Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57565

⸱

4 maja 2018

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Louis University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Streszczenie

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) odgrywa rolę w ochronie komórek przed wewnątrzkomórkowym stresem redukcyjnym, jak również w ochronie przed uszkodzeniem przez zewnątrzkomórkowe utleniacze. Ten proces transportu elektronów z reduktorów wewnątrzkomórkowych do utleniaczy zewnątrzkomórkowych nie jest dobrze zdefiniowany. W tym artykule przedstawiono testy spektrofotometryczne za pomocą miotub C2C12 do monitorowania tPMET z wykorzystaniem zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów: rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolu-1 (WST-1) i 2,6-dichlorofenolindofenolu (DPIP lub DCIP). Dzięki redukcji tych akceptorów elektronów jesteśmy w stanie monitorować ten proces w analizie w czasie rzeczywistym. Po dodaniu do testów enzymów, takich jak oksydaza askorbinianowa (AO) i dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), możemy określić, która część tPMET jest spowodowana odpowiednio eksportem askorbinianu lub produkcją ponadtlenków. Podczas gdy wykazano, że WST-1 daje stabilne wyniki przy niskim tle, DPIP był w stanie ponownie utlenić się po dodaniu AO i SOD, co wykazano za pomocą analizy spektrofotometrycznej. Metoda ta demonstruje wielodołkowy, szybki test spektrofotometryczny w czasie rzeczywistym, który ma przewagę nad innymi metodami stosowanymi do monitorowania tPMET, takimi jak redukcja żelazocyjanku (FeCN) i żelazorytochromu c.

Wprowadzenie

Zdolność oczyszczonych błon plazmatycznych do redukcji akceptorów elektronów doprowadziła do wniosku, że błona plazmatyczna ma wrodzoną zdolność redoks1. Wcześniej obserwowany u grzybów, roślin i zwierząt, tPMET jest procesem wspólnym dla wielu organizmów2,3,4,5. W szczególności proces ten wykazano w Saccharomyces cerevisiae, komórkach marchwi, erytrocytach, limfocytach, kostniakomięsaku, czerniaku, makrofagach, mięśniach szkieletowych i neutrofilach2,3,4,5,6,7. W procesie, który transportuje elektrony przez błonę plazmatyczną w celu redukcji zewnątrzkomórkowych utleniaczy, tPMET bierze udział w wielu funkcjach komórkowych, w tym: wzrost komórek5,8, żywotność komórki9, metabolizm żelaza10, sygnalizacja komórkowa11,12,13 oraz ochrona przed reaktywnymi formami tlenu12,14,15. Ze względu na udział tPMET w wielu funkcjach komórkowych, przypuszcza się, że brak równowagi tPMET przyczynia się do rozwoju niektórych poważnych schorzeń, w tym raka16, choroby układu krążenia17 i zespół metaboliczny18.

Istnieje wiele sposobów monitorowania transferu elektronów przez błonę plazmatyczną, ale najczęściej używaną techniką jest ocena redukcji zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów za pomocą testów kolorymetrycznych. Powszechnie stosowanymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów są sole tetrazoliowe, DPIP, FeCN i żelazochrom c19,20. Najczęściej stosowaną solą tetrazolową jest sól drugiej generacji znana jako WST-119. Związek ten jest łatwiejszy do wykorzystania w testach kolorymetrycznych w porównaniu z solami tetrazolowymi pierwszej generacji ze względu na dwie grupy sulfonianów, które zwiększają jego rozpuszczalność w wodzie21. WST-1, w połączeniu z pośrednim akceptorem elektronów 1-metoksy-fenazynosiarczanem (mPMS), ulega redukcji w dwóch zdarzeniach przeniesienia pojedynczego elektronu. Ta redukcja zmienia słabo zabarwioną, utlenioną formę WST-1 na bardziej intensywną, żółtą formazan20,22. WST-1 ma wysoki współczynnik ekstynkcji molowej wynoszący 37 x 103 M-1 cm-1, co prowadzi do wysokiej czułości testu21,22. DPIP jest również wykorzystywany jako zewnątrzkomórkowy akceptor elektronów do monitorowania tPMET. Wykazano, że DPIP może być redukowany zewnątrzkomórkowo przez tPMET bez pomocy pośrednich akceptorów elektronów23,24. Ze względu na brak pośrednich akceptorów elektronów, DPIP może bezpośrednio odbierać elektrony z błony plazmatycznej, w przeciwieństwie do WST-124. Podobnie jak w przypadku DPIP, wykazano, że FeCN jest redukowany zewnątrzkomórkowo do żelazocyjanku przez tPMET bez pomocy pośrednich akceptorów elektronów19,24. W przeciwieństwie do WST-1 i DPIP, FeCN ma niski współczynnik ekstynkcji molowej, co prowadzi do niższej czułości testu9. Innym powszechnie stosowanym zewnątrzkomórkowym akceptorem elektronów do monitorowania tPMET jest żelazorytochrom c. Podobnie jak w przypadku WST-1, redukcja żelazorytochromu c zwiększa się przy użyciu pośredniego akceptora elektronów, mPMS22. Jednak w przeciwieństwie do WST-1, metoda ferrycytochromu c jest mniej czuła ze względu na wysokie tło i niski współczynnik ekstynkcji molowej22.

Tutaj prezentujemy metodę analizy tPMET w czasie rzeczywistym za pomocą testów spektrofotometrycznych. W metodzie wykorzystano zewnątrzkomórkowe akceptory elektronów WST-1 i DPIP, ponieważ oba mają wysoki współczynnik ekstynkcji molowej, a jednocześnie są tańsze w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów, takimi jak ferrycytochrom c. Użyliśmy metosiarczanu fenazyny (PMS) zamiast mPMS, mają one podobny skład chemiczny, a PMS jest znacznie tańszy. mPMS jest stabilny fotochemicznie, co jest ważną cechą zestawu komercyjnego, który wymaga długiego okresu przydatności do spożycia. Jednak sprawiamy, że PMS jest świeży dla każdego testu, więc stabilność nie powinna być problemem. Przedstawiamy również metodę oceny możliwych oddziaływań enzymatycznych (patrz Rysunek 1) między zewnątrzkomórkowym akceptorem elektronów a enzymami, które można wykorzystać do dalszego scharakteryzowania procesu tPMET. W szczególności enzymy AO i SOD mogą być używane do określania, która część tPMET jest spowodowana transportem askorbinianu lub zewnątrzkomórkowym uwalnianiem ponadtlenku, dwiema powszechnymi metodami transportu elektronów przez błonę plazmatyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć schematyczny przegląd kluczowych kroków.

1. Test redukcyjny WST-1

  1. Hoduj i różnicuj komórki przylegające do C2C12 przy użyciu standardowych procedur hodowli komórek7 na 96-dołkowej płytce z wykorzystaniem rzędów A-F.
    1. Użyj pożywki różnicującej składającej się ze zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 2% surowicą końską, 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    2. Monitorując udział askorbinianu w tPMET, należy uzupełnić pożywkę różnicującą kwasem askorbinowym o stężeniu 100 μM. Pozwól komórkom inkubować się w pożywce różnicowej przez ~ 24-48 godzin.
  2. Przygotuj standardowe roztwory WST-1 i PMS.
    1. Aby przygotować 10 mM zapasu WST-1, rozpuść 0,033 g WST-1 (masa formuły (FW): 651,34 g/mol) w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Aby przygotować 5 mM zapasu PMS, rozpuść 0,0023 g PMS (FW: 306,34 g/mol) w 1,5 ml dejonizowanegoH2O(diH2O). Przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem.
  3. Dodać 0,0108 g glukozy dla końcowego stężenia 5 mM do 11,4 ml PBS lub buforowanej soli fizjologicznej HEPES (HBS; 20 mM soli sodowej HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mMMgSO4, 1 mM CaCl2). Dodać 480 μl 10 mM WST-1 dla końcowego stężenia 400 μM i 48 μL 5 mM PMS dla końcowego stężenia 20 μM.
  4. Monitorując udział askorbinianu w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 6 μl diH2O, a do drugiej podwielokrotności dodać 6 μl 2 kU/ml AO, aby uzyskać końcowe stężenie 2 U/ml.
  5. Monitorując udział ponadtlenków w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 55 μl 0,1 M buforu KPO4, a do drugiej podwielokrotności dodać 55 μl 6,5 kU/ml SOD dla końcowego stężenia 60 U/mL.
  6. Umyj komórki PBS. Odessać pożywkę i dodać 150 μl PBS. Następnie odessać PBS.
    UWAGA: Test wykonuje się za pomocą platerowanych, dołączonych komórek. W związku z tym nie ma wirowania ani stosowania trypsyny w procesie mycia.
  7. Dodać 100 μl roztworu WST-1 (-) SOD lub (-) AO do kolumn 1-6 i dodać 100 μl roztworu WST-1 (+) SOD lub (+) AO do kolumn 7-12 w płytce 96-dołkowej. Użyć wierszy G i H jako kontrolnych tła (tj. do monitorowania zmian absorbancji w samym odczynniku w studzienkach bez komórek).
  8. Mierzyć wartości absorbancji za pomocą spektrofotometru co 10 minut przez 1 godzinę przy długości fali 438 nm.
  9. Po odczytaniu odessać pożywkę i umyć każdą studzienkę 150 μl PBS. Następnie odessać PBS.
  10. Obliczyć zmianę absorbancji dla każdej studzienki, odejmując początkową absorbancję dla studzienki od absorbancji w dowolnym punkcie czasowym dla tej studzienki. Skorygować tę zmianę o zmianę absorbancji (jeśli występuje) zaobserwowaną w studzienkach tła (tj. studzienkach z roztworem testowym, ale bez komórek).
  11. W celu analizy znormalizuj dane absorbancji do 60-minutowego pomiaru kontrolnego lub przepłucz studzienki PBS lub HBS, a następnie wykonaj test białka kwasu bicinchoninowego (BCA).
  12. Dodać 2 mg/ml wzorca albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (zakres od 0,5-2 μl dla krzywej wzorcowej, w zależności od stopnia zbiegu komórek) do pustych studzienek (rzędy G i H), a następnie dodać odczynnik BCA do wszystkich studzienek.
  13. Określ ilościowo dane za pomocą nmol redukcji WST-1 na μg białka. Użyj 37 mM-1 cm-1 22 jako współczynnika ekstynkcji dla zredukowanego WST-1 przy 438 nm.

2. Test redukcji DPIP

  1. Hoduj i różnicuj przylegające komórki C2C12 zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 1.1.
  2. Przygotuj podstawowy roztwór DPIP 10 mM w następujący sposób. Rozpuścić 0,029 g DPIP (FW: 290,08 g/mol) w 10 ml diH2O. Potwierdzić stężenie DPIP, mierząc absorbancję przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Użyj 1 mM-1 cm-1 23 jako współczynnika ekstynkcji dla zmniejszonego DPIP przy 600 nm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 0,0108 g glukozy do 11,880 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM. Dodać 120 μl 10 mM DPIP, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM.
  4. Monitorując udział askorbinianu w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 6 μl diH2O, a do drugiej podwielokrotności dodać 6 μl 2 kU/ml AO, aby uzyskać końcowe stężenie 2 U/ml.
  5. Monitorując udział ponadtlenków w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 55 μl 0,1 M buforu KPO4, a do drugiej podwielokrotności dodać 55 μl 6,5 kU/ml SOD dla końcowego stężenia 60 U/mL.
  6. Odessać pożywkę i przepłukać komórki w 150 μl PBS. Odessać PBS i dodać 100 μl roztworu DPIP (-) SOD lub (-) AO do kolumn 1-6 i dodać 100 μl roztworu DPIP (+) SOD lub (+) AO do kolumn 7-12 w płytce 96-dołkowej. Użyj wierszy G i H jako kontrolnych tła (tj. do monitorowania zmian absorbancji w samym odczynniku w studzienkach bez komórek).
  7. Mierzyć absorbancję przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru co 10 minut przez 1 godzinę. Określić ilościowo zmianę absorbancji w stosunku do kontroli po 60 minutach, podobnie jak w krokach 1.9-1.13.

3. Określenie, czy akceptory zredukowanych elektronów są substratami dla AO czy SOD

  1. Do 5,436 ml PBS lub HBS dodać 240 μl 10 mM WST-1 dla końcowego stężenia 400 μM i 24 μL 5 mM PMS dla końcowego stężenia 20 μM.
    1. W przypadku DPIP dodać 60 μl 10 mM DPIP, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM, do 5,940 ml PBS lub HBS.
  2. Dodać 100 μl roztworu do każdej studzienki na płaskodennej 96-dołkowej płytce bez komórek i zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy 438 nm, dla WST-1, lub 600 nm, dla DPIP.
  3. Dodać 1 μl 10 mM askorbinianu do połowy studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM. Monitorować absorbancję, aż się ustabilizuje.
  4. Po ustabilizowaniu dodać 1 μl 200 U/ml AO dla końcowego stężenia 2 U/ml do każdej studzienki lub dodać 1 μl 6 kU/ml SOD dla końcowego stężenia 60 U/ml do każdego dołka i monitorować absorbancję przez 1 godzinę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu ANOVA z powtarzanymi pomiarami w oprogramowaniu statystycznym RStudio25. Wielkości prób podano w legendach do rycin.

W celu monitorowania tPMET wykorzystano miotuby C2C12 wraz z pozakomórkowymi akceptorami elektronów, WST-1 i DPIP. AO zastosowano w celu określenia, jaka część redukcji WST-1 i DPIP wynikała z odpływu askorbinianu, natomiast SOD wykorzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy dwie metody wykorzystania zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów, WST-1 i DPIP, w testach spektrofotometrycznych do monitorowania tPMET w miotubach C2C12. Dzięki wzrostowi linii komórkowych w standardowych procedurach hodowli i czytnikowi płytek spektrofotometru, możliwe jest monitorowanie tPMET za pomocą tych akceptorów elektronów w prostym teście mikropłytkowym. Redukcja WST-1 jest odtwarzalna od studni do studni w teście, ale występuje zmienność z dnia na dzień. Dzienny współczynnik zmienności (CV) ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Thomasowi Bellowi, Lyn Mattathil, Markowi Mannino i Neejowi Patelowi za ich wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez Publiczną Służbę Zdrowia Stanów Zjednoczonych R15DK102122 przyznaną przez Narodowy Instytut Cukrzycy oraz Chorób Układu Pokarmowego i Nerek (NIDDK) dla Jonathana Fishera. Wyłączną odpowiedzialność za treść manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy NIDDK lub National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolekcja kultur typu amerykańskiego C2C12 mioblastów CRL-1772
Zmodyfikowany orzeł Dulbecco średnio - niski poziom glukozySigmaD6046
Fetal Plex kompleks surowicy zwierzęcejGemini Bio-Products 100-602
penicylina-streptomycynaSigma516106
surowica koniaGibco Technologies16050-130
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigmaD8537
trypsyna-EDTASigmaT4049
Naczynia hodowlane 15 cmTPP93150
96 dołków płytki hodowlaneTPP92096
Sól sodowa 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H-tetrazolium (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
metosiarczan fenazyny SigmaP9625
Kwas L-askorbinowySigmaA5960
oksydaza askorbinianowa SigmaA0157
dysmutaza ponadtlenkowa SigmaS5395
Sól sodowa 2,6-dichloroindofenolu ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glukozaSigmaG7528
HEPES sól sodowaSigmaH3784
chlorek soduSigmaS7653
chlorek potasuFisher Scientific BP366
siarczan magnezu siedmiowodnySigmaM5921
dwuwodny chlorek wapniaSigmaC7902
fosforan potasuFisher Scientific BP363
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225
Powerwave X-IWycofane z produkcji Biotek Insturment 
Spektrofotometr Spectronic Genesys 5Thermo Scientific336001
Mikropłytka PureGrade 96-dołkowa, z dnem F, przezroczysta, nieobrobiona, niesterylnaMidSci781602
Czterowodny chlorek żelaza (II)Sigma220299
Siarczan żelaza (II) siedmiowodnySigma215422
hipoksantynaSigmaH9636
oksydaza ksantynowaSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentswycofane 
Spektrofotometr

Bibliografia

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89(2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza spektrofotometrycznaredukcja WST 1redukcja DPIPoksydaza askorbinianowadysmutaza ponadtlenkowaanaliza w czasie rzeczywistymp ytka wielodo kowanormalizacja bia ka
Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.