Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57592

⸱

22 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ningbo Key Laboratory of Behavioral Neuroscience, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Pathophysiology, School of Medicine, Ningbo University, 2Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Research Center, Ningbo University, 3School of Materials Science and Chemical Engineering, Ningbo University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Streszczenie

β-amyloid (Aβ) jest hydrofobowym peptydem z wewnętrzną tendencją do samoorganizacji w agregaty. Spośród różnych agregatów oligomer Aβ jest powszechnie uznawany za wiodącą neurotoksynę w postępie choroby Alzheimera (AD) i jest uważany za kluczowe zdarzenie w patogenezie AD. W związku z tym inhibitory oligomerów Aβ mogą zapobiegać neurodegeneracji i mają potencjał do opracowania jako terapie modyfikujące przebieg choroby Alzheimera. Jednak różne protokoły tworzenia oligomeru Aβ mogą prowadzić do powstania oligomerów o różnych cechach. Co więcej, nie ma wielu metod skutecznego badania przesiewowego inhibitorów oligomerów Aβ1-42. Przeciwciało A11 może reagować z podzbiorem toksycznego oligomeru Aβ1-42 o antyrównoległych strukturach β-arkuszowych. W tym protokole opisujemy, jak przygotować A11-dodatnią próbkę bogatą w oligomery Aβ1-42 z syntetycznego peptydu Aβ1-42 in vitro i ocenić względne ilości A11-dodatniego oligomeru Aβ1-42 w próbkach za pomocą analizy kropkowej przy użyciu przeciwciał 6E10 swoistych dla A11 i Aβ1-42. Korzystając z tego protokołu, inhibitory A11-dodatniego oligomeru Aβ1-42 mogą być również badane przesiewowo na podstawie półilościowych wyników eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Choroba Alzheimera (AD) jest jedną z najważniejszych chorób neurodegeneracyjnych dotykających osoby starsze na całym świecie1. Powszechnie przyjmuje się, że nieprawidłowa agregacja β-amyloidu (Aβ) może być głównym czynnikiem patologicznym choroby Alzheimera. Agregaty Aβ są głównymi składnikami blaszek starczych, jednego z markerów biologicznych w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera. Co więcej, agregaty Aβ, w tym w szczególności oligomery, wytwarzają silną neurotoksyczność, która może być przyczyną śmierci neuronów w miarę postępu choroby Alzheimera. W związku z tym hamowanie tworzenia oligomerów Aβ może zapobiegać neurodegeneracji, a inhibitory oligomerów Aβ mogą być opracowywane jako terapie modyfikujące przebieg choroby Alzheimera. W wielu badaniach wykorzystano syntetyczny peptyd Aβ do tworzenia oligomerów in vitro, badania morfologii i struktur sztucznych oligomerów Aβ oraz badania inhibitorów oligomeru Aβ przy użyciu modeli in vitro2,3,4. Jednak różne protokoły tworzenia oligomeru Aβ in vitro mogą prowadzić do powstania oligomeru o różnych cechach morfologicznych, co może skutkować nieporównywalnymi wynikami między różnymi grupami badawczymi. Dlatego pilnie potrzebny jest standardowy protokół tworzenia oligomeru Aβ.

Do tej pory nie opisano wielu metod bezpośredniego wykrywania oligomerów Aβ. Transmisyjna mikroskopia elektroniczna (TEM), elektroforeza żelowa bez denaturacji, test immunoenzymatyczny (ELISA) i analiza punktowa mogą być wykorzystane do zbadania ilości i/lub morfologii oligomeru Aβ in vitro5,6. Na przykład morfologię i strukturę oligomeru Aβ można zaobserwować w TEM. Względne ilości i wielkość cząsteczkową agregacji Aβ można zmierzyć za pomocą elektroforezy żelowej bez denaturacji. Test ELISA może być używany do oznaczania oligomeru Aβ w surowicy, osoczu i ekstraktach z tkanki mózgowej. Wreszcie, analiza punktowa, technika stosowana do wykrywania, analizowania i identyfikacji białek, może być stosowana do oceny względnego stężenia oligomeru Aβ w różnych próbkach za pomocą przeciwciał specyficznych dla oligomerów i swoistych dla Aβ. Co więcej, test igłowy zapewnia znaczną oszczędność czasu, ponieważ elektroforeza żelowa i procedury blottingu dla żeli nie są wymagane. Dlatego test ten jest zwykle stosowany do badań przesiewowych potencjalnych inhibitorów oligomerów Aβ. Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie stosunkowo prostej, niezawodnej i powtarzalnej metody przygotowania próbki bogatej w oligomery Aβ1-42, analizy ilości oligomeru Aβ1-42 za pomocą analizy punktowej oraz badania przesiewowego inhibitorów oligomerów Aβ przy użyciu półilościowych wyników eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów, aby zapoznać się ze źródłami odczynników.

  1. Przygotować 5% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA), dodając 5 g BSA do 100 ml podwójnie destylowanej wody. Wymieszaj je całkowicie, wirując je. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  2. Przygotować roztwór przeciwciała antyoligomerowego A11 (1:1 000), dodając 10 μl roztworu podstawowego przeciwciała do 10 ml 5% roztworu BSA. Wymieszaj je całkowicie, wirując je. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  3. Przygotować roztwór przeciwciała anty-Aβ 6E10 (1:1 000), dodając 10 μl roztworu podstawowego przeciwciała do 10 ml 5% roztworu BSA. Wymieszaj je całkowicie przez wirowanie. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  4. Przygotować roztwór OC przeciwciała oligomerowego antyfibrylarnego (1:1 000), dodając 10 μl podstawowego roztworu przeciwciała do 10 ml 5% roztworu BSA. Wymieszaj je całkowicie przez wirowanie. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  5. Przygotować roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS), dodając 24 g zasady Tris i 88 g NaCl do 1,000 ml podwójnie destylowanej wody. Dostosować pH do 7,4. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  6. Przygotuj roztwór soli fizjologicznej i Tween-20 (TBST) z buforem Tris, dodając 1 ml Tween-20 do 100 ml roztworu podstawowego TBS i 900 ml podwójnie destylowanej wody.
  7. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała, dodając 10 μl peroksydazy chrzanowej (HRP) Koziej anty-króliczej IgG (H + L) do 10 ml roztworu TBST. Wymieszaj je całkowicie, wirując je. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
  8. Rozpuść 3,68 g kurkuminy w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO), aby utworzyć 10-milimetrowy roztwór podstawowy kurkuminy.
  9. Rozpuścić 5 mg syntetycznego Aβ1-42 w 2 ml 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu (HFIP) do uzyskania roztworu monomeru Aβ o stężeniu 2,5 mg/mL. Umieść go w temperaturze pokojowej (25 °C) na 20 minut. Przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
    UWAGA: Ta procedura powinna być uruchamiana tak szybko, jak to możliwe. Końcówki pipet należy odciąć, aby zapewnić dokładne pipetowanie.
  10. Przygotować płyn elektrochemiluminescencyjny (ECL), mieszając płyn ECL A i B w stosunku objętościowym 1:1. Roztwór ten należy przygotować tuż przed użyciem.

2. Przygotowanie próbki

UWAGA: Przygotuj próbkę 2 dni przed analizą punktową.

  1. Dodać 900 μl podwójnie destylowanej wody do probówki z roztworem monomeru Aβ1-42; stężenie Aβ1-42 wyniesie 0,25 mg/ml. Umieść mieszaninę w temperaturze pokojowej na 20 minut.
  2. Odparować roztwór z gazowym azotem o wysokiej czystości, aż jego objętość wyniesie około 850 μl. Stężenie roztworu Aβ1-42 wyniesie około 0,29 mg/mL.
    UWAGA: Roztwór należy od czasu do czasu wstrząsać, aby upewnić się, że HFIP został całkowicie odparowany. Zwykle po 30 minutach odparowania objętość pozostałego roztworu wynosi około 850 μL.
  3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy kurkuminy do roztworu roboczego kurkuminy (0,2 i 2 μM) wodą podwójnie destylowaną. Wymieszaj roztwór Aβ1-42i roztwór roboczy kurkuminy w stosunku objętościowym 1:1. Końcowe stężenia kurkuminy wynoszą 0,1 i 1 μM.
    UWAGA: Potencjalne inhibitory oligomerów można w razie potrzeby mieszać z roztworem Aβ1-42 w dowolnym stosunku.
  4. Wstrząsać roztworem w sposób ciągły w mieszadle magnetycznym (patrz Tabela materiałów).
    1. Przymocuj plastikową przegrodę do mieszadła magnetycznego. Umieść 2 magnetyczne pręty mieszające w 2 rogach pudełka i umieść probówki z próbkami na środku pudełka.
    2. Wstrząśnij pudełkiem w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 48 h.
      UWAGA: Prędkość obrotowa mieszadła magnetycznego wynosi około 60 obr./min.
  5. Odwirować probówki przez 15 minut w temperaturze 4 °C i 18 000 x g. Zebrać supernatant.

3. Analiza plam punktowych

UWAGA: Wszystkie inkubacje są wykonywane na wytrząsarce poziomej.

  1. Pokrój membranę nitrocelulozową na paski o szerokości 1 cm.
    UWAGA: Szerokość membrany nitrocelulozowej można regulować w zależności od potrzeb eksperymentalnych.
  2. Próbki o objętości 2 μl należy umieścić równomiernie na 2 paskach (pasek 1 i 2) w odstępie co 0,5 cm.
  3. Umieść paski w temperaturze pokojowej na 5 minut, aż kropla na opasce wyschnie.
  4. Inkubować paski z 5% roztworem BSA przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Płucz paski roztworem TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odessać roztwór TBST. Przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej inkubować pasek 1 z roztworem przeciwciała antyoligomerowego A11, a pasek 2 z roztworem przeciwciała anty-Aβ 6E10.
  7. Opłucz paski roztworem TBST trzy razy, za każdym razem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać roztwór TBST. Inkubować paski z wtórnym roztworem przeciwciał przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Opłucz paski roztworem TBST trzy razy, za każdym razem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Równomiernie nanieść zmieszany płyn ECL na powierzchnię pasków. Naświetlić paski w automatycznym systemie obrazowania chemiluminescencyjnego (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Zwykle 300 μl płynu ECL wystarcza na jedną membranę. Membrana musi być wilgotna podczas ekspozycji. Czas naświetlania jest automatycznie obliczany przez system obrazowania.
  11. Wykonaj analizę w skali szarości za pomocą ImageJ (National Institutes of Health) lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby uzyskać wyniki półilościowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać, czy monomer Aβ1-42 może po przygotowaniu utworzyć oligomer Aβ1-42, zastosowano analizę TEM. W próbce monomeru Aβ1-42 rozpuszczonego w HFIP nie zaobserwowano widocznych agregatów (Ryc. 1A). Ponadto w próbce Aβ1-42 po 48 h wstrząsania zaobserwowano głównie agregaty globularne o średnicy około 10 - 80 nm, co sugeruje, że Aβ1-42 po przygotowaniu tworzy oligomery (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole opisaliśmy metodę przygotowania próbek zawierających oligomer Aβ1-42 oraz analizy ilości oligomeru A11-dodatniego Aβ1-42 za pomocą analizy punktowej. Chociaż nasze metody przygotowania próbek bogatych w oligomery Aβ1-42 są dość proste, niezawodne i powtarzalne, nadal należy zwrócić uwagę na kilka punktów. Po pierwsze, HFIP służy do rozpuszczania syntetycznego peptydu Aβ1-42 . Zagregowany peptyd Aβ1-42 może rozpadać się na monomer w roztworze HFIP. Jed...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (U1503223, 81673407, 21475131), Projektu Badań Stosowanych nad Technologią Nonprofit w Prowincji Zhejiang (2016C37110), Międzynarodowego Projektu Współpracy Naukowej i Technologicznej Ningbo (2014D10019), Zespołu Innowacji Miejskich Ningbo ds. Nauk Przyrodniczych i Zdrowia (2015C110026), Ningbo Sci & Tech Project for Common Wealth (2017C50042), Li Dak Sum Yip Yio Chin Kenneth Li Marine Biopharmaceutical Development Fund oraz K. C. Wong Magna Fund na Uniwersytecie Ningbo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A11 (ab126892 Rb pAb do oligomerów amyloidowych)AbcamGR91739-58
6E10 (beta-amyloid królik Ab)Komórka  Technologia sygnalizacji2454S
)MilliporeAB2286
Peroksydaza chrzanowa (HRP) Marker Koza anty królik IgG (H + L) BeyotimeA0208
Aβ 1-42GL Biochem52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanolAladynI1523078
KurkuminaSigmaC1386
Albumina bydlęca VSolarbioA8020
Chlorek soduSangon BiotechD920BA0003
Dodecylosiarczan soduSCR30166428
TRISSolarbioT8060
GlicynaSolarbioG8200
  DimetylosulfotlenekSolarbioD8370
5 i razy; żel niedenaturujący PAGE Marker białkowyBeyotimeP0016
Genshare CFAS anyKD PAGEGenshareJC-PE022
Czysta membrana nitrocelulozowaPall CorporationT50189
MetanolSCR10014118
EtanolSCR10009218
Super niski zakres  Marker białkowySolarbioPR1300
Membrany transferoweImmobilon-PSQISEQ00010
BeyoECL StarBeyotimeP0018A
Commassie Blue Szybkie rozwiązanie do barwieniaBeyotimeP0017
All - automatyczny system obrazowania chemiluminescencyjnegoTanonTanon 5200
Image JNational Instytuty Zdrowia
Oprogramowanie do przetwarzania obrazówAdobePhotoshop CS6
Mieszadło magnetyczneShanghai Huxi
OC (przeciwciało OC przeciwko fibrylom antyamyloidowym

Bibliografia

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
  5. Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256(2015).
  6. Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
  7. Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
  8. Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
  9. Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
  10. Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).
  11. Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oligomer beta amyloiduprzeciwcia o A11przygotowanie beta amyloiduhamowanie kurkuminobrazowanie TEMdetekcja chemiluminescencyjnaprzeciwcia o wt rneprzemywanie TBSTmembrana nitrocelulozowa

Powiązane artykuły