Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Podsumowanie

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Streszczenie

Złożone choroby często opierają się na wielu powszechnych wariantach genetycznych, które przyczyniają się do podatności na choroby. W tym miejscu opisujemy opłacalne podejście do polimorfizmu pojedynczego nukleotydu znacznikowego (SNP) przy użyciu multipleksowanego testu genotypowania ze spektrometrią mas, w celu zbadania asocjacji szlaków genowych w kohortach klinicznych. Jako przykład badamy locus kandydata na alergię pokarmową Interleukinę13 (IL13). Ta metoda skutecznie maksymalizuje zasięg, wykorzystując nierównowagę wspólnych powiązań (LD) w regionie. Wybrane SNP LD są następnie projektowane w teście multipleksowanym, co umożliwia jednoczesną analizę do 40 różnych SNP, co zwiększa opłacalność. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest stosowana do amplifikacji docelowych loci, a następnie do wydłużania pojedynczego nukleotydu, a amplikony są następnie mierzone za pomocą spektrometrii mas wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji czasu lotu (MALDI-TOF). Surowe dane wyjściowe są analizowane za pomocą oprogramowania do wywoływania genotypów, przy użyciu rygorystycznych definicji i punktów odcięcia kontroli jakości, a genotypy o wysokim prawdopodobieństwie są określane i wyprowadzane do analizy danych.

Wprowadzenie

W złożonych chorobach ludzkich, warianty genetyczne przyczyniają się do podatności na choroby, a ilościowe określenie tych wariantów może być przydatne do zrozumienia patogenezy, identyfikacji grup pacjentów wysokiego ryzyka i odpowiedzi na leczenie. Rzeczywiście, obietnica medycyny precyzyjnej zależy od wykorzystania informacji genomicznych do identyfikacji podgrup pacjentów¹. Niestety, w złożonej przestrzeni biologii chorób, w której fenotypy chorób opierają się na znacznej heterogeniczności genetycznej, niskiej penetracji i zmiennej ekspresji, wymagania dotyczące wielkości kohorty dla podejść obejmujących cały genom w celu identyfikacji nowych kandydatów są często zbyt duże². Alternatywnie, podejście oparte na genach docelowych zaczyna się od hipotezy a priori dotyczącej określonych genów/szlaków w etiologii choroby³. Narzędzia do analizy ścieżek są powszechnie stosowane do badania patofizjologii zidentyfikowanych loci docelowych, generując liczne potencjalne szlaki do zbadania. Demonstrujemy tutaj podejście do genotypowania multipleksowego, które pozwala na badanie dziesiątek do setek SNP za pomocą jednego testu, odpowiedniego dla badań kohortowych na ludziach⁴. Podejście to charakteryzuje się stosunkowo wysoką przepustowością, co pozwala na genotypowanie setek do tysięcy próbek DNA w celu przeprowadzenia nowatorskich badań odkrywczych i zbadania określonych szlaków. Przedstawione tutaj metody są przydatne do identyfikacji alleli ryzyka i ich powiązań z cechami klinicznymi w stosunkowo szybki i niedrogi sposób. Platforma ta okazała się bardzo korzystna do celów badań przesiewowych i diagnostycznych^5,6, a ostatnio także do infekcji mikrobiologicznych⁷ i wirusa brodawczaka ludzkiego⁸.

Ten protokół zaczyna się od selekcji zestawu genów do badania, tj. regionów docelowych, zazwyczaj określanych przez przeszukiwanie literatury, lub hipotez a priori dotyczących udziału w procesie chorobowym; lub być może wybranych do replikacji jako wiodące asocjacje w badaniu odkrycia całego genomu (GWA). Z zestawu genów badacz wybierze doprecyzowaną listę SNP znaczników. Oznacza to, że nierównowaga sprzężeń (LD) lub korelacja między wariantami w regionie jest wykorzystywana do identyfikacji reprezentatywnego "znacznika SNP" dla grupy SNP o wysokim LD, znanego jako haplotyp. Wysoki LD regionu oznacza, że SNP są często dziedziczone razem, tak że genotypowanie jednego SNP jest wystarczające do przedstawienia zmienności we wszystkich SNP w haplotypie. Alternatywnie, w przypadku śledzenia ostatecznej listy SNP z wielu regionów, np. replikacji na potrzeby badania GWA, proces ten może być niepotrzebny. W przypadku genotypowania multipleksowego należy następnie zaprojektować test wokół tych celów w taki sposób, aby startery amplifikacyjne miały różną masę niż startery i produkty rozszerzające w celu uzyskania interpretowalnych widm masowych. Parametry te można łatwo zaimplementować za pomocą narzędzia do projektowania multipleksowanego testu genotypowania. Startery do przodu i do tyłu z tego projektu zostaną wykorzystane do celowania w markery zainteresowania i wzmacniania sekwencji zawierającej SNP. Startery rozszerzające przyłączają się bezpośrednio proksymalnie do SNP i dodawana jest pojedyncza, masowo modyfikowana baza "terminatorowa", która jest komplementarna do SNP. Baza terminatora zapobiega dalszemu rozszerzaniu DNA. Modyfikacja masy zasady umożliwia wykrywanie fragmentów różniących się pojedynczą zasadą za pomocą spektrometrii mas. Płytka zawierająca chemię genotypowania jest następnie nakładana na chip w celu pomiaru na platformie spektrometrii mas. Po zastosowaniu odpowiednich kontroli jakości w odniesieniu do wykrytych przez system wywołań nieprzetworzonego genotypowania, dane mogą zostać wyeksportowane i wykorzystane do analizy statystycznej w celu zbadania związku z fenotypami choroby.

Protokół

Materiał genetyczny użyty w niniejszym dokumencie został etycznie zatwierdzony do użytku przez Biuro ds. Dzieci HREC (Komitet Etyki Badań Naukowych) (CDF/07/492), Departament Opieki Społecznej HREC (10/07) oraz Królewski Szpital Dziecięcy (RCH) HREC (27047).

1. Projektowanie testu multipleksowanego

1. Przygotuj listę SNP do zaprojektowania testu.
   1. Wprowadź region docelowy do funkcji taggera Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Użyj LD (korelacja, r²) między SNP obejmującymi region docelowy, aby wygenerować listę SNP, która zapewnia pełne pokrycie żądanego regionu z najmniejszą liczbą wymaganych wariantów. Wygeneruj listę SNP tak, aby wszystkie allele do przechwycenia były skorelowane powyżej progu zdefiniowanego przez użytkownika (np. r² ≥0,8).
2. Identyfikacja odpowiednich sekwencji dla starterów do przodu, do tyłu i przedłużającego
   1. Wprowadź wygenerowaną listę SNP do wybranego narzędzia do projektowania testów.
      Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą narzędzia do projektowania testu używanego do generowania reprezentatywnych wyników, jak określono w tabeli materiałów.
   2. Po uruchomieniu narzędzia do projektowania testu wybierz opcję Nowy projekt genotypowania. Wprowadź nazwę projektu testu w polu Nazwa wzoru.
   3. Podaj listę SNP wygenerowaną w kroku 1.1.1, klikając przycisk oznaczony Edit Text Input z instrukcjami rs lub FASTA po lewej stronie przycisku.
      Uwaga: SNP mogą być wprowadzane jako tekstowa lista referencyjnych (rs) SNP ID lub wgrywane w formacie FASTA lub formacie pliku SNP Group używanym przez narzędzie. Aby przesłać pliki w tych formatach, wybierz przycisk Prześlij plik. Górna granica wariantów, które można zaprojektować w jednym teście, określanym jako "studnia", wynosi 40 SNP. Możliwe jest określenie SNP, które są priorytetem dla projektu przed rozpoczęciem biegu; Zostaną one zaprojektowane w pierwszej kolejności. Można określić SNP kontrolne: na przykład test w celu wykrycia płci w przypadku pomieszania próbki lub test kontrolny w celu ustalenia, czy dodano wystarczającą ilość matrycy w przypadku pracy z DNA o niskiej lub złej jakości. Należy jednak zauważyć, że stosowanie SNP kontrolnych i priorytetowych może zmniejszyć liczbę SNP, które można zaprojektować w jednym odwiercie.
   4. Z menu Preset (Ustawienia wstępne) wybierz opcję High Multiplexing iPLEX Preset (Ustawienie wstępne iPLEX o wysokim multipleksowaniu). Z menu Organizm wybierz organizm, z którego pochodzi DNA, które ma zostać zgenotypowane. Dla reprezentatywnych wyników przedstawionych tutaj był to Human.
      Uwaga: Organizmy mysie i bydlęce są również kompatybilne z tym narzędziem. Można również wybrać Inne, jeśli pracujesz z alternatywnym organizmem, takim jak roślina lub mikrob; jednak zautomatyzowane kroki wyszukiwania proksymalnych SNP i optymalnych obszarów starterów nie będą dostępne ze względu na brak genomu referencyjnego.
   5. W menu Baza danych wybierz najnowszą kompilację genomu lub alternatywną kompilację, jeśli jest to wymagane, z menu Chemia. Wybierz opcję iPLEX i w polu Poziom multipleksu wprowadź najwyższy poziom multipleksowania: 40. Teraz wybierz Rozpocznij uruchamianie. Rozpocznie się "Krok 1" narzędzia.
      Uwaga: W kroku 1 narzędzie pobiera i formatuje sekwencje SNP. W tym przypadku błędy mogą obejmować formatowanie pliku FASTA, w którym to przypadku plik FASTA powinien zostać sprawdzony i ponownie sformatowany w razie potrzeby. Kolejnym błędem są numery rs SNP, które zostały połączone z innym numerem rs, w takim przypadku numer rs należy wyszukać w bazie danych SNP, takiej jak dbSNP NCBI, aby zidentyfikować nowy numer rs SNP. Sekwencje wokół SNP są przeszukiwane pod kątem wszelkich znanych proksymalnych SNP, które mogłyby zakłócać projekt startera. Potencjalne miejsca starterów PCR są porównywane z genomem, aby uniknąć niespecyficznej amplifikacji z powodu wielu trafień w genomie.
   6. Poczekaj na zakończenie "Kroku 2" narzędzia do projektowania, w którym zostaną zidentyfikowane proksymalne SNP.
      Uwaga: Jeśli używasz organizmu, który nie jest obsługiwany na tym etapie, opisz sekwencje za pomocą proksymalnych SNP w adnotacji IUPAC, jeśli te informacje są dostępne. Na tym etapie rzadko występują błędy; jednak błędy mogą wystąpić, jeśli wybrano niewłaściwy organizm referencyjny lub genom lub jeśli wprowadzono sekwencje cDNA, a nie genomowe DNA. Aby zoptymalizować krok 2, w obszarze Ustawienia zaawansowane można odfiltrować SNP na podstawie populacji, jeśli pracują w określonej populacji. Rzadkie SNP można również odfiltrować, wykluczając te o częstości poniżej 1%. Wreszcie, SNP, które nie mają zatwierdzonego statusu lub nie mają informacji o populacji, mogą być również wykluczone w razie potrzeby.
   7. Poczekaj na zakończenie "Kroku 3" narzędzia do projektowania, które identyfikuje optymalne obszary podkładu. Jeśli zidentyfikowano preferowane lokalizacje starterów lub jeśli pracujesz z innym organizmem, ręcznie wprowadź lokalizacje startera, dodając adnotacje do sekwencji wejściowej (pliki grupy SNP) preferowanymi regionami startera wielkimi literami, a resztę sekwencji małymi literami, wybierz opcję Zachowaj wielkość liter z menu Ustawienia zaawansowane dla tego kroku.
      Uwaga: Błędy w krokach 2 i 3 mogą obejmować: (1) Proksymalny SNP blokujący projekt startera z roztworem polegającym na zamaskowaniu za pomocą zasady nieszablonowej i zamówieniu oligonugozasady uniwersalnej, takiej jak izonina, lub zaprojektowaniu dwóch starterów, po jednym z alleli proksymalnego SNP, lub zaprojektowaniu jednego startera tylko ze wspólnym allelem. (2) Innym częstym błędem jest niemożność zidentyfikowania unikalnego miejsca dla startera, przy czym rozwiązaniem jest modyfikacja długości amplikonu w celu zidentyfikowania unikalnego miejsca. W narzędziu używanym dla tego dokumentu wartość domyślna to 80 - 120 bp. Można to zmienić w zakresie od 60 do 400 bp w oknie dialogowym ustawień zaawansowanych w ustawieniach Amplicon Length w "3. Zidentyfikuj optymalne obszary podkładu", a także w zakładce Amplicon w "4. Testy projektowe." Upewnij się, że oba zostały zmienione. Należy jednak zauważyć, że zwiększanie długości amplikonu w przypadku stosowania zdegradowanego DNA nie jest zalecane.
   8. Poczekaj na zakończenie etapu projektowania testu ("krok 4" narzędzia projektowego), w którym narzędzie ma na celu zapewnienie optymalnej separacji przejścia między starterami rozszerzającymi a allelami wszystkich SNP w projektach multipleksowanych. Po wykonaniu tego kroku wyeksportuj plik Oligo Order, który jest sformatowany w celu łatwego zamawiania za pośrednictwem wybranego dostawcy zamówień oligo.
      Uwaga: Startery wzmacniające (do przodu (F) i do tyłu (R)) są zaprojektowane tak, aby uzyskać optymalny rozmiar amplikonu od 80 do 120 pz. Masa startera amplifikacyjnego musi różnić się od masy startera przedłużającego i jego produktu, aby uniknąć sprzecznych wyników w spektrum mas i dla ogólnej wydajności PCR. Starter rozszerzający powinien mieć długość od 15 do 30 nukleotydów (4,500 - 9,000 Da), zaprojektowany tak, aby koniec 3' przylegał bezpośrednio do miejsca polimorfizmu. Wszystkie te ustawienia są automatycznie ustawiane w narzędziu używanym do generowania reprezentatywnych wyników.
3. Wyeksportuj projekt z wybranego narzędzia i zamów startery u dostawcy oligomerów: 25 nmol każdego ze starterów PCR (do przodu i do tyłu) oraz 100 nmol każdego ze starterów rozszerzających. W tabeli 1 przedstawiono startery użyte do wygenerowania reprezentatywnych wyników.

2. Genotypowanie (1 - 2 dni)

1. Przygotuj podkłady wzmacniające.
   1. Jeśli zamówiono liofilizowane startery, rozpuść je w wodzie molekularnej. Użyj stężenia 100 μM/μL dla starterów do przodu i do tyłu oraz 500 μM/μL do przedłużania.
   2. Połącz startery do przodu i do tyłu dla każdego testu multipleksowanego w podstawową mieszankę starterów, zawierającą każdy starter w stężeniu 0,5 mM.
      Uwaga: Na przykład pula starterów o pojemności 400 μl na 400 reakcji:
      
      Do puli podkładów podstawowych wymagane są 2 μl każdego podkładu o stężeniu 100 μM/μl. W przypadku testu 30-plex z 60 starterami do przodu i do tyłu wymagane byłoby łącznie 120 μl startera (skoncentrowana pula starterów). Następnie dodaje się 280 μl wody molekularnej, aby uzyskać końcową objętość 400 μl mieszanki starterów.
2. Amplifikacja za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
   1. Wykonać mieszaninę wzorcową do PCR zawierającą 100 nM mieszaniny starterów opisanej powyżej, 500 μM dNTP, 2 mM MgCl₂ i 0,5 M enzymu polimerazy DNA. 1 U jest wymagane dla testów większych niż 26-plex. Patrz Tabela 2.
   2. Dodać 4 μl tej mieszanki do każdego dołka 384-dołkowej płytki PCR wraz z 1 μl genomowego DNA w stężeniu 5 - 10 ng/μL.
      Uwaga: Na płytce należy również uwzględnić kontrole jakości, takie jak kontrola bez matrycy oraz kontrola pozytywna, która wcześniej dobrze wypadła z testem (podczas serii testowej). W przypadku stosowania wielu płytek, wiele próbek DNA z drugiej płytki, np. w trzech egzemplarzach, powinno być przeprowadzanych jako kontrola techniczna zmienności między płytkami.
   3. Odwirować płytkę o sile 200 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej z założoną pokrywą płytki, aby upewnić się, że cała ciecz znajduje się na dnie płytki.
   4. Przeprowadzić PCR w następujących warunkach termocyklera: 4-minutowa inkubacja w temperaturze 94 °C w celu aktywacji polimerazy DNA; 45 następujących cykli (denaturacja w temperaturze 94 °C przez 20 s, wyżarzanie w temperaturze 56 °C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę), a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 3 minuty. Patrz program PCR w Tabeli 3.
   5. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym, aby upewnić się, że amplifikacja DNA zakończy się sukcesem. Użyj 1 μl produktu PCR (z 3 μl buforu ładującego) na 2% (w/v) żelu agarozowym, sporządzonym przez zmieszanie proszku agarozy i 0,5% buforu Tris Borate EDTA (TBE) i uruchom przez 45 minut przy 100 V.
3. Etap oczyszczania fosfatazy alkalicznej krewetek (SAP)
   Uwaga: Ten krok służy do usuwania niewbudowanych nukleotydów. Enzym SAP rozszczepia grupy fosforanowe, aby zapobiec nadmiarowi starterów i nieinkorporowanych dNTP przed zakłóceniem nadchodzącej reakcji rozszerzenia.
   1. Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą 1,7 jednostki/μl enzymu fosfatazy alkalicznej krewetek (SAP), 10x bufor SAP i uzupełnić do kreski wodą molekularną. Patrz Tabela 4.
   2. Dodać 2 μl świeżo przygotowanej mieszanki głównej SAP do każdego dołka płytki, zawierającego już 5 μl z reakcji PCR. Odwirować na krótko i powrócić do termocyklera w temperaturze 37 °C przez 40 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 5 minut w celu inaktywacji enzymu. Patrz Tabela 5.
4. Reakcja na wydłużenie podkładu
   Uwaga: Stężenie podkładów przedłużających w mieszance podkładów przedłużających należy dostosować do wielkości (Linear Primer Adjustment – LPA). Dzieje się tak, ponieważ istnieje odwrotna zależność między intensywnością piku (w widmach masowych) a masą produktu. Regulacja stężenia startera przedłużającego koryguje tę zależność, aby uzyskać piki o jednakowej intensywności. Skorygowane startery użyte do wygenerowania reprezentatywnych wyników przedstawiono w tabelach 6 i 7. Podane objętości mają wytworzyć 1,5 ml mieszanki podkładów przedłużających.
   1. Obliczyć współczynniki rozcieńczenia dla każdego startera za pomocą algorytmu gradientowego, dostępnego w Agena Biosciences ("Linear Primer Adjustment"), który dostosowuje się do masy i stężenia startera oraz całkowitej liczby starterów w reakcji multipleksowanej (zob. tabele 6 i 7). Wprowadź masę UEP dla każdego podkładu w polu UEP_MASS arkusza Liniowej korekty podkładu.
      Uwaga: Stężenie skorygowane o masę startera zostanie automatycznie obliczone w komórce z tekstem nagłówka "Docelowe stężenie reakcji (μM)". Objętość startera, która ma zostać dodana do puli starterów, zostanie wyświetlona w komórce pod tekstem nagłówka "Objętość podstawowego startera, który ma zostać dodany do puli (μL)". Objętość wody, która ma zostać dodana do puli starterów w celu uzupełnienia obliczone stężenia są wyprowadzane do komórki obok tekstu "Objętość_H2Owolnej od RNaz PCR do dodania puli starterów (μL)".
   2. Weź objętość każdego podkładu zgodnie z opisem w pliku Linear Primer Adjustment i uzupełnij pulę starterów. Dodać objętość wody obliczoną przez algorytm w celu rozcieńczenia puli podkładu, jak określono w kroku 2.4.1.
      Uwaga: Jeśli metoda algorytmu gradientu jest niedostępna, inną metodą jest podzielenie starterów na startery o małej masie i dużej masie oraz dodanie podwójnej koncentracji starterów o dużej masie w stosunku do grupy o niskiej masie. Do testu high-plex mogą być wymagane trzy lub cztery grupy (czyli więcej niż 19 SNP). Jednak ta metoda nie zapewni tak optymalnych stawek za połączenia, jak metoda algorytmu gradientowego.
   3. Zmontuj główny miks rozszerzenia. W przypadku testu niskiej plekscytacji (1 - 18 pleksów) dodać 0,2 μl buforu, 0,1 μl mieszaniny terminacyjnej, 0,94 μl mieszanki starterów dostosowanych do LPA i 0,0205 μl enzymu (przygotowanego na lodzie). W przypadku testu o wysokiej pleksie (19 - 36 pleksów) dodać podwójne stężenie mieszaniny terminacyjnej i enzymu (mieszanina terminacji 0,2 μl i enzym iPLEX 0,041 μl). Patrz Tabela 8.
   4. Dodać 2 μl głównej mieszanki reakcyjnej z przedłużenia do płytki z poprzedniej reakcji, teraz zwiększając całkowitą objętość do 9 μl na studzienkę. Krótko odwirować i umieścić w termocyklerze: 94 °C przez 30 s początkowa inkubacja, 40 cykli 1 x 94 °C przez 5 s z 5 x (52 °C przez 5 s, a następnie 80 °C przez 5 s), a następnie 72 °C przez 3 min. Patrz Tabela 9.
5. Oczyszczanie żywicy.
   Uwaga: Nadmiar soli można teraz usunąć z reakcji za pomocą żywicy.
   1. Dodaj 16 μl wody dejonizowanej do studzienek pobranej płytki, zwiększając objętość w płytce do 25 μl.
   2. Nałóż żywicę, zwykle 6 mg płytki z żywicą z wgłębieniami (do kupienia osobno), równomiernie na całą płytkę. Pozostaw żywicę do wyschnięcia w płytce z wgłębieniami żywicy na 20 minut w temperaturze pokojowej przed nałożeniem na płytkę reakcyjną. Po dodaniu żywicy obracać płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej ręcznie lub za pomocą mieszadła do zawiesiny z małą prędkością (np. 7,5 obr./min).
      Uwaga: Przed załadowaniem analitu do genotypowania na chip do genotypowania, próbki i układ testu muszą zostać wprowadzone do interfejsu oprogramowania. Można to osiągnąć za pomocą pliku podsumowania projektu z narzędzia do projektowania testów.
6. Pomiar na platformie spektrometrii mas.
   1. Odwirować płytkę o masie 3 200 x g przez 5 minut, aby uniknąć nałożenia żywicy na układ widma masy.
   2. Prześlij układ płytek próbek do interfejsu oprogramowania systemu przed uruchomieniem.
      Uwaga: Krok 2.6.3 powinien być wykonywany wyłącznie przez przeszkolony personel.
   3. Nanieść mieszaninę analitu genotypowania z płytki na chip do genotypowania za pomocą systemu dozującego. Następnie załaduj chip do systemu MALDI-TOF, aby wygenerować widma masowe z mieszaniny analitów, które można następnie zinterpretować za pomocą interfejsu oprogramowania platformy.
      Uwaga: System generuje widma masowe poprzez kierowanie krótkich impulsów światła UV na każdą "podkładkę", odpowiadającą pojedynczemu dołkowi płytki genotypowania, chipa widm masy. Impuls ten powoduje desorpcję i jonizację analitu. Te zjonizowane cząsteczki DNA są następnie napędzane na szczyt rury próżniowej przez pole elektrostatyczne o wysokim napięciu, oddzielając lżejsze jony, które przemieszczają się szybciej i docierają do detektora jako pierwsze, od cięższych jonów. "Czas przelotu" tych analitów jest rejestrowany przez układ, na podstawie którego można określić masę każdego fragmentu DNA, a tym samym wywnioskować zasadę nukleotydową obecną w SNP.

3. Dane dotyczące genotypowania

Uwaga: Kontrola jakości i interpretacja danych nie są przedmiotem tego artykułu metodologicznego. Poniżej jednak pokrótce omówimy interpretację widm masowych.

1. Ręczna inspekcja i kontrola jakości widm mas.
   Uwaga: Widma masy surowej są generowane przez system i analizowane za pomocą oprogramowania zgodnie z tabelą materiałów. Do tych danych wyjściowych stosuje się metodę grupowania mieszanin Gaussa w celu wykonania probabilistycznych wywołań genotypowania.
   1. Otwórz oprogramowanie do analizy. Wybierz opcję Typer Analyzer. Z menu Plik wybierz opcję Otwórz studnie z pliku i wybierz plik xml z danymi widma wygenerowanymi w kroku 2.6.3. Nazwa chipa dla przebiegu powinna być widoczna, wybierz ją, a zostanie wyświetlone okienko "sygnalizacji świetlnej" na tabliczce 384-dołkowej z listą SNP w wybranym dołku. W tym miejscu wybierz opcję Wywołaj wykresy klastrów, aby wyświetlić wykres rozrzutu punktów danych dla każdego SNP.
      Uwaga: Zaleca się zastosowanie wyniku "no call" w przypadku SNP o niskiej intensywności. W oprogramowaniu używanym do uzyskania reprezentatywnych wyników sugeruje się odcięcie wielkości klastrowania wynoszące 5, które jest wyższe niż domyślne, w celu ścisłej kontroli jakości. To ustawienie można dostosować w polu Odcięcie wielkości w obszarze Parametry w okienku Klastry przetwarzania końcowego. Wybierz opcję Autoklaster na karcie Narzędzia, aby uruchomić analizę skupień.
   2. Wykonaj ręczną inspekcję wywołań genotypu, sprawdzając wykresy kartezjańskie w okienku przetwarzania końcowego. W okienku Test wybierz interesujący Cię SNP i kliknij zakładkę Klastry przetwarzania końcowego, widoczny będzie wykres skupień z grupowaniem genotypów z identyfikatorami próbek i odpowiadającymi im genotypami dla SNP.
   3. Zbadaj klastry wywołań genotypu i oceń, jak dobrze każde pojedyncze wywołanie grupuje się z innymi wywołaniami SNP. Oprogramowanie zapewnia kilka linii granicznych na powierzchni dla każdego genotypu w celu uzyskania wskazówek; zobacz przykład wywołania genotypu wykresu klastra z SNP IL13 (Rysunek 1). Jeśli połączenie nie grupuje się ściśle z innymi połączeniami i znajduje się wyraźnie poza klastrem lub jeśli ma bardzo niską intensywność, kliknij prawym przyciskiem myszy punkt danych i wybierz polecenie Zmień połączenie, aby ręcznie ustawić go na Brak połączenia.
   4. Aby zapewnić wysoką jakość danych genotypowania wykorzystywanych do dalszej analizy, należy wykluczyć SNP i osoby, których wskaźniki połączeń są poniżej progu kontroli jakości, np. 90%. Po wprowadzeniu odpowiednich korekt w danych wywołania należy wyeksportować dane do zastosowań statystycznych. W oprogramowaniu używanym do generowania reprezentatywnych wyników (wymienionych w Tabeli materiałów) osiąga się to poprzez wybór Dane płyty z menu widoku i wybranie opcji Zapisz jako.

Wyniki

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, genotypowaliśmy SNP znaczników w genie immunologicznym Th2 IL13 w kohorcie przypadków alergii pokarmowych i kontrolnych⁹. Zastosowaliśmy analizę regresji logistycznej, skorygowaną o pochodzenie i inne potencjalne zmienne współistniejące, aby sprawdzić, czy warianty genetyczne w regionie zainteresowania zwiększają ryzyko alergii pokarmowej. Tabela 10⁹ pokazuje, że jeden wariant ...

Dyskusja

W tym miejscu demonstrujemy metodę genotypowania multipleksowanego z wykorzystaniem spektrometrii mas. Reprezentatywne wyniki uzyskano przy użyciu PCR w połączeniu ze spektrometrią mas MALDI-TOF⁴ z chemią testową wymienioną w tabeli materiałów¹³. Dzięki tej platformie w ciągu 40 godzin w laboratorium wygenerowaliśmy łącznie 11 295 genotypów u 1 255 osób dla 9 SNP.

Ilustrujemy przydatność tej techniki w odpowiadaniu na hipotezy ge...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Genomowe DNA	-	-	1 μ L w stężeniu 5-10 ng/μ L
Startery: wzmocnienie i wydłużenie do przodu i do tyłu	IDT	-	patrz sekcja 1.2.1 manuskryptu na temat projektowania starterów
Woda dejonizowana	Np. woda Milli-Q	-	dejonizowany 18,2 MΩ. cm rezystywność
Zestaw odczynników do genotypowania. Zestaw odczynników iPLEX Gold Chemistry	Agena Bioscience	#10148-2	zawiera wszystkie odczynniki do reakcji w 2.2.1, 2.3.1 i 2.4.2 , chipowe i żywiczne
płytki PCR (384-dołkowe)	Abgene	#ABGAB-1384	Do płytek systemu MassARRAY firmy Abgene są kompatybilne
Wirówka mikropipet			jedno i 8-kanałowa
			kompatybilny z płytkami 384-dołkowymi
Termocykler			kompatybilny z programami PCR zgodnie z opisem w 2.2.4, 2.3.2 i 2.4.3
Płytka z żywicy Dimple	Agena Bioscience		6mg, 384-dołkowy
rotator płytkowy
MassARRAY Analyzer 4 System	Agena Biosciences		Spektrometr masowy MALDI-TOF (matrycowo wspomagana desorpcja/jonizacja laserowa – czas przelotu).
RS1000 Nanodispenser	Agena Biosciences
Assay Design Suite	Agena Biosciences		Narzędzie służące do projektowania multipleksowych testów genotypowania
Hot Start Taq			DNA polimerazy enzymu
Żywica	Agena Biosciences Dostarczany		z zestawem iPLEX