Method Article

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

DOI:

10.3791/57576

⸱

June 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodysekcja laserowa (LCM) pozwoliła na analizę ekspresji genów pojedynczych komórek i wzbogaconych populacji komórek w skrawkach tkanki. LCM jest doskonałym narzędziem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek oraz rozwoju i progresji różnych chorób, w tym jaskry. Jaskra, która obejmuje rodzinę postępujących neuropatii nerwu wzrokowego, jest najczęstszą przyczyną nieodwracalnej ślepoty na całym świecie. Zmiany strukturalne i uszkodzenia w obrębie siatki beleczkowej (TM) mogą powodować wzrost ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP), który jest głównym czynnikiem ryzyka rozwoju jaskry. Jednak dokładne mechanizmy molekularne związane z tym są nadal słabo poznane. Możliwość przeprowadzenia analizy ekspresji genów będzie miała kluczowe znaczenie dla uzyskania dalszych informacji na temat funkcji tych komórek i ich roli w regulacji IOP i rozwoju jaskry. Aby to osiągnąć, potrzebna jest powtarzalna metoda izolowania wysoce wzbogaconej TM z zamrożonych fragmentów oczu myszy oraz metoda dalszej analizy ekspresji genów, taka jak RT-qPCR i RNA-Seq. Opisana w niniejszym dokumencie metoda została opracowana w celu wyizolowania TM o wysokiej czystości z oczu myszy w celu przeprowadzenia dalszej cyfrowej analizy PCR i mikromacierzy. Ponadto technikę tę można łatwo dostosować do izolacji innych wysoce wzbogaconych komórek oka i przedziałów komórkowych, które były trudne do wyizolowania od oczu myszy. Połączenie analizy LCM i RNA może przyczynić się do bardziej wszechstronnego zrozumienia zdarzeń komórkowych leżących u podstaw jaskry.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jaskra to grupa chorób charakteryzujących się neuropatią nerwu wzrokowego i retinopatią, która ostatecznie prowadzi do nieodwracalnej ślepoty1,2. Szacuje się, że do 2020 roku ponad 70 milionów ludzi na całym świecie będzie żyło z jakąś formą choroby3,4,5,6,7. Jaskra pierwotnego otwartego kąta (POAG), najbardziej rozpowszechniony typ jaskry, charakteryzuje się zmniejszeniem odpływu cieczy wodnistej (AH), co prowadzi do wzrostu ciśnienia wewnątrzgałkowego (IOP)8,9,10,11,12,13,143,15,16,17,18. Nieleczone, przewlekle podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe prowadzi do postępującego i nieodwracalnego uszkodzenia siatkówki i głowy nerwu wzrokowego, powodując ślepotę promieniową1,2,19. Wszystkie obecne metody spowalniania postępu jaskry koncentrują się na zmniejszeniu ciśnienia wewnątrzgałkowego, albo poprzez zmniejszenie tempa produkcji AH przez ciało rzęskowe, albo zwiększenie jego odpływu1,8,9,10,11,12,13,14. Siatka beleczkowa (TM) odgrywa istotną rolę w aktywnej regulacji pierwotnego szlaku odpływu AH, a jej niewłaściwa funkcja jest czynnikiem sprawczym jaskry nadciśnieniowej1,2,19. Jednak mechanizmy molekularne związane z dysfunkcją TM i sposób, w jaki reguluje ona drenaż AH, nie są jeszcze w pełni poznane i są obecnie głównym przedmiotem badań nad jaskrą1,2,19,20. Podczas gdy kilka badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS) powiązało wiele genów z jaskrą i zwiększoną opornością na odpływ AH w TM, dokładne mechanizmy molekularne, które prowadzą do choroby, nie są jeszcze w pełni zrozumiałe21,22,23,24,25.

Modele zwierzęce znacznie poszerzyły naszą obecną wiedzę na temat postępu choroby w jaskrze (obszerne przegląd w3,15,16,26,27,28,29,30,31,32,33). Opracowano kilka pionierskich metod do badania klasy TM34,35,36 i metody te są szeroko stosowane w celu pogłębienia naszej obecnej wiedzy na temat prawidłowych i chorych tkanek. Jednym z obszarów, który nie został dogłębnie zbadany, jest wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy do badania molekularnych mechanizmów niewydolności TM. Transgeniczne badania genów związanych z TM na myszach typu knock-in i knock-out, takie jak Myocilin (Myoc)37,38 i Cyp1b139, były podstawowymi narzędziami do badania molekularnych mechanizmów funkcji TM. Zrozumiałe jest, że mały rozmiar TM u myszy stanowi poważną przeszkodę, którą należy pokonać, aby rozpocząć badanie tej tkanki. Modele mysie stanowią potężne narzędzie do badania genetyki i molekularnych mechanizmów chorób, podczas gdy postępy w technologiach LCM dostarczają niezbędnych narzędzi do umożliwienia badania najmniejszych i najdelikatniejszych tkanek, w tym TM.

W tym raporcie opisano solidną i powtarzalną metodę dla LCM wysoce wzbogaconej TM z oczu myszy wraz z późniejszą izolacją RNA i amplifikacją do dalszej analizy ekspresji. Podobne metody zostały z powodzeniem zastosowane u myszy do izolacji innych typów tkanek oka40,41,42,43,44, opisana tutaj metodologia może być zastosowana do innych dyskretnych tkanek oka do badania RNA, mikroRNA, DNA i białek. Co ważne, technika ta umożliwia wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu lepszego zrozumienia molekularnej patogenezy upośledzenia TM w jaskrze i chorobach oczu3,15,16,17,18,26,31,45,46. Możliwość wyizolowania TM oczu myszy za pomocą LCM będzie przydatną techniką w uzyskaniu dalszych informacji na temat mechanizmów molekularnych kilku chorób oczu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (ACUC) Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS) zatwierdził całą metodologię tego badania w ramach Propozycji Badań na Zwierzętach NIEHS IIDL 05-46.

1. Optymalna kolekcja tkanek do mikrodysekcji laserowej

  1. Uzyskaj 2 do 3 miesięcznych myszy, samca lub samicę C57BL/6. Poddać eutanazji za pomocą CO2 przez co najmniej 1 minutę lub do momentu ustania oddychania. Wyjmij zwierzę z klatki i zapewnij śmierć przez zwichnięcie szyjki macicy, dekapitację lub torakotomię.
  2. Przed sekcją upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania są czyste i wysterylizowane.
    UWAGA: Do usuwania oczu potrzebne będą zakrzywione nożyczki i kleszcze z ząbkowaną końcówką (preferowany rozmiar końcówki: 0,5 x 0,4 mm).
  3. Połóż mysz na płaskiej powierzchni na boku, tak aby oko było łatwo dostępne. Chwyć kleszczami za kant (kącik oka), aby ustabilizować mysz, a następnie za pomocą zakrzywionych nożyczek, skierowanych do krzywej od oka, przetnij wokół oka, używając oczodołu jako prowadnicy, aż gałka oczna będzie mogła być łatwo wyjęta z oczodołu (użyj krzywej, a nie końcówek nożyczek).
  4. Delikatnie pociągnij i za pomocą zakrzywionych nożyczek przetnij nerw wzrokowy, który uwalnia oko z oczodołu. Ostrożnie usuń tkankę nieoczną z oka i przepłucz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Powtórz 1,3 - 1,4 dla przeciwległego oka.
  5. Osusz oko chusteczką higieniczną, aby usunąć wilgoć przed osadzeniem. Umieść oko w formie próbki (25 x 20 x 5 mm3) tak, aby soczewka i nerw wzrokowy były równoległe do blatu stołu, aby uzyskać przekroje strzałkowe. Zanurz oczy w środku o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.) i umieść na suchym lodzie do zamrożenia. Po zamrożeniu bloki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie zamrożonego przekroju do mikrodysekcji laserowej

  1. Przed użyciem inkubować szkiełka membranowe z politereftalanu etylenu (PET) w sieciowniku UV z maksymalną mocą przez 45 min.
  2. Rozpyl roztwór odkażający RNase na szczotkę, kleszcze, słoiki sprzęgające i uchwyt montażowy. Dokładnie wytrzyj. Spłucz wodą bez nukleaz i wysusz. Przetrzyj kriostat 100% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
  3. Ustawić kriostat do -18 °C. Wyjąć po jednym zamrożonym bloku z zamrażarki o temperaturze -80 °C i dostarczyć do kriostatu wraz z suchym lodem. Pozostawić zamrożony blok do zrównoważenia z temperaturą kriostatu przez co najmniej 10 minut.
  4. Wyciśnij niewielką ilość O.C.T. na kawałek montażowy ( Rysunek 1A) i wyjmij blok tkanki z formy i ostrożnie umieść blok na uchwycie montażowym (Rysunek 1B). Gdy blok tkanki na uchwycie montażowym zostanie zamrożony na stałe, włóż do uchwytu próbki kriostatu (Rysunek 2A).
  5. Wyreguluj kriostat, aby przeciąć odcinki o wielkości 8 μm i ostrożnie przeciąć blok OCT, aby dotrzeć do próbki tkanki. Po zaobserwowaniu tkanki przerwij cięcie, przytnij zamrożone bloki ze wszystkich stron za pomocą czystej żyletki i pozostaw 3 - 4 mm OCT otaczające tkankę, aby umożliwić obsługę pędzlem (Rysunek 2B). Między każdą wymianą próbki należy używać nowego, czystego pędzla zamiast płytki rolkowej, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki.
  6. Przekrój przez oko działa szybko. Zabarwić co trzeci odcinek, zalewając szkiełko szybkim, jednoetapowym barwnikiem hematoksyliny i eozyny (H&E) przez 60 s, spłukać wodą z kranu, wysuszyć na powietrzu, zaczyścić w środku czyszczącym i zamontować na naładowanym szkiełku z szkiełkiem nakrywkowym. View pod mikroskopem i kontynuuj cięcie, aż TM będzie widoczny w wyciętych sekcjach.
  7. Gdy TM zacznie się pojawiać, wytnij 2 sekcje i zamontuj na naładowanym szkiełku w celu rutynowego barwienia H&E, aby utworzyć mapę do cięcia za pomocą LCM.
    UWAGA: Patrz rozdział 3, aby zapoznać się ze szczegółami mapy i barwienia.
  8. Po pierwszym szkiełku z mapą H&E wytnij i wyrównaj 6 szeregowych odcinków o grubości 8 μm w kriostacie i jednocześnie zamontuj na szkiełku z membraną PET (Rysunek 3A, B). Przyklej tkankę, krótko przesuwając kciuk w rękawicy wzdłuż tylnej części membrany. Po zamontowaniu należy natychmiast umieścić szkiełko z membraną PET w pudełku na suwak na suchym lodzie.
    UWAGA: Można zamontować mniej sekcji, jednak zaleca się jednoczesne montowanie wielu sekcji na szkiełku w celu zmniejszenia degradacji RNA poprzez ograniczenie czasu, przez jaki każda sekcja jest wystawiona na działanie powietrza o temperaturze pokojowej.
  9. Kontynuuj sekcję oka, po każdych dwóch szkiełkach z membraną PET po 6 sekcji każdy, zbierz dwie sekcje na naładowanym szkiełku, aby utworzyć kolejny szkiełko do barwienia H&E. Kontynuuj cięcie, około 100 szeregowych odcinków o grubości 8 μm, aż TM przestanie być widoczny. Potwierdzić, szybko zabarwiając jedną sekcję na naładowanym szkiełku podstawowym (patrz 2.6).
  10. Przechowuj wszystkie szkiełka z membraną PET w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania LCM.

3. Protokół barwienia szkiełek na mapie H&E i przegląd morfologiczny

  1. Aby zobrazować i przejrzeć szkiełka mapowe na naładowanych szkiełkach, utrwal tkankę, natychmiast przenosząc ją do słoika do barwienia wypełnionego 100 ml roztworu do szybkiego utrwalania przez 7 sekund. Przepłucz szkiełko, zanurzając je w wodzie destylowanej 10 - 20 razy, a następnie przenieś szkiełko do słoika sprzęgającego z czystą wodą destylowaną.
  2. Wyjmij szkiełko z wody i osusz suche krawędzie chusteczką higieniczną. Odpipetować 200 μl zmodyfikowanej przefiltrowanej hematoksyliny Harrisa na każdą sekcję i inkubować przez 30 s w temperaturze pokojowej. Ostrożnie opłucz szkiełko pod bieżącą wodą z kranu, aż woda będzie czysta. Osusz koniec szkiełka chusteczką chusteczką między każdym krokiem (osusz między każdym krokiem od 3,2 do 3,5), aby usunąć nadmiar płynu.
  3. Umieść szkiełko w 1x PBS w temperaturze pokojowej na 30 s. Następnie ostrożnie płucz szkiełko pod bieżącą wodą z kranu przez 30 sekund.
  4. Zanurz szkiełko 3 - 4 razy w kąpieli etanolowej 95%. Nałożyć wystarczającą ilość roztworu barwnika Eozyny Y, aby pokryć tkankę na szkiełku i inkubować przez 15 s w temperaturze pokojowej.
  5. Opłucz szkiełko w kąpieli z 95% etanolem dwa razy, z 10 - 20 szybkimi zanurzeniami każdy. Opłucz szkiełko w kąpieli 100% etanolowej dwa razy, z 10 - 20 szybkimi zanurzeniami każdy. Następnie spłucz szkiełko dwa razy w kąpieli ksylenowej (po 10 - 20 szybkich zanurzeń).
  6. Zamontuj, nakładając żywiczny środek montażowy na tkankę, ostrożnie dodaj szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i pozostaw do wyschnięcia w kapturze na noc.
  7. Przeglądaj slajdy H&E wizualnie lub za pomocą cyfrowego skanera slajdów. Zidentyfikuj slajdy mapy z TM wyraźnie widoczne i dostępne do cięcia. Użyj szkiełek z membraną PET między tymi szkiełkami mapy dla LCM.

4. Protokół przetwarzania i barwienia szkiełek membranowych z politereftalanu etylenu (PET)

  1. Przed wyjęciem szkiełek PET z zamrażarki należy najpierw przygotować roztwór podstawowy fioletu krezylowego, rozpuszczając 0,3 g octanu fioletu krezylowego w 20 ml 75% etanolu i umieścić na wytrząsarce na 2 godziny. Przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 6 miesięcy.
  2. Przygotować alkoholowy roztwór eozyny Y ze świeżym 75% etanolem w stosunku 1:4. Przygotuj roztwory utrwalające (75% etanolu) i odwadniające (75%, 95% i 100% etanolu) w czystych, wolnych od nukleaz, stożkowych probówkach polipropylenowych o pojemności 50 ml na lodzie. Dodaj inhibitor RNazy do każdego roztworu.
  3. Wyjąć pudełko ze szkiełkami zawierającymi zamrożone skrawki tkanek z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić je na suchym lodzie. Przetwarzaj jeden slajd na raz. Napraw szkiełka, umieszczając je natychmiast w zimnym 75% etanolu na 30 s.
  4. Delikatnie zanurz szkiełko w wodzie wolnej od nukleaz na 10 - 15 sekund, aby rozpuścić O.C.T. bez ingerencji w skrawki tkanki.
  5. Ostrożnie odpipetować 300 μl 1,5% roztworu octanu fioletu krezylowego bezpośrednio na sekcje i inkubować przez 45 s w temperaturze pokojowej. Następnie umyj jeden raz, umieszczając go w kąpieli z 75% etanolem na 30 sekund. Odpipetować 200 μl roztworu eozyny Y na sekcje i inkubować przez 3 - 5 s.
  6. Odwodnić tkankę, umieszczając szkiełko w kąpieli 75% etanolu, 95% etanolu, a na koniec w 100% etanolu na 30 sekund każda. Osusz koniec szkiełka chusteczką chusteczką między każdym krokiem, aby usunąć nadmiar płynu. Pozostaw zjeżdżalnię do całkowitego wyschnięcia pod maską przez 5 minut. Po wyschnięciu natychmiast wykonaj LCM.
    UWAGA: Zaleca się unikanie stosowania ksylenu na tym etapie, może to spowodować nieodpowiednie przyleganie skrawków tkanki do szkiełka membranowego i zmniejszyć skuteczność wychwytywania tkanek.

5. Mikrodysekcja laserowa za pomocą lasera UV

  1. Włącz komputer i pozwól na uruchomienie. Włącz zasilanie mikroskopu światłem białym. Włącz lasera UV, a zaświeci się żółta dioda LED. Uruchom oprogramowanie LCM, pozwól mu się w pełni załadować, a wyświetli się wideo na żywo. Naciśnij przycisk lasera na skrzynce sterownika, a zaświeci się zielona dioda LED.
  2. Załaduj nowe szkiełko podstawowe na stolik mikroskopu, a następnie umieść szkiełko z membraną PET stroną z zabarwionej tkanki skierowaną w dół bezpośrednio na górnej części szkiełka podstawowego. Upewnij się, że membrana i szkiełko są ściśle sparowane na stoliku mikroskopu.
  3. Rozpocznij LCM, najpierw ustawiając limity suwaka. Wybierz najmniejsze powiększenie 4X w panelu obiektywu (Rysunek 4). Następnie zdefiniuj obszar roboczy szkiełka membranowego, przesuwając stolik xy mikroskopu, aż lewy górny róg, w którym spotykają się metal i membrana, będzie widoczny w strumieniu wideo na żywo, naciśnij przycisk "Limit 1", a na mapie drogowej pojawi się czerwony prostokąt. Następnie przejdź do stolika xy w przeciwległym rogu i naciśnij przycisk "limit 2". Naciśnij przycisk "skanuj", aby utworzyć obraz mapy drogowej błony i tkanek między ustawionymi limitami.
  4. Kliknij dwukrotnie w pobliżu TM jednej z sekcji oka na mapie drogowej, TM może znajdować się w pobliżu wierzchołka kąta tęczówkowo-rogówkowego (Rysunek 5A). Po zidentyfikowaniu TM zwiększ powiększenie do 10X i ręcznie ustaw ostrość na TM. Powtórz tę czynność z obiektywami 20X i 40X. Gdy TM jest ostra na obiektywie 40X (Rysunek 5B), przejdź do pustego obszaru w pobliżu (może być konieczne nieznaczne dostosowanie ostrości), wybierz "narzędzie do rysowania odręcznego" i narysuj długą linię na pustym obszarze tkanki.
  5. Ustaw parametry lasera tak, aby "prędkość cięcia" wynosiła 34%, "ostrość" wynosiła 58%, a "moc" wynosiła 70% (Rysunek 4), a następnie naciśnij przycisk "cięcie". Dokonuj precyzyjnych regulacji parametrów lasera dotyczącego prędkości, ostrości i mocy, aż do uzyskania wyraźnej i cienkiej linii cięcia (patrz Rysunek 5C). Aby uzyskać precyzyjne cięcie, upewnij się, że cięcie przebiega zgodnie z narysowaną linią.
  6. Załaduj pokrywę rurki izolacyjnej do uchwytu nasadki i otwórz rurkę. Przymocuj uchwyt nasadki do podnośnika nasadki i upewnij się, że rurka jest odwrócona. Upewnij się, że materiał nasadki samoprzylepnej wystaje poza końcówkę nasadki, aby zapewnić prawidłowe uchwycenie pożądanej tkanki.
  7. Wybierz "Ręczny" tryb preparowania w panelu oprogramowania. Dokładnie sprawdź, czy TM (Rysunek 5B) znajduje się bezpośrednio pod rurką izolacyjną. Ustaw balans bieli i dostosuj jasność, aby uzyskać optymalną jakość obrazu (Rysunek 4).
  8. Aby rozpocząć cięcie, ręcznie wyreguluj ostrość i narysuj linię za pomocą narzędzia odręcznego, upewnij się, że nasadka zbierająca pozostaje w górnej pozycji, nie dotykając jeszcze membrany. Narysuj częściowe okręgi w pobliżu miejsca, w którym TM styka się z twardówką (Rysunek 5C), a następnie naciśnij "wytnij". Po wykonaniu pierwszych cięć ustaw nasadkę w dolnej pozycji i ponownie wyreguluj ostrość, a następnie narysuj dwie linie w otwartej lub wolnej przestrzeni, aby połączyć dwie częściowe okręgi kończące okrąg wokół TM, następnie naciśnij "wytnij" i zbierz tkankę z przekroju, upewnij się, że TM została podniesiona przez nasadkę do mikrodysekcji (Rysunek 5D-F).
  9. Umieść nasadkę z powrotem w górnej pozycji i powtórz (5.2 - 5.8) na pozostałych sekcjach. Nieznacznie dostosuj pozycję nasadki, tak aby wszystkie wyizolowane próbki zmieściły się na nasadce i nie nachodziły na siebie ( Rysunek 5G). Aby zachować spójność, okno czasowe dla jednego slajdu wynosi 20 minut. Użyj mniejszej liczby sekcji na szkiełko PET, jeśli potrzeba więcej czasu na odizolowanie TM od wszystkich sekcji. W przypadku następnej membrany PET włóż nową rurkę izolacyjną i powtórz sekcję 5.

6. Liza mikrowypreparowanej tkanki TM

  1. Świeżo przygotowany bufor do lizy RNA do lizy izolowanej tkanki LCM. Dodać 10 μl β-merkaptoetanolu do każdego 1 ml buforu do lizy. Bufor do lizy z β-merkaptoetanolem należy przechowywać w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 1 miesiąc.
  2. Wyjmij rurkę izolacyjną z uchwytu nakrętki w ciągu 20 minut od rozpoczęcia mikrodysekcji. Wizualizuj powierzchnię nasadki na oko, aby zapewnić uchwycenie TM.
  3. Ostrożnie odpipetować 10 μl buforu do lizy na pokrywę probówki zbiorczej, upewniając się, że bufor do lizy całkowicie zakrywa mikrowyciętą TM. Delikatnie zamknij samoprzylepną nasadkę i inkubuj probówkę zbiorczą do góry nogami w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwirować przy 800 x g przez 2 minuty i umieścić lizat na suchym lodzie. Przechowywać lizaty w temperaturze -80 °C w celu późniejszego oczyszczenia i analizy.

7. Izolacja RNA i analiza jakości

  1. Analizuj jakość RNA, rozmrażając próbki w temperaturze pokojowej. Zbierz wszystkie próbki wyizolowane od jednej myszy w jednej probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.
    UWAGA: Na przykład dla każdej kontrpróby biologicznej wygenerowano 10 - 12 probówek z mikrowyciętymi czapeczkami w 10 μl lizatu, a wszystkie lizaty przeniesiono do jednej probówki dla każdej kontrpróby biologicznej (100 - 120 μl lizatu).
  2. Dodaj jedną objętość świeżo przygotowanego 70% etanolu (wykonanego z wody wolnej od RNaz) do każdego roztworu lizatu. Następnie oczyść całkowite RNA zgodnie z wytycznymi użytkownika zestawu do izolacji RNA. Upewnij się, że usunięto genomowe DNA z każdej próbki RNA.
    UWAGA: Genomowe DNA może zakłócać dalszą analizę RNA.
  3. Zmierz jakość RNA wyizolowanego z TM, łącząc próbki od każdej myszy i analizując integralność rybosomalnego RNA (Rysunek 6A).
    UWAGA: Ze względu na mały rozmiar TM, piki rybosomalnego RNA mogą nie być obserwowalne (Figura 6B) w profilu jakości RNA (dwa piki obserwowane między 1,000 - 4,000 pz w Rysunek 6A, C), który jest używany do obliczania liczby integralności RNA (RIN)47.
    1. Uzyskaj dokładniejszą miarę integralności RNA, izolując RNA z obficiej występującej tkanki pozostałej na szkiełku błonowym. Aby uzyskać reprezentatywny RIN, należy wyizolować RNA z tkanki oka na szkiełku membranowym, pipetując 10 μl buforu do lizy na jeden fragment tkanki i przeprowadzić izolację RNA. Przeanalizuj jakość RNA i oblicz RIN (Rysunek 6C).
  4. W przypadku dalszych zastosowań RNA należy użyć zestawu RNA o niskim wkładzie do sekwencjonowania i generowania biblioteki cDNA, aby uzyskać powtarzalne wyniki z zaledwie 80 odcinków izolowanej TM LCM.

8. Analiza

  1. Aby sprawdzić, czy pobrana tkanka jest rzeczywiście wzbogacona w geny związane z TM, zbierz wiele dodatkowych RNA z mikrowypreparowanego całego oka, twardówki, tęczówki, siatkówki, rogówki i soczewki od 3 oddzielnych myszy. Użyj tego RNA w połączeniu z RNA zebranym LCM z izolowanej TM i ciałem rzęskowym pobranym od 4 oddzielnych myszy.
  2. Konwersja RNA z mikrowypreparowanych próbek polegała na przekształceniu w cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA. Amplifikuj RNA z izolowanych próbek LCM i przekształć je w cDNA przy użyciu zestawu RNA do cDNA o niskim wchodzeniu.
  3. Przeanalizuj całe RNA pod kątem genów eksprymujących siatkę beleczkową, miocyliny (MYOC) i alfa-aktyny-2 (ACTA2) i znormalizuj za pomocą genu porządkowego HSP90a1 za pomocą cyfrowego PCR (Figura 7A-B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LCM zebrał RNA z TM i wyizolował ciało rzęskowe od 4 różnych myszy, aby móc analizować ekspresję genów i porównywać ekspresję z ekspresją w całym oku, twardówce, tęczówce, siatkówce, rogówce i soczewce wyizolowanej od trzech oddzielnych myszy. Geny wyrażające TM, MYOC48 i ACTA249 zostały przeanalizowane we wszystkich pobranych tkankach, aby potwierdzić, że wyizolowane próbki TM były rzeczywiście wysoce wzbogacone w TM. Ze w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TM odgrywa istotną rolę w aktywnym utrzymaniu homeostatycznego ciśnienia wewnątrzgałkowego, a jego dysfunkcja jest powszechnie akceptowana jako główny czynnik wywołujący jaskrę nadciśnieniową 1,2,19. Szereg polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w kilku genach zidentyfikowanych za pomocą analizy GWAS powiązano ze zwiększonym ryzykiem jaskry i zwiększoną odpornością na odpływ AH w TM; Jednak dokładne mechanizmy molekularne, które...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Podkłady ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282)BioRad10031252
FAM Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2946-90004
Zestaw Agilent RNA 6000 PicoAgilent Technologies5067-1513
BioRad QX200 Kroplowy cyfrowy system PCRMały
malarski BioRadSzkiełko mikroskopowe z naładowanym szkłemThermo scientific4951PLUS-001
Octan fioletu krezylowegoSigma AldrichC5042
Zakrzywione nożyczki
Barwnik Eosin YThermo scientific71204
Kleszczyki
HemaCenAmerican MasterTechSTHEM30
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościApplied Biosystems4368814
Startery ddPCR Hsp90a (dMmuCPE5097465)BioRad10031255VEX
Kriostat Leica CM1850 JednostkaLeica
Millex-GSEMD MilliporeSLGS033SB0,22 i mikro; m
MMI CellCut UV Model do cięcia UVMaszyny molekularne i BranżeInstalacje LCM
MMI CellTools OprogramowanieMaszyny molekularne i Branże50202Oprogramowanie LCM
Probówka na próbkę do mikrodyssekcji wychwytu laserowegoProdukty ASEEST-LMD-M-500/ Wyprodukowana przez Microdissect GmBH w Niemczech i rozprowadzona przez ASEE
Products Probówka na próbkę do mikrodysekcji wychwytu laserowego (alternatywna)Maszyny molekularne i Branże
zmodyfikowane Harris HematoxylinThermo scientific7211FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)Szkiełka Memebrane BioRad10031252
PBS
, wolne od RNazProdukty ASEEFS-LMD-M-50rMembrana z politereftalanu etylenu (PET) / Wyprodukowane przez Microdissect GmBH w Niemczech i dystrybuowane przez Produkty ASEE
Szkiełka Memebrane, wolne od RNaz (alternatywne)Maszyny molekularne i Branże50102
Rapid FixThermo 6764212 naukowyH& Bufor
RLTQiagen79216stosowany do próbek LCM
RNAseZapSigmaR2020Roztwór do dekontaminacji RNazy
Chroń inhibitor RNA RNAzaSigma AldrichR7397
RNeasy Micro KitQiagen74004Zestaw do izolacji RNA
SMART-Seq v4 Zestaw RNA o bardzo niskim nakładzie wejściowymTakara Clontech634888zestaw do pobierania RNA do cDNA o niskim wkładzie do próbek LCM
SuperMix (bez dUTP)BioRad1863023cyfrowa mieszanka główna PCR
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm)Sakura4557
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Stratalinker UV CrosslinkerStratagene400075
XyleneMacron8668
pędzel do etanolu Zakrzywiona i ząbkowana końcówka (preferowany rozmiar końcówki: 0,5 x 0,4 mm) filtrująca Rurka z nasadką izolacyjną do lizy do barwienia E

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionTrabecular MeshworkMouse EyesGene Expression AnalysisRNA IsolationDigital PCRMicroarray AnalysisH E StainingPET Membrane SlidesCryostat Sectioning

Related Articles