Artykuł metodologiczny

Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolulinowego na biofilm Staphylococcus aureus

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57604

⸱

16 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje protokół do badania przeciwbakteryjnego wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolewulinowego (ALA-PDT) na biofilm Staphylococcus aureus. Protokół ten może zostać wykorzystany do opracowania modelu in vitro w celu zbadania leczenia biofilmów bakteryjnych za pomocą PDT w przyszłości.

Streszczenie

Staphylococcus aureus (S. aureus) jest powszechnym ludzkim patogenem, który powoduje infekcje ropotwórcze i ogólnoustrojowe. Zakażenia gronkowcem złocistym są trudne do zwalczenia nie tylko ze względu na pojawienie się szczepów opornych na antybiotyki, ale także ze względu na jego zdolność do tworzenia biofilmów. Ostatnio terapia fotodynamiczna (PDT) została wskazana jako jedna z potencjalnych metod leczenia kontroli zakażeń biofilmem. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat jego wpływu na biofilmy bakteryjne, a także mechanizmów leżących u jego podstaw. Manuskrypt ten opisuje model PDT in vitro z kwasem 5-aminolewulinowym (5-ALA), prekursorem właściwego fotosensybilizatora, protoporfiryny IX (PpIX). Krótko mówiąc, dojrzałe biofilmy S. aureus inkubowano z ALA, a następnie wystawiono na działanie światła. Następnie przeciwbakteryjne działanie ALA-PDT na biofilm S. aureus określono ilościowo, obliczając jednostki tworzące kolonie (CFU) i wizualizując je za pomocą barwienia fluorescencyjnego żywotności za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Reprezentatywne wyniki wykazały silne działanie przeciwbakteryjne ALA-PDT na biofilmy S. aureus. Protokół ten jest prosty i może być wykorzystany do opracowania modelu in vitro do badania leczenia biofilmów S. aureus za pomocą ALA-PDT. W przyszłości może być również przywoływany w badaniach PDT wykorzystujących inne fotouczulacze dla różnych szczepów bakterii przy minimalnych korektach.

Wprowadzenie

S. aureus jest ważnym patogenem Gram-dodatnim, który kolonizuje skórę i błonę śluzową ludzkich gospodarzy. Jego zdolność do tworzenia biofilmów jest uważana za ważny aspekt jego patogenezy1. Biofilmy bakteryjne to społeczność bakterii osadzona w samodzielnie wytworzonej matrycy, która składa się z zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, w tym polisacharydu, DNA i białka. Matryca ta odgrywa znaczącą rolę w utrzymywaniu się infekcji bakteryjnych, przyczyniając się do wysokiego stopnia odporności na ludzki układ odpornościowy i obecne terapie przeciwdrobnoustrojowe2. Antybiotyki są nadal głównym sposobem leczenia zakażeń biofilmem, chociaż wpływ antybiotyków na biofilm jest ograniczony. Wykazano wcześniej, że komórki w biofilmach są 10 - 1000 razy bardziej odporne na antybiotyki w porównaniu do ich planktonowych odpowiedników3. Dlatego potrzebne są alternatywne strategie, aby pokonać ten problem.

PDT, alternatywna metoda leczenia infekcji bakteryjnych, wykorzystuje światło o odpowiedniej długości fali do aktywacji fotouczulaczy. Prowadzi to do produkcji reaktywnych form tlenu (ROS), które są śmiertelne dla komórek docelowych poprzez zakłócanie ściany komórkowej, inaktywację enzymów i uszkadzanie DNA4. Ta wielocelowa cecha utrudnia bakteriom rozwinięcie oporności na leczenie PDT.

Przeciwbakteryjny wpływ PDT na biofilmy bakteryjne i grzybowe, z wieloma fotouczulaczami, takimi jak błękit toluidynowy, zieleń malachitowa, błękit metylenowy, chlor E6 i porfiryny, był badany w poprzednich raportach5,6,7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, prolek właściwego fotosensybilizatora, PpIX, charakteryzuje się małą masą cząsteczkową i szybkim klirensem12,14. Te zalety dają ALA-PDT duży potencjał jako zastosowanie terapeutyczne. Chociaż wpływ ALA-PDT na bakterie planktoniczne był badany przez wiele grup12, przeciwdrobnoustrojowy wpływ ALA-PDT na biofilmy bakteryjne nie został jeszcze wyjaśniony. Tymczasem trudno jest porównywać wyniki między wcześniejszymi badaniami. Jednym z powodów jest to, że różne protokoły są używane przez różne grupy. W związku z tym protokół ten opisuje model in vitro systemu ALA-PDT oparty na naszym poprzednim work15. Efekt tego modelu został potwierdzony przez obliczenia CFU i barwienie żywotności za pomocą CLSM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Tworzenie biofilmu

  1. Tworzenie biofilmu w 96-dołkowych mikropłytkach
    1. Pobrać szczep S. aureus USA300 i 3 szczepy kliniczne tworzące biofilm (C1 - C3) przechowywane w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Zdolność szczepów klinicznych do tworzenia biofilmów została określona za pomocą testu na płytce mikromiareczkowej opisanego wcześniej15.
    2. Zaszczepić bakterię w 5 ml pożywki z bulionu sojowego z tryptonem (TSB) i hodować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc do fazy stacjonarnej.
    3. Odwirować nocną kulturę bakteryjną o sile 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C, a następnie odrzucić supernatant. Zawiesić granulki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 2,0 x 109 CFU/mL.
      UWAGA: Stężenie bakterii oszacowano za pomocą pomiaru gęstości optycznej, a następnie określono za pomocą liczby płytek16, ujawniając, że 1 OD600 zawiesiny zawierał 1,5 x 108 CFU/ml.
    4. Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną w stosunku 1:200 (1,0 x 107 jtk/ml) w pożywce TSB zawierającej 0,5% glukozy. Zaszczepić 200 μl zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki polistyrenowej poddanej działaniu kultur komórkowych.
    5. Mikropłytkę inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w dobrze natlenionym środowisku.
      UWAGA: Czas inkubacji dojrzałego biofilmu może być różny dla różnych szczepów bakterii; powinno to zostać ustalone przed eksperymentem PDT15.
    6. Wyrzucić pożywkę z dołków i delikatnie umyć studzienki mikropłytki trzykrotnym PBS, a następnie wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Krok ten należy wykonać bardzo delikatnie, aby nie naruszyć powstałego biofilmu.
  2. Tworzenie się biofilmu w naczyniach
    1. Zaszczepić szczep S. aureus USA300 w 5 ml pożywki TSB i hodować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc do fazy stacjonarnej.
    2. Odwirować nocną kulturę bakteryjną o sile 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C, a następnie odrzucić supernatant. Zawiesić granulki w PBS do końcowego stężenia 2,0 x 109 jtk/ml. Następnie zawiesinę bakteryjną rozcieńczyć do 1:200 (1,0 x 107 jtk/ml) w pożywce TSB zawierającej 0,5% glukozy. Inokulować 2 ml zawiesiny bakteryjnej w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórek ze szkła o jakości optycznej i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny
      UWAGA: Stężenie bakterii oszacowano poprzez pomiar gęstości optycznej.
    3. Odessać pożywkę pipetą, a następnie delikatnie przepłukać biofilmy w naczyniu trzykrotnie PBS, a następnie ostrożnie wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Unikaj dotykania końcówki pipety do dna naczynia. Krok 2.2 należy wykonać natychmiast po tym etapie, aby zapobiec wysuszeniu utworzonego biofilmu.

2. Promieniowanie światłem

  1. Przechowywać 5-ALA w lodówce o temperaturze 4 °C. Przed eksperymentem rozcieńczyć 5-ALA z PBS do 10 mM.
    UWAGA: Roztwór 5-ALA powinien być świeżo przygotowany przed eksperymentem.
  2. W grupie eksperymentalnej dodaj 200 μl 10 mM ALA do każdego dołka mikropłytki lub 2 ml do szalki hodowlanej. Przykryj talerz/naczynie folią aluminiową i inkubuj przez 1 godzinę. Następnie należy naświetlić płytkę/szalkę diodą elektroluminescencyjną (LED) o natężeniu światła 100 mW/cm2 przez 1 godzinę, aby uzyskać dawkę światła 360 J/cm2 przy głównej długości fali 633 ± 10 nm17,
    UWAGA: Aby energia świetlna była skutecznie i równomiernie dostarczana do biofilmu we wszystkich studzienkach/naczyniach, należy ustalić odległość od szczytu źródła światła do studzienki/naczynia na 6,0 cm i ograniczyć obszar doświadczalny do centralnego obszaru napromieniowania (10 cm x 8 cm). Aby zapewnić powtarzalność wyników, eksperymenty należy przeprowadzać w tej samej temperaturze pokojowej.
    Na etapie naświetlania diodami LED, aby uniknąć bezpośredniego wystawienia płytki na inne źródła światła, takie jak światło słoneczne, oświetlenie pomieszczenia lub lampa, dioda LED została włączona przed przeniesieniem płyty/naczynia do obszaru napromieniowania, a światło było wystarczająco jasne, aby zakończyć operację.
  3. Skonfiguruj grupy kontrolne (w naszym eksperymencie utworzono trzy grupy kontrolne).
    1. Dla pierwszej grupy kontrolnej (ALA-LED-) dodać 200 μl PBS do każdej studzienki mikropłytki lub 2 ml do szalki hodowlanej. Przykryj talerz/naczynie folią aluminiową i inkubuj przez 2 godziny.
    2. Dla drugiej grupy kontrolnej (ALA+LED-) dodać 200 μl 10 mM ALA do każdego dołka mikropłytki lub 2 ml do szalki hodowlanej. Przykryj talerz/naczynie folią aluminiową i inkubuj przez 2 godziny.
    3. Dla trzeciej grupy kontrolnej (ALA-LED+) dodać 200 μl PBS do każdego dołka mikropłytki lub 2 ml do szalki hodowlanej. Przykryj talerz/naczynie folią aluminiową i inkubuj przez 1 godzinę. Następnie naświetl płytkę diodą LED za pomocą naświetlania światłem 360 J/cm2 o głównej długości fali 633 ± 10 nm17,
      UWAGA: Na etapie naświetlania diodami LED należy unikać bezpośredniego wystawiania płytki na działanie innych źródeł światła, takich jak światło słoneczne, oświetlenie pomieszczenia lub lamplight.

3. Określanie skuteczności leczenia PDT

UWAGA: Aby potwierdzić wpływ ALA-PDT na biofilmy S. aureus, żywotność komórek z lub bez ALA-PDT została oceniona przez liczenie CFU, jak również przez barwienie żywotności.

  1. Oznaczanie pozostałych żywotnych komórek bakteryjnych
    1. Po leczeniu ALA-PDT wyrzuć pożywkę ze studzienek i umyj studzienki trzykrotnie PBS, aby usunąć wszystkie nieprzylegające komórki zarówno dla grupy eksperymentalnej, jak i kontrolnej.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać bardzo delikatnie.
    2. Dokładnie zeskrob przylegające komórki bakteryjne ze studzienek za pomocą końcówki pipety i zbierz komórki do stożkowych probówek.
    3. Odwirować zawiesinę bakteryjną o stężeniu 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
    4. Zawiesić bakterie w 1 ml 0,25% enzymu pankreatynowego w PBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny.
    5. Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut; wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS.
    6. Wykonać seryjne rozcieńczenia roztworu komórkowego w stosunku 1:10 za pomocą PBS, a następnie dodać 5 μl każdej próbki z seryjnego rozcieńczenia na płytkę z agarem sojowym tryptonowym (TSA). Inkubować płytkę TSA w temperaturze 37 °C przez 16 godzin; następnie policz (gołym okiem) liczbę kolonii bakteryjnych (CFU/ml).
  2. Obserwacja biofilmów S. aureus za pomocą CLSM
    1. Po lekkim napromieniowaniu należy trzykrotnie przemyć biofilmy w naczyniu hodowlanym PBS.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać bardzo delikatnie.
    2. Dodać 1 ml 1 μM barwienia jądrowego i chromosomowego o zielonej fluorescencji, które jest przepuszczalne dla błon komórek prokariotycznych (np. SYTO9) i 1 ml 1 μM jodku propydyny (PI) przez 20 minut, aby wybarwić biofilm, a także martwe komórki.
    3. Obserwuj żywe komórki (zielona fluorescencja, Ex/Em 485 nm/530 nm) i martwe komórki (czerwona fluorescencja, Ex/Em 485 nm/630 nm) pod CLSM z soczewką obiektywu olejowego 63X 1,4-NA.
    4. Generuj obrazy za pomocą oprogramowania do mikroskopii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Żywotność bakterii w biofilmach uległa zmniejszeniu po zastosowaniu terapii ALA-PDT w porównaniu z grupami kontrolnymi (ALA-LED-, ALA+LED- oraz ALA-LED+) zarówno w przypadku szczepu USA300, jak i trzech szczepów klinicznych (Rysunek 1).

Aby potwierdzić wyniki analizy CFU i zaobserwować efekt przeciwbakteryjny ALA-PDT na S. aureus biofilm in situbiofilmy USA300 zwizualizowano za pom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

PDT jest dobrze przebadaną terapią w leczeniu raka od czasu jej wynalezienia ponad 100 lattemu18. W ciągu ostatniej dekady PDT była stosowana jako strategia przeciwdrobnoustrojowa i wykazała skuteczność przeciwko niektórym opornym na antybiotyki bakteriom chorobotwórczym12. W porównaniu ze stanem planktonowym, biofilmy bakteryjne wydają się być bardziej odporne na leczenie antybiotykami3, podczas gdy wpływ ALA-PDT na biofilmy nie został jeszcze w peł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez National Nature Science Foundation of China for Young Scholars (nr 81300810), Shanghai Young Doctor Training Program (nr 20141057) oraz National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 i 81571955). Chcielibyśmy podziękować LetPub (www.letpub.com) za pomoc językową podczas przygotowania tego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bulion sojowy tryptonowy (TSB)OXOIDCM0129B
Agar sojowy tryptonowy (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012Zestawy żywotności bakterii ALIVE/DEAD BacLight 
Jodek propidyny (PI)Thermo Fisher ScientificL7012Zestawy żywotności bakterii ALIVE/DEAD BacLight 
PancreatinSigma-AldrichP3292
Kwas 5-aminolewulinowy (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus szczep USA300//Źródło USA 300 referencje " Tenover FC, Goering RV. J Chemiogram przeciwdrobnoustrojowy. 2009 Wrzesień; 64(3):441-6".
Staphylococcus aureus szczepy kliniczne (C1-C3)//Wszystkie szczepy kliniczne wyizolowano od pacjentów z przewlekłym zapaleniem zatok przynosowych w Klinice Otorynolaryngologii-Chirurgii Głowy i Szyi, Szpitala Okulistycznego i Laryngologicznego Uniwersytetu Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-dołkowa mikropłytkaCorning Inc3599Przezroczyste mikropłytki z polistyrenu z płaskim dnem poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne
FluorodishNEST Biotechnology801001Szklane dno, niepirogenne
probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mlEppendorf0030120086
Eppendorf Mikrowirówka 5417EppendorfZ365998 |  Inkubator SIGMA
Thermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Wytrząsarki orbitalne
Dioda elektroluminescencyjna (LED)Wuhan Yage Technika optyczna i elektroniczna COLED-IB
Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop skaningowy Leica TCS SP8Leica Microsystems
Oprogramowanie Leica LAS AFLeica Microsystems
IMARIS oprogramowanieBitplane
stacjonarne

Bibliografia

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202(2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863(2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Jednostki tworz ce koloniekonfokalna mikroskopia skaningowabarwienie fluorescencyjneywotno bakteriitworzenie biofilmudzia anie przeciwdrobnoustrojowe

Powiązane artykuły