Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57601

⸱

21 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Molecular Genetics of Chronic Inflammation and Allergic Disease, Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Paediatrics, University of Melbourne, 4Centre for Social and Early Emotional Development, Faculty of Health, Deakin University, 5Department of Paediatrics, University of Western Australia

W tym artykule

Podsumowanie

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Streszczenie

Złożone choroby często opierają się na wielu powszechnych wariantach genetycznych, które przyczyniają się do podatności na choroby. W tym miejscu opisujemy opłacalne podejście do polimorfizmu pojedynczego nukleotydu znacznikowego (SNP) przy użyciu multipleksowanego testu genotypowania ze spektrometrią mas, w celu zbadania asocjacji szlaków genowych w kohortach klinicznych. Jako przykład badamy locus kandydata na alergię pokarmową Interleukinę13 (IL13). Ta metoda skutecznie maksymalizuje zasięg, wykorzystując nierównowagę wspólnych powiązań (LD) w regionie. Wybrane SNP LD są następnie projektowane w teście multipleksowanym, co umożliwia jednoczesną analizę do 40 różnych SNP, co zwiększa opłacalność. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest stosowana do amplifikacji docelowych loci, a następnie do wydłużania pojedynczego nukleotydu, a amplikony są następnie mierzone za pomocą spektrometrii mas wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji czasu lotu (MALDI-TOF). Surowe dane wyjściowe są analizowane za pomocą oprogramowania do wywoływania genotypów, przy użyciu rygorystycznych definicji i punktów odcięcia kontroli jakości, a genotypy o wysokim prawdopodobieństwie są określane i wyprowadzane do analizy danych.

Wprowadzenie

W złożonych chorobach ludzkich, warianty genetyczne przyczyniają się do podatności na choroby, a ilościowe określenie tych wariantów może być przydatne do zrozumienia patogenezy, identyfikacji grup pacjentów wysokiego ryzyka i odpowiedzi na leczenie. Rzeczywiście, obietnica medycyny precyzyjnej zależy od wykorzystania informacji genomicznych do identyfikacji podgrup pacjentów1. Niestety, w złożonej przestrzeni biologii chorób, w której fenotypy chorób opierają się na znacznej heterogeniczności genetycznej, niskiej penetracji i zmiennej ekspresji, wymagania dotyczące wielkości kohorty dla podejść obejmujących cały genom w celu identyfikacji nowych kandydatów są często zbyt duże2. Alternatywnie, podejście oparte na genach docelowych zaczyna się od hipotezy a priori dotyczącej określonych genów/szlaków w etiologii choroby3. Narzędzia do analizy ścieżek są powszechnie stosowane do badania patofizjologii zidentyfikowanych loci docelowych, generując liczne potencjalne szlaki do zbadania. Demonstrujemy tutaj podejście do genotypowania multipleksowego, które pozwala na badanie dziesiątek do setek SNP za pomocą jednego testu, odpowiedniego dla badań kohortowych na ludziach4. Podejście to charakteryzuje się stosunkowo wysoką przepustowością, co pozwala na genotypowanie setek do tysięcy próbek DNA w celu przeprowadzenia nowatorskich badań odkrywczych i zbadania określonych szlaków. Przedstawione tutaj metody są przydatne do identyfikacji alleli ryzyka i ich powiązań z cechami klinicznymi w stosunkowo szybki i niedrogi sposób. Platforma ta okazała się bardzo korzystna do celów badań przesiewowych i diagnostycznych5,6, a ostatnio także do infekcji mikrobiologicznych7 i wirusa brodawczaka ludzkiego8.

Ten protokół zaczyna się od selekcji zestawu genów do badania, tj. regionów docelowych, zazwyczaj określanych przez przeszukiwanie literatury, lub hipotez a priori dotyczących udziału w procesie chorobowym; lub być może wybranych do replikacji jako wiodące asocjacje w badaniu odkrycia całego genomu (GWA). Z zestawu genów badacz wybierze doprecyzowaną listę SNP znaczników. Oznacza to, że nierównowaga sprzężeń (LD) lub korelacja między wariantami w regionie jest wykorzystywana do identyfikacji reprezentatywnego "znacznika SNP" dla grupy SNP o wysokim LD, znanego jako haplotyp. Wysoki LD regionu oznacza, że SNP są często dziedziczone razem, tak że genotypowanie jednego SNP jest wystarczające do przedstawienia zmienności we wszystkich SNP w haplotypie. Alternatywnie, w przypadku śledzenia ostatecznej listy SNP z wielu regionów, np. replikacji na potrzeby badania GWA, proces ten może być niepotrzebny. W przypadku genotypowania multipleksowego należy następnie zaprojektować test wokół tych celów w taki sposób, aby startery amplifikacyjne miały różną masę niż startery i produkty rozszerzające w celu uzyskania interpretowalnych widm masowych. Parametry te można łatwo zaimplementować za pomocą narzędzia do projektowania multipleksowanego testu genotypowania. Startery do przodu i do tyłu z tego projektu zostaną wykorzystane do celowania w markery zainteresowania i wzmacniania sekwencji zawierającej SNP. Startery rozszerzające przyłączają się bezpośrednio proksymalnie do SNP i dodawana jest pojedyncza, masowo modyfikowana baza "terminatorowa", która jest komplementarna do SNP. Baza terminatora zapobiega dalszemu rozszerzaniu DNA. Modyfikacja masy zasady umożliwia wykrywanie fragmentów różniących się pojedynczą zasadą za pomocą spektrometrii mas. Płytka zawierająca chemię genotypowania jest następnie nakładana na chip w celu pomiaru na platformie spektrometrii mas. Po zastosowaniu odpowiednich kontroli jakości w odniesieniu do wykrytych przez system wywołań nieprzetworzonego genotypowania, dane mogą zostać wyeksportowane i wykorzystane do analizy statystycznej w celu zbadania związku z fenotypami choroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zastosowany w niniejszej pracy materiał genetyczny został zatwierdzony pod kątem etycznym do użytku przez Office for Children HREC (Human Research Ethics Committee) (CDF/07/492), Department of Human Services HREC (10/07) oraz Royal Children’s Hospital (RCH) HREC (27047).

1. Projektowanie testu multipleksowego

  1. Przygotuj listę SNP do projektowania testu.
    1. Wprowadź docelowy region do funkcji taggera w programie Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Użyj LD (korelacja, r2) pomiędzy SNP obejmującymi docelowy region, aby wygenerować listę SNP zapewniającą pełne pokrycie pożądanego regionu przy najmniejszej liczbie wymaganych wariantów. Wygeneruj listę SNP w taki sposób, aby wszystkie uchwycone allele były skorelowane powyżej zdefiniowanego przez użytkownika progu (np.., r2 ≥0.8).
  2. Identyfikacja odpowiednich sekwencji dla starterów forward, reverse i przedłużających
    1. Wprowadź wygenerowaną listę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) do wybranego narzędzia do projektowania testów.
      Uwaga: Poniższe instrukcje odnoszą się do narzędzia do projektowania testów wykorzystanego do wygenerowania reprezentatywnych wyników, zgodnie ze specyfikacją w Tabela materiałów.
    2. Po uruchomieniu narzędzia do projektowania analizy, należy wybrać Nowy projekt genotypowaniaWprowadź nazwę projektu analizy w polu Nazwa projektu dziedzina
    3. Przedstaw listę SNP wygenerowaną w kroku 1.1.1, klikając przycisk o nazwie Edytuj wprowadzone dane tekstowe zgodnie z instrukcjami rs lub FASTA po lewej stronie przycisku.
      Uwaga: SNP można wprowadzić jako tekstową listę identyfikatorów referencyjnych (rs) SNP lub przesłać w formacie FASTA bądź w formacie pliku SNP Group obsługiwanym przez narzędzie. Aby przesłać pliki w tych formatach, należy wybrać Przesyłanie plików przycisk. Górna granica wariantów, które można zaprojektować w ramach jednego testu, zwanego „dołkiem”, wynosi 40 SNP. Przed rozpoczęciem procesu możliwe jest określenie SNP będących priorytetem dla projektu; zostaną one zaprojektowane w pierwszej kolejności. Można określić SNP kontrolne: na przykład test do wykrywania płci w przypadku pomylenia próbek lub kontrolę pozwalającą ustalić, czy dodano wystarczającą ilość matrycy, jeśli pracuje się z DNA o niskiej lub słabej jakości. Należy jednak zauważyć, że stosowanie SNP kontrolnych i priorytetowych może zmniejszyć liczbę SNP, które można zaprojektować w jednej studzience.
    4. Z Ustawienie wstępne menu, wybierz Wysokomultipleksowy zestaw presetów iPLEX opcja. Z Organizm z menu wybierz organizm, z którego pochodzi DNA poddawane genotypowaniu. W przypadku zaprezentowanych tutaj reprezentatywnych wyników był to człowiek.
      Uwaga: Narzędzie jest również kompatybilne z organizmami myszy i bydła. Można również wybrać Inne w przypadku pracy z innym organizmem, np. rośliną lub mikroorganizmem; jednakże z powodu braku genomu referencyjnego niedostępne będą zautomatyzowane etapy wyszukiwania proksymalnych SNP oraz optymalnych obszarów dla starterów.
    5. W Baza danych z menu wybierz najnowszą wersję genomu lub wersję alternatywną, jeśli jest wymagana, z Chemia menu. Wybierz iPLEX i dla Poziom multipleksacji pole, wprowadź najwyższy poziom multipleksowania: 40. Teraz wybierz Rozpocznij uruchomienieRozpocznie się „Krok 1” procedury narzędzia.
      Uwaga: W kroku 1 narzędzie pobiera i formatuje sekwencje SNP. W tym przypadku błędy mogą dotyczyć formatowania pliku FASTA; wówczas należy sprawdzić plik FASTA i w razie potrzeby go sformatować. Innym błędem mogą być numery rs SNP, które zostały scalone z innym numerem rs; w takiej sytuacji należy wyszukać numer rs w bazie danych SNP, takiej jak dbSNP NCBI, aby zidentyfikować nowy numer rs SNP. Sekwencje wokół SNP są przeszukiwane pod kątem znanych proksymalnych SNP, które mogłyby zakłócić projektowanie starterów. Potencjalne miejsca wiązania starterów PCR są porównywane z genomem, aby uniknąć niespecyficznej amplifikacji wynikającej z występowania wielu dopasowań w genomie.
    6. Należy oczekiwać na zakończenie „Kroku 2” w narzędziu projektowym, podczas którego zostaną zidentyfikowane proksymalne SNP.
      Uwaga: Jeśli używany jest organizm nieobsługiwany w tym kroku, należy adnotować sekwencje za pomocą proksymalnych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) w adnotacji IUPAC, jeśli taka informacja jest dostępna. Błędy na tym etapie występują rzadko; mogą one jednak pojawić się w przypadku wyboru niewłaściwego organizmu referencyjnego lub genomu, a także w sytuacji, gdy wprowadzono sekwencje cDNA zamiast genomowego DNA. Aby zoptymalizować krok 2, w ramach Ustawienia zaawansowane, W przypadku pracy z konkretną populacją możliwe jest odfiltrowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) w oparciu o tę populację. Rzadkie SNP można również odfiltrować, wykluczając te o częstości poniżej 1%. Na koniec, jeśli jest to pożądane, można wykluczyć SNP, które nie posiadają zweryfikowanego statusu lub informacji o populacji.
    7. Należy oczekiwać na zakończenie „Kroku 3” w narzędziu projektowym, który identyfikuje optymalne regiony starterów. Jeśli zidentyfikowano preferowane lokalizacje starterów lub w przypadku pracy z innym organizmem, należy ręcznie wprowadzić lokalizacje starterów, adnotując sekwencję wejściową (pliki grup SNP) w taki sposób, aby preferowane regiony starterów zapisane były wielkimi literami, a reszta sekwencji małymi literami, a następnie wybrać Zachowaj wielkość liter z menu ustawień zaawansowanych dla tego kroku.
      Uwaga: Błędy w Krokach 2 & 3 może obejmować: (1) Proksymalny SNP uniemożliwiający zaprojektowanie startera, w przypadku czego rozwiązaniem jest zastosowanie zasady maskującej i zamówienie oligonukleotydu z zasadą uniwersalną, taką jak izonin, lub zaprojektowanie dwóch starterów, z których każdy odpowiada innemu allelowi proksymalnego SNP, lub zaprojektowanie jednego startera wyłącznie dla allelu wspólnego. (2) Innym częstym błędem jest niepowodzenie w zidentyfikowaniu unikalnego miejsca dla startera, w przypadku czego rozwiązaniem jest zmiana długości amplikonu w celu znalezienia unikalnego miejsca. W narzędziu wykorzystanym w niniejszej pracy wartość domyślna wynosi 80–120 bp. Można ją zmienić w zakresie 60–400 bp w oknie ustawień zaawansowanych w sekcji parametrów długości amplikonu w punkcie „3. Identify Optimal Primer Areas” (3. Identyfikacja optymalnych obszarów dla starterów), a także w Amplikon zakładka „4. Projektowanie testów”. Należy upewnić się, że oba zostały zmienione. Należy jednak zauważyć, że w przypadku stosowania zdegradowanego DNA zwiększanie długości amplikonu nie jest zalecane.
    8. Należy poczekać na zakończenie etapu projektowania testu („krok 4” narzędzia do projektowania); w tym kroku narzędzie ma na celu zapewnienie optymalnej separacji między primerami elongacyjnymi a allelami wszystkich SNP w projektach multipleksowych. Po zakończeniu tego etapu należy wyeksportować plik zamówienia oligonukleotydów (Oligo Order file), który jest sformatowany w sposób ułatwiający zamawianie u wybranego dostawcy oligonukleotydów.
      Uwaga: Primery amplifikacyjne (Forward (F) i Reverse (R)) są zaprojektowane tak, aby uzyskać optymalną wielkość amplikonu od 80 do 120 bp. Masa primerów amplifikacyjnych musi różnić się od masy primera elongacyjnego oraz jego produktu, aby uniknąć kolizji wyników w widmie masowym i zapewnić ogólną wydajność PCR. Primer elongacyjny powinien mieć długość od 15 do 30 nukleotydów (4 500 – 9 000 Da) i być zaprojektowany tak, aby koniec 3’ przylegał bezpośrednio do miejsca polimorfizmu. Wszystkie te ustawienia są automatycznie konfigurowane w narzędziu służącym do generowania reprezentatywnych wyników.
  3. Wyeksportuj projekt z wybranego narzędzia i zamów primery u dostawcy oligonukleotydów: 25 nmol każdego z primerów do PCR (przedniego i odwrotnego) oraz 100 nmol każdego z primerów do elongacji. Patrz Tabela 1 dla starterów użytych do uzyskania reprezentatywnych wyników.

2. Genotypowanie (1 - 2 dni)

  1. Przygotuj startery do amplifikacji.
    1. W przypadku zamówienia liofilizowanych starterów, należy je zrekonstytuować wodą klasy molekularnej. Należy zastosować stężenie 100 μM/μL dla starterów przednich i odwrotnych oraz 500 μM/μL do przedłużenia.
    2. Łączenie próbek do dalszej analizy & przeciwstawne primery dla każdego z multipleksowych testów do zapasu mieszaniny primerów, zawierającej każdy primer w stężeniu 0,5 mM.
      Uwaga: Na przykład, a 400 μL mieszanina starterów na 400 reakcji:
      figure-protocol-1
      2 μL każdego startera, w stężeniu 100 μM/μL, jest wymagane do przygotowania zapasu puli starterów. Dla testu 30-pleksowego z 60 starterami prawymi i lewymi, całkowita ilość wyniesie 120 μL będzie wymagana ilość startera (skoncentrowanej puli starterów). 280 μL następnie należy dodać wodę o czystości molekularnej, aby uzyskać końcową objętość wynoszącą 400 μL mieszaniny starterów.
  2. Amplifikacja za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
    1. Przygotuj mieszaninę master mix do PCR zawierającą 100 nM wyżej opisanej mieszaniny starterów, 500 μM dNTP, 2 mM MgCl22oraz 0,5 U enzymu polimerazy DNA. W przypadku analiz z więcej niż 26 multipleksami wymagane jest 1 U. Należy odnieść się do Tabela 2.
    2. Dodać 4 μL tej mieszaniny do każdego dołka 384-dołkowej płytki PCR, wraz z 1 μL genomic DNA o stężeniu 5–10 ng/μL.
      Uwaga: Na płytce należy również umieścić kontrole jakości, takie jak kontrola bez matrycy oraz kontrola pozytywna, która wcześniej wykazała prawidłowe wyniki w analizie (podczas serii próbnej). W przypadku analizy wielu płytek, należy uwzględnić wiele próbek DNA z pozostałych płytek, np.., w trzech powtórzeniach, należy przeprowadzić jako kontrole techniczne w celu oceny zmienności między płytkami.
    3. Wirowarkę z płytką należy wirować z przyspieszeniem 200 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej z założoną pokrywą płytki, aby upewnić się, że cała ciecz znajduje się na dnie dołków płytki.
    4. Przeprowadź reakcję PCR zgodnie z następującymi warunkami termocyklera: inkubacja przez 4 min w temperaturze 94 °C w celu aktywacji polimerazy DNA; 45 cykli następujących etapów (denaturacja w 94 °C przez 20 s, przycieplanie w temperaturze 56 °C przez 30 s, a następnie elongacja w 72 °C przez 1 min), a następnie końcową elongację w 72 °C przez 3 min. Patrz program PCR w Tabela 3.
    5. Przeprowadź elektroforezę w żelu agarozowym, aby potwierdzić pomyślną amplifikację DNA. Użyj 1 µL produktu PCR (z 3 µL buforu do prób) na żelu agarozowym o stężeniu 2% (w/v), przygotowanym poprzez zmieszanie proszku agarozy z 0,5% buforem Tris-boran EDTA (TBE), a następnie przeprowadzono elektroforezę przez 45 min przy napięciu 100 V.
  3. Etap oczyszczania fosfatazy alkalicznej krewetki (SAP)
    Uwaga: Krok ten służy do usunięcia niewbudowanych nukleotydów. Enzym SAP odszczepia grupy fosforanowe, aby zapobiec zakłócaniu nadmiaru starterów i niewbudowanych dNTP w nadchodzącej reakcji elongacji.
    1. Przygotuj master mix zawierający 1,7 j./μL enzymu fosfatazy alkalicznej krewetki (SAP), 10-krotnego buforu SAP i uzupełnić objętość wodą klasy molekularnej. Należy odnieść się do Tabela 4.
    2. Dodaj 2 μL świeżo przygotowanej mieszaniny głównej SAP do każdej studzienki płytki, zawierającej już 5 μL z reakcji PCR. Odwiruj krótko w wirówce i wprowadź ponownie do termocyklera w temperaturze 37 °C przez 40 min, a następnie w 85 °C przez 5 min w celu inaktywacji enzymu. Należy odnieść się do Tabela 5.
  4. Reakcja wydłużania startera
    Uwaga: Stężenie starterów do elongacji w mieszaninie starterów do elongacji musi zostać dostosowane do ich długości (liniowa korekta starterów – LPA). Wynika to z odwrotnej zależności między intensywnością piku (na widmach masowych) a masą produktu. Korekta stężenia starterów do elongacji pozwala zniwelować tę zależność, aby uzyskać piki o jednakowej intensywności. Dostosowane startery użyte do uzyskania reprezentatywnych wyników podano w Tabele 6 & 7Podane objętości służą do przygotowania 1,5 ml mieszaniny starterów elongacyjnych.
    1. Oblicz współczynniki rozcieńczenia dla każdego primera za pomocą algorytmu gradientowego, dostępnego w Agena Biosciences („Linear Primer Adjustment”), który koryguje masę i stężenie primera oraz całkowitą liczbę primerów w reakcji multipleksowej (patrz Tabela 6 & 7). Wprowadź masę UEP dla każdego primera w polu UEP_MASS w arkuszu Linear Primer Adjustment.
      Uwaga: stężenie startera skorygowane o masę zostanie automatycznie obliczone w komórce z nagłówkiem „Docelowe stężenie w reakcji (µM).” Objętość startera, którą należy dodać do mieszaniny starterów, zostanie wyświetlona w komórce pod nagłówkiem „Volume Stock Primer to be Added to Pool (µL).” Objętość wody, którą należy dodać do puli starterów w celu uzyskania obliczonych stężeń, jest wyświetlana w komórce obok tekstu „Volume of PCR Grade RNase free H2do dodania pula starterów (µL).”
    2. Pobrać objętość każdego primera zgodnie ze specyfikacją w pliku Linear Primer Adjustment i przygotować pulę primerów. Dodać objętość wody obliczoną przez algorytm w celu rozcieńczenia puli primerów, zgodnie z ustaleniami z kroku 2.4.1.
      Uwaga: Jeśli metoda algorytmu gradientowego jest niedostępna, inną metodą jest podzielenie starterów na grupy o niskiej i wysokiej masie i dodanie podwójnego stężenia starterów z grupy o wysokiej masie w stosunku do grupy o niskiej masie. W przypadku testów wysokiego stopnia multipleksowania (tzn. więcej niż 19 SNP) może być wymagane utworzenie trzech lub czterech grup. Metoda ta nie pozwoli jednak na uzyskanie tak optymalnych wskaźników odczytu (call rates), jak metoda algorytmu gradientowego.
    3. Przygotuj mieszaninę master mix do elongacji. W przypadku testu o niskiej wielokrotności (1–18 pleksów) dodać 0.2 μL buforu, 0.1 μL mieszaniny terminującej, 0.94 μL z mieszaniny starterów skorygowanych pod kątem LPA oraz 0.0205 μL enzymu (przygotowanego w lodzie). W przypadku analizy o wysokiej liczbie pleksów (19–36 pleksów) należy dodać podwójne stężenie mieszaniny terminacyjnej i enzymu (mieszanina terminacyjna 0.2 μL oraz enzym iPLEX 0.041 μL). Należy odnieść się do Tabela 8.
    4. Dodaj 2 μL mieszaniny reakcyjnej do elongacji do płytki z poprzedniej reakcji, tak aby całkowita objętość wynosiła 9 μL na studzienkę. Krótko odwiruj i umieść w termocyklerze: 94 °C przez 30 s wstępnej inkubacji, 40 cykli z 1 x 94 °C przez 5 s z 5 x (52 °C przez 5 s, a następnie 80 °C przez 5 s), a następnie 72 °C przez 3 min. Należy odnieść się do Tabela 9.
  5. Oczyszczanie żywicy.
    Uwaga: Nadmiar soli można teraz usunąć z mieszaniny reakcyjnej za pomocą żywicy.
    1. Dodaj 16 μL wody dejonizowanej do studzienek wyjętej płytki, tak aby objętość w płytce wynosiła 25 μL.
    2. Nanieś równomiernie żywicę, zazwyczaj 6 mg z płytki z wgłębieniami zawierającej żywicę (zakupionej oddzielnie), na całą płytkę. Pozostaw żywicę do wyschnięcia w płytce z wgłębieniami na 20 min w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem jej na płytkę reakcyjną. Po dodaniu żywicy rotuj płytkę przez 5 min w temperaturze pokojowej, ręcznie lub za pomocą mieszadła suspencyjnego z niską prędkością (np.., 7,5 obr./min).
      Uwaga: Przed nałożeniem analizy genotypowej na chip do genotypowania, próbki oraz układ analizy muszą zostać wprowadzone do interfejsu oprogramowania. Można to zrealizować, wykorzystując plik Design Summary z narzędzia do projektowania analiz.
  6. Pomiar na platformie spektrometrii mas.
    1. Wirować płytkę przy 3 200 x g przez 5 min, aby zapobiec naniesieniu żywicy na chip do spektrometrii mas.
    2. Przed uruchomieniem analizy należy wgrać do interfejsu oprogramowania systemu układ próbek na płytce.
      Uwaga: Krok 2.6.3 powinien być wykonywany wyłącznie przez przeszkolony personel.
    3. Nanieś mieszaninę analitów do genotypowania z płytki na chip do genotypowania za pomocą systemu dozującego. Następnie zamontuj chip w systemie MALDI-TOF, aby uzyskać widma masowe mieszaniny analitów, które można następnie zinterpretować za pomocą interfejsu oprogramowania platformy.
      Uwaga: System generuje widma masowe poprzez kierowanie krótkich impulsów światła UV na każdą „podkładkę”, odpowiadający pojedynczej studzience płytki do genotypowania, z chipa do spektrometrii mas. Impuls ten powoduje desorpcję i jonizację analitu. Zjonizowane cząsteczki DNA są następnie przepędzone do górnej części rury próżniowej przez elektrostatyczne pole wysokiego napięcia, co pozwala na oddzielenie lżejszych jonów, które poruszają się szybciej i pierwsze docierają do detektora, od jonów cięższych. System rejestruje „czas przelotu” (time of flight) tych analitów, na podstawie czego można określić masę każdego fragmentu DNA, a w konsekwencji wywnioskować zasadę nukleotydową obecną w SNP.

3. Dane genotypowania

Uwaga: Kontrola jakości i interpretacja danych nie stanowią głównego celu niniejszego artykułu metodycznego. Poniższa sekcja będzie jednak krótko omawiać interpretację widm mas.

  1. Ręczna inspekcja i kontrola jakości widm mas.
    Uwaga: Surowe widma mas są generowane przez system i analizowane za pomocą oprogramowania wymienionego w Tabeli materiałów. Do tych wyników stosowana jest metoda klastrowania mieszanin gaussowskich w celu dokonania probabilistycznego przypisania genotypów.
    1. Otwórz oprogramowanie analityczne. Wybierz Typer Analyzer. Z menu File wybierz Open Wells from File i zaznacz plik xml z danymi widmowymi wygenerowanymi w kroku 2.6.3. Powinna być widoczna nazwa chipa dla danego przebiegu; wybierz ją, a zostanie wyświetlony panel z „sygnalizacją świetlną” dla płytki 384-dołkowej wraz z listą SNP w wybranym dołku. Następnie wybierz Call Cluster Plots, aby wyświetlić wykres rozrzutu punktów danych dla każdego SNP.
      Uwaga: W przypadku SNP o niskiej intensywności zaleca się przypisanie wyniku „no call”. W oprogramowaniu wykorzystanym do uzyskania reprezentatywnych wyników, w celu rygorystycznej kontroli jakości, sugeruje się zastosowanie progu wielkości klastra wynoszącego 5, co jest wartością wyższą niż domyślna. Ustawienie to można zmienić w polu Magnitude Cutoff field w sekcji Parameters w panelu Post Processing Clusters. Z karty Tools wybierz Autocluster, aby przeprowadzić analizę klastrowania.
    2. Przeprowadź ręczną inspekcję przypisanych genotypów, badając wykresy kartezjańskie w panelu Post Processing. W panelu Assay wybierz interesujący SNP i kliknij kartę Post-Processing Clusters; pojawi się wykres klastrowania genotypów z identyfikatorami próbek i odpowiadającymi im genotypami dla danego SNP.
    3. Zbadaj klastry przypisanych genotypów i oceń, jak dobrze poszczególne przypisania grupują się z innymi przypisaniami dla danego SNP. Oprogramowanie wyświetla na wykresie linie pomocnicze dla każdego genotypu; zobacz przykład wykresu klastrów przypisań genotypów dla SNP genu IL13 (Rysunek 1). Jeśli przypisanie nie tworzy zwartego klastra z innymi przypisaniami i znajduje się wyraźnie poza klastrem lub jeśli ma bardzo niską intensywność, kliknij prawym przyciskiem myszy punkt danych i wybierz Change Call, aby ręcznie ustawić go na No Call.
    4. Aby zapewnić wysoką jakość danych genotypowania do dalszych analiz, wyklucz SNP oraz osobniki z poziomem uzyskania wyników (call rate) poniżej progu kontroli jakości, np. 90%. Po wprowadzeniu odpowiednich korekt w danych przypisań, wyeksportuj dane do zastosowań statystycznych. W oprogramowaniu użytym do wygenerowania reprezentatywnych wyników (wymienionym w Tabeli materiałów) osiąga się to poprzez wybranie opcji Plate Data z menu widoku i wybranie Save As.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, przeprowadziliśmy genotypowanie SNP tagujących w obrębie genu odpowiedzi immunologicznej Th2 IL13 w kohorcie osób z alergią pokarmową oraz grupy kontrolnej9. Zastosowaliśmy analizę regresji logistycznej, skorygowaną o pochodzenie etniczne oraz inne potencjalne współzmienne, aby sprawdzić, czy warianty genetyczne w badanym regionie zwiększają ryzyko wystąpienia alergii pokarmowej. Tabela 10

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu demonstrujemy metodę genotypowania multipleksowanego z wykorzystaniem spektrometrii mas. Reprezentatywne wyniki uzyskano przy użyciu PCR w połączeniu ze spektrometrią mas MALDI-TOF4 z chemią testową wymienioną w tabeli materiałów13. Dzięki tej platformie w ciągu 40 godzin w laboratorium wygenerowaliśmy łącznie 11 295 genotypów u 1 255 osób dla 9 SNP.

Ilustrujemy przydatność tej techniki w odpowiadaniu na hipotezy ge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Genomowe DNA --1 μ L w stężeniu 5-10 ng/μ L
Startery: wzmocnienie i wydłużenie do przodu i do tyłuIDT-patrz sekcja 1.2.1 manuskryptu na temat projektowania starterów
Woda dejonizowana Np. woda Milli-Q -dejonizowany 18,2 MΩ. cm rezystywność
Zestaw odczynników do genotypowania. Zestaw odczynników iPLEX Gold Chemistry Agena Bioscience#10148-2zawiera wszystkie odczynniki do reakcji w 2.2.1, 2.3.1 i 2.4.2 , chipowe i żywiczne
płytki PCR (384-dołkowe)Abgene#ABGAB-1384Do płytek systemu MassARRAY firmy Abgene są kompatybilne
Wirówka mikropipetjedno i 8-kanałowa
 kompatybilny z płytkami 384-dołkowymi
Termocyklerkompatybilny z programami PCR zgodnie z opisem w 2.2.4, 2.3.2 i 2.4.3
Płytka z żywicy Dimple Agena Bioscience6mg, 384-dołkowy
rotator płytkowy 
MassARRAY Analyzer 4 SystemAgena BiosciencesSpektrometr masowy MALDI-TOF (matrycowo wspomagana desorpcja/jonizacja laserowa – czas przelotu).
RS1000 NanodispenserAgena Biosciences
Assay Design SuiteAgena BiosciencesNarzędzie służące do projektowania multipleksowych testów genotypowania
Hot Start TaqDNA polimerazy enzymu 
Żywica Agena Biosciences Dostarczanyz zestawem iPLEX

Bibliografia

  1. Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
  2. Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
  3. Kwon, J. M., Goate, A. M. The candidate gene approach. Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).
  4. Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
  5. Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
  6. Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
  7. Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791(2015).
  8. Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
  9. Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
  10. Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251(2013).
  11. Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
  12. Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
  13. Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
  14. Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
  15. Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Polimorfizm pojedynczego nukleotydureakcja a cuchowa polimerazyanaliza MALDI TOFoprogramowanie do okre lania genotypunier wnowaga sprz ealergia pokarmowa
Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.