Ten manuskrypt opisuje protokół do badania przeciwbakteryjnego wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolewulinowego (ALA-PDT) na biofilm Staphylococcus aureus. Protokół ten może zostać wykorzystany do opracowania modelu in vitro w celu zbadania leczenia biofilmów bakteryjnych za pomocą PDT w przyszłości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolulinowego na biofilm Staphylococcus aureus
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Staphylococcus aureus (S. aureus) jest powszechnym ludzkim patogenem, który powoduje infekcje ropotwórcze i ogólnoustrojowe. Zakażenia gronkowcem złocistym są trudne do zwalczenia nie tylko ze względu na pojawienie się szczepów opornych na antybiotyki, ale także ze względu na jego zdolność do tworzenia biofilmów. Ostatnio terapia fotodynamiczna (PDT) została wskazana jako jedna z potencjalnych metod leczenia kontroli zakażeń biofilmem. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby poszerzyć naszą wiedzę na temat jego wpływu na biofilmy bakteryjne, a także mechanizmów leżących u jego podstaw. Manuskrypt ten opisuje model PDT in vitro z kwasem 5-aminolewulinowym (5-ALA), prekursorem właściwego fotosensybilizatora, protoporfiryny IX (PpIX). Krótko mówiąc, dojrzałe biofilmy S. aureus inkubowano z ALA, a następnie wystawiono na działanie światła. Następnie przeciwbakteryjne działanie ALA-PDT na biofilm S. aureus określono ilościowo, obliczając jednostki tworzące kolonie (CFU) i wizualizując je za pomocą barwienia fluorescencyjnego żywotności za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM). Reprezentatywne wyniki wykazały silne działanie przeciwbakteryjne ALA-PDT na biofilmy S. aureus. Protokół ten jest prosty i może być wykorzystany do opracowania modelu in vitro do badania leczenia biofilmów S. aureus za pomocą ALA-PDT. W przyszłości może być również przywoływany w badaniach PDT wykorzystujących inne fotouczulacze dla różnych szczepów bakterii przy minimalnych korektach.
Wprowadzenie
S. aureus jest ważnym patogenem Gram-dodatnim, który kolonizuje skórę i błonę śluzową ludzkich gospodarzy. Jego zdolność do tworzenia biofilmów jest uważana za ważny aspekt jego patogenezy1. Biofilmy bakteryjne to społeczność bakterii osadzona w samodzielnie wytworzonej matrycy, która składa się z zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych, w tym polisacharydu, DNA i białka. Matryca ta odgrywa znaczącą rolę w utrzymywaniu się infekcji bakteryjnych, przyczyniając się do wysokiego stopnia odporności na ludzki układ odpornościowy i obecne terapie przeciwdrobnoustrojowe2. Antybiotyki są nadal głównym sposobem lecze....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Tworzenie biofilmu
- Tworzenie biofilmu w 96-dołkowych mikropłytkach
- Pobrać szczep S. aureus USA300 i 3 szczepy kliniczne tworzące biofilm (C1 - C3) przechowywane w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Zdolność szczepów klinicznych do tworzenia biofilmów została określona za pomocą testu na płytce mikromiareczkowej opisanego wcześniej15. - Zaszczepić bakterię w 5 ml pożywki z bulionu sojowego z tryptonem (TSB) i hodować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc do fazy stacjonarnej.
- Odwirować nocną kulturę bakteryjną o sile 4 000 x g przez 10 minut w tempera....
- Pobrać szczep S. aureus USA300 i 3 szczepy kliniczne tworzące biofilm (C1 - C3) przechowywane w temperaturze -80 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Żywotność bakterii w biofilmach uległa zmniejszeniu po zastosowaniu terapii ALA-PDT w porównaniu z grupami kontrolnymi (ALA-LED-, ALA+LED- oraz ALA-LED+) zarówno w przypadku szczepu USA300, jak i trzech szczepów klinicznych (Rysunek 1).
Aby potwierdzić wyniki analizy CFU i zaobserwować efekt przeciwbakteryjny ALA-PDT na S. aureus biofilm in situbiofilmy USA300 zwizualizowano za pom.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
PDT jest dobrze przebadaną terapią w leczeniu raka od czasu jej wynalezienia ponad 100 lattemu18. W ciągu ostatniej dekady PDT była stosowana jako strategia przeciwdrobnoustrojowa i wykazała skuteczność przeciwko niektórym opornym na antybiotyki bakteriom chorobotwórczym12. W porównaniu ze stanem planktonowym, biofilmy bakteryjne wydają się być bardziej odporne na leczenie antybiotykami3, podczas gdy wpływ ALA-PDT na biofilmy nie został jeszcze w peł.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez National Nature Science Foundation of China for Young Scholars (nr 81300810), Shanghai Young Doctor Training Program (nr 20141057) oraz National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 i 81571955). Chcielibyśmy podziękować LetPub (www.letpub.com) za pomoc językową podczas przygotowania tego manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bulion sojowy tryptonowy (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Agar sojowy tryptonowy (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Zestawy żywotności bakterii ALIVE/DEAD BacLight |
| Jodek propidyny (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | Zestawy żywotności bakterii ALIVE/DEAD BacLight |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| Kwas 5-aminolewulinowy (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus szczep USA300 | / | / | Źródło USA 300 referencje " Tenover FC, Goering RV. J Chemiogram przeciwdrobnoustrojowy. 2009 Wrzesień; 64(3):441-6". |
| Staphylococcus aureus szczepy kliniczne (C1-C3) | / | / | Wszystkie szczepy kliniczne wyizolowano od pacjentów z przewlekłym zapaleniem zatok przynosowych w Klinice Otorynolaryngologii-Chirurgii Głowy i Szyi, Szpitala Okulistycznego i Laryngologicznego Uniwersytetu Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-dołkowa mikropłytka | Corning Inc | 3599 | Przezroczyste mikropłytki z polistyrenu z płaskim dnem poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Szklane dno, niepirogenne |
| probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Mikrowirówka 5417 | Eppendorf | Z365998 | Inkubator SIGMA | |
| Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Wytrząsarki orbitalne | |
| Dioda elektroluminescencyjna (LED) | Wuhan Yage Technika optyczna i elektroniczna CO | LED-IB | |
| Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop skaningowy Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Oprogramowanie Leica LAS AF | Leica Microsystems | ||
| IMARIS oprogramowanie | Bitplane |
Bibliografia
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
