Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

DOI:

10.3791/57599

⸱

2 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Center for Cell and Gene Therapy, Texas Children's Hospital, and Houston Methodist Hospital, Baylor College of Medicine, 3Molecular and Cellular Biology Department, Baylor College of Medicine, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine, 5McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzustka to złożony organ złożony z wielu różnych typów komórek, które współpracują ze sobą, aby regulować homeostazę i trawienie glukozy we krwi. Te typy komórek obejmują komórki groniaste wydzielające enzymy, arboryzowany system przewodowy odpowiedzialny za transport enzymów do jelit oraz komórki endokrynne wytwarzające hormony.

Endokrynologiczne komórki beta to jedyny typ komórek w organizmie, który wytwarza insulinę obniżającą poziom glukozy we krwi. Cukrzyca, choroba charakteryzująca się utratą lub dysfunkcją komórek beta, osiąga rozmiary epidemii. W związku z tym konieczne jest ustanowienie protokołów do badania rozwoju komórek beta, które można wykorzystać do celów przesiewowych w celu uzyskania leku i terapii opartych na komórkach. Podczas gdy eksperymentalne badania rozwoju myszy są niezbędne, badania in vivo są pracochłonne i czasochłonne. Hodowane komórki stanowią wygodniejszą platformę do badań przesiewowych; Nie są jednak w stanie utrzymać różnorodności komórkowej, organizacji architektonicznej i interakcji komórkowych występujących in vivo. Dlatego konieczne jest opracowanie nowych narzędzi do badania organogenezy i fizjologii trzustki.

Komórki nabłonka trzustki rozwijają się w ścisłym związku z mezenchymą od początku organogenezy, gdy komórki organizują się i różnicują w złożony, fizjologicznie kompetentny organ dorosłego. Mezenchyma trzustki dostarcza ważnych sygnałów dla rozwoju układu hormonalnego, z których wiele nie jest jeszcze dobrze poznanych, a zatem trudnych do odtworzenia podczas hodowli in vitro. Tutaj opisujemy protokół hodowli trójwymiarowych, złożonych komórkowo organoidów myszy, które zatrzymują mezenchymę, zwaną trzustkami. Mysi pączek trzustki e10.5 jest preparowany, dysocjowany i hodowany w środowisku wolnym od rusztowań. Te pływające komórki samoorganizują się z mezenchymą otaczającą rozwijającą się trzustkę i dużą liczbą endokrynologicznych komórek beta rozwijających się wraz z komórkami groniastymi i przewodowymi. System ten może być używany do badania determinacji losu komórki, organizacji strukturalnej i morfogenezy, interakcji komórka-komórka podczas organogenezy lub do badania przesiewowego leku, małej cząsteczki lub genetyki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie mechanizmów normalnego rozwoju i fizjologii jest niezbędne do zrozumienia etiologii choroby i ostatecznie do opracowania metod leczenia. Hodowla i różnicowanie komórek macierzystych umożliwia szybką i wysokoprzepustową analizę rozwoju, jednak jest ograniczona przez istniejący zasób wiedzy na temat mechanizmów regulujących los komórek i sztucznie podsumowuje rozwój w stosunkowo jednorodnym, dwuwymiarowym stanie1,2. Na rozwój in vivo wpływają nie tylko wpływy zewnętrzne, przy czym różne typy komórek w niszy i środowisku dostarczają sygnałów parakrynnych i wsparcia organizacyjnego w kierowaniu organogenezą, ale funkcja tych komórek zależy również od ich otoczenia w celu uzyskania wskazówek3,4,5. Biorąc pod uwagę znaczenie tych zewnętrznych wskazówek, ograniczenia protokołów różnicowania i pracochłonną naturę modeli myszy in vivo, potrzebne są nowe systemy do eksperymentalnego badania podstawowych procesów rozwojowych i fizjologii.

Pojawienie się protokołów do generowania trójwymiarowych, złożonych organoidów dostarcza wygodnego i spójnego systemu do badania organogenezy, fizjologii, skuteczności leków, a nawet patogenezy. Ustalenie mysich organoidów dla różnych układów, takich jak żołądek6 i intestine7 poszerzyło naszą wiedzę na temat organogenezy, dostarczając narzędzia do badania złożoności rozwojowej z mniejszymi ograniczeniami niż modele in vivo i in vitro. Ze względu na te postępy w tworzeniu mysich organoidów i pojawienie się ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, wyprodukowano organoidy Human intestinal8, retinal9, renal10,11, oraz cerebral12 organoidów, a ten repertuar jest ograniczony tylko przez istniejącą wiedzę na temat mechanizmów rozwoju.

Szczególnie interesujące jest generowanie organoidów trzustki, ponieważ niezliczone choroby nękają różne typy komórek trzustki, w tym komórki groniaste i przewody w zewnątrzwydzielniczej niewydolności trzustki13, komórki groniaste w zapaleniu trzustki14, oraz komórki beta w cukrzycy15. Zdobycie wiedzy na temat rozwoju tych różnych typów komórek może pomóc w zrozumieniu ich patologii, a także może służyć jako platforma do spersonalizowanych badań przesiewowych lub przeszczepów leków. Wcześniej Greggio i in. opracowali metodę tworzenia mysich organoidów trzustkowych, które podsumowują morfogenezę in vivo i rozwijają zorganizowane, trójwymiarowe, złożone struktury złożone ze wszystkich głównych typów komórek nabłonka trzustki16,17. Jest to duży krok naprzód w dziedzinie trzustki, zwłaszcza że tworzenie komórek in vitro może umożliwić biologiczne badanie rozwoju komórek beta. Jednak w tym protokole powstał niedobór komórek endokrynnych, chyba że organoidy zostały przeszczepione do tkanki, gdzie nisza mogła wchodzić w interakcje i dostarczać wskazówek instruktażowych17. Mezenchyma stanowi największą część niszy, silnie otaczając rozwijający się nabłonek od wczesnych etapów organogenezy do późniejszych etapów, w tym rozwarstwienia i różnicowania endokrynologicznego3,4,18. Interakcja mezenchymy z rozwijającą się trzustką jest kolejnym przykładem sygnalizacji zewnętrznej i znaczenia utrzymania złożoności komórkowej in vivo w badaniu organogenezy.

Tutaj opisujemy, jak wygenerować trójwymiarowe organoidy trzustkowe, zwane trzustkami, z dysocjowanych mysich progenitorów trzustki e10.5. Te trzustetki zachowują natywną mezenchymę, samoorganizują się w warunkach swobodnego pływania i generują wszystkie główne typy komórek trzustki, w tym dużą liczbę endokrynologicznych komórek beta19. Podejście to najlepiej nadaje się do analizy rozwoju układu hormonalnego, ponieważ poprzednie protokoły nie uwzględniały solidnego różnicowania endokrynologicznego. Jednak stosowanie protokołu dla organoidów trzustki, jak opisano przez Greggio i wsp., lepiej nadaje się do analizy rozgałęzień i morfogenezy nabłonka trzustki, ponieważ rozgałęzienia są bardziej ograniczone w trzustce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane tą metodą zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Baylor College of Medicine.

1. Przygotowanie Dnia Embrionalnego Myszy 10.5 Przodkowie trzustki

Uwaga: Ten protokół nie musi być przestrzegany w sterylnych warunkach aż do kroku 2, jednak optymalne jest wysterylizowanie narzędzi do preparacji i spryskanie 70% etanolem przed użyciem.

  1. Aby przygotować się do sekcji, napełnij wiadro na lód i umieść w lodzie pojemnik z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Wyczyść dwa kleszcze z cienką końcówką i nożyczki preparacyjne 70% etanolem. Umieść w pobliżu obszaru sekcji, pojemnik z co najmniej trzema borokrzemianowymi rurkami kapilarnymi, pipetą doustną, zapalniczką i przefiltrowanymi końcówkami do pipet o pojemności 1 000 μl.
    1. Przygotować co najmniej 1 ml zimnej dypasy o stężeniu 1,25 mg/ml rozcieńczonej w wysterylizowanej wodzie i umieścić w drugim dołku 12-dołkowej płytki na lodzie. Umieść PBS w pierwszym, trzecim i czwartym dołku płytki 12-dołkowej. Umieść 1 ml 0,05% trypsyny w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Podgrzej inkubator z wytrząsaniem do temperatury 37 oC.
  2. Poddaj e10,5 myszy w ciąży zgodnie z wytycznymi IACUC. Spryskaj brzuch 70% etanolem, aby oczyścić obszar przed wykonaniem nacięcia w kształcie litery V w okolicy narządów płciowych myszy za pomocą nożyczek i kleszczy i kontynuuj go aż do przepony.
    UWAGA: Pojawienie się czopa dopochwowego w tym protokole wskazuje na dzień 0,5. U 5-6-tygodniowych myszy przyrost masy ciała o ponad 2 g działa jako drugorzędna miara udanego zapłodnienia.
    1. Ostrożnie wyciąć macicę, wykonując nacięcie w najwyższych bocznych częściach macicy, odciągając narząd w górę od myszy i podążając za tym nacięciem w dół do okolicy narządów płciowych, a następnie powtórz po przeciwnej stronie. Umieść go na 10 cm szalce Petriego z zimnym PBS.
      UWAGA: Możliwe jest uzyskanie organoidów z komórek zdysocjowanych e11.5, jednak w przeciwieństwie do trzustek e10.5, organoidy te nie są jeszcze scharakteryzowane, a zatem mogą nie zachować zdolności do różnicowania się we wszystkie trzy główne linie trzustki.
  3. Pod mikroskopem rozwarstwiającym pod światłem umieść szalkę Petriego i ostrożnie otwórz tkankę macicy, umieszczając dwa kleszcze między każdym zarodkiem i złuszczając tkankę z dala od woreczka żółtkowego. Przenieś zarodki, delikatnie chwytając woreczek żółtkowy kleszczami i umieść na 10-centymetrowej szalce Petriego ze świeżym, zimnym PBS. Umieść szalkę Petriego na lodzie.
    UWAGA: Ważne jest, aby uważnie usuwać zarodki, najlepiej utrzymywane w woreczku żółtkowym, ponieważ usunięcie na siłę może pociągnąć pępowinę, rozrywając tkankę zarodka i naruszając integralność strukturalną.
  4. Umieść kilka kropli PBS na 10-centymetrowej pokrywie szalki Petriego. Użyj tych kropelek do przeniesienia zarodka podczas sekcji, gdy tkanki pozazarodkowe są usuwane, aby zapewnić widoczność. Przenieś zarodek do kropli PBS i delikatnie wyjmij z woreczka żółtkowego za pomocą kleszczy, podczas gdy pozostałe zarodki pozostają w PBS na lodzie (Rysunek 1A). Usuń głowę przed przeniesieniem zarodka do nowej kropli PBS, używając kleszczy, aby delikatnie zgarnąć zarodek, aby nie uszkodzić tkanki (Rysunek 1B).
    UWAGA: Tkanka może wymagać częstszego przenoszenia do świeżych kropelek PBS niż opisano tutaj, w zależności od nieprzezroczystości płynu.
    1. W nowym kropli PBS usuń pąki kończyn przednich za pomocą kleszczy (Rysunek 1B). Umieść kleszcze w otworze, w którym znajdował się pączek kończyny i delikatnie rozerwij tylko najbardziej zewnętrzną tkankę z przodu (Rysunek 1B). Obróć zarodek i powtórz w kierunku tylnym, zatrzymując się na zawiązku kończyny tylnej. W tym momencie przewód pokarmowy powinien być widoczny (Rysunek 1B).
    2. Tylny obszar przewodu pokarmowego ma lekkie wygięcie (Rysunek 1F). Włóż kleszcze za tym zgięciem w otworze między przewodem pokarmowym a obszarem rdzeniowym ściany ciała. Odłącz przewód pokarmowy, pracując powoli w górę, aż do osiągnięcia najbardziej przedniego obszaru, w którym łączy się obszar serca (Rysunek 1B-E).
      OPCJONALNIE: Usuń pierwotne serce i pąki wątroby z brzusznych obszarów przewodu pokarmowego, pozostawiając tylko ciągłą rurkę jelitową. Za pierwszym razem, gdy ten protokół jest wykonywany, może być łatwiej pozostawić serce i wątrobę jako brzuszne punkty orientacyjne, dopóki morfologia przewodu pokarmowego i pączka grzbietowego trzustki nie stanie się bardziej znana (Rysunek 1C i D).
    3. Przenieś przewód pokarmowy do świeżej kropli PBS.
    4. Weź kleszcze i delikatnie uszczypnij tkankę pod wystającym pączkiem i jelitem, a następnie lekko unieś zewnętrzną tkankę (Rysunek 1D-F).
      UWAGA: Grzbietowy pączek trzustki znajduje się między żołądkiem a jelitem (Rysunek 1CG). Pączek trzustki pod spodem powinien wyglądać jak okrągła, guzowata struktura (Ryc. 1G).
    5. Umieść kleszcze w miejscu, w którym pączek łączy się z jelitem i ściśnij w górę, aby poluzować pączek (Rysunek 1G). Umyj jeden raz w nowej bańce PBS przed przeniesieniem pąka do pierwszego dołka 12-dołkowej płytki w zimnym PBS na lodzie. Powtarzać, aż wszystkie pąki zostaną zebrane z zarodków i umieszczone w pierwszym dołku płytki 12-dołkowej.
  5. Umieść 12-dołkową miskę pod mikroskopem do lekkiego wypreparowania. Policz liczbę pomyślnie wypreparowanych zawiązków trzustki, aby później obliczyć współczynnik podziału.
    1. Umieść przefiltrowaną końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl w pipecie doustnej z dołączoną rurką kapilarną. Wysterylizuj płomieniem rurkę kapilarną i utwórz zagięcie w probówce, aby ułatwić użycie. Użyj kapilary, aby przenieść pąki do drugiej studzienki zawierającej zimny roztwór dypazy przez 2 minuty przed przeniesieniem do trzeciej studzienki za pomocą czystego PBS (Rysunek 1G).
      UWAGA: Podczas przenoszenia pąków z dypazy do PBS należy unikać dotykania tkanki do końcówki rurki kapilarnej. Jeśli chusteczka utknie na końcu probówki, pipetuj w górę i w dół lub wstrząśnij czystym roztworem PBS, aż się poluzuje.
    2. Pipetuj pąki w górę iw dół i przenieś do czwartej studzienki z czystym PBS. Na koniec, za pomocą urządzenia kapilarnego, przenieś pąki do probówki o pojemności 1,5 ml z 0,05% trypsyny. Umieścić probówkę w rozgrzanym wytrząsarce o temperaturze 37 oC i wstrząsać z prędkością 1 500 obr./min przez 4 minuty.
    3. Wirować przez około 10 sekund, a następnie natychmiast umieścić probówkę w wirówce i wirować przez 5 minut w temperaturze 200 g. Ostrożnie usunąć wszystko, z wyjątkiem około 50 μl roztworu, aby nie naruszyć odwirowanych komórek (Rysunek 1G).

2. Hodowla zdysocjowanych przodków w celu utworzenia trzustki

Uwaga: Następujące czynności powinny być wykonywane w sterylnej atmosferze w standardowym kapturze do hodowli tkankowej, przy użyciu standardowych sterylnych procedur.

  1. Na każdy zebrany pączek dodaj 400 μl pożywki organogenezy16,17 (Tabela 1) do odwirowanych komórek. Trzykrotnie przeprowadź wir pulsacyjny i umieść 100 μl na dołku 96-dołkowej płytki o niskim natężeniu, dzieląc pąki w stosunku 1:4 (Rysunek 1G).
  2. Sprawdź pod mikroskopem, aby zwizualizować swobodnie unoszące się zdysocjowane komórki (Rysunek 1H). Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 oC z 5% CO2 na kołysku ze średnią prędkością.
  3. Codziennie monitoruj postęp trzustki. Wymieniaj na 100 μl świeżej pożywki co 3 dni, ostrożnie pipetując pożywkę pod mikroskopijną kontrolą w kapturze, aby usunąć, pozostawiając trzustkę w studzience. Alternatywnie, świeże 100 μl pożywki można dodać do nowego dołka i przenieść trzustkowo-trzustkową za pomocą borokrzemianowej rurki kapilarnej dołączonej do pipety doustnej i 1000 μl przefiltrowanej końcówki do pipety.

3. Przetwarzanie trzustki do obrazowania immunofluorescencyjnego

  1. Aby przetworzyć pankreatoidy do obrazów immunofluorescencyjnych, najpierw przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu/PBS, pH 7,4 (PFA). Umieścić 50 μl 4% PFA w studzienkach z 96-dołkową płytką.
    1. Używając borokrzemianowych probówek kapilarnych i pipety doustnej z filtrowaną końcówką pipety o pojemności 1 000 μl, przenieś trzustki z pożywki hodowlanej, pobierając jak najmniej pożywki, do świeżej studzienki z 4% PFA. Ustaw na bujaku w temperaturze pokojowej na 15 min.
    2. Przenieś pankretoidy z 4% PFA do studzienki ze 100 μl świeżego PBS, kołysz w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Powtórz w sumie trzy świeże płukania PBS.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, przy czym trzustki są przechowywane w 100 μl PBS w temperaturze 4 oC przez okres do jednego tygodnia.
  2. Do obrazowania całościowego (zalecane, jeśli przeciwciała są odpowiednie, alternatywne podejście w sekcji 3.3. i mikroskopia w 3.4.), przenieść z PBS do 50 μl 5% surowicy osła w 1x PBS z 0,1% detergentem niejonowym (PBST) w celu zablokowania. Kołysz przez noc w temperaturze 4 oC lub alternatywnie przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
    1. Przenieś pankreatoidy do nowej studzienki zawierającej przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w 50 μl 5% surowicy osła w 1x PBST. Optymalnie bujać się przez 24 h w temperaturze 4 oC (co najmniej 12 h, ale do 36 h).
      UWAGA: Przeciwciała wymienione w Tabeli materiałów przeciwko Chga (1:100), DBA (1:400), Vim (1:400) i Pdx1 (1:100) są odpowiednie do barwienia całościowego; Inne przeciwciała mogą wymagać optymalizacji.
    2. Przenieś trzustetki do studzienki zawierającej 100 μl świeżego PBST w celu umycia i rozdrobnienia przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie trzy świeże prania PBST.
    3. Przenieś trzustekosteroidy do nowej studzienki zawierającej przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w 50 μl 5% surowicy osła w 1x PBST. Chronić płytkę przed światłem i umieścić w temperaturze 4 oC, kołysząc się optymalnie przez 24 godziny (co najmniej 12 godzin, ale do 36 godzin).
      UWAGA: Wszystkie przeciwciała drugorzędowe wymienione w Tabeli Materiałów i Przeciwbarwieniu jądrowym DAPI nadają się do barwienia całościowego.
    4. Przenieść trzustekoty do nowej studzienki zawierającej 100 μl 1x PBST i rozdrabniać w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórzyć w sumie trzy płukania w 1x PBST. W trzecim i ostatnim praniu dodaj 300 nM DAPI.
    5. Na koniec umieścić w 100 μl czystego PBS i przechowywać w temperaturze 4 oC, chronić przed światłem przez okres do tygodnia przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej, chociaż najlepsze wyniki uzyskuje się z obrazowania bezpośrednio po barwieniu. Aby zapobiec ruchowi trzustki podczas obrazowania, ale zapobiec wysuszeniu, należy umieścić każdą trzustkę w kropli PBS o objętości 20 μl. Jeśli trzustka nie pozostaje nieruchoma, zmniejsz objętość PBS.
  3. W przypadku skrawków mrożonych przenieść trzustki z PBS do 30% roztworu sacharozy przez noc w temperaturze 4 oC.
    1. Dodaj pożywkę do zatapiania w bańce pod mikroskopem preparacyjnym. Używając kleszczy pod mikroskopijną kontrolą, namocz trzustki, delikatnie kilkakrotnie przepychając się przez podłoże do zatapiania, aby usunąć resztki sacharozy przed przeniesieniem do bloku tkankowego z zamrożonym podłożem do zatapiania.
    2. Umieścić blok tkanki na suchym lodzie do momentu zamrożenia i przeciąć na kriostacie w temperaturze 8 μm.
      UWAGA: Skrawki mogą być przechowywane w temperaturze -80 oC lub natychmiast wybarwione immunologicznie.
    3. Pozostawić skrawki o temperaturze od -80 oC do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez około 5 minut, aż wyschną. Narysuj barierę hydrofobową za pomocą hydrofobowego pisaka papkowego wokół tkanki i bloku, używając 5% surowicy osła rozcieńczonej w 1x PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć pożywkę i natychmiast zastąpić przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy osła, rozcieńczonej w 1x PBST na noc w temperaturze 4 oC.
    5. Usuń roztwór pierwotny i przemyj chusteczki trzy razy 1x PBST przez 10 minut każda. Następnie dodać drugorzędowy roztwór przeciwciał rozcieńczony w 5% surowicy osła rozcieńczonej w 1x PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i chronić szkiełka przed światłem.
    6. Usuń roztwór wtórny i umyj szkiełka trzy razy w 1x PBST przez 10 minut każda. W ostatnim praniu dodaj 300 nM DAPI.
    7. Wyjmij nośnik i dodaj nośnik montażowy oraz szkiełko nakrywkowe. Przechowywać szkiełka z dala od światła w temperaturze 4 oC, aż będą gotowe do obrazowania.

4. Izolacja RNA z trzustki do analizy transkryptu

  1. Zebrać trzustki za pomocą kapilary borokrzemianowej podłączonej do pipety doustnej z przefiltrowaną końcówką pipety o pojemności 1 000 μl w celu zapewnienia sterylności i umieścić w 500 μl kwaśnego roztworu tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu w probówce o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 oC lub natychmiast przystąpić do izolacji RNA.
  2. W celu izolacji RNA w razie potrzeby rozmrozić próbki na lodzie i dodać 100 μl chloroformu. Dobrze odwirować i umieścić w temperaturze 4 oC na 15 min. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 oC.
    1. Umieścić probówki w wirówce i wirować przez 20 minut w temperaturze 12 000 g w temperaturze 4 oC.
    2. Ostrożnie wyjmij rurki, aby nie zakłócać oddzielania warstw. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl zebrać klarowny roztwór wodny i umieścić go w nowej probówce o pojemności 1,5 ml, pozostawiając niewielką ilość do buforowania z warstwy białka białego i warstwy DNA różowej. W tym procesie nie należy dotykać końcówki pipety do niczego i nie dotykać ścianek probówki o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 500 μl 100% izopropanolu do nowej probówki zawierającej warstwę wodną i wir. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 20 minut, dłużej na lodzie lub dla maksymalnych opadów pozostaw na noc w temperaturze -20 oC.
    4. Wirować przy 12 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 oC w celu osadzenia RNA. Usunąć izopropanol bez naruszania osadu.
      UWAGA: Ponieważ trzustka jest mała, jest prawdopodobne, że osad nie będzie widoczny.
    5. Dodaj zimny, 75% etanol i kilkakrotnie odwróć rurkę. Umieścić w wirówce i wirować z prędkością 9.000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 oC. Usunąć etanol i wirować przez 2 minuty w temperaturze 9.000 x g.
    6. Użyj pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć pozostały etanol z probówki, bez kontaktu z obszarem, w którym znajduje się granulka. Pozostaw otwartą nakrętkę na probówce na 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić odparowanie resztkowego etanolu.
    7. Zawiesić osad przez wirowanie w 20 μl czystej, wolnej od nukleaz wody.
      Opcjonalnie: Podgrzewać RNA w temperaturze 65 oC przez 3 minuty i natychmiast wrócić do lodu. RNA może być przechowywane w temperaturze -80 oC lub natychmiast wykorzystane do odwrotnej transkrypcji i qPCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staranna sekcja embrionów myszy w e10.5 z rogu macicy powinna dać nieuszkodzone zarodki w PBS do dalszej sekcji (Rysunek 1A). Przewód pokarmowy może być skutecznie usunięty z zarodka (Ryc. 1B), co pozwala na rozpoznanie grzbietowego zawiązka trzustki na styku jelita i żołądka (Rysunek 1C-F). Pączek trzustki e10.5 został wcześniej scharakteryzowany; przodkowie powinni wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progresja modeli hodowli komórkowych ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego rozwoju modelu, wytworzenia klinicznie istotnych typów komórek, przetestowania skuteczności leków, a nawet przeszczepu pacjentom. Jednak sztuczne rekapitulowanie rozwoju w potrawie jest trudne, ponieważ wciąż jesteśmy dalecy od zrozumienia mechanizmów organogenezy i fizjologii in vivo. W ten sposób komórki in vitro są generowane nieefektywnie, nie są w pełni funkcjonalne, nie są w stanie utrzymać się przez długi czas lub mają in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jolancie Chmielowiec za pomocną dyskusję na temat protokołu i rękopisu. Dziękujemy również Benjaminowi Arenkielowi za dostęp do mikroskopu konfokalnego. Praca ta była wspierana przez NIH (P30-DK079638 do M.B. i T32HL092332-13 do M.A.S. i M.B.), McNair Medical Foundation (do M.B.) oraz rdzeń konfokalny w Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową BCM (NIH U54 HD083092 z Narodowego Instytutu Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka Eunice Kennedy Shriver).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
Rurki aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnychSigma-AldrichA5177
BarnStead NanoPure Woda wolna od nukleazTermoFisherD119
Borosilikarowe rurki kapilarneSutter InstrumentsGB1007515OD 1 mm, ID 0,75 mm, długość
1,5 cmCaCl2Sigma-AldrichC5080
Odstraszająca komórki 96-dołkowa mikropłytkaGreiner Bio-One650970Wirówka z dnem w kształcie litery U
5424 REppendorf5401000013
ChloroformSigma-Aldrich233306
Chromogranina-AAbcamab15160
Kompaktowy, modułowy mikroskop stereoskopowy M60
CountessInvitrogenC10310
Prowadnice licznika komórek CountessInvitrogenC10312
CryoStar NX70ThermoFisher957000L
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
DAPI (dichlorowodorek 4',6-diamidyno-2'-fenyloindolu)Roche10 236 276 001Proszek
Przeciwciało DBAVector LabRL-1032
Dispase II, ProszekGibco17105041
DMEM/F-12, HEPESGibco11330032
Dnase IInvitrogen18068-015
Dumont #5 KleszczeFine Science Tools11251-100,05 x 0,02 mm; Tytan; Wskazówka biologiczna
EGF (naskórkowy czynnik wzrostu)Sigma-AldrichE9644
Etanol, 200 ProofDecon Laboratories2716
Inkubatory CO2 Forma Steri CycleThermoFisher370
Fluoromount-GSouthern BiotechOB10001
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigma-AldrichH3149-10KU
INSM1 PrzeciwciałoSanta Cruz BioTechnologysc-271408Poliklonalny mysi
izopropanolIgG Fishera4164
Isothesia Isoflurane, USPHenry Schein11695-6776-2
Przeciwciało insulinoweDakoA056401Poliklonalna świnka morska
KAPA SYBR FAST UniversalKAPA BiosystemsKK4618
KClKaryoMax10575090
KnockOut Zamiennik serumInvitrogen10828028
Leica TCS SPE Wysoka rozdzielczość spektralna konfokalnaMysz Leica
MgCl2Sigma-Aldrich442615
z peptydem C ELISAALPCO80-CPTMS-E01
Ultraczuła Insulina ELISAALPCO80-INSMSU-E01
MX35 Ostrza mikrotomuThermoFisher3052835
NaClSigma-AldrichS7653
NaHCO3Sigma-AldrichS3817
NaH2PO4Sigma-Aldrich
Normalna surowica osłaJackson Immuno Research017-000-121
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
PBS 1XCorning21-040-CV
Przeciwciało Pdx1DSHBF6A11Mysz monoklonalna MIgG1
Peel-A-Way Jednorazowe formy do zatapianiaVWR15160-157
Roztwór penicyliny i streptomycynyCorningMT30002CI
PMA (Phorbol 12-mirystynian 13- Octan)Sigma-AldrichP1585
Białkowe probówki do mikrowirówek LoBindEppendorf22431081Pojemność 1,5 ml
Rekombinowane ludzkie białko FGF-10R& D Systems345-FG
Rekombinowany ludzki FGF-kwasowyPeprotech100-17A
Rekombinowane ludzkie białko R-spondyny I R& D Systems4546-RS
BenchRocker2D BenchmarkBR2000
Sacharoza 500gSigma-AldrichS0389
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost PlusFisher Scientific12-550-15
Super Pap PenMikroskopia elektronowa Sciences71310
Thermomixer REppendorf05-412-401
Tissue Tek O.C.T. CompoundSakura4583
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TRIzolOdczynnik Invitrogen15596018
TrypLE ExpressInvitrogen12604039(1x), bez Phenol Red
Trypan Blue StainInvitrogen15250061Do szkiełek do liczenia komórek
Trypsin-EDTA (0,05% )Corning25-052-CI
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200072Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-dołkowa płytkaCorning3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-dołkowaCorning4520
Przeciwciało VimentinEMD MilliporeAB5733Poliklonalny kurczak IgY
Vortex GenieBioExpresS-7350-1
Y-27632 DichlorowodorekR& D Systems1254Znany również jako inhibitor ROCK
Mikroskop konfokalny Zeiss 710Zeiss
Automatyczny licznik komórek Leica Mysz

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hodowla bezrusztowaniowaformowanie pankreatoid wsekcja embrionu myszytraktowanie dyspaztrawienie trypsynwysiew na pod o a o niskim przywieraniuanaliza immunobarwieniailo ciowy PCRrozw j kom rek beta

Powiązane artykuły