Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej

Summary

Tutaj prezentujemy i porównujemy dwa protokoły używane do decelularizacji tkanek roślinnych: podejście oparte na detergentach i podejście bez detergentów. Obie metody pozostawiają macierz zewnątrzkomórkową zastosowanych tkanek roślinnych, które można następnie wykorzystać jako rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej.

Abstract

Autologiczne, syntetyczne i zwierzęce przeszczepy obecnie używane jako rusztowania do zastępowania tkanek mają ograniczenia wynikające z niskiej dostępności, słabej biokompatybilności i kosztów. Tkanki roślinne mają korzystne cechy, które sprawiają, że wyjątkowo nadają się do stosowania jako rusztowania, takie jak duża powierzchnia, doskonały transport i retencja wody, porowatość połączeń, istniejące wcześniej sieci naczyniowe i szeroki zakres właściwości mechanicznych. Opisano tutaj dwie skuteczne metody decelularyzacji roślin do zastosowań w inżynierii tkankowej. Pierwsza metoda opiera się na kąpielach detergentowych w celu usunięcia materii komórkowej, co jest podobne do wcześniej ustalonych metod stosowanych do oczyszczania tkanek ssaków. Druga to metoda bez detergentów zaadaptowana z protokołu, który izoluje naczynia krwionośne liści i polega na użyciu podgrzanego wybielacza i kąpieli solnej w celu oczyszczenia liści i łodyg. Obie metody pozwalają uzyskać rusztowania o porównywalnych właściwościach mechanicznych i niskim wpływie na metabolizm komórkowy, co pozwala użytkownikowi wybrać protokół, który lepiej odpowiada jego zamierzonemu zastosowaniu.

Introduction

Inżynieria tkankowa pojawiła się w latach 80. XX wieku w celu stworzenia żywych substytutów tkanek i potencjalnie rozwiązania znacznych niedoborów narządów i tkanek¹. Jedna ze strategii wykorzystuje rusztowania do stymulowania i kierowania ciałem w celu regeneracji brakujących tkanek lub narządów. Chociaż zaawansowane podejścia produkcyjne, takie jak druk 3D, pozwoliły wytworzyć rusztowania o unikalnych właściwościach fizycznych, zdolność do produkcji rusztowań o zróżnicowanym zakresie osiągalnych właściwości fizycznych i biologicznych pozostaje wyzwaniem^2,3. Ponadto, ze względu na brak funkcjonalnej sieci naczyniowej, techniki te zostały ograniczone w regeneracji tkanek trójwymiarowych. Użycie zdecelularyzowanych tkanek zwierzęcych i ludzkich jako rusztowań pomogło w obejściu tego problemu^4,5,6,7. Jednak wysokie koszty, zmienność między partiami i ograniczona dostępność mogą ograniczać powszechne stosowanie rusztowań dla zwierząt bez komórek⁸. Istnieją również obawy dotyczące potencjalnego przenoszenia choroby na pacjentów i reakcji immunologicznej na niektóre pozbawione komórek tkanki ssaków⁹.

Celuloza, pochodząca ze źródeł roślinnych i bakteryjnych, była szeroko wykorzystywana do generowania biomateriałów do szerokiego zakresu zastosowań w medycynie regeneracyjnej. Oto kilka przykładów: bone^10,11, cartilage^12,13,14 i wound healing¹⁵. Rusztowania wykonane z celulozy mają dodatkową zaletę, ponieważ są trwałe i odporne na rozkład przez komórki ssaków. Wynika to z faktu, że komórki ssaków nie wytwarzają enzymów niezbędnych do rozkładu cząsteczek celulozy. Dla porównania, rusztowania wytwarzane przy użyciu makrocząsteczek z macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak kolagen, są łatwo rozkładane¹⁶ i mogą nie nadawać się do długoterminowych zastosowań. Rusztowania kolagenowe mogą być stabilizowane przez chemiczne sieciowanie. Istnieje jednak kompromis ze względu na nieodłączną toksyczność środków sieciujących, które wpływają na biokompatybilność rusztowań¹⁷. Z drugiej strony, celuloza może pozostać obecna w miejscu implantacji przez dłuższy czas, ponieważ jest odporna na degradację enzymatyczną przez komórki ssaków^18,19,20. Można to zmienić, dostrajając szybkość degradacji poprzez wstępną obróbkę hydrolizy i jednoczesne dostarczanie rusztowań z celulazami²¹. Biokompatybilność decelularyzowanych rusztowań celulozowych pochodzenia roślinnego in vivo została również wykazana w badaniu przeprowadzonym na myszach²².

Przez setki milionów lat ewolucji, rośliny udoskonaliły swoją strukturę i skład, aby zwiększyć efektywność transportu i zatrzymywania płynów. Naczynia naczyniowe roślin minimalizują opór hydrauliczny, rozgałęziając się na mniejsze naczynia, podobnie jak naczynia krwionośne ssaków zgodnie z prawem Murraya²³. Po decelularyzacji roślina utrzymuje złożoną sieć naczyń krwionośnych i połączonych ze sobą porów. Biorąc pod uwagę ogromną liczbę łatwo dostępnych różnych gatunków roślin, rusztowania pochodzenia roślinnego mają potencjał, aby przezwyciężyć ograniczenia projektowe, które obecnie dotykają rusztowania w inżynierii tkankowej^24,25. Na przykład Modulevsky i wsp. wykazali, że angiogeneza i migracja komórek występują, gdy zdeceluloaryzowaną tkankę jabłka wszczepiono podskórnie na grzbiet myszy ²². Podobnie Gershlak i wsp. wykazali, że komórki śródbłonka mogą być hodowane w unaczynieniu zdecelularyzowanych liści²⁴. W innym eksperymencie Gershlak i wsp. byli również w stanie wykazać, że kardiomiocyty mogą rosnąć na powierzchni liści i były w stanie się skurczyć²⁴.

Rośliny również zawierają złożoną organizację od skali komórkowej do makroskopowej, co jest trudne do osiągnięcia nawet przy użyciu najbardziej zaawansowanych technik produkcji opracowanych do tej pory. Złożona, hierarchiczna konstrukcja tkanek roślinnych sprawia, że są one silniejsze niż suma ich składników²⁶. Rośliny posiadają mnóstwo różnych właściwości mechanicznych, począwszy od sztywnych i wytrzymałych elementów, takich jak łodygi, po znacznie bardziej elastyczne i giętkie, takie jak liście²⁷. Liście różnią się w zależności od gatunku pod względem wielkości, kształtu, wytrzymałości na pękanie, stopnia unaczynienia i mogą mieć różny stopień hydrofilowości. Ogólnie rzecz biorąc, te właściwości roślin sugerują, że rośliny pozbawione komórek mogą służyć jako unikalne i wysoce funkcjonalne urządzenia medyczne, w tym jako rusztowania inżynierii tkankowej.

Ten protokół skupia się na dwóch metodach decelularyzacji tkanek roślinnych, takich jak liście i łodygi, do wykorzystania jako rusztowania w inżynierii tkankowej. Pierwsza metoda to technika oparta na detergentach, która wykorzystuje serię kąpieli do usuwania DNA i materii komórkowej, która została zaadaptowana z szeroko stosowanej techniki decelularyzacji tkanek ssaków i roślin^{6,22,25,28,29,30}. Druga metoda nie wymaga użycia detergentów i jest zaadaptowana z protokołu "szkieletyzacji" zwykle używanego do usuwania tkanek miękkich liści³¹. Wcześniejsze prace wykazały, że gotowanie liści na wolnym ogniu w roztworze wybielacza i wodorowęglanu sodu ułatwiało oddzielenie naczyń krwionośnych od otaczających tkanek miękkich³¹. Technika ta może być zaczerpnięta z eksperymentów przeprowadzonych w XVII i XVIII wieku, takich jak praca Albertusa Seba³² i Edwarda Parrish³³. Eksperymenty te koncentrowały się na pozostawieniu materii roślinnej, takiej jak liście i owoce, zanurzonej w wodzie na dłuższy czas (od tygodni do miesięcy) i umożliwieniu bardziej miękkim tkankom naturalnego rozkładu. W tym przypadku podejście "szkieletyzacji" jest przystosowane do stosowania łagodniejszych warunków, takich jak dłuższy czas inkubacji w niższych temperaturach, w celu usunięcia pozostałości komórkowych i uniknięcia znacznego zakłócenia struktury tkanek miękkich. Do opisanych w niniejszym dokumencie doświadczeń wykorzystano trzy rodzaje roślin: Ficus hispida, Pachira aquatica i gatunek Garcinia. Opisano wyniki kwantyfikacji DNA, testów mechanicznych oraz wpływu obu metod na komórkową aktywność metaboliczną.

Protocol

1. Decelularyzacja tkanki roślinnej przy użyciu metody opartej na detergentach

1. Używaj świeżych lub mrożonych F. hispida, próbek liści. Niewykorzystane świeże próbki należy zamrozić w zamrażarce o temperaturze -20 °C i przechowywać do wykorzystania w przyszłości (do roku).
   UWAGA: Użyj tkanki łodygi lub liścia prawie każdej pożądanej rośliny. Wydłużony czas przechowywania może spowodować uszkodzenie tkanek.
   1. Należy określić wielkość i kształt próbek, które mają być przetworzone, na podstawie zamierzonego zastosowania próbki (tj. próbki pokrojone w paski dobrze nadają się do zastosowań związanych z badaniami mechanicznymi, natomiast próbki z krążkiem o średnicy 8 mm są przydatne w zastosowaniach związanych z hodowlą wielodołkową). Pokrój liść na krążki o średnicy 8 mm ostrym, czystym stemplem do biopsji, zanurzając go w temperaturze pokojowej (20-25 °C) dejonizowanym H₂O.
      Uwaga: Ten protokół może być stosowany na całych liściach i łodygach. Jednak mniejsze próbki będą szybciej decelularyzować.
   2. Próbki inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (20-25 °C) dejonizowanego_H2Ona płytce wstrząsającej ustawionej na niską prędkość w celu ich umycia i/lub rozmrożenia. Użyj wystarczającej ilości dejonizowanego_H2O, aby upewnić się, że wszystkie próbki są dokładnie zwilżone.
2. Przygotować roztwór 10% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS) w dejonizowanym_H2O. Umieścić próbki w odpowiednim pojemniku (idealne jest szklane lub plastikowe naczynie) i dodać roztwór SDS, aby całkowicie pokryć próbki. Próbki należy inkubować przez 5 dni w temperaturze pokojowej (20–25 °C) na płytce wstrząsającej ustawionej na niską prędkość, aby zapobiec uszkodzeniu próbek.
   UWAGA: Nie należy przepełniać pojemnika, ponieważ może to spowolnić proces decelularyzacji i prowadzić do nierównomiernego traktowania przez SDS. Na tym etapie próbki powinny nabrać brązowego odcienia.
   1. Po 5 dniach zastąp roztwór SDS dejonizowanym_H2O. Próbki inkubować przez dodatkowe 10-15 minut na płycie wstrząsającej, aby dokładnie spłukać resztki roztworu SDS.
3. Przygotować 1% (v/v) niejonowy środek powierzchniowo czynny w 10% (v/v) roztworze wybielacza. Aby przygotować 500 ml roztworu, wymieszaj 5 ml niejonowego środka powierzchniowo czynnego z 50 ml wybielacza, a następnie dodaj 445 ml dejonizowanego_H2O. Zanurz próbki w świeżo przygotowanym roztworze.
   UWAGA: Niejonowy roztwór środka powierzchniowo czynnego/wybielacza nie ma długiego okresu przydatności do spożycia, dlatego należy go zużyć w ciągu 48 godzin od przygotowania.
4. Niejonowy roztwór środka powierzchniowo czynnego/wybielacza należy wymieniać co 24 godziny, aż próbki zostaną całkowicie oczyszczone (patrz Rysunek 1A dla porównania wizualnego). Następnie inkubuj próbkę w wodzie dejonizowanej na płytce wstrząsającej przez 2 minuty, aby spłukać nadmiar niejonowego roztworu środka powierzchniowo czynnego/wybielacza. Ustaw płytkę potrząsającą na niskim poziomie, aby zapobiec uszkodzeniu próbek.
   UWAGA: Czas potrzebny do oczyszczenia użytych próbek różni się w zależności od rodzaju i gatunku rośliny. Całkowite odbarwienie próbek wskazuje na pełną decelularyzację (wykonaj kwantyfikację DNA, aby zapewnić dokładne oczyszczenie).
   1. Liofilizuj próbki w celu przechowywania ich do roku (preferowane jest błyskawiczne zamrażanie przy użyciu ciekłego azotu, dopuszczalne jest również zamrażanie próbek w temperaturze -80 °C) i przechowuj je w temperaturze pokojowej (20-25 °C) w niskiej wilgotności.
   2. Rozpuść próbki w Tris-HCl (10 mM, pH 8,5), używając wystarczającej ilości do pokrycia próbek. Przed użyciem delikatnie przepłukać próbki 2-3 razy w podłożu bez surowicy za pomocą mikropipety (tj. użyć 150-300 μl na płukanie, w standardowej płytce 24-dołkowej).
      UWAGA: Bufor Tris-HCl i pożywki wolne od surowicy (tj. DMEM, ale można zastąpić dowolne podstawowe podłoża do hodowli komórkowych) są bardziej skuteczne w obniżaniu wpływu na żywotność komórek próbek poddanych SDS niż tych poddanych działaniu dejonizowanego_H2Osamego.

2. Przygotowanie próbek metodą decelularizacji bez użycia detergentów

UWAGA: Początkowe kroki tej procedury pokrywają się z krokami 1.1-1.1.2 (patrz wyżej).

1. Przygotować 5% (v/v) roztwór wybielacza (NaClO) i 3% (w/v) wodorowęglanu sodu (NaHCO₃). Podgrzać roztwór w dygestorium do temperatury 60-70 °C dla próbek liści F. hispida pokrojonych w krążki o średnicy 8 mm, mieszając na płycie grzejnej.
   UWAGA: Wodorowęglan sodu można zastąpić węglanem sodu (Na₂CO₃ ) lub wodorotlenkiem sodu (NaOH). Żądana temperatura jest bardzo zróżnicowana (od temperatury pokojowej do 90 °C) i powinna być dostosowana do właściwości użytych próbek.
2. Gdy roztwór osiągnie żądany zakres temperatur, zanurz próbki i zmniejsz prędkość mieszania, aby uniknąć ich uszkodzenia. Po widocznym oczyszczeniu próbek (patrz Rysunek 1B dla porównania wizualnego), ostrożnie wyjmij z kąpieli. Próbki inkubować raz w dejonizowanym_H2Oprzez 1-2 minuty, aby usunąć nadmiar roztworu wybielacza.
   UWAGA: Czas potrzebny do oczyszczenia próbek może się znacznie różnić. Na przykład pokrojoną pietruszkę można oczyścić w ciągu 10-15 minut, podczas gdy grubsze i/lub większe próbki, takie jak całe liście lub łodygi, mogą potrzebować godzin w kąpielach wysokotemperaturowych, aby całkowicie się oczyścić.
3. Liofilizować próbki i przechowywać je w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przy niskiej wilgotności.

Results

Obie metody dały rusztowania, które nadawały się do zastosowań w hodowli komórkowej i inżynierii tkankowej. Rysunek 1 pokazuje ogólny przebieg procesu decelularyzacji przy użyciu nienaruszonego liścia dla metody opartej na detergentach i ciętych próbek (średnica 8 mm) dla metody bezdetergentowej. Udana decelularyzacja tkanek figowca hispida przy użyciu obu metod pozwoliła uzyskać czyste i nienaruszone próbki (Ryc. 1A i 1B<...

Discussion

W tym artykule opisano dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych. Przedstawione tutaj wyniki, w połączeniu z wynikami wcześniejszych badań²⁵, sugerują, że przedstawione protokoły mogą mieć zastosowanie do szerokiego spektrum gatunków roślin i mogą być wykonywane zarówno na łodygach, jak i liściach. Procedury te są proste i nie wymagają specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu decelularyzacja roślin może być przeprowadzona w większości laboratoriów. Warto zauważyć, że po decelularyzacji rusztowa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dodecylosiarczan sodu	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Niejonowy środek powierzchniowo czynny, o którym mowa w artykule. Bardzo lepki odczynnik, może pomóc w przecięciu końcówki pipety podczas jej wyciągania.
Skoncentrowany wybielacz (8,25% podchlorynu sodu)	Clorox	Pozycja #: 31009	Standardowy skoncentrowany wybielacz.
Wodorowęglan sodu	Acros Organics	217120010	Można zastąpić wodorotlenkiem sodu lub węglanem sodu.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Tnie próbki, które dobrze mieszczą się w 24-dołkowej
płytce Stół do potrząsania brzuchem	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Używaj niskich prędkości, aby nie uszkodzić tkanek. Może używać dowolnego modelu / marki stołu do wytrząsania.
Płyta do mieszania na gorąco / na	Fisher Scientific		Może używać dowolnego stylu / marki płyty gorącej / mieszającej.
Zlewka	Dowolna		Może używać zlewki o dowolnym rozmiarze, o ile będzie pasować do twoich próbek i nie będzie ich przepełniona.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Test Quant-iT Picogreen dsDNA	Life Technologies	P11496	Może używać dowolnego dostępnego urządzenia do oznaczania ilościowego dsDNA.