Tutaj prezentujemy i porównujemy dwa protokoły używane do decelularizacji tkanek roślinnych: podejście oparte na detergentach i podejście bez detergentów. Obie metody pozostawiają macierz zewnątrzkomórkową zastosowanych tkanek roślinnych, które można następnie wykorzystać jako rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych do zastosowań w inżynierii tkankowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Autologiczne, syntetyczne i zwierzęce przeszczepy obecnie używane jako rusztowania do zastępowania tkanek mają ograniczenia wynikające z niskiej dostępności, słabej biokompatybilności i kosztów. Tkanki roślinne mają korzystne cechy, które sprawiają, że wyjątkowo nadają się do stosowania jako rusztowania, takie jak duża powierzchnia, doskonały transport i retencja wody, porowatość połączeń, istniejące wcześniej sieci naczyniowe i szeroki zakres właściwości mechanicznych. Opisano tutaj dwie skuteczne metody decelularyzacji roślin do zastosowań w inżynierii tkankowej. Pierwsza metoda opiera się na kąpielach detergentowych w celu usunięcia materii komórkowej, co jest podobne do wcześniej ustalonych metod stosowanych do oczyszczania tkanek ssaków. Druga to metoda bez detergentów zaadaptowana z protokołu, który izoluje naczynia krwionośne liści i polega na użyciu podgrzanego wybielacza i kąpieli solnej w celu oczyszczenia liści i łodyg. Obie metody pozwalają uzyskać rusztowania o porównywalnych właściwościach mechanicznych i niskim wpływie na metabolizm komórkowy, co pozwala użytkownikowi wybrać protokół, który lepiej odpowiada jego zamierzonemu zastosowaniu.
Wprowadzenie
Inżynieria tkankowa pojawiła się w latach 80. XX wieku w celu stworzenia żywych substytutów tkanek i potencjalnie rozwiązania znacznych niedoborów narządów i tkanek1. Jedna ze strategii wykorzystuje rusztowania do stymulowania i kierowania ciałem w celu regeneracji brakujących tkanek lub narządów. Chociaż zaawansowane podejścia produkcyjne, takie jak druk 3D, pozwoliły wytworzyć rusztowania o unikalnych właściwościach fizycznych, zdolność do produkcji rusztowań o zróżnicowanym zakresie osiągalnych właściwości fizycznych i biologicznych pozostaje wyzwaniem2,3. Ponadto, ze względu na brak....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Decelularyzacja tkanki roślinnej przy użyciu metody opartej na detergentach
- Używaj świeżych lub mrożonych F. hispida, próbek liści. Niewykorzystane świeże próbki należy zamrozić w zamrażarce o temperaturze -20 °C i przechowywać do wykorzystania w przyszłości (do roku).
UWAGA: Użyj tkanki łodygi lub liścia prawie każdej pożądanej rośliny. Wydłużony czas przechowywania może spowodować uszkodzenie tkanek.- Należy określić wielkość i kształt próbek, które mają być przetworzone, na podstawie zamierzonego zastosowania próbki (tj. próbki pokrojone w paski dobrze nadają się do zastosowań związanych z badaniam....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Obie metody pozwoliły na otrzymanie rusztowań odpowiednich do hodowli komórkowych i zastosowań w inżynierii tkankowej. Rycina 1 przedstawia ogólny schemat procesu decelularyzacji z wykorzystaniem nienaruszonego liścia w metodzie opartej na detergentach oraz wyciętych próbek (o średnicy 8 mm) w metodzie bezdetergentowej. Skuteczna decelularyzacja tkanek Ficus hispida z zastosowaniem obu metod pozwoliła na uzyskanie przeźroczystych i nienaruszonych pró.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano dwie metody decelularyzacji tkanek roślinnych. Przedstawione tutaj wyniki, w połączeniu z wynikami wcześniejszych badań25, sugerują, że przedstawione protokoły mogą mieć zastosowanie do szerokiego spektrum gatunków roślin i mogą być wykonywane zarówno na łodygach, jak i liściach. Procedury te są proste i nie wymagają specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu decelularyzacja roślin może być przeprowadzona w większości laboratoriów. Warto zauważyć, że po decelularyzacji rusztowa.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Johnowi Wirthowi z Ogrodów Olbrich za łaskawe dostarczenie okazów użytych w tym projekcie. Praca ta jest częściowo wspierana przez Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (R01HL115282 do G.R.G.) Narodowa Fundacja Nauki (DGE1144804 J.R.G. i G.R.G.) oraz Wydział Chirurgii Uniwersytetu Wisconsin i Fundusz Absolwentów (H.D.L.). Prace te były również częściowo wspierane przez Agencję Ochrony Środowiska (grant STAR nr 83573701), National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 i UH3TR000506) oraz National Science Foundation (IGERT DGE1144804).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dodecylosiarczan sodu | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Niejonowy środek powierzchniowo czynny, o którym mowa w artykule. Bardzo lepki odczynnik, może pomóc w przecięciu końcówki pipety podczas jej wyciągania. |
| Skoncentrowany wybielacz (8,25% podchlorynu sodu) | Clorox | Pozycja #: 31009 | Standardowy skoncentrowany wybielacz. |
| Wodorowęglan sodu | Acros Organics | 217120010 | Można zastąpić wodorotlenkiem sodu lub węglanem sodu. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Tnie próbki, które dobrze mieszczą się w 24-dołkowej |
| płytce Stół do potrząsania brzuchem | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Używaj niskich prędkości, aby nie uszkodzić tkanek. Może używać dowolnego modelu / marki stołu do wytrząsania. |
| Płyta do mieszania na gorąco / na | Fisher Scientific | Może używać dowolnego stylu / marki płyty gorącej / mieszającej. | |
| Zlewka | Dowolna | Może używać zlewki o dowolnym rozmiarze, o ile będzie pasować do twoich próbek i nie będzie ich przepełniona. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Test Quant-iT Picogreen dsDNA | Life Technologies | P11496 | Może używać dowolnego dostępnego urządzenia do oznaczania ilościowego dsDNA. |
Bibliografia
- Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
- Kim, S., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
