °C przez 45 s (denaturacja), 78 °C przez 10 s (wyżarzanie PNA), 55 °C przez 60 s (wyżarzanie startera) i 72 °C przez 90 s (przedłużanie), następnie 600 s w temperaturze 72 °C, a następnie etap utrzymywania 4 °C. Po amplifikacji połącz trzy powtórzone płytki w jedną 96-dołkową płytkę.
  3. Określ ilościowo DNA za pomocą odczynników fluorometrycznych o wysokiej czułości w 96-dołkowym czytniku płytek.
    1. Dodać 2 μl każdego produktu PCR do 96-dołkowej mikropłytki wraz z 98 μl roztworu roboczego fluorometru (1:200 barwnik: bufor). Uwzględnij 4 studzienki jako wzorce: 5 μL wzorca DNA 1 (0 ng / μL DNA), 1 μL wzorca 2 (10 ng / μL), 2 μL wzorca 2 (20 ng / μL) i 5 μL wzorca 2 (50 ng / μL). Następnie dodać roztwór roboczy fluorometru do uzyskania końcowej objętości 100 μl.
      UWAGA: Każda próbka może być mierzona za pomocą fluorometru laboratoryjnego, jak opisano w kroku 2.3, jeśli czytnik płytek nie jest dostępny.
    2. Obliczyć stężenie DNA na podstawie wyjściowej absorbancji za pomocą regresji liniowej czterech wzorców.
    3. W przypadku pomyślnie amplifikowanych produktów z kodami kreskowymi (tych, których stężenie jest większe niż 15 ng/μl), należy zebrać 100 ng każdej próbki w jednej probówce o pojemności 1,5 ml (tabela 2).
    4. Obliczanie średniej objętości próbek dodanych do puli przy użyciu funkcji =ŚREDNIA() w programie arkusza kalkulacyjnego. Dodać objętość "ślepych" produktów PCR do próbek zbiorczych.
      UWAGA: Ponieważ "ślepe" produkty PCR mają swoje własne unikalne kombinacje kodów kreskowych, można je sekwencjonować w celu sprawdzenia pod kątem zanieczyszczeń laboratoryjnych.
  4. Zmierzyć stężenie połączonego produktu za pomocą fluorometru stacjonarnego, jak opisano w kroku 2.3, a następnie pobrać 600 ng DNA i rozcieńczyć w wodzie molekularnej do końcowej objętości 100 μl w probówce o pojemności 1,5 ml. Pozostały produkt należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przemyć podwielokrotność DNA o pojemności 600 ng, postępując zgodnie z ustalonym procesem oczyszczania PCR za pomocą paramagnetycznych kulek oczyszczających w formacie 96-dołkowym, z kilkoma wyjątkami.
    1. Przygotować świeżą porcję 600 μl 70% etanolu. Potrząśnij butelką z koralikami magnetycznymi, aby ponownie zawiesić koraliki, które osiadają na dnie.
    2. Dodać 1x objętość (100 μl) roztworu kulek do 600 ng porcji DNA. Dokładnie wymieszać, pipetując 10 razy. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty (lub do momentu, gdy roztwór będzie klarowny), aby oddzielić kulki od roztworu. Gdy probówka jest nadal w stojaku magnetycznym, należy ostrożnie zassać przezroczysty supernatant, nie dotykając kulek magnetycznych, i wyrzucić przezroczysty supernatant.
      UWAGA: W tym momencie produkty amplikonu są związane z kulkami magnetycznymi. Wszelkie koraliki, które zostaną naruszone lub zgubione podczas aspiracji, spowodują utratę DNA.
    4. Pozostaw probówkę w stojaku magnetycznym i dodaj do niej 300 μl 70% etanolu; inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 s. Odessać etanol i wyrzucić. Powtórz ten proces i usuń cały etanol po drugim praniu. Wyjmij rurkę ze stojaka magnetycznego i susz na powietrzu przez 5 minut.
    5. Do wysuszonych kulek dodać 30 μl wody molekularnej i wymieszać pipetując 10 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby oddzielić kulki od roztworu. Przenieść eluat do nowej probówki.
      UWAGA: Koraliki magnetyczne nie będą miały wpływu na dalsze reakcje.
  6. Zmierzyć końcowe stężenie oczyszczonego, połączonego DNA za pomocą fluorometru laboratoryjnego, jak opisano w kroku 2.3. Rozcieńczyć podwielokrotność do 10 nM w końcowej objętości 30 μl lub do stężenia i objętości preferowanych przez urządzenie do sekwencjonowania.
  7. Skorzystaj z usług zakładu sekwencjonowania, aby zsekwencjonować DNA na platformie NGS, sekwencjonowanie sparowanych końców 2 x 300 pz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonanie zalecanego protokołu powinno zaowocować zestawem danych indeksowanych odczytów parowanych końców, które mogą być dopasowane z powrotem do każdej próbki i przypisane do bakteryjnej operacyjnej jednostki taksonomicznej (OTU) lub dokładnego wariantu sekwencji (ESV, określane również jako wariant sekwencji amplikonu (ASV) i suboperacyjna jednostka taksonomiczna (sOTU)), w zależności od dalszej analizy. W celu uzyskania wysokiej jakości danych sekwencyjnych, na każdym etapie należy z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten demonstruje ugruntowaną linię produkcyjną do badania składu endosfery korzeniowej, ryzosfery i zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, od pobierania próbek w terenie po przetwarzanie próbek i sekwencjonowanie na dalszych etapach. Badanie mikrobiomów związanych z korzeniami stanowi wyjątkowe wyzwanie, częściowo ze względu na nieodłączne trudności w pobieraniu próbek z gleby. Gleby są bardzo zmienne pod względem właściwości fizycznych i chemicznych, a różne warunki glebowe mogą być oddalone od siebie nawet o k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS jest wspierany przez NSF Graduate Research Fellowship Program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1-10/20 i mikro; L filtrowane końcówki do mikropipetUSA Scientific1120-3810Można zastąpić odpowiednikami innych dostawców.
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlUSA Scientific1615-5510Można zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
10 &mikro; L Pipeta wielokanałowaEppendorf3122000027Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
10 &mikro; L, 100 i mikro; L oraz 1000 i mikro; L MikropipetyEppendorf3120000909Można zastąpić odpowiednikami innych dostawców.
100 &mikro; L Pipeta wielokanałowaEppendorf3122000043Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
1000 &mikro; L końcówki do mikropipet z filtremUSA Scientific1122-1830Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Probówki do mikrowirówek 2 mlUSA Scientific1620-2700Można zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Sito glebowe 2 mmDostawcy leśnictwa60141009Można zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
200 i mikro; L końcówki do mikropipet z filtremUSA Scientific1120-8810Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Zbiorniki o pojemności 25 mlVWR International LLC89094-664Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Fiolki stożkowe 50 mlThermo Fisher Scientific352098Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Filtry próżniowe 500 ml (0,2 i mikro; m wielkość porów)VWR International LLC156-4020
96-dołkowe mikropłytkiUSA Scientific655900
96-dołkowe płytki do PCRKoraliki BioRadHSP9631
Agencourt AMPure XPThermo Fisher ScientificNC9933872Instrukcja użycia:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf Folia
aluminiowaBoardwalk7124Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Waga analityczna o rozdzielczości 0,001 gOhaus PioneerPA323Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Ultrasonograf Bioruptor PlusDiagenodeB01020001
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) 20 mg / mlNew England BiolabsB9000S
WirówkaEppendorf5811000908W tym adaptery do wiader z płytkami 50 ml i 96 dołkami
Rękawice kriogeniczneMillipore SigmaZ183490Można zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Zestaw DNeasy PowerClean (opcjonalnie)Qiagen Inc.12877-50Poprzednio MoBio
DNeasy PowerSoil kitQiagen Inc.12888-100Poprzednio MoBio
Suchy lódDowolnyNA
DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321DNie zastępuj
EtanolVWR International LLC89125-188Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Worki do zamrażania o pojemności galonówZiplocNAMożna zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Czytnik mikropłytek Gemini EMUrządzenia molekularneEMMoże używać innego fluorometru, który odczytuje 96-dołkowe płytki od góry.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Fartuch laboratoryjnyWorkriteJ1367Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Płynny N2DowolnyNAMoże zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Płyn N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
System oczyszczania wody ultraczystej Milli-Q MilliporeSigmaSYNS0R0WW
MiniwirówkaEppendorf5404000014
Woda klasy molekularnejThermo Fisher Scientific4387937Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
ZaprawyVWR International LLC89038-150Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Rękawice nitryloweThermo Fisher Scientific19167032BMożna zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Ręczniki papieroweVWR International LLCBWK6212Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Folia uszczelniająca do płytek PCRThermo Fisher ScientificNC9684493
Probówki paskowe do PCRUSA Scientific1402-2700
TłuczkiVWR International LLC89038-166Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Szpatułki plastikoweLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNA - chloroplast i mitochondrialnePNA BioNAUpewnij się, że zweryfikowałeś sekwencję bioinformatycznie
Okulary ochronneMillipore Sigma Z759015Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
Fluorometr Qubit 3.0Thermo Fisher ScientificQ33216
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSThermo Fisher ScientificQ32854
Młotek gumowy (opcjonalnie)Ace Hardware2258622Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Nożyce lub nożyczkiVWR International LLC89259-936Można zastąpić odpowiednikami od innych dostawców.
ShovelHome Depot2597400Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Kolektor rdzenia gruntowego (mała średnica: < 1 cal)Ben Meadows221700Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Butelki z rozpylaczemSanta Cruz Biotechnologysc-395278Można zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Standardowe odsolone startery z kodami kreskowymi (10 &mikro; M) (Tabela 1)IDTNA4 nmole Ultramer DNA Oligo ze standardowym odsalaniem. Adapter NGS i starter sekwencjonowania (Tabela 1) są przeznaczone do użytku z Illumina MiSeq przy użyciu chemii v3.
TermocyklerThermo Fisher ScientificE950040015Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Triton X-100Sigma-AldrichX100Może zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
Łodzie wagoweSpectrum ChemicalsB6001WMożna zastąpić odpowiednikiem od innych dostawców.
magnes

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592(2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827(2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209(2014).
  6. Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773(2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062(2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692(2013).
  21. O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257(2016).
  25. Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O'Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564(2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804(2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258(2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360(2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Root Microbiome16S rRNA SequencingSoil DNA ExtractionRhizosphere IsolationRoot EndosphereAmplicon Library PreparationPCR PurificationBacterial Community AnalysisPlant Microbiome ProfilingDNA Isolation Kit

Related Articles