Artykuł metodologiczny

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

DOI:

10.3791/57600

⸱

8 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowa ekspresja białka we właściwym czasie i w odpowiednich ilościach jest podstawą prawidłowego funkcjonowania komórek i przetrwania w szybko zmieniającym się środowisku. Przez długi czas badania nad ekspresją genów były zdominowane przez badania na poziomie transkrypcji. Jednak poziomy mRNA w stanie stacjonarnym nie korelują dobrze z produkcją białek, a translatowalność mRNA różni się znacznie w zależności od warunków. W niektórych organizmach, takich jak pasożyt Leishmania, ekspresja białka jest regulowana głównie na poziomie translacyjnym. Ostatnie badania wykazały, że dysregulacja translacji białek jest związana z rakiem, chorobami metabolicznymi, neurodegeneracyjnymi i innymi chorobami ludzkimi. Profilowanie polisomów jest potężną metodą badania regulacji translacji białek. Pozwala na pomiar stanu translacyjnego poszczególnych mRNA lub badanie translacji w skali całego genomu. Podstawą tej techniki jest oddzielenie polisomów, rybosomów, ich podjednostek i wolnych mRNA podczas wirowania lizatu cytoplazmatycznego przez gradient sacharozy. W tym artykule przedstawiamy uniwersalny protokół profilowania polisomów zastosowany na trzech różnych modelach - pasożyta Leishmania major, hodowanych komórkach ludzkich i tkankach zwierzęcych. Komórki Leishmania swobodnie rosną w zawiesinie, a hodowane komórki ludzkie rosną w przylegającej monowarstwie, podczas gdy jądra myszy reprezentują próbkę tkanki zwierzęcej. W ten sposób technika jest dostosowana do wszystkich tych źródeł. Protokół analizy frakcji polisomicznych obejmuje detekcję poszczególnych poziomów mRNA metodą RT-qPCR, białek metodą Western blot oraz analizę rybosomalnego RNA metodą elektroforezy. Metodę można dalej rozszerzyć poprzez badanie związku mRNA z rybosomem na poziomie transkryptomu za pomocą głębokiego sekwencjonowania RNA oraz analizę białek związanych z rybosomami za pomocą spektroskopii mas frakcji. Metodę można łatwo dostosować do innych modeli biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacja ekspresji genów w komórkach jest kontrolowana przez mechanizmy transkrypcyjne, potranskrypcyjne i potranslacyjne. Postępy w głębokim sekwencjonowaniu RNA pozwalają na badanie poziomów mRNA w stanie ustalonym w skali całego genomu na niespotykanym dotąd poziomie. Jednak ostatnie odkrycia ujawniły, że poziom mRNA w stanie stacjonarnym nie zawsze koreluje z produkcją białka1,2. Los pojedynczego transkryptu jest bardzo złożony i zależy od wielu czynników, takich jak bodźce wewnętrzne/zewnętrzne, stres itp. Regulacja ekspresji genów podczas syntezy białek zapewnia kolejną warstwę kontroli ekspresji niezbędną do szybkiej reakcji w zmieniających się warunkach. Profilowanie polisomów (lub "polirybosomów"), czyli separacja i wizualizacja aktywnie translujących rybosomów, jest potężną metodą badania regulacji syntezy białek. Chociaż pierwsze eksperymentalne zastosowania pojawiły się w latach sześćdziesiątych XX wieku3, profilowanie polisomów jest obecnie jedną z najważniejszych technik w badaniach nad translacją białek4. Pojedyncze mRNA mogą ulegać translacji przez więcej niż jeden rybosom, co prowadzi do powstania polisomu. Transkrypty mogą być zatrzymywane na rybosomach za pomocą cykloheksymidu5, a mRNA zawierające różną liczbę polisomów można rozdzielić w procesie frakcjonowania polisomów za pomocą ultrawirowania w gradionym poziomie sacharozy6,7,8,9. Analiza RNA frakcji polisomilnych pozwala następnie na pomiar zmian w stanach translacyjnych poszczególnych mRNA w skali całego genomu i podczas różnych warunków fizjologicznych4,7,10. Metoda ta została również wykorzystana do ujawnienia roli sekwencji 5'UTR i 3'UTR w kontroli translatowalności mRNA11, zbadania roli miRNA w represji translacyjnej12, odkrycia defektów w biogenezie rybosomów13 oraz zrozumienia roli białek związanych z rybosomami w chorobach człowieka14,15. W ciągu ostatniej dekady pojawiła się rosnąca rola regulacji ekspresji genów podczas translacji, co ilustruje jej znaczenie w chorobach człowieka. Dowody na kontrolę translacyjną w chorobach nowotworowych, metabolicznych i neurodegeneracyjnych są przytłaczające15,16,17,18. Na przykład rozregulowanie kontroli translacyjnej zależnej od eIF4E przyczynia się do deficytów związanych z autyzmem15, a FMRP jest zaangażowana w zatrzymanie rybosomów na mRNA związanych z autyzmem14. Tak więc profilowanie polisomalne jest bardzo ważnym narzędziem do badania defektów regulacji translacyjnej w wielu chorobach człowieka.

Analiza białek frakcji polisomalnych w różnych warunkach fizjologicznych analizuje funkcję czynników związanych z rybosomami podczas translacji. Technika profilowania polisomów została zastosowana u wielu gatunków, w tym drożdży, komórek ssaków, roślin i pierwotniaków10,19,20,21. Pasożytnicze pierwotniaki, takie jak Trypanosoma i Leishmania, wykazują ograniczoną kontrolę transkrypcji ekspresji genów. Ich genomy są zorganizowane w polistroniczne klastry genów, które nie mają transkrypcji regulowanej przez promotor22. Zamiast tego ekspresja genów rozwojowych jest głównie kontrolowana na poziomie translacji białek i stabilności mRNA u gatunków trypanosomatidów23,24. Dlatego zrozumienie kontroli translacyjnej przy braku regulacji transkrypcji jest szczególnie ważne dla tych organizmów. Profilowanie polisomalne jest potężnym narzędziem do badania potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów w Leishmania25,26,27,28.

Niedawny postęp w wykrywaniu indywidualnych poziomów mRNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) i pełnej transkryptomu za pomocą sekwencjonowania nowej generacji, a także technologie proteomiczne, przenoszą rozdzielczość i zalety profilowania polisomalnego na nowy poziom. Zastosowanie tych metod można dodatkowo rozszerzyć o analizę poszczególnych frakcji polisomicznych za pomocą głębokiego sekwencjonowania RNA połączonego z analizą proteomiczną w celu monitorowania stanu translacyjnego komórek w skali całego genomu. Pozwala to na identyfikację nowych graczy molekularnych regulujących translację w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. W tym artykule przedstawiamy uniwersalny protokół profilowania polisomów zastosowany w trzech różnych modelach: pasożyta Leishmania major, hodowanych komórkach ludzkich i tkankach zwierzęcych. Przedstawiamy porady dotyczące przygotowania lizatów komórkowych z różnych organizmów, optymalizacji warunków gradientowych, wyboru inhibitorów RNazy oraz zastosowania RT-qPCR, Western blot i elektroforezy RNA do analizy frakcji polisomów w tym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zabiegi na zwierzętach i obchodzenie się z tkankami uzyskanymi w badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Texas Tech zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi dobrostanu zwierząt, numer protokołu 96005. Prosimy o składanie w ofierze kręgowców i przygotowanie tkanek zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania. W przypadku braku takiej komisji należy zapoznać się z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Użyto dorosłych (>60 dniowych) myszy C57BL/6. Wszystkie zwierzęta i tkanki zostały pozyskane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Centrum Nauk o Zdrowiu Texas Tech University zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi dobrostanu zwierząt. W przypadku eutanazji pojedynczą mysz umieszczono w małej komorze, a powietrze było stopniowo wypierane około 30% dwutlenku węgla, aby znieczulić i zminimalizować cierpienie zwierzęcia. Po ustaniu oddychania zastosowaliśmy zwichnięcie szyjki macicy, aby potwierdzić śmierć zwierzęcia przed pobraniem tkanek.

Uwaga: Wszystkie prace z żywymi Leishmania i hodowanymi komórkami ludzkimi zostały wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w certyfikowanym laboratorium BSL-2.

1. Przygotowanie lizatów cytoplazmatycznych z Leishmania major, hodowanych komórek ludzkich i tkanek myszy

UWAGA: Istnieje kilka różnic w przygotowaniach lizatu z różnych materiałów źródłowych. Inne etapy, w tym przygotowanie gradientu sacharozy i frakcjonowanie polisomalne, są identyczne i nie zależą od źródła próbki.

  1. Preparat lizatu cytoplazmatycznego Leishmania major
    1. Zaszczepić komórki Leishmania major (szczep FV1) w 30 ml 1x M199 medium29 zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i mieszaninę penicyliny/streptomycyny (odpowiednio 100 jednostek i 100 μg/ml) o gęstości 1x105 komórek/ml.
      UWAGA: Wszystkie etapy związane z głównymi komórkami Leishmania muszą być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Umieścić komórki w inkubatorze i hodować je w temperaturze 27 °C aż do fazy logarytmicznej (mid log odpowiada 5x106 komórek/ml). Wzrost trwa zwykle około dwóch dni.
    3. Dodaj cykloheksymid do głównej hodowli Leishmania do końcowego stężenia 100 μg/ml, aby zatrzymać rybosomy na translowanych mRNA. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na 10 minut w temperaturze 27 °C.
    4. Po zakończeniu leczenia cykloheksymidem przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować je w temperaturze 1 800 x g i 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
    5. Przemyć komórki 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. Wirować przy 1.800 x g i temperaturze 4 °C przez 8 min.
    6. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml DPBS.
    7. Weź porcję komórek i wymieszaj ją z 3,5% roztworem formaldehydu.
    8. Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ ich stężenie. Przenieś żądaną liczbę komórek do probówki do mikrofuge. Lizat przygotowany z 0,5x10 8-2x108 komórek/ml wystarcza na jedno obciążenie gradientem sacharozy.
    9. Wirować komórki w temperaturze 1 800 x g i w temperaturze 4 °C przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
    10. Zawiesić osad komórkowy na lodzie w 1 ml buforu do lizy zawierającego inhibitory proteazy i inhibitor RNazy (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% NP-40, 1x koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA), 200 jednostek/ml inhibitora RNazy).
    11. Przepuść lizat przez igłę o rozmiarze 23 razy. Lizat powinien stać się przezroczysty po przejściu przez igłę.
    12. Wirować przy 11 200 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu sklarowania lizatu. Przenieść oczyszczony lizat do świeżej probówki i trzymać go na lodzie do momentu ultrawirowania sacharozy w gradionym gradiluminie.
    13. Zbierz 400-500 μl lizatu jako dane wejściowe (do późniejszej analizy), zamroź go od razu w ciekłym azocie do przyszłej analizy białek lub dodaj odczynnik do oczyszczania RNA przed zamrożeniem do analizy RNA.
  2. Preparat lizatu cytoplazmatycznego z hodowanych ludzkich komórek HeLa
    1. Podziel komórki HeLa i wysiew je w 20 ml pożywki DMEM zawierającej 10% FBS i mieszaniny penicyliny/streptomycyny (odpowiednio 100 jednostek i 100 μg/ml) z liczbą komórek 2x105 komórek/ml na 15 cm płytce.
    2. Hoduj komórki HeLa w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20-24 h. Wykonaj transfekcję plazmidowego DNA zgodnie z protokołami producenta.
    3. Rozmnażać komórki przez 24 godziny po transfekcji w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    4. Dodać cykloheksymid do wyhodowanych komórek HeLa do końcowego stężenia 100 μg/ml, aby zatrzymać rybosomy na translowanych mRNA i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Odsysać pożywkę. Umyj komórki dwukrotnie zimnym DPBS na lodzie.
    5. Dodaj 500 μl buforu do lizy (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1x koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA), 200 jednostek/ml inhibitora RNazy lub 1 mg/ml heparyny) do płytki i zeskrobać komórki na lodzie.
    6. Przenieś zlizowane komórki do probówki do mikrofuge. Dostosuj stężenie NP-40 do 0,5% i MgCl od2 do 5 mM w zależności od zwiększonej objętości próbki.
    7. Przepuść lizat przez igłę o rozmiarze 23 3-6 razy.
    8. Wirować w temperaturze 11 200 x g i temperaturze 4 °C przez 8 minut, aby sklarować lizat. Po odwirowaniu przenieść supernatant do nowej probówki. Użyj spektrofotometru, aby ocenić wydajność lizy komórek i określić ilość próbki do obciążenia gradientu. Dodać 10 μl próbki do 0,5 ml 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Ślepa wartość w stosunku do 0,1% SDS. Zmierzyć absorbancję przy 260 nm. Oczekiwana wartość absorbancji wynosi około 15-20 jednostek/ml.
    9. Rozcieńczyć wszystkie próbki buforem do lizy do tej samej wartości absorbancji przed wirowaniem w gradiacji sacharozy. Próbki należy przechowywać na lodzie do momentu odwirowania sacharozy w wyniku gradientu sacharozy.
  3. Preparat lizatu cytoplazmatycznego z jądra myszy
    1. Wypreparuj jądro myszy. Wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej i zbierz kanaliki nasienne jąder i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml DPBS uzupełnionej 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF).
    2. Energicznie wymieszaj tkankę, kilkakrotnie odwracając. Pozwól tkance osiąść na lodzie przy jednostkowej grawitacji przez 5 minut.
    3. Usunąć i wyrzucić mętny bufor zawierający komórki łączne i fragmenty tkanek. Powtórz procedurę jeszcze 2-3 razy. Pozostały biały osad jest wzbogacony o kanaliki nasienne i komórki rozrodcze.
    4. Przenieść osad kanalika nasiennego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i wirować z prędkością 500 x g przez 1 minutę. Odrzucić supernatant.
    5. Dodać 500 μl buforu do lizy (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 1x koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA), 1 mg/ml heparyny lub 200 jednostek/ml inhibitora RNazy) do kanalików. Użyj pipety, aby rozcierić tkankę.
    6. Przenieść zawiesinę do małego (0,5-1,0 ml) homogenizatora Dounce. Rozerwij tkankę siedmioma do ośmiu pociągnięciami szklanego tłuczka.
    7. Przenieść lizat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    8. Odwirować próbkę przy 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 8 minut w celu usunięcia lizatu. Przenieść supernatant do nowej probówki i przechowywać na lodzie do momentu obciążenia gradientu sacharozy.
    9. Zebrać 50 μl lizatu jako próbkę wejściową, natychmiast zamrozić go w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy białek lub dodać odczynnik do oczyszczania RNA przed zamrożeniem do analizy RNA.

2. Przygotowanie gradientu sacharozy i ultrawirowanie

  1. Przygotować dwa roztwory gradientu sacharozy (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1x koktajl inhibitorów proteazy), zawierające 10% sacharozy lub 50% sacharozy. (Tris-HCl, pH 7,4, może być stosowany zamiast HEPES). Dodać 200 jednostek/ml inhibitora RNazy lub 1 mg/ml heparyny zgodnie z planem eksperymentalnym. Umieść probówkę ultrawirówki do wirnika SW 41 w bloku znacznika i narysuj linię wzdłuż górnego poziomu bloku. Przenieś rurkę do stabilnego stojaka.
  2. Weź strzykawkę o pojemności 10 ml z dołączonym urządzeniem do nakładania warstw i napełnij strzykawkę 10% roztworem sacharozy (przygotowanym jak powyżej). Delikatnie zwolnij go na dnie probówki ultrawirówki, aż dotrze do oznaczenia na probówce.
  3. Napełnij kolejną strzykawkę 50% roztworem sacharozy i ostrożnie włóż jej urządzenie do nakładania warstw przez warstwę 10% sacharozy na dno probówki. Delikatnie wypuść roztwór sacharozy, zaczynając od dołu, aż dotrze do znaku na probówce. Uszczelnij rurkę za pomocą dostarczonej nasadki.
  4. Aby przygotować gradient sacharozy, włącz urządzenie do tworzenia gradientów. Wypoziomuj płytkę za pomocą przycisków GÓRA lub DÓŁ i naciśnij GOTOWE. Wyrównanie jest ważne dla liniowości gradientu.
  5. Po wypoziomowaniu płyty naciśnij GRAD, aby otworzyć menu gradientu. Przejdź do LISTA w menu gradientu i wybierz wirnik SW 41 Ti. Następnie wybierz żądany gradient sacharozy z listy menu za pomocą przycisków GÓRA i DÓŁ. Naciśnij przycisk UŻYJ.
  6. Umieść uchwyt rurki gradientowej na płycie do tworzenia gradientów. Przenieś rurkę do uchwytu. Jednocześnie można przygotować do 6 gradientów. Naciśnij przycisk URUCHOM. Kreator gradientów obraca rury z zaprogramowaną prędkością i kątami, tworząc gradient liniowy. Przygotowanie gradientu zajmie tylko kilka minut.
  7. Po zakończeniu procesu umieść probówki w stojaku. Zdejmij nakrętki. Pobrać tę samą objętość, co objętość próbki, z górnej części probówek ultrawirówek.
  8. Ostrożnie załaduj 400-500 μl lizatu zawierającego 15-20 A260 jednostek polisomów na wierzch. Umieść rurki w wiadrach wirnika i wyważ je.
  9. Wirować przy 260 000 x g i 4 °C przez 2 godziny za pomocą wirnika SW 41.

3. Frakcjonowanie polisomów i pobieranie próbek

UWAGA: Podczas gdy preparaty lizatu różnią się nieco w zależności od źródła, protokoły przygotowania gradientowego i frakcjonowania polisomów są takie same dla wszystkich typów lizatów.

  1. Po zakończeniu ultrawirowania umieść wiadra wirnika z rurkami na lodzie. Włącz kolektor frakcji i frakcjonator gradientowy. Kliknij SKANUJ w menu frakcjonatora. Umieść stojak z 24 probówkami zbiorczymi do kolektora frakcji.
  2. Napełnij zbiornik do płukania z boku frakcjonatora wodą dejonizowaną. Naciśnij przycisk RINSE przez 10 s, aby przepłukać pompę na frakcjonatorze. Podłącz adapter do płukania ze strzykawką wypełnioną wodą do tłoka w celu kalibracji.
  3. Otwórz oprogramowanie frakcjonatora na komputerze. Naciśnij przycisk KALIBRUJ. Użyj USTAWIEŃ DOMYŚLNYCH i naciśnij OK. Być gotowym do wstrzykiwania wody ze strzykawki.
  4. Naciśnij OK, aby przeprowadzić kalibrację. Natychmiast rozpocznij wstrzykiwanie wody przez następne 5 sekund. W tym czasie woda będzie przepływać przez celę przepływową detektora UV, a przyrząd zostanie skalibrowany. Pojawi się znak KALIBRACJA ZERA ZAKOŃCZONA. Przyrząd jest gotowy do frakcjonowania.
  5. Wyjąć łącznik do płukania za pomocą strzykawki. Przymocuj końcówkę do tłoka frakcjonatora.
  6. Otwórz mosiężny zawór powietrza i naciśnij AIR przez 10 sekund, aby wysuszyć rurkę i komorę przepływową. Zamknij zawór powietrza.
  7. Delikatnie wyjmij rurkę gradientową z wiadra wirnika i umieść ją w stojaku. Nałóż nasadkę uchwytu probówki na górną część probówki i ostrożnie wsuń rurkę do uchwytu probówki i zablokuj ją na miejscu.
  8. Umieść uchwyt pod tłokiem frakcjonatora. Często pasma polisomalne można zobaczyć gołym okiem. Wprowadź żądane ustawienia liczby frakcji i objętości (zwykle wystarczają 24 frakcje o stężeniu 500 μl/frakcję). Nazwij plik odpowiednio. Naciśnij przycisk OK, a następnie PRZEJDŹ DO WYKRESU. W następnym oknie naciśnij ROZPOCZNIJ SKANOWANIE. Pojawią się ustawienia, naciśnij OK. Kolektor przesunie się od rynny do pierwszej frakcji, a tłok wsunie się do rury. Gdy tłok osiągnie szczyt gradientu, zwolni do wybranej prędkości, a frakcje zostaną zebrane. Po zakończeniu tłok wysuwa się z rury gradientowej.
  9. Otwórz mosiężny zawór powietrza i naciśnij AIR na frakcjonatorze, aby pobrać ostatnią frakcję.
  10. Przesuń rurki ze stojaka na lodzie.
  11. Dodaj 2 objętości odczynnika do oczyszczania RNA do każdej frakcji i błyskawicznie zamroź w ciekłym azocie do czasu oczyszczenia RNA. Alternatywnie, jeśli białko musi być analizowane, dodać kwas trichlorooctowy do końcowego stężenia 10%, aby zagęścić je do Western blot (patrz punkt 8).

4. Przygotowanie syntetycznego RNA in vitro do normalizacji poziomów mRNA podczas analizy danych RT-qPCR

UWAGA: mRNA OmpA E. coli jest używane w tym protokole do normalizacji. Można użyć dowolnego innego RNA, które nie ma rozległej tożsamości z mRNA badanego organizmu (ssaka lub Leishmania).

  1. Przygotuj fragment DNA OmpA zawierający sekwencję promotora SP6 za pomocą standardowej reakcji PCR z plazmidu zawierającego gen OmpA30.
  2. Przygotować 100 μL mieszaniny: 80 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 16 mM MgCl2, 2 mM spermidyna, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0,5 U/μL inhibitora RNazy, 1 μg DNA OmpA PCR, 3 μL polimerazy RNA SP6, 0,005 U/μL pirofosfatazy.
  3. Inkubować w temperaturze 40 °C przez 2 godziny.
  4. Oczyść RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.
  5. Zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru i zbadać za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

5. Izolacja RNA z frakcji gradientowych i przygotowanie cDNA

UWAGA: Postępuj bezpośrednio zgodnie z tym protokołem do oczyszczania RNA, jeśli inhibitor RNazy był używany jako inhibitor rybonukleazy. Jednak heparyna stosowana jako inhibitor rybonukleazy hamuje odwrotną transkryptazę stosowaną w preparacie cDNA. Dlatego konieczne będzie dodatkowe oczyszczanie RNA, jeśli heparyna została użyta w buforze do lizy i gradiencie. Patrz punkt 6 w celu przygotowania RNA do syntezy cDNA, jeśli zastosowano heparynę.

  1. Rozmrozić próbki zawierające odczynnik do oczyszczania RNA, dodać 20 ng syntetycznego RNA jako kontrolę wewnętrzną w celu normalizacji wyników RT-qPCR. Preparat RNA należy kontynuować zgodnie z protokołem producenta, z wyjątkiem jednej modyfikacji. Dodać 1 μl glikogenu klasy RNA (20 μg) przed wytrąceniem izopropanolu. Rozpuść granulki RNA w 20-25 μl wody wolnej od RNaz.
    UWAGA: Glikogen służy jako nośnik i pomaga uniknąć strat i uwidocznić osad RNA podczas oczyszczania. mRNA OmpA służy do dalszej normalizacji w reakcjach RT-qPCR.
  2. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru, aby zapewnić odpowiednią wydajność. Połącz równe objętości frakcji RNA zawierających 40S, 60S i monosomy jako prepolisomy. Frakcje zawierające 2-4 rybosomy łączą się jako lekkie polisomy, a frakcje z 5-8 rybosomami łączą się jako ciężkie polisosomy.
  3. Użyj 5-10 μL RNA z połączonych frakcji do przygotowania cDNA za pomocą zestawu i zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Dodaj 80 μl wody wolnej od nukleaz do 20 μl cDNA. Próbki cDNA należy zamrozić w temperaturze -20 °C.

6. Oczyszczanie RNA z zanieczyszczenia heparyną

UWAGA: Heparyna hamuje enzymy przetwarzające kwasy nukleinowe, takie jak odwrotna transkryptaza. W związku z tym należy stosować ten dodatkowy protokół oczyszczania, gdy heparyna jest stosowana w buforze do lizy i/lub w gradiencie.

  1. Dodać LiCl do końcowego stężenia 1 M do oczyszczonych próbek RNA.
  2. Wymieszać próbki i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
  3. Wirować próbki w temperaturze 16 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut.
  4. Usunąć supernatant tak dokładnie, jak to możliwe, za pomocą pipety.
  5. Suszyć granulki na powietrzu przez około 5 minut.
  6. Ponownie zawiesić granulki w początkowej objętości wody wolnej od RNaz.
  7. Wykonać pomiar spektrofotometryczny przy długości fali 260 nm, aby określić stężenie RNA. Zazwyczaj strata próbki jest minimalna.

7. RT-qPCR i analiza danych dystrybucji mRNA

  1. Połącz 10,2 μl wody, 20 μl SYBR Green, 4,8 μl starterów specyficznych dla genów (po 2,5 μM każdy zestaw), 5 μL cDNA, dobrze wymieszaj i załaduj 10 μl na studzienkę w trzech kroplach do płytki 384-dołkowej.
  2. Przykryj szczelnie płytkę folią samoprzylepną i płytkę wirówkową o wymiarach 1.800 x g przez 5 min.
  3. Za pomocą przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym nastaw reakcję qPCR w warunkach przedstawionych w Tabeli 1.
    4. Korzystając z wartości progu cyklu (CT) i metody porównawczej CT (ΔΔCT), 31 oblicz procent (%) rozkładu mRNA w prepolisomach, lekkich i ciężkich polisomach zgodnie z opisem32 z jedną modyfikacją.
  4. Użyj syntetycznego RNA (tutaj OmpA) do normalizacji danych w analizie danych RT-qPCR. Syntetyczny RNA zapewnia kontrolę normalizacji, która pozwala obliczyć względne poziomy mRNA i porównać je w różnych frakcjach gradientu.

8. Analiza białek we frakcjach polisomalnych metodą Western Blotting

  1. Z wywaru 100% (w/v) dodać kwas trichlorooctowy (TCA) do wybranych frakcji (500 μL) do końcowego stężenia 10%, trzymać na lodzie przez co najmniej 15 minut, odwirować w mikrodymie przez 5 minut, odrzucić supernatant, przemyć dwukrotnie lodowatym acetonem i rozpuścić w 25 μl buforu ładującego próbkę SDS-PAGE do elektroforezy.
  2. Załadować na SDS-PAGE i przeprowadzić standardową elektroforezę, a następnie przenieść na membranę PVDF. Przejdź do Western blotting33.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisujemy zastosowanie techniki profilowania polisomalnego do trzech różnych źródeł: pasożytniczej Leishmania major, hodowanych komórek ludzkich i jąder myszy. Komórki Leishmania swobodnie rosną w płynnym podłożu w zawiesinie, hodowane komórki ludzkie rosną w przylegającej monowarstwie na płytkach, a jądro myszy reprezentuje próbkę tkanki. Metodę można łatwo dostosować do innych typów swobodnie rosnących komórek w zawiesinie, różnych typów tkanek lub pochod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Frakcjonowanie polisomów za pomocą gradientu sacharozy w połączeniu z analizą RNA i białek frakcji jest potężną metodą analizy stanu translacyjnego poszczególnych mRNA lub całego translatomu, a także roli czynników białkowych regulujących maszynerię translacyjną w normalnym stanie fizjologicznym lub chorobowym. Profilowanie polisomalne jest szczególnie odpowiednią techniką do badania regulacji translacji u organizmów takich jak trypanosomatydy, w tym Leishmania, gdzie kontrola transkrypcji jest w dużej mierze ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Ching Lee za pomoc w nagrywaniu dźwięku. Badania były wspierane przez fundusze start-upowe z Centrum Nauk o Zdrowiu Texas Tech University oraz przez grant Center of Excellence for Translational Neuroscience and Therapeutics (CTNT) PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW dla A.L.K.; częściowo dzięki grantowi NIH R01AI099380 dla K.Z. James C. Huffman i Kristen R. Baca byli stypendystami CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research) i byli wspierani przez program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Tłokowy frakcjonator gradientowyBiocomp Instruments Inc.152
Zbieracz frakcjiGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
Mikroskop odwrócony NikonECLIPSE Ts2-FL/TS2
2720 TermocyklerApplied Biosystems firmy Life Technologies4359659
inkubator CO2Panasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
Inkubator HERATHERMThermo Scientific51028063
Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego, klasa II, typ A2NuAire Inc.NU-543-400
Zamrażarka RevcoTechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeRedlica BeckmanL8M-70
WirówkaEppendorf5810R
WirówkaEppendorf5424
Wirnik ultrawirówki SW41Redlica Beckman 331362
Rotor wahadłowo-kubełkowyEppendorfA-4-62
Rotor o stałym kącie nachyleniaEppendorfF-45-30-11
Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym Quant Studio 12K Flex 285880228Applied Biosystems by life technologies4470661
TC20 Automatyczny licznik komórekBio-Rad145-0102
HemacytometrHausser Scientific02-671-51B
Software 
Triax oprogramowanie Biocomp Instruments Inc.
< mocny>Materiały:
Szkiełka zliczające, dwukomorowe do licznika komórekBio-Rad145-0011
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlUSA Scientific1615-5500
Otwarte probówki wirówkowe polyclear, (14 mm x 89 mm)Seton Scientific7030
, 5 mlBD
Strzykawka BD 3 mL23 Gauge 1 calowa igłaBD10020439
Nunclon Delta Płytka powierzchniowa, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Płytka powierzchniowa, 9 cmThermo Scientific172931
Szybkoprzepływowa jednostka filtrująca Nalgene 90 mm, 500 mL, 0,2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3Thermo Scientific130193
Nunc 50 mL stożkowe probówki wirówkoweThermo Scientific339653
Chemikalia:
Trizol LSAmbion firmy Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Podstawa TrizmaSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM)SigmaD6429-500ML
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicylina-Streptomycyna (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-019
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco ( DPBS)SigmaD8537-500ML
Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Chlorek potasu (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Rekombinowany inhibitor rybonukleazy RnasinaPromegaN2511
Heparyna sól sodowaSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini inhibitory proteazy wolne od EDTARoche Diagnostics11836170001
GlikogenThermo ScientificR0551
WodaSigmaW4502-1L
CykloheksymidSigmaC7698-1G
ChloroformFisher Scientific194002
Ditiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Bromek etydynyFisher ScientificBP-1302-10
Kwas etylenodiaminotetraoctowy odwadnianie disodowe (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Dichlorowodorek puromycynySigmaP8833-100MG
SacharozaFisher ScientificS5-3KG
Roztwór trypsyny-EDTASigmaT4049-100ML
Hgh Pojemność cDNA Zestaw odwrotnej transkryptazyApplied Biosystems by life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems by life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma221473-500G
Przeciwciało anty-RPL11Abcamab79352
Przeciwciało przeciwko białku rybosomalnemu S6 (C-8)Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
Kloródek lituSigmaL-9650
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Bufor ładujący żel IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgarozaThermo Scientific16500-100
Kwas trichlorooctowy (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Podłoże chemiluminescencyjne Pico PLUSThermo Scientific34580
FormaldehydFisher ScientificBP531-500
Dodecylosiarczan sodu (SDS)SigmaL5750-1KG
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Hydrat soli disodowej 5'-trifosforanu adenozyny (ATP)SigmaA1852-1VL
Cytozyna 5'-trifosforan sól disodowa hydrat (CTP)SigmaC1506-250MG
Hydrat soli trisodowej 5'-trifosforanu urydyny (UTP)SigmaU6625-100MG
Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 Polimeraza RNANEBM0207S
PirofosfatazaSigmaI1643-500UN
SpermidynaSigmaS0266-1G
Strzykawka 309646

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069(2013).
  3. Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
  4. Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
  5. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  6. Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  7. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  8. Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
  9. Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15(2017).
  10. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  11. Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
  12. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  13. Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
  14. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  15. Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
  16. Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
  17. Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
  18. Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
  19. Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
  20. Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
  21. Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128(2013).
  22. De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
  23. Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
  24. De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
  25. Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
  26. McNicoll, F., et al. Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
  27. Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
  28. Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
  29. Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
  30. Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
  31. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  32. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
  33. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  34. Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
  35. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  36. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
  37. Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
  38. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

gradient sacharozyultrawirowanieprzygotowanie lizatuzbieranie frakcjianaliza RNAWestern blotasocjacja rybosom wregulacja translacjiorganizmy modelowe

Powiązane artykuły