Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) odgrywa rolę w ochronie komórek przed wewnątrzkomórkowym stresem redukcyjnym, jak również w ochronie przed uszkodzeniem przez zewnątrzkomórkowe utleniacze. Ten proces transportu elektronów z reduktorów wewnątrzkomórkowych do utleniaczy zewnątrzkomórkowych nie jest dobrze zdefiniowany. W tym artykule przedstawiono testy spektrofotometryczne za pomocą miotub C2C12 do monitorowania tPMET z wykorzystaniem zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów: rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolu-1 (WST-1) i 2,6-dichlorofenolindofenolu (DPIP lub DCIP). Dzięki redukcji tych akceptorów elektronów jesteśmy w stanie monitorować ten proces w analizie w czasie rzeczywistym. Po dodaniu do testów enzymów, takich jak oksydaza askorbinianowa (AO) i dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), możemy określić, która część tPMET jest spowodowana odpowiednio eksportem askorbinianu lub produkcją ponadtlenków. Podczas gdy wykazano, że WST-1 daje stabilne wyniki przy niskim tle, DPIP był w stanie ponownie utlenić się po dodaniu AO i SOD, co wykazano za pomocą analizy spektrofotometrycznej. Metoda ta demonstruje wielodołkowy, szybki test spektrofotometryczny w czasie rzeczywistym, który ma przewagę nad innymi metodami stosowanymi do monitorowania tPMET, takimi jak redukcja żelazocyjanku (FeCN) i żelazorytochromu c.
Wprowadzenie
Zdolność oczyszczonych błon plazmatycznych do redukcji akceptorów elektronów doprowadziła do wniosku, że błona plazmatyczna ma wrodzoną zdolność redoks1. Wcześniej obserwowany u grzybów, roślin i zwierząt, tPMET jest procesem wspólnym dla wielu organizmów2,3,4,5. W szczególności proces ten wykazano w Saccharomyces cerevisiae, komórkach marchwi, erytrocytach, limfocytach, kostniakomięsaku, czerniaku, makrofagach, mięśniach szkieletowych i neutrofilach2,3
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć schematyczny przegląd kluczowych kroków.
1. Test redukcyjny WST-1
- Hoduj i różnicuj komórki przylegające do C2C12 przy użyciu standardowych procedur hodowli komórek7 na 96-dołkowej płytce z wykorzystaniem rzędów A-F.
- Użyj pożywki różnicującej składającej się ze zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 2% surowicą końską, 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Monitorując udział askorbinianu w tPMET, należy uzupełnić pożywkę....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu ANOVA z powtarzanymi pomiarami w oprogramowaniu statystycznym RStudio25. Wielkości prób podano w legendach do rycin.
W celu monitorowania tPMET wykorzystano miotuby C2C12 wraz z pozakomórkowymi akceptorami elektronów, WST-1 i DPIP. AO zastosowano w celu określenia, jaka część redukcji WST-1 i DPIP wynikała z odpływu askorbinianu, natomiast SOD wykorzys.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiliśmy dwie metody wykorzystania zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów, WST-1 i DPIP, w testach spektrofotometrycznych do monitorowania tPMET w miotubach C2C12. Dzięki wzrostowi linii komórkowych w standardowych procedurach hodowli i czytnikowi płytek spektrofotometru, możliwe jest monitorowanie tPMET za pomocą tych akceptorów elektronów w prostym teście mikropłytkowym. Redukcja WST-1 jest odtwarzalna od studni do studni w teście, ale występuje zmienność z dnia na dzień. Dzienny współczynnik zmienności (CV) .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Thomasowi Bellowi, Lyn Mattathil, Markowi Mannino i Neejowi Patelowi za ich wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez Publiczną Służbę Zdrowia Stanów Zjednoczonych R15DK102122 przyznaną przez Narodowy Instytut Cukrzycy oraz Chorób Układu Pokarmowego i Nerek (NIDDK) dla Jonathana Fishera. Wyłączną odpowiedzialność za treść manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy NIDDK lub National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolekcja kultur typu amerykańskiego C2C12 mioblastów | CRL-1772 | ||
| Zmodyfikowany orzeł Dulbecco średnio - niski poziom glukozy | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex kompleks surowicy zwierzęcej | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicylina-streptomycyna | Sigma | 516106 | |
| surowica konia | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco | Sigma | D8537 | |
| trypsyna-EDTA | Sigma | T4049 | |
| Naczynia hodowlane 15 cm | TPP | 93150 | |
| 96 dołków płytki hodowlane | TPP | 92096 | |
| Sól sodowa 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H-tetrazolium (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| metosiarczan fenazyny | Sigma | P9625 | |
| Kwas L-askorbinowy | Sigma | A5960 | |
| oksydaza askorbinianowa | Sigma | A0157 | |
| dysmutaza ponadtlenkowa | Sigma | S5395 | |
| Sól sodowa 2,6-dichloroindofenolu | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glukoza | Sigma | G7528 | |
| HEPES sól sodowa | Sigma | H3784 | |
| chlorek sodu | Sigma | S7653 | |
| chlorek potasu | Fisher Scientific | BP366 | |
| siarczan magnezu siedmiowodny | Sigma | M5921 | |
| dwuwodny chlorek wapnia | Sigma | C7902 | |
| fosforan potasu | Fisher Scientific | BP363 | |
| Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I | Wycofane z produkcji Biotek Insturment | ||
| Spektrofotometr Spectronic Genesys 5 | Thermo Scientific | 336001 | |
| Mikropłytka PureGrade 96-dołkowa, z dnem F, przezroczysta, nieobrobiona, niesterylna | MidSci | 781602 | |
| Czterowodny chlorek żelaza (II) | Sigma | 220299 | |
| Siarczan żelaza (II) siedmiowodny | Sigma | 215422 | |
| hipoksantyna | Sigma | H9636 | |
| oksydaza ksantynowa | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | wycofane |
Bibliografia
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
