Artykuł metodologiczny

Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57573

⸱

3 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół procesu produkcji polimerowych cienkowarstwowych struktur kompozytowych o różnych modułach lub grubościach Younga. Folie są produkowane do zaawansowanych badań nad kulturami komórkowymi lub jako kleje do skóry.

Streszczenie

W tym protokole prezentujemy metody wytwarzania cienkich warstw kompozytowych z elastomeru do zaawansowanych zastosowań w hodowlach komórkowych oraz do rozwoju klejów do skóry. Dwa różne poli-(dimetylosiloksany) (PDMS i miękki klej do skóry (SSA)) zostały wykorzystane do dogłębnego zbadania efektów biologicznych i właściwości adhezyjnych. Folie kompozytowe składają się z elastycznej warstwy nośnej i adhezyjnej powłoki wierzchniej. Obie warstwy zostały wyprodukowane techniką aplikacji rakli. W niniejszym badaniu zbadano adhezyjne zachowanie folii kompozytowych w funkcji grubości warstwy lub zmiany modułu Younga warstwy wierzchniej. Moduł Younga PDMS został zmieniony poprzez zmianę proporcji mieszania zasady do środka sieciującego. Ponadto grubość folii SSA została zróżnicowana od ok. 16 μm do ok. 320 μm. Do pomiarów grubości wykorzystano skaningową mikroskopię elektronową (SEM) i mikroskopię optyczną. Właściwości adhezyjne folii elastomerowych zależą w dużym stopniu od grubości warstwy, modułu Younga polimerów i charakterystyki powierzchni. W związku z tym zbadano normalną przyczepność tych folii do podłoży szklanych o gładkich i chropowatych powierzchniach. Naprężenia związane z odrywaniem i praca separacji zależą od proporcji mieszania elastomerów silikonowych.

Dodatkowo, grubość miękkiego kleju do skóry umieszczonego na podpartej warstwie spodniej została zmieniona w celu uzyskania plastrów do aplikacji na skórę. Przeprowadzono badania cytotoksyczności, proliferacji i adhezji komórkowej mysich fibroblastów L929 na błonach PDMS (stosunek mieszania 10:1) i SSA (stosunek mieszania 50:50). Pokazaliśmy tutaj po raz pierwszy porównanie obok siebie cienkich folii kompozytowych wykonanych z obu polimerów oraz przedstawiamy badania ich właściwości biologicznych i adhezyjnych.

Wprowadzenie

W tym protokole przedstawione są szczegółowe metody produkcji cienkich folii elastomerowych. Powszechnie dostępna technika rakli została wykorzystana do produkcji cienkich folii kompozytowych. Technika produkcji została wykonana na foliach polietylenowo-jelitowych (PET), co umożliwia późniejszą produkcję tych folii na dużą skalę. Nacisk w tym protokole kładzie się na ocenę odtwarzalności, precyzyjne wytwarzanie różnych warstw folii kompozytowych oraz określenie właściwości biologicznych i adhezyjnych końcowego plastra kompozytowego. Elastomer silikonowy poli-(dimetylosiloksan) (PDMS) jest szeroko stosowany w technologii biomedycznej, w tym w produkcji klejów do skóry, zastosowaniach mikrofluidycznych i dodatkowych dziedzinach badawczych1,2,3,4. Niedawno wprowadzono inną podklasę PDMS, tak zwane kleje do miękkiej skóry (SSA), szczególnie do delikatnego łączenia i rozklejania skóry.

Silikonowe SSA to elastomery funkcjonalizowane winylem, różniące się od analogicznych polimerów brakiem wzmacniającej krzemionki5. Podobnie jak w przypadku innych PDMS, moduł Younga SSA może być dostosowywany w szerokim zakresie, modulując stężenie czynnika sieciującego lub czas utwardzania6,7,8. Ta zmiana modułu elastomerów silikonowych Younga znacząco wpływa na właściwości adhezyjne materiału, a także ma poważne konsekwencje dla komórek prokariotycznych i eukariotycznych hodowanych na powierzchni9,10,11. Na komórkowym poziomie biologicznym wykazano, że komórki eukariotyczne reagują na poziomie transdukcji sygnału na modulację elastyczności matrycy lub grubości powierzchni9,10,12,13,14. W związku z tym istnieje szerokie zainteresowanie zastosowaniami polimerów o regulowanych właściwościach mechanicznych w hodowlach komórkowych. Co ważne, wewnętrznie niska energia powierzchniowa elastomerów na bazie silikonu nie zapewnia optymalnych warunków do hodowli komórkowej komórek eukariotycznych. Obróbka plazmą tlenową jest szeroko stosowaną techniką tymczasowego zwiększania niskiej energii powierzchniowej PDMS, co prowadzi do zwiększenia jego siły zrywania, zmniejszenia adsorpcji powierzchniowej cząsteczek, przy jednoczesnym promowaniu przyczepiania, rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek eukariotycznych15,16,17,18.

Oprócz właściwości materiałów, topografia powierzchni znacząco wpływa na adhezję komórkową i interakcję adhezyjną między dwoma materiałami19,20,21,22. Chropowatość powierzchni ma kilka czynników wpływających na powstawanie kontaktu między dwiema powierzchniami: zmniejszenie powierzchni styku, wysoka zmagazynowana energia sprężystości otaczająca nierówności, a także wpływ na propagację pęknięć mogą zmienić siłę klejenia23,24. Przyczepność folii samoprzylepnych do ludzkiej skóry to nowa dziedzina zastosowań, np. opatrunki na rany, mocowanie elektrod EKG lub innych urządzeń elektronicznych do noszenia25,26,27,28. Aby zmierzyć przyczepność klejów samoprzylepnych w odniesieniu do topografii powierzchni, w normalnych pomiarach przyczepności można użyć podłoży szklanych o różnym stopniu chropowatości8,21. W tym przypadku wybrano dwa podłoża szklane w celu zbadania właściwości adhezyjnych folii polimerowych. W pierwszej kolejności scharakteryzowano folie kompozytowe z warstwą nośną PDMS w proporcji mieszania 10 do 1 części wagowych pokrytych PDMS o różnych proporcjach mieszania. W drugim etapie przygotowano warstwę kleju SSA z równą wagą obu składników i o różnej grubości warstwy na wierzchu nośnej folii PDMS.

Protokół

Uwaga: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki materiałów (MSDS). Niektóre z chemikaliów użytych w tym protokole są substancjami drażniącymi, ostro toksycznymi i/lub rakotwórczymi. Podczas pracy z tymi odczynnikami należy stosować wszelkie odpowiednie zasady bezpieczeństwa. Obejmuje to stosowanie środków technicznych (dygestorium) oraz środków ochrony indywidualnej (okularów ochronnych, rękawic, fartucha laboratoryjnego, długich spodni i pełnych butów). Część poniższych procedur obejmuje hodowlę linii komórkowej zwierzęcej. W związku z tym należy przestrzegać odpowiednich przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego. Odpady chemiczne i biologiczne muszą być utylizowane zgodnie z konkretnymi przepisami i zaleceniami krajowymi oraz instytucjonalnymi.

1. Przygotowanie kompozytowych struktur cienkowarstwowych z elastomeru krzemowego

  1. Przygotowanie polimerów
    1. Aby przygotować 1,1 g PDMS w stosunku 10:1, wymieszaj 1,0 g związku A z 0,1 g związku B.
    2. Wymieszaj i odgazuj prepolimery w mikserze szybkim z prędkością 2350 rpm w próżni przez 3 min.
    3. Zmień stosunek masowy związku A do związku B na 45:1 oraz 70:1. Przygotuj je w sposób analogiczny do metody opisanej w punkcie 1.1.2.
    4. Przygotuj 1 g miękkiego kleju skórnego (SSA) w stosunku 50:50. W tym celu wymieszaj 0,5 g związku A i 0,5 g związku B zgodnie z opisem w punkcie 1.1.2.
  2. Przygotowanie folii PET powlekanej poli(alkoholem winylowym) (PVA)
    1. Przygotuj 18% (w/w) roztwór PVA w wodzie, dodając PVA do wody dejonizowanej, a następnie mieszaj przez noc za pomocą mieszadła magnetycznego. Przechowuj ten roztwór w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj cienkie filmy o efektywnej grubości 15 µm za pomocą maszyny do nakładania warstw metodą doctor blade, stosując przerwę ostrza 100 µm i prędkość ok. 2,0 mm/s.
    3. Umieść filmy w piekarniku w temperaturze 95 °C na 15 min.
  3. Przygotowanie warstwy podkładowej z PDMS o stosunku mieszania 10:1 metodą doctor blade
    1. Do przygotowania cienkich filmów użyj automatycznie sterowanej maszyny do nakładania warstw metodą doctor blade.
    2. Oczyść folię PET 100% izopropanolem i umieść ją na powierzchni obszaru nakładania doctor blade.
    3. Umieść ostrze doctor blade nad folią i dostosuj grubość za pomocą śrub mikro-pozycjonujących. Do wytwarzania warstw mokrych zastosuj grubości 60 µm, 100 µm, 200 µm i 500 µm.
    4. Napełnij zbiornik doctor blade polimerem PDMS 10:1 przygotowanym w kroku 1.1 za pomocą jednorazowej strzykawki. Rozpocznij ruch ostrza z prędkością ok. 2,0 mm/s.
    5. Zdejmij z maszyny folię PET z naniesioną powłoką 10:1 i umieść ją w piekarniku na 1 h w temperaturze 95 °C, w pomieszczeniu o wilgotności od 40% do 65%.
    6. Oczyść ostrze doctor blade izopropanolem i ręcznikami papierowymi.
    7. Powtórz tę procedurę dla wszystkich wymaganych grubości.
  4. Przygotowanie górnej warstwy PDMS w różnych stosunkach mieszania metodą doctor blade
    1. Usuń skalpelem lub żyletką cienkie paski z krawędzi bocznych underlying film, aby umożliwić umieszczenie i przesuwanie ostrza doctor blade na folii PET.
    2. Postępuj zgodnie z krokami protokołu od 1.3.3 do 1.3.6. Naniesiona grubość mokra filmu wynosi 160 µm.
    3. Powtórz tę procedurę w celu wytworzenia dwóch niezależnych filmów, z których każdy ma inny stosunek mieszania komponentów PDMS (45:1 i 70:1). Przechowuj filmy w temperaturze pokojowej (ok. 22 °C i przy wilgotności od 40 do 65%) w kwadratowych szalkach Petriego, aby zapobiec ich zanieczyszczeniu i osadzaniu się kurzu.
  5. Przygotowanie cienkich filmów kompozytowych o różnych grubościach warstwy SSA 50:50
    1. Przygotuj filmy PDMS 10:1 jako warstwę podkładową, zgodnie z opisem w kroku 1.3.
    2. Postępuj zgodnie z krokami protokołu 1.4.1 i 1.4.2, aby wytworzyć te filmy. Użyj SSA w stosunku mieszania 50:50 i wykonaj film o grubości mokrej 40 µm.
    3. Powtórz procedurę dla dodatkowych grubości mokrych: 120 µm, 300 µm, 500 µm.

2. Pomiary normalnej adhezji przy użyciu podłoży o różnej chropowatości powierzchni

  1. Przygotowanie i charakterystyka podłoży szklanych o różnej chropowatości powierzchni
    1. Jako „gładkie podłoże” należy wykorzystać szklany cylinder o średnicy 2 mm.
    2. Aby przygotować „podłoże szorstkie”, należy za pomocą przecinaka do szkła wyciąć z matowej lamélki fragment o wymiarach około 4x4 mm. Następnie, używając diamentowej gąbki ściernej, należy uzyskać obszar kolisty o średnicy około 3 mm.
    3. Przykleić szkło do aluminiowego stożka za pomocą kleju UV, a następnie naświetlać w komorze naświetlania UV przez 3 min.
    4. Wyznacz promień powierzchni podłoża za pomocą mikroskopu optycznego. Oblicz powierzchnię zgodnie ze wzorem A = πr²2.
    5. Wyznaczenie parametru chropowatości Ra oraz Rz (zgodnie z normami: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) przy użyciu profilometru stykowego.
    6. Przymocuj podłoże do stolika pomiarowego profilometru i zbliż końcówkę (diamentową, standardową: 2 µm/60°) w kontakt z próbką.
    7. Należy zarejestrować profil chropowatości z prędkością 0,3 mm/s i na długości 1 mm.
    8. Aby przeanalizować topografię powierzchni, należy zmierzyć obszar o wymiarach dokładnie 1 mm2 za pomocą profilometru igłowego, obsługiwanego przez dedykowane oprogramowanie.
      UWAGA: Profilometrem steruje zewnętrzny komputer. Uchwyt jest przesuwany o 0,001 mm w kierunku osi y po osiągnięciu przesunięcia 1 mm w kierunku osi x. Zarejestrowany plik .RS3 jest importowany do oprogramowania Surfcom Map Expert w celu utworzenia obrazów 3D.
  2. Pomiar normalnej adhezji cienkich warstw wykonanych z PDMS lub SSA
    1. Za pomocą żyletki potnij filmy na folii PET na małe fragmenty o powierzchni około 4,0 cm²2 następnie należy umieścić je na szkiełku przedmiotowym za pomocą kleju UV. Naświetlać światłem UV przez 3 min.
    2. Zamocuj próbkę polimerową w uchwycie na próbki.
    3. Ostrożnie oczyść powierzchnię podłoża etanolem, a następnie wysusz azotem.
    4. Przymocuj podłoże szklane, zamontowane w aluminiowym stożku, do ogniwa obciążnikowego.
    5. Użyj stołu z możliwością regulacji kąta nachylenia (goniometru), aby precyzyjnie wyrównać powierzchnie, dostosowując kąt nachylenia podłoża zbliżającego się do filmu polimerowego. W tym celu manualnie doprowadź podłoże do kontaktu z filmem. Zmieniaj kąt nachylenia aż do momentu uzyskania pełnego równoległego ustawienia obu powierzchni względem siebie, co należy zweryfikować na obrazach z kamer.
      UWAGA: Czujnik siły jest połączony z stołem z możliwością nachylenia. Pod próbką znajduje się pryzmat szklany, jak pokazano w Rycina 4co pozwala na wizualizację obszaru styku za pomocą dwóch kamer i umożliwia wyrównanie podłoża względem folii polimerowej.
    6. Przesuń podłoże w stronę powierzchni folii polimerowej, aż do uzyskania naprężenia wstępnego wynoszącego 13 ± 5 kPa (Rycina 4).
    7. Uruchom dedykowany pakiet oprogramowania napisany w środowisku LabView, służący do sterowania wymaganymi parametrami pomiarowymi, takimi jak czas utrzymania oraz prędkość zbliżania/wycofania. Czas utrzymania tutrzymać wynosi 1 sekunda, prędkość zbliżania i oddalania się wynosi 30 µm/s i 10 µm/s odpowiednio.
    8. Przeprowadzić pomiary adhezji na trzech niezależnych próbkach wykonanych w procesie produkcji oraz w sześciu różnych miejscach na powierzchni każdego filmu.
  3. Analiza danych i obliczanie kluczowych czynników mechanicznych: naprężenia odrywania oraz pracy rozdzielania.
    1. Oblicz naprężenie schemat równowagi statycznej ΣF=0; przedstawienie sił; pojęcie fizyczne; analiza równowagi poprzez podzielenie zarejestrowanej siły przez powierzchnię podłoża AS.
      Wzór na naprężenie σ=F/As, wskazujący na analizę naprężeń w inżynierii materiałowej, przedstawiony w formie równania.
    2. Wyznacz naprężenie oderwania, definiowane jako maksymalna wartość naprężenia normalnego.
      Wzór na równowagę statyczną, σmax=max(F/As), związany z analizą naprężeń materiałowych.
    3. Przesunięcie Δs wyznacza się poprzez odjęcie pozycji początkowej zakresu rozciągania.s0 z pozycji próbki skoniec w miejscu, gdzie zakończyło się odspajanie. Przyjmij początek zakresu rozciągania jako s0 = 0.
      Wzór na zmianę entropii, Δs = s_end - s_0, równanie termodynamiczne.
    4. Skoryguj zmierzone wartości położenia próbki o podatność systemu C zgodnie z poniższym równaniem:
      Równanie równowagi statycznej, S = S_measured - C*F, formuła analizy matematycznej.
    5. Zintegruj krzywą naprężenie-przemieszczenie pomiędzy s0 i skoniec w celu obliczenia pracy separacji.
      Wzór na równanie równowagi statycznej; rachunek całkowy; analiza rozkładu sił w badaniach z fizyki.
  4. Obliczanie kluczowych parametrów mechanicznych przy użyciu oprogramowania do obliczeń matematycznych Origin.
    1. Zaimportuj zapisany plik .dat z pojedynczego pomiaru adhezji do tabeli w programie Origin. Zapisanymi parametrami są czas, położenie próbki oraz siła. Wprowadź te parametry do kolumn A (czas), B (położenie próbki) i C (siła).
    2. Aby wyznaczyć wartość tła, należy obliczyć średnią z około 20 pomiarów siły przed zetknięciem z błoną polimerową. Tę wartość średnią oznaczamy jako F.przesunięcie i wklej go w kolumnie D.
    3. Oblicz siłę skorygowaną o tło F* zgodnie z poniższym równaniem
      Równanie kalibracji siły, F*=F-F_offset, stosowane w eksperymentalnej korekcji przesunięcia siły.
      i wprowadź poniższe równanie do kolumny E.
      Równanie przedstawiające wyznaczenie koloru: col(E)=col(C)-F_offset.
    4. Przyjmij początek zakresu rozciągania jako przemieszczenie równe zero, t. j., s0 = 0. W związku z tym należy wyznaczyć s0 i odjąć go od wartości przemieszczenia w kolumnie B, a następnie zapisać wynik w kolumnie F:
      Wzór na transformację liniową, col(F)=col(B)-s₀, równanie matematyczne.
    5. Ponadto należy skorygować pozycję próbki zgodnie z podatnością urządzenia. Korekcja ta jest wykonywana w kolumnie G. W kolumnie G należy wprowadzić następujące równanie
      Wzór na operację na kolumnach macierzy: col(G) = col(F) - C * col(E), pojęcie z zakresu algebry liniowej.
    6. Oblicz naprężenie w następnej kolumnie H. W tym celu podziel siłę przez powierzchnię podłoża. Wstaw poniższe równanie
      Równanie separacji kolumny: col(H) = col(E)/A. Wyrażenie matematyczne dla chromatografii.
      gdzie A to powierzchnia podłoży szklanych w mm²2 (wyznaczone w punkcie 2.1).
    7. Obliczyć pracę rozdzielenia na podstawie wartości naprężeń i przemieszczenia. W tym celu nanieść przemieszczenie na oś x, a naprężenia na oś y. Obliczyć całkę z tego wykresu od s0 to skoniec gdzie skoniec definiuje się jako przemieszczenie, przy którym naprężenie rozciągające powraca do zera, co oznacza całkowite oderwanie. Aby zintegrować wykres, należy wybrać funkcję integrate. Obliczone wartości należy wprowadzić do kolumn I i J.

3. Charakterystyka powłok za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i mikroskopii optycznej

  1. Mikroskopia optyczna
    1. Za pomocą żyletki potnij błonę polimerową na małe kawałki (ok. 0,25 cm2) i przymocuj je do krawędzi szkiełka przedmiotowego. Umieść szkiełko przedmiotowe w orientacji pionowej pod mikroskopem biologicznym i zmierz grubość przekroju błony.
      UWAGA: Do pomiaru grubości błony wynoszącej ok. ≤ 20 µm użyj obiektywu 20X (NA = 0,45, rozdzielczość teoretyczna przy 800 nm wynosząca 1,1 µm). Dla grubości błony w zakresie od 20 µm do 50 µm użyj obiektywu 10X (NA = 0,30, rozdzielczość teoretyczna przy 800 nm wynosząca 1,6 µm), a dla grubości błony ≥ 50 µm użyj obiektywu 5X (NA = 0,15, rozdzielczość teoretyczna przy 800 nm wynosząca 3,3 µm).
  2. Badanie SEM
    1. Wytnij folię PET, przymocuj próbkę o powierzchni ok. 2 cm2 do szkiełka przedmiotowego i umieść ją pionowo w mechanizmie zaciskowym wewnątrz uchwytu na próbki, ≤ 2 mm poniżej górnej powierzchni uchwytu.
    2. Wybierz napięcie przyspieszające 10 kV, detektor elektronów wstecznie rozproszonych (BSD) oraz warunki niskiej próżni (60 Pa).
    3. Dostosuj ostrość, powiększenie, jasność i kontrast obrazów.
    4. Wybierz czas akwizycji obrazu wynoszący 28 s przy rozdzielczości 1024 x 2048 pikseli.
    5. Wyjmij uchwyt na próbki z mikroskopu SEM.

4. Badania biologiczne

  1. Rutynowa hodowla komórek L929
    1. Do badań wykorzystać linię komórkową fibroblastów mysich L929. Komórki hodować w podstawowym medium Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz penicylinę i streptomycynę w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 w kolbach do hodowli komórkowej T75. Przesiewać komórki przy konfluencji wynoszącej około 70% do 80%.
    2. W celu przesiewania komórek usunąć medium poprzez aspirację i przemyć buforem fosforanowym bez jonów wapnia i magnezu (DPBS-/-) przez 30 s w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie inkubować komórki z 2 mL Accutase, roztworu enzymatycznego o aktywności proteolitycznej i kolagenolitycznej, do 5 min w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.
    3. Zweryfikować odklejenie się komórek od powierzchni kolby do hodowli za pomocą mikroskopu fazowego.
    4. Dodać do kolby 8 mL medium zawierającego surowicę i przenieść zawiesinę komórkową do probówki reakcyjnej o pojemności 15 mL.
    5. Pobrać 10 µL próbki zawiesiny komórkowej i zmieszać z 10 µL błękitu trypanu (Trypan Blue).
    6. Określić liczbę komórek za pomocą komory Neubauera i obliczyć całkowitą liczbę komórek.
      UWAGA: Błękit trypanu jest toksyczny, dlatego wymagana jest konsultacja z kartą charakterystyki (MSDS), przestrzeganie obowiązkowych procedur opisanych w MSDS, stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej oraz praca pod dygestorium chemicznym. Zebrać odpady do utylizacji odpadów chemicznych.
      UWAGA: Komórki wybarwione błękitem trypanu mają kolor niebieski, co wskazuje na nienaruszone błony komórkowe.
    7. Do kolejnego pasażu hodować 5 x 105 komórek w nowej sterylnej kolbie do hodowli komórkowej z 10 mL nowego medium. W warunkach eksperymentalnych hodować 3 x 105 komórek na płytkach 6-dołkowych i 6 x 104 komórek w każdym dołku płytki 24-dołkowej zawierającej próbki polimerowe (krok protokołu 4.2).
  2. Przygotowanie filmów kompozytowych do eksperymentów z hodowlą komórek.
    1. Wyciąć skalpelem pojedyncze kawałki filmów o pożądanych wymiarach, wykonanych w krokach protokołu 1.4 i 1.5, z podłoża PET i za pomocą pęsety umieścić je na powierzchni szklanych lamellek o średnicy 12 mm. Umieścić próbki w dołkach płytki 24-dołkowej.
    2. W celu oznaczenia cytotoksyczności i zliczania komórek nie usuwać filmów z folii PET. Wyciąć z filmów wytworzonych w punktach 1.4 i 1.5 obszary koliste o powierzchni ok. 9,4 cm2, dopasowane do pojedynczych dołków płytki 6-dołkowej, i umieścić je w dołkach płytki do hodowli komórkowej.
    3. Zanurzyć próbki polimerowe w dejonizowanej wodzie H2O na ≥ 30 min.
      UWAGA: Próbki polimerowe można sterylizować w autoklawie. W tym celu usunąć wszystkie próbki zawierające polimer z naczyń do hodowli komórkowej i umieścić je w szklanej szalce Petriego. Sterylizację przeprowadza się w autoklawie pod ciśnieniem 2,05 bar przez 20 min w temperaturze 121 °C.
  3. Opracowanie polimerów za pomocą plazmy
    1. Umieścić filmy przymocowane do folii PET lub okrągłych szklanych lamellek (wykonane w 4.2.1) w komorze reakcyjnej urządzenia plazmowego.
    2. Zamknąć pokrywę i odsysać powietrze, aż do osiągnięcia ciśnienia 1,6 x 10-2 mbar.
    3. Przeprowadzić obróbkę plazmową przez 3 min.
    4. Odpowietrzyć komorę reakcyjną i umieścić próbki w płytkach 24- lub 6-dołkowych do dalszych badań z hodowlą komórkową.
    5. Jedną próbkę wykorzystać do oznaczenia kąta zwilżania wodą za pomocą goniometru. W tym celu zbliżyć strzykawkę do powierzchni polimerowej, korzystając z pakietu oprogramowania, i nanieść na powierzchnię kroplę 3 µL wody. Obliczyć statyczny kąt zwilżania wodą za pomocą oprogramowania goniometru.
  4. Barwienie i mikroskopia
    1. Przygotować komórki zgodnie z opisem w kroku 4.1.7 i hodować przez 3 dni w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    2. Tuż przed fiksacją wykonać zdjęcia w kontraście fazowym komórek hodowanych przez trzy dni na filmach nienaruszonych oraz poddanych obróbce plazmą.
    3. Przygotować PBS uzupełniony o 0,2% Triton-X-100. Powoli pipetować 200 µL roztworu zapasowego do 100 mL PBS (PBS-T).
    4. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu w PBS (PFA/PBS-T).
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny, dlatego wymagana jest konsultacja z kartą charakterystyki (MSDS), przestrzeganie obowiązkowych procedur opisanych w MSDS, stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej oraz praca pod dygestorium chemicznym.
    5. Przygotować 5% roztwór BSA/PBS-T.
    6. Usunąć medium poprzez aspirację w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Dodać PBS do dołków w celu usunięcia pozostałości medium.
    7. Przenieść płytkę do dygestorium chemicznego i zastąpić PBS roztworem PFA/PBS (400 µL) na 25 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Usunąć roztwór PFA/PBS z pojedynczych dołków, ostrożnie przemyć PBS cztery razy. Odczekać 3 min między każdym etapem mycia i zebrać roztwory do utylizacji odpadów chemicznych. Użyć płytki bezpośrednio lub przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
    9. Dodać 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS-T do dołków i inkubować przez 60 min w temperaturze pokojowej (RT), aby zablokować nieswoiste miejsca wiązania.
    10. Odssać roztwór i zastąpić go roztworem faloidyny sprzężonej z Alexa-488 (rozcieńczenie 1:160)/PBS-T uzupełnionym o 0,2% Triton-X-100.
      UWAGA: Faloidyna-488 jest toksyczna, dlatego wymagana jest konsultacja z kartą charakterystyki (MSDS), przestrzeganie obowiązkowych procedur opisanych w MSDS, stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej oraz praca pod dygestorium chemicznym.
    11. Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować przez 3 h w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    12. Odssać roztwór i przemyć trzy razy PBS. Odczekać 3 min między każdym etapem mycia. Zebrać roztwory do utylizacji odpadów chemicznych.
    13. Przygotować roztwór 1 µL barwnika Hoechst 33342 (roztwór zapasowy 1 mg/mL). Dla rozcieńczenia 1:1000 pipetować 1 µL barwnika Hoechst 33342 do 1 mL PBS-T i dobrze wymieszać. Dodać 300 µL roztworu barwnika Hoechst 33342 do dołków i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Barwnik Hoechst 33342 jest odczynnikiem interkalującym DNA i tym samym potencjalnie mutagennym, dlatego wymagana jest konsultacja z kartą charakterystyki (MSDS), przestrzeganie obowiązkowych procedur opisanych w MSDS, stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej oraz praca pod dygestorium chemicznym.
    14. Odssać roztwór i przemyć próbki cztery razy PBS. Odczekać 3 min między każdym etapem mycia. Zebrać roztwór do utylizacji odpadów chemicznych.
    15. Do zatopienia ostrożnie usunąć filmy z powierzchni hodowli i umieścić je na szkiełku mikroskopowym. Dodać od 20 do 40 µL rozpuszczalnego w wodzie medium do zatapiania na film i przyłożyć nową okrągłą szklaną lamelkę na wierzchu, wywierając lekki nacisk.
    16. Przeprowadzić obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Filtry potrzebne do oświetlenia: Alexa-488 ma maksimum wzbudzenia przy 496 nm, a maksimum emisji występuje przy 519 nm, zatem kolor emisji jest zielony. Kompleks barwnika Hoechst 33342 trihydrochloridu trihydratu z DNA ma maksimum wzbudzenia przy 355 nm, a maksymalna emisja kompleksu DNA występuje przy 465 nm.
  5. Oznaczanie cytotoksyczności i wyznaczanie liczby komórek
    1. Przeprowadzić eksperyment z komórkami hodowanymi na płytkach 6-dołkowych przygotowanych w kroku 4.3 oraz komórkami przygotowanymi w kroku 4.1.7. Hodować komórki przez 3 dni w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Jako kontrolę pozytywną wykorzystać komórki hodowane na powierzchni polistyrenowej traktowanej do hodowli komórkowej, nie zawierającej filmów polimerowych. Do oznaczenia tła (warunek negatywny) pobrać medium z dołka bez komórek.
      UWAGA: Medium można również pobrać z dołka zawierającego komórki hodowane na powierzchni polistyrenowej traktowanej do hodowli komórkowej.
    2. Oznakować probówki 15 mL zgodnie z liczbą próbek eksperymentalnych.
    3. Dodać 40 µL roztworu PBS zawierającego 0,9% Triton X-100 do kontroli pozytywnej i energicznie wymieszać końcówką 1000 µL. Odczekać ok. 3 min.
    4. Bez usuwania komórek przytwierdzonych do powierzchni, odessać medium ze wszystkich próbek, w tym z próbek przygotowanych w 4.5.3 i przenieść medium do probówek 15 mL. Dodać 3 mL DPBS-/- do pojedynczych dołków i przechowywać płytki w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu oznaczenia liczby komórek zgodnie z opisem w 4.5.9.
    5. Wirować przy 200 x g przez 3 minuty i pobrać 1 mL supernatantu do oznaczenia aktywności LDH. Przechowywać probówki 15 mL zawierające komórki i pozostałe medium w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    6. Do analizy wykorzystać czarne płytki 96-dołkowe z płaskim dnem. Dodać 50 µL odczynnika CytoTox-ONE do 50 µL medium z próbki i dobrze mieszać przez 30 s.
    7. Przykryć płytkę folią aluminiową i przechowywać przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    8. Dodać 25 µL roztworu stopującego do każdego dołka i zarejestrować intensywność fluorescencji za pomocą płytkowego czytnika fluorescencyjnego. Wstrząsnąć płytką przez 10 s i wykryć sygnał fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 520 nm i długości fali emisji 560 nm. Unikać pęcherzyków powietrza.
    9. W celu oznaczenia liczby komórek odessać DPBS-/- z dołków płytki hodowlanej z kroku protokołu 4.5.4 i dodać roztwory do probówek reakcyjnych 15 mL zawierających supernatanty zebrane w kroku protokołu 4.5.5.
    10. Wirować probówkę reakcyjną 15 mL przy 200 x g przez 3 min i odessać supernatant. Dodać 0,5 mL trypsyny/EDTA i inkubować przez 10 min w 37 °C.
    11. Dodać 2 mL trypsyny/EDTA do dołków płytki i inkubować przez ok. 10 min w 37 °C, aby odkleić komórki od filmów polimerowych.
    12. Zawiesinę komórkową przenieść do probówki reakcyjnej 15 mL z kroku nr 4.6.10. Dodatkowo energicznie przemyć płytki medium zawierającym surowicę.
    13. Wirować próbki przy 200 x g przez 3 min, odessać supernatant i dodać do probówki medium zawierające surowicę.
    14. Określić liczbę komórek zgodnie z opisem w krokach 4.1.5 i 4.1.6.

Wyniki

W pierwszych eksperymentach na foliach PET wykonano filmy PDMS o różnej grubości i stałym stosunku mieszania 10:1 (Rysunek 1). Ponieważ grubość warstwy podkładowej może znacząco wpływać na sztywność i właściwości manipulacyjne całych filmów kompozytowych, w początkowych badaniach wykonano pojedyncze filmy o grubości od 13 ± 2 µm do 296 ± 13 µm (Rysunek 1). Znane jest, że podczas procesu sieciowania dochodzi do skurczu filmów polimerowych. W przypadku najcieńszych filmów zaobserwowano różnicę 78% ± 3,1% między stanem mokrym a utwardzonym. Dla najgrubszych filmów odnotowano skurcz na poziomie 40,9% ± 2,6% (Rysunek 1).

W zastosowaniach przedstawionych w niniejszym protokole błony muszą zostać ręcznie oddzielone od folii PET. Zauważyliśmy, że szczególnie cienkie błony są trudne do manipulowania pęsetą i często ulegają zniszczeniu podczas tego procesu. Dlatego zbadaliśmy wpływ cienkiej powłoki z poli(alkoholu winylowego) jako warstwy wspierającej. PVA charakteryzuje się wysoką sztywnością i może zostać łatwo usunięty w późniejszych etapach dzięki swojej rozpuszczalności w wodzie. Naniesiona powłoka PVA ma grubość ok. 17 µm, w związku z czym błony PDMS pokryte na tej warstwie są nieco cieńsze w porównaniu do błon bez powłoki PVA (dane nie przedstawiono). Skupiając się szczególnie na właściwościach manipulacyjnych, wyciągnęliśmy wniosek, że tylko najcieńsza błona wymaga wspierającej warstwy PVA w celu oddzielenia jej od folii PET.

Do wszystkich dalszych eksperymentów wybrano efektywną grubość filmu wynoszącą około 40 µm. W celu wytworzenia filmów kompozytowych stosunek mieszania PDMS zmieniano z 10:1 na 45:1 oraz na 70:1, a następnie naniesiono go na wcześniej spolimeryzowany film PDMS techniką doctor blade (Rysunek 2A). Z wyjątkiem stosunku 10:1, poszczególne filmy można było wyraźnie rozróżnić za pomocą mikroskopii optycznej z odpowiednią precyzją. Do analizy mikroskopowej filmy wycięto skalpelem i przymocowano do krawędzi szkiełka przedmiotowego. Wyższe stosunki mieszania warstwy wierzchniej wydawały się wizualnie jaśniejsze na obrazach mikroskopowych w porównaniu do stosunku 10:1 warstwy podstawy (Rysunek 2B). Dodatkowo wykorzystano skaningową mikroskopię elektronową do obrazowania próbek przy powiększeniu około 860X (Rysunek 2C). W przeciwieństwie do stosunku 10:1, zaobserwowano wyraźną różnicę w jasności między dwoma filmami PDMS wytworzonymi przy wyższych stosunkach mieszania. Procedura cięcia pozostawia ślady widoczne na zdjęciach SEM (Rysunek 2B). Na podstawie tych wyników średnia całkowita grubość filmów kompozytowych wyniosła 112 µm ± 5.0 µm (Rysunek 2D).

W kolejnych eksperymentach właściwości adhezyjne tych filmów określono za pomocą pomiarów adhezji siłą normalną przy użyciu dwóch różnych podłoży szklanych (Rysunek 3). „Gładkie podłoże” posiada teksturę powierzchni z arytmetyczną średnią chropowatością Ra wynoszącą 0,013 ± 0,0002 µm oraz średnią wysokością profilu Rz wynoszącą 0,12 ± 0,004 µm (Rysunek 3A). Podłoże 2 (GS2, określone jako chropowate) wykazało wartości chropowatości 0,338 ± 0,021 (Ra) µm oraz 2,055 ± 0,017 µm (Rz) (Rysunek 3B). Przyjmując średni promień uzyskany w punkcie 2.1.4, powierzchnia „gładkiego” podłoża wyniosła 3,2 mm2, natomiast dla podłoża „chropowatego” obliczono powierzchnię 6,07 mm2.

Przy użyciu tych dwóch podłoży określono właściwości adhezyjne różnych powłok. Do opisu właściwości adhezyjnych powłok wybrano dwa parametry: naprężenie odrywania σmax oraz pracę separacji Wsep. Podczas całego procesu łączenia i rozłączania rejestrowano położenie próbki s oraz siłę normalną F. Wyniki przedstawiono na krzywej naprężenie-przemieszczenie (Rysunek 4).

Dla prawidłowej interpretacji wyników eksperymentalnych istotne jest dokładne wyrównanie podłoża względem powierzchni filmu polimerowego. Należy również uwzględnić podatność maszyny urządzenia pomiarowego w celu skorygowania przemieszczenia. Podczas pomiaru przyłożona siła działa nie tylko na próbkę, ale także na pozostałe części urządzenia badawczego. W związku z tym każde z dwóch podłoży jest dociskane do szkiełka przedmiotowego z naprężeniem ściskającym wynoszącym 13 ± 5 kPa. W celu pomiaru podatności bierze się pod uwagę krzywą obciążenia, t. j. część krzywej siła-przemieszczenie, w której dwie powierzchnie wchodzą w kontakt, aż do pozycji próbki, w której osiągnięta zostanie dokładna siła obciążenia wstępnego. Odwrotność nachylenia tej krzywej jest równa podatności maszyny C. Obliczona wartość C wynosi 0.12 µm/mN.

W pierwszym doświadczeniu przeanalizowano błony o różnych proporcjach mieszania PDMS (Rycina 5). W przypadku błon kompozytowych grubość oraz proporcje mieszania warstwy podkładowej, wykonanej z PDMS 10:1, pozostawiono stałe. Grubość warstwy wierzchniej również pozostawiono stałą na poziomie 65 µm. Najwyższe naprężenie oderwania wynoszące 109 ± 27,6 kPa wyznaczono dla gładkiego podłoża szklanego na błonie PDMS 10:1 (Rycina 5A). Zwiększenie proporcji mieszania prowadzi do spadku naprężenia oderwania do 76,7 ± 17 kPa dla proporcji 45:1 oraz 41,4 ± 17 kPa dla proporcji 70:1. Dla szorstkiego podłoża szklanego na błonie PDMS 10:1 wyznaczono naprężenie oderwania wynoszące 22 ± 2,2 kPa. Ogólnie praca oddzielania była porównywalna dla obu podłoży szklanych, np. 1,4 ± 0,6 J/m2 dla najcieńszej błony uzyskanej na gładkim podłożu i 1,84 ± 0,7 J/m2 dla najcieńszej błony uzyskanej na szorstkim podłożu (Rycina 5B).

Następnie zbadano wytwarzanie cienkich warstw do zastosowań skórnych oraz do hodowli komórkowych (Rysunek 6). Do wytworzenia górnej warstwy filmów kompozytowych zastosowano SSA 50:50. Jako warstwę podkładową wykorzystano PDMS w stosunku mieszania 1:10 o grubości ok. 40 µm. W przeciwieństwie do wcześniejszych eksperymentów przedstawionych na Rysunku 5, zmieniano grubość górnej warstwy, podczas gdy stosunek mieszania pozostawał stały (Rysunek 6A). Wybrano SSA ze względu na jego właściwości adhezyjne w zastosowaniach wymagających przytwierdzenia do powierzchni o wysokiej chropowatości, zwłaszcza do ludzkiej skóry, stosując zalecany przez producenta stosunek mieszania 50:505,8. Ludzka naskórka charakteryzuje się wysoką chropowatością powierzchni. W zależności od wieku i regionu anatomicznego zgłaszano średnią głębokość chropowatości powierzchni (RZ) od 48 µm do 71 µm29. Bezpieczna i delikatna adhezja do skóry jest istotna, szczególnie w przypadku wrażliwej skóry noworodków lub słabo regenerującej się skóry osób starszych. Zastosowano różne grubości mokre, wynoszące odpowiednio 40 µm, 120 µm, 300 µm oraz 500 µm (Rysunek 6A). W zależności od grubości mokrej, całkowita grubość filmów kompozytowych waha się od 51 µm do 344 µm (Rysunek 6B). Po utwardzeniu kompozyty przymocowano do grzbietu dłoni ochotnika (Rysunek 6C). Różne grubości filmów wykazują wyraźne różnice w ich właściwościach adaptacyjnych do chropowatości skóry (Rysunek 6C). Cienkie filmy (całkowita grubość 50 µm i 100 µm) wykazują wyższy stopień adaptacji do zmarszczek skóry w porównaniu z filmami grubszymi (całkowita grubość 220 µm i 340 µm). Wyniki te wskazują, że za pomocą zastosowanej techniki raklowania można precyzyjnie wytwarzać filmy kompozytowe o szerokim zakresie grubości.

Przeprowadzono eksperymenty dotyczące adhezji z zastosowaniem tych filmów kompozytowych (Rysunek 7). W zależności od grubości górnego filmu SSA zaobserwowano spadek naprężenia przy odrywaniu wraz ze wzrostem grubości filmu. Najwyższą siłę odrywania wynoszącą 133 ± 36,6 kPa zmierzono na gładkim podłożu (Rysunek 7A). Najniższe naprężenie przy odrywaniu wynoszące 18 ± 4 kPa uzyskano dla podłoża chropowatego przy najgrubszym filmie. Co ciekawe, porównanie obu podłoży wykazuje 2,7-krotną różnicę w przypadku najcieńszych filmów (Rysunek 7A). Wraz ze wzrostem grubości filmu, szczególnie w przypadku najgrubszych filmów, nie zaobserwowano znaczących różnic (Rysunek 7A). Dla gładkiego podłoża pracę oddzielenia na poziomie 1,8 ± 0,8 J/m2 wykryto dla filmu o całkowitej grubości ok. 100 µm, po czym nastąpił spadek zależny od grubości filmu (grubość 220 µm: 1,6 ± 0,6 J/m2 oraz 330 µm: 1,3 ± 0,4 J/m2 (Rysunek 7B)). Praca oddzielenia mierzona dla podłoży chropowatych była ogólnie nieco niższa w porównaniu z podłożem gładkim (grubość 100 µm: 1,63 ± 0,6 J/m2; grubość 220 µm: 1,1 ± 0,6 J/m2 oraz 330 µm: 1,0 ± 0,2 J/m2 (Rysunek 7B)).

Dodatkowo, podczas pomiarów zarejestrowano mechanizm odrywania (Rysunek 7C). Na najcieńszej błonie zaobserwowano niewielką kawitację, natomiast na błonach grubszych widoczne było pojawienie się pęknięć przypominających palce (Rysunek 7C).

Pomiary wykonano w ciągu miesiąca od wytworzenia błon. Stabilność i zachowanie właściwości mechanicznych elastycznych błon mogą być jednak zależne od czynników środowiskowych, w tym temperatury i wilgotności. Zgodnie z opisem w kroku 1.4.3 protokołu, błony przechowywano w temperaturze pokojowej i przy wilgotności 40-65%. Aby zapobiec ich zanieczyszczeniu i osadzaniu się kurzu, błony przechowywano w ciemności w plastikowych szalkach Petriego. W celu zbadania długoterminowej stabilności, pomiary adhezji oraz wyznaczenie grubości błon SSA 50:50 przeprowadzono około czterech miesięcy po wykonaniu. Po przechowywaniu nie stwierdzono istotnego wpływu na grubość błony, naprężenie odrywania oraz pracę separacji. Na przykład, naprężenie odrywania kompozytowych błon SSA wykonanych z mokrej grubości 120 µm SSA i mokrej grubości 100 µm PDMS wynosiło 46,6 ± 6 kPa, a praca separacji 1627 ± 592 mJ/m2 bezpośrednio po wykonaniu. Około czterech miesięcy po wytworzeniu wyznaczono naprężenie odrywania równe 48,8 ± 5,4 kPa oraz pracę separacji wynoszącą 1666 ± 723 mJ/m2 . Dodatkowo, krótko po wykonaniu całkowita grubość tych błon wynosiła 103,3 ± 13,9 µm, a po przechowywaniu 98,1 ± 9,1 µm.

W dalszych eksperymentach jako podłoża do hodowli komórkowej zastosowano błony kompozytowe PDMS 10:1 i SSA 50:50 o całkowitej grubości ok. 105 µm (Rysunek 8). Błony kompozytowe wykonane zgodnie z krokiem 1 protokołu można łatwo oddzielić od folii PET i dociąć do wymaganych wymiarów oraz form geometrycznych. Co więcej, podczas przytwierdzania błon do sztywnej powierzchni, na przykład szkła, można obok siebie przymocować wiele błon o różnych modułach Younga, co pozwala na umieszczenie ich w obrębie jednego dołka płytki do hodowli komórkowej. Błony można przytwierdzać bezpośrednio do powierzchni polistyrenowej bez użycia dodatkowego szkiełka podstawowego. Błony mogą być również dostosowane do różnych powierzchni i struktur geometrycznych, takich jak rurki czy pierścienie, co umożliwia prowadzenie badań nieosiągalnych przy użyciu konwencjonalnych materiałów do hodowli komórkowej. W przeprowadzonych eksperymentach przedstawionych na Rysunku 8 błony kompozytowe na folii PET umieszczano bezpośrednio w płytkach do hodowli komórkowej lub oddzielano błony od folii PET i umieszczano je na szklanych szkiełkach podstawowych. W określonych warunkach eksperymentalnych niektóre polimery poddano działaniu plazmy powietrznej w celu zwiększenia ich energii powierzchniowej. Co do zasady PDMS wykazuje kąt zwilżania wodą wynoszący ok. 115° przed obróbką plazmową i staje się silnie hydrofilowy (kąt zwilżania wodą < 30°) po obróbce8. Obróbka plazmowa czyni powierzchnię biokompatybilną i ułatwia przyleganie komórek eukariotycznych. W zależności od czasu i intensywności obróbki powierzchnia polimeru ulega zmianie, wykazując wyższy stopień chropowatości, a mogą również pojawić się pęknięcia. Bezpośrednio po obróbce obserwuje się proces powrotu do hydrofobowości. Zgodnie z opisem w kroku protokołu 4.3.5, do wyznaczenia statycznych kątów zwilżania wodą użyto goniometru. Następnie przeanalizowano polimery, które po obróbce plazmą powietrzną pozostawiono w ddH2O na 1 h. Obróbka plazmą znacząco zmniejszyła kąt zwilżania wodą (PDMS przed obróbką: 117,0 ± 2,2°; SSA przed obróbką: 127,9 ± 5,6°; PDMS po plazmie: 18,0 ± 7,2°; SSA po plazmie: 29,3 ± 11,5°).

Do zatapiania próbek zastosowano wodny środek montażowy. Jeśli na dowolnym etapie zajdzie potrzeba ponownego wyjęcia próbek, preparaty można umieścić na noc w szalce Petri z wodą. Następnie można usunąć szkiełka nakrywkowe w celu przeprowadzenia dodatkowych analiz.

Zachowanie adhezyjne i morfologia komórek L929 wysianych na 3 dni na błony kompozytowe PDMS i SSA 50:50 zostały określone za pomocą mikroskopii fazokontrastowej oraz po barwieniu koniugowaną z fluorescencją falloidyną-488 i barwnikiem Hoechst 33342 (Rysunek 8). Wysoce zalecane jest pozyskiwanie obrazów za pomocą mikroskopii fazokontrastowej, szczególnie w przypadku polimerów niepoddanych działaniu plazmy. Ze względu na słabą adhezję komórkową do tych powierzchni polimerowych pojedyncze komórki lub agregaty są łatwo odrywane, co utrudnia poprawną interpretację późniejszych metod analizy.

Komórki wysiane na niezmodyfikowanych polimerach wykazały słabe przywieranie oraz ograniczoną zdolność do rozprzestrzeniania się (Rycyna 8A1 i C1), podczas gdy w przypadku komórek hodowanych na powierzchniach potraktowanych plazmą zaobserwowano obecność zgodnej warstwy monowarstwy (Rycyna 8B1 i D1). Tworzenie agregatów komórkowych oraz odrywanie się od powierzchni było bardziej wyraźne na powierzchniach niezmodyfikowanych. Wizualizacja filamentów aktynowych po utrwaleniu 4% paraformaldehydem ujawniła niewielką liczbę komórek migrujących na obrzeża agregatów komórkowych oraz emanację wypustek lamellipodialnych na niezmodyfikowanych błonach z PDMS i kompozytu SSA 50:50 (Rycyna 8A2 i C2, strzałki). Nie zaobserwowano istotnych różnic jakościowych podczas porównywania obu materiałów polimerowych. Warto zauważyć, że na SSA 50:50 wydawało się występować mniej agregatów komórkowych w porównaniu do PDMS. Ponadto agregaty przytwierdzone do powierzchni SSA 50:50 wydawały się bardziej spłaszczone (Rycyna 8C1). Zgodnie z oczekiwaniami, traktowanie plazmą powietrzną znacząco poprawiło przywieranie i rozprzestrzenianie się komórek na obu powierzchniach, co doprowadziło do powstania wyraźnych wypustek lamellipodialnych oraz zgodnej monowarstwy (Rycyna 8B2 i 8D2).

Uwalnianie LDH po 3 dniach hodowli wykorzystano jako wskaźnik do określenia efektów cytotoksycznych (Rycina 9A). Ogólnie poziomy LDH były porównywalne dla komórek hodowanych na obu materiałach polimerowych, przy cytotoksyczności poniżej 5% (czysty PDMS: 2,8 ± 2,0%; czysty SSA 50:50: 4,5 ± 3,6%; PDMS traktowany plazmą: 3,4 ± 1,5%; SSA 50:50 traktowany plazmą: 3,4 ± 1,6%). Wyniki te są porównywalne z danymi przedstawionymi w naszej wcześniej opublikowanej pracy koncentrującej się na badaniu obu elastomerów.8 Aby dodatkowo potwierdzić wyniki testu LDH, przeprowadzono test wykluczania błękitu trypanu. Ponadto stwierdzono różnice w aktywności proliferacyjnej całej populacji komórek (Rycina 9B). Ogólnie odnotowano mniej niż 5% komórek wykazujących reakcję pozytywną z błękitem trypanu (czysty PDMS: 2,4 ± 0,3%; czysty SSA 50:50: 3,8 ± 2,5%; PDMS traktowany plazmą: 0,74 ± 1,3%; SSA 50:50 traktowany plazmą: 0,95 ± 1,6%).

Przygotowanie warstwy polimerowej, wpływ grubości PDMS; schemat i wykres słupkowy przedstawiający wyniki analizy.
Rysunek 1: Przygotowanie błon PDMS na folii PET powlekanej poli(alkoholem winylowym) (PVA): W celu określenia powtarzalności i wydajności manipulacyjnej zastosowano proces wytwarzania błon PDMS o różnej grubości na folii PET (A). Grubości błon PDMS analizowano za pomocą mikroskopii optycznej po utwardzaniu w temperaturze 95 °C (B). Przeanalizowano N=3 niezależnie wykonanych błon. Z każdej błony wybrano trzy różne miejsca, wycięto je i przeanalizowano po 3 pozycje na każdej próbce (k=27). Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Proces warstwowania PDMS; stosunki 10:1, 45:1, 70:1; schemat, mikroskopia, wyniki analizy grubości.
Rycina 2: Przygotowanie filmów kompozytowych z PDMS sporządzonych w różnych stosunkach mieszania: Filmy kompozytowe o różnych stosunkach mieszania bazy (komponent A) do sieciowania (komponent B) PDMS zostały wykonane techniką doctor blade. Górna warstwa składająca się z PDMS w stosunkach 10:1 (komponent A:B), 45:1 oraz 70:1 została naniesiona na wcześniej utwardzony film z PDMS 10:1 (A). Po następnym utwardzaniu w temperaturze 95 °C grubość filmów kompozytowych analizowano za pomocą mikroskopii optycznej (B) oraz skaningowej mikroskopii elektronowej (C). Przeprowadzono N=3 niezależne eksperymenty i przeanalizowano je za pomocą mikroskopii optycznej (D). Z każdego niezależnie wykonanego filmu wybrano i wycięto trzy różne obszary, a następnie przeanalizowano po 3 pozycje na każdej próbce (k=27). Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza chropowatości powierzchni w mikroskopii; mapa kolorów i wykres liniowy przedstawiające zmienności wysokości.
Rycina 3: Wyznaczenie topograficznej chropowatości powierzchni dwóch podłoży użytych do pomiarów adhezji: Scharakteryzowano dwa podłoża szklane o różnej chropowatości powierzchni. Trójwymiarową analizę profilometryczną powierzchni przeprowadzono dla podłoża „gładkiego” GS (A1) oraz podłoża „chropowatego” GR (B1). Odpowiednie krzywe pojedynczej linii przedstawiono w A2 i B2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza naprężeń filmu polimerowego: A) układ spektroskopowy, mikroskop B) schemat urządzenia C-D) wykres naprężenia w funkcji czasu/przemieszczenia.
Rycina 4: Zasada pomiarów adhezji normalnej: Do charakterystyki właściwości adhezyjnych próbek polimerowych wykorzystano specjalnie skonstruowany układ. Układ pomiarowy przedstawiono na (A), a szczegóły ukazano na (B). W analizie pomiarowej naprężenie określono na podstawie krzywej naprężenia w funkcji czasu (C). Praca separacji została wyznaczona poprzez całkowanie krzywej naprężenia w funkcji przemieszczenia pomiędzy send a s0 (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe naprężeń odrywania w funkcji pracy oddzielania; analiza podłoża na gładkim/chropowatym szkle.
Rycina 5: Wyznaczenie właściwości adhezyjnych filmów kompozytowych o różnych stosunkach mieszania PDMS: Zmierzono naprężenia odrywania (A) oraz pracę oddzielania (B) filmów kompozytowych wykonanych z PDMS w stosunkach mieszania 10:1, 45:1 i 70:1. Do analizy wykorzystano „gładkie” podłoże szklane (GS) o Ra = 0.013 µm oraz „chropowate” podłoże szklane (GR) o Ra = 0.338 µm. Przeanalizowano N=3 niezależnie wykonanych filmów. Z każdego filmu wybrano dwa fragmenty i przeanalizowano trzy różne pozycje na każdej próbce (k=18). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Eksperyment dotyczący grubości polimeru; schemat i wykres słupkowy; warstwy PDMS i SSA na skórze do analizy.
Rysunek 6: Przygotowanie kompozytowych filmów z SSA o różnej grubości: SSA 50:50 naniesiono na wcześniej utwardzony film PDMS 10:1 (A). Zastosowano różne grubości mokre tej warstwy w zakresie od 40 do 500 µm, a grubość po utwardzeniu zbadano za pomocą mikroskopii optycznej (B). Przymocowanie filmów do grzbietu dłoni ochotnika wykazało, że filmy o całkowitej grubości ok. 100 µm (film nr 2) dobrze dopasowały się do chropowatości skóry (C). Grubość pojedynczych warstw oraz całkowita grubość filmów kompozytowych przedstawione są na Rysunku 6B. Do analizy za pomocą mikroskopii optycznej wykorzystano n=3 niezależnie wykonanych próbek. Z każdego filmu wybrano i wycięto trzy różne obszary, a następnie przeanalizowano 3 pozycje na każdej próbce (k=27). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Pasek skali na rys. 6C przedstawia ok. 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy naprężenia przy odrywaniu w funkcji grubości; obrazy morfologii kontaktu; analiza adhezji do powierzchni szkła.
Rycina 7: Wyznaczenie właściwości adhezyjnych kompozytowych błon miękkiego kleju do skóry: Wykonano cienkie błony kompozytowe z SSA jako warstwy wierzchniej oraz PDMS 10:1 jako warstwy podkładowej. Grubość warstwy wierzchniej zmieniano w zakresie od 50 do 330 µm. Przeanalizowano naprężenie przy odrywaniu (A) oraz pracę rozdzielania (B) błon kompozytowych pomierzoną na dwóch różnych podłożach szklanych (podłożu szklanym „gładkim” (GS) o Ra = 0.013 µm oraz podłożu szklanym „chropowatym” (GR) o Ra = 0.338 µm). Przykładowe obrazy mechanizmów odrywania przedstawiono w C. Do analizy danych wykorzystano n=3 niezależnie przeprowadzonych eksperymentów. Z każdej błony wybrano dwa fragmenty i przeanalizowano trzy różne pozycje na każdej próbce (k=18). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Paski skali w 7C oznaczają 0.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Powierzchnie PDMS i SSA w mikroskopii fazowo-kontrastowej i fluorescencyjnej; analiza morfologii komórek.
Rysunek 8: Morfologia komórkowa fibroblastów L929 hodowanych na cienkich warstwach: mysie fibroblasty L929 hodowano przez 3 dni na cienkich warstwach wykonanych z PDMS (A1, A2, B1, B2) lub SSA (C1, C2, D1, D2). W celu zwiększenia hydrofilowości powierzchni przeprowadzono obróbkę plazmą powietrzną (B1, B2, D1, D2). Paski skali na zdjęciach D1 i D2 odpowiadają 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe cytotoksyczności i liczby komórek porównujące PDMS i SSA, materiały pierwotne i traktowane plazmą.
Rycina 9: Określanie cytotoksyczności i proliferacji komórkowej: W celu określenia efektów cytotoksycznych i proliferacji komórkowej komórki L929 wysiano na trzy dni na kompozytowe błony z PDMS 10:1 oraz SSA 50:50. Uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) określono za pomocą testu aktywności LDH, który wykazał cytotoksyczność poniżej 5% (A). Całkowitą liczbę komórek po okresie hodowli oceniono poprzez manualne zliczenie pojedynczych komórek przy użyciu komory Neubauera (B). Przeanalizowano N=3 niezależnie przeprowadzonych eksperymentów. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Projektowanie struktur kompozytowych umożliwia proste dostosowanie właściwości materiału, takich jak moduł Younga czy grubość próbek. Moduł Younga PDMS może być skutecznie zmieniany w szerokim zakresie, zmieniając proporcje mieszania między dwoma składnikami lub wytwarzając mieszanki przy użyciu innego elastomeru silikonowego30,31. Opisane metody nie ograniczają się do PDMS stosowanych w obecnym badaniu, ale przede wszystkim wydajność klejenia zależy w dużym stopniu od konkretnego zastosowanego typu. Kluczowym etapem w ramach tego protokołu jest proces produkcji folii kompozytowych (ilustracja 1). Wykazano, że grubość folii wpływa znacząco na przyczepność folii do różnych podłoży, w tym do skóry (ryc. 5 i ryc. 6). Oprócz grubości powłoki, na właściwości materiału wpływa czas i temperatura podczas procesu utwardzania32. W związku z tym parametry takie jak grubość warstw polimerowych muszą być starannie dostosowane i zweryfikowane.

Analizę właściwości adhezyjnych cienkich warstw przeprowadzono przy pomiarach przyczepności siły normalnej przy użyciu dwóch podłoży szklanych o różnej chropowatości powierzchni do Ra = 0,338 μm (rysunek 3). Ogólnie rzecz biorąc, chropowatość ma znaczący wpływ na przyczepność powierzchni, zwłaszcza materiałów elastycznych 33,34. Chropowatość szkła można łatwo zmieniać poprzez szlifowanie papierem ściernym o różnych rozmiarach nierówności, co pozwala na wytwarzanie podłoży o wyższych wartościach chropowatości21. Ponadto do produkcji podłoży można stosować inne materiały, na przykład żywicę epoksydową15,35. To może być istotna strategia modyfikacji prezentowanego protokołu. Na przykład, jeśli potrzebne są podłoża wykazujące różne swobodne energie powierzchniowe lub wymagana jest określona topografia. W tym przypadku analizowano naprężenia związane z odrywaniem i separację cienkich warstw wykonanych z PDMS i SSA za pomocą specjalnie skonstruowanej konfiguracji (makroskopowe urządzenie do pomiaru przyczepności (MAD, rysunek 4)). 36 Optyczne wyrównanie podłoża i wgłębnika jest kluczowym etapem analizy wyników pomiarów. Dlatego regulacja kąta nachylenia musi być wykonywana za pomocą goniometru, tak precyzyjnie, jak to możliwe. Można to osiągnąć z wystarczającą precyzją, ręcznie doprowadzając podłoże do powierzchni folii, aż do uzyskania kontaktu poziomego.

W obecnym protokole czas podtrzymania był utrzymywany na stałym poziomie jednej sekundy (rysunek 5 i rysunek 7). Zwłaszcza w przypadku badania przyczepności elastycznej folii do szorstkiej powierzchni podłoża, wydłużenie czasu utrzymywania dostarcza dodatkowych informacji. Na przykład odnotowano wzrost naprężeń związanych z odrywaniem wraz ze wzrostem czasu podtrzymania8. Oprócz pomiarów wykonywanych w obecnym protokole można by przeprowadzić inne metody, na przykład testy odrywania, co pozwoliłoby na bardziej kompleksowe badanie przyczepności37.

Określono właściwości adhezyjne folii kompozytowych o różnej grubości warstwy kleju soft skin (ryc. 7). Nasze wyniki są zgodne z opublikowanymi danymi, z których wynika, że zmniejszenie grubości folii prowadzi do wzrostu naprężeń zrywających wraz ze wzrostem uwięzienia, tj. stosunku średnicy podłoża do grubości folii38,39. Na podstawie tych wyników oraz danych przedstawionych na rysunku 7 wnioskujemy, że folie kompozytowe o łącznej grubości ok. 100 μm (grubość warstwy SSA ok. 60 μm nałożona na folię PDMS o grubości ok. 40 μm) wykazują korzystne właściwości adhezyjne na chropowatych powierzchniach.

Następnie przeprowadzono eksperymenty związane z charakterystyką biologiczną na nieskazitelnych foliach kompozytowych i foliach kompozytowych poddanych obróbce plazmowej (ryc. 8). Obróbka plazmowa elastomerów krzemowych jest często stosowaną, wszechstronną techniką w celu zwiększenia właściwości hydrofilowych powierzchni oraz promowania przyczepiania komórkowego i rozprzestrzeniania się komórkowego40,41. Silikony są dobrze znane ze swojej niskiej toksyczności i wysokiej biostabilności, ale mogą zawierać resztkowe monomery lub katalizatory, które mogą wpływać na procesy fizjologiczne, prowadząc również do cytotoksyczności42,43. W przeprowadzonych eksperymentach zaobserwowaliśmy mniej niż 5% cytotoksyczność przy użyciu uwalniania LDH jako wskaźnika i testu wykluczenia błękitu trypanowego. W przedstawionym protokole przeanalizowano całą populację komórkową, w tym agregaty komórkowe oderwane od powierzchni, do analizy proliferacji (ryc. 9B). Modyfikacja protokołu może przynieść bardziej zróżnicowane wyniki. Dla każdej próbki supernatant zawierający oderwane agregaty komórkowe może być przeniesiony do oddzielnej probówki reakcyjnej i nie łączony z komórkami enzymatycznie usuniętymi z powierzchni polimeru. Pozwoliłoby to na dokładną ocenę komórek przyczepionych do powierzchni i ostatecznie ujawniłoby bardziej szczegółowe określenie wpływu polimerów na proces adhezji komórkowej. Oprócz przedstawionych tu metod immunocytochemicznych, komórki mogą być pobierane do badań za pomocą metod immunoblot, co pozwala na szczegółową ilościową ocenę ekspresji białek.

Podsumowując, ustaliliśmy warunki wytwarzania cienkich elastomerowych folii kompozytowych do zastosowań w zaawansowanych badaniach nad kulturami komórkowymi. Dodatkowo te cienkie folie mają wysoką zdolność adaptacji do szorstkości skóry, umożliwiając wyrafinowane projektowanie klejów do skóry.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Martin Danner jest doceniany za pomoc w przygotowaniu próbek i ustanowieniu procedur hodowli komórkowych. Autorzy pragną podziękować firmie Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Niemcy), a w szczególności Robertowi Radsziwillowi za nieustanne wsparcie i dyskusje. Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP/2007-2013) / Umowa o grant ERBN nr 340929.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Propanol, 97%Stockmeier Chemie1000452610000Isopropanol
Ścierna podkładka ręczna z diamnodemBohleMO 5007522Ziarnistość: 220
Accutase CapricornScientificACC-1B
Albumin Fraktion VRoth0163.2BSA
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermoFischer ScientificA12379wysoce toksyczny
AquamountPolysciences18606-20rozpuszczalne w wodzie podłoże montażowe
CytoTox-ONE Jednorodny test integralności membranyPromegaG7890
DPBS, bez Ca2+, Mg2+ThermoFischer Scientific14190094
Płodowa surowica bydlęcazłota GE Health Care Life ScienceA15-151FBS
Goniometr OCA35Datafizykado wyznaczania statycznego kąta zwilżania wody
Hoechst Dye 33342Sigma-AldrichB1155-100MGtrichlorowodorek bisBenzimide H 33342, silnie toksyczny
mikroskop Axiovert 25Mikroskop Zeissużywany do dokumentacji hodowli
Mikroskop Eclipse LV100NDNikonMikroskop używany do oznaczania grubości filmu
Paraformaldehyd, roztwór wodny 16%Mikroskopia elektronowa SciencesRT 15710mikroskopia elektronowa klasa
penicyliny i streptomycyny roztwór penicyliny i streptomycynySigma-AldrichP4333-100ML
Phenom XL Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)Phenom
Poly-(alkohol winylowy) 4-88, MW 31000Sigma-Aldrich81381-1KGMowiol 4-88
Poli-dimetylosiloksany, Sylgard 184Dow Corning(400)000108351397PDMS
RPMI 1640 podłoże podstawoweThermoFischer Scientific21875034
miękki klej do skóry (SSA)Dow Corning(400)000108251792MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA)
mikser prędkości DAC 600.2 VAC-PHauschild
rysik profilomterZeissModel: SURFCOM 1500SD3
Tecan Infinite M200 proCzytnik płytek fluorescencyjnychTecan
Triton X 100Calbiochem648466
roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154-100MLwysoce toksyczny
roztwór trypsyny/EDTAPAN-BiotechP10-0235000,05% trypsyna, 0,02% EDTA w PBS
Klej UVBohleBO MV76002średniej lepkości
komórkowych

Bibliografia

  1. Lloyd, A. W., Faragher, R. G. A., Denyer, S. P. Ocular biomaterials and implants. Biomaterials. 22, 769-785 (2001).
  2. Zhang, M., Wu, J., Wang, L., Xiao, K., Wen, W. A simple method for fabricating multi-layer PDMS structures for 3D microfluidic chips. Lab Chip. 10, 1199-1203 (2010).
  3. Kwak, M. K., Jeong, H. E., Suh, K. Y. Rational design and enhanced biocompatibility of a dry adhesive medical skin patch. Adv. Mater. 23, 3949-3953 (2011).
  4. Gun Park, D., Chul Shin, S., Won Kang, S., Tae Kim, Y. Development of flexible self adhesive patch for professional heat stress monitoring service. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 4, 3789-3792 (2005).
  5. Thomas, X. Silicone Adhesives in Healthcare Applications. Dow corning Lit. , (2013).
  6. Fuard, D., Tzvetkova-Chevolleau, T., Decossas, S., Tracqui, P., Schiavone, P. Optimization of poly-di-methyl-siloxane (PDMS) substrates for studying cellular adhesion and motility. Microelectron. Eng. 85, 1289-1293 (2008).
  7. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. J. Appl. Polym. Sci. 131, 41050(2014).
  8. Fischer, S. C. L., Kruttwig, K., Bandmann, V., Hensel, R., Arzt, E. Adhesion and cellular compatibility of silicone-based skin adhesives. Macromol. Mater. Eng. , 1-11 (2017).
  9. Martina, D., Creton, C., Damman, P., Jeusette, M., Lindner, A. Adhesion of soft viscoelastic adhesives on periodic rough surfaces. Soft Matter. 8, 5350-5357 (2012).
  10. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  11. Song, F., Ren, D. Stiffness of cross-linked poly(dimethylsiloxane) affects bacterial adhesion and antibiotic susceptibility of attached cells. Langmuir. 30, 10354-10362 (2014).
  12. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys. Condens. Matter. 22, 194116(2010).
  13. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  14. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  15. Roth, J., et al. Surface functionalization of silicone rubber for permanent adhesion improvement. Langmuir. 24, 12603-12611 (2008).
  16. Thiébaud, P., Lauer, L., Knoll, W., Offenhäusser, A. PDMS device for patterned application of microfluids to neuronal cells arranged by microcontact printing. Biosens. Bioelectron. 17, 87-93 (2002).
  17. Tourovskaia, A., Figueroa-Masot, X., Folch, A. Differentiation-on-a-chip: a microfluidic platform for long-term cell culture studies. Lab Chip. 5, 14-19 (2005).
  18. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: Cell culture and flow studies with glial cells. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 72, 10-18 (2005).
  19. Wan, Y., et al. Nanotextured substrates with immobilized aptamers for cancer cell isolation and cytology. Cancer. 118, 1145-1154 (2012).
  20. Ross, A. M., Jiang, Z., Bastmeyer, M., Lahann, J. Physical aspects of cell culture substrates: Topography, roughness, and elasticity. Small. 8, 336-355 (2012).
  21. Barreau, V., et al. Fibrillar Elastomeric Micropatterns Create Tunable Adhesion Even to Rough Surfaces. Adv. Funct. Mater. 26, 4687-4694 (2016).
  22. Briggs, G. A. D., Briscoe, B. J. The effect of surface topography on the adhesion of elastic solids. J. Phys. D. Appl. Phys. 10, 2453-2466 (1977).
  23. Dapp, W. B., Lücke, A., Persson, B. N. J., Müser, M. H. Self-affine elastic contacts: Percolation and leakage. Phys. Rev. Lett. 108, 1-4 (2012).
  24. Putignano, C., Carbone, G., Dini, D. Mechanics of rough contacts in elastic and viscoelastic thin layers. Int. J. Solids Struct. 69, 507-517 (2015).
  25. Laulicht, B., Langer, R., Karp, J. M. Quick-release medical tape. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 18803-18808 (2012).
  26. Kim, T., Park, J., Sohn, J., Cho, D., Jeon, S. Bioinspired, Highly Stretchable, and Conductive Dry Adhesives Based on 1D-2D Hybrid Carbon Nanocomposites for All-in-One ECG Electrodes. ACS Nano. 10, 4770-4778 (2016).
  27. Adamietz, I. A., et al. Effect of self-adhesive, silicone-coated polyamide net dressing on irradiated human skin. Radiat. Oncol. Investig. 2, 277-282 (1994).
  28. White, R. Evidence for atraumatic soft silicone wound dressing use. Wounds UK. 1, 104-109 (2005).
  29. Quan, M. B., Edwards, C., Marks, R. Non-invasive in vivo techniques to differentiate photodamage and ageing in human skin. Acta Derm. Venereol. 77, 416-419 (1997).
  30. Brown, X. Q., Ookawa, K., Wong, J. Y. Evaluation of polydimethylsiloxane scaffolds with physiologically-relevant elastic moduli: Interplay of substrate mechanics and surface chemistry effects on vascular smooth muscle cell response. Biomaterials. 26, 3123-3129 (2005).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS One. 7, e51499(2012).
  32. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. J. Micromechanics Microengineering. 24, 35017(2014).
  33. Persson, B. N. J., Gorb, S. The effect of surface roughness on the adhesion of elastic plates with application to biological systems. J. Chem. Phys. 119, 11437(2003).
  34. Peressadko, A. G., Hosoda, N., Persson, B. N. J. Influence of surface roughness on adhesion between elastic bodies. Phys. Rev. Lett. 95, 1-4 (2005).
  35. Purtov, J., et al. Measuring of the hardly measurable: adhesion properties of anti-adhesive surfaces. Appl Phys A. 111, 183-189 (2013).
  36. Kroner, E., Blau, J., Arzt, E. Note: An adhesion measurement setup for bioinspired fibrillar surfaces using flat probes. Rev. Sci. Instrum. 83, 16101(2012).
  37. Sun, S., Li, M., Liu, A. A review on mechanical properties of pressure sensitive adhesives. Int. J. Adhes. Adhes. 41, 98-106 (2013).
  38. Webber, R. E., Shull, K. R., Roos, A., Creton, C. Effects of geometric confinement on the adhesive debonding of soft elastic solids. Phys. Rev. E. 68, 21805(2003).
  39. Creton, C., Lakrout, H. Micromechanics of flat-probe adhesion tests of soft viscoelastic polymer films. J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 38, 965-979 (2000).
  40. Tan, S. H., Nguyen, N. -T., Chua, Y. C., Kang, T. G. Oxygen plasma treatment for reducing hydrophobicity of a sealed polydimethylsiloxane microchannel. Biomicrofluidics. 4, 32204(2010).
  41. Kim, B., Peterson, E. T. K., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 7, 5013-5016 (2004).
  42. Briganti, E., et al. Silicone based polyurethane materials: A promising biocompatible elastomeric formulation for cardiovascular applications. J. Mater. Sci. Mater. Med. 17, 259-266 (2006).
  43. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9, 2132(2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Polimeryczne cienkie warstwynak adanie metod doctor bladepomiary adhezjizastosowania w hodowli kom rkowejopracowywanie klej w sk rnychskaningowa mikroskopia elektronowamikroskopia optycznaobr bka plazmowaocena cytotoksyczno ci
Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.