Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka

Podsumowanie

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych endosferą Bacillus mycoides na wysięki z korzenia ziemniaka. Metoda ta ułatwia identyfikację ważnych genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje roślina-mikroorganizm i zasadniczo ma zastosowanie do innych endofitów i roślin, z niewielkimi dostosowaniami.

Streszczenie

Pożyteczne bakterie związane z roślinami odgrywają ważną rolę w promowaniu wzrostu i zapobieganiu chorobom roślin. Stosowanie ryzobakterii wspomagających wzrost roślin (PGPR) jako bionawozów lub środków kontroli biologicznej stało się skuteczną alternatywą dla stosowania konwencjonalnych nawozów i może zwiększyć wydajność upraw przy niskich kosztach. Interakcje między roślinami a mikroorganizmami zależą od sygnałów wydzielanych przez roślinę gospodarza i reakcji zachodzącej w tym procesie przez powiązane z nimi bakterie. Jednak mechanizmy molekularne, w jaki sposób pożyteczne bakterie reagują na związane z nimi sygnały pochodzenia roślinnego, nie są w pełni poznane. Ocena odpowiedzi transkryptomicznej bakterii na wysięki korzeniowe jest skutecznym podejściem do określania ekspresji i regulacji genów bakteryjnych w warunkach ryzosfery. Taka wiedza jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw interakcji między roślinami a mikroorganizmami. W artykule opisano szczegółowy protokół badania odpowiedzi transkryptomicznej szczepu B. mycoides EC18, wyizolowanego z endosfery ziemniaka, na wysięki z korzeni ziemniaka. Dzięki najnowszej technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości protokół ten może być wykonany w ciągu kilku tygodni i generować ogromne zbiory danych. Najpierw zbieramy wysięki korzeniowe w sterylnych warunkach, po czym dodaje się je do kultur B. mycoides. RNA z tych kultur jest izolowane metodą fenol/chloroform w połączeniu z komercyjnym zestawem i poddawane kontroli jakości za pomocą automatycznego przyrządu do elektroforezy. Po sekwencjonowaniu przeprowadzana jest analiza danych za pomocą internetowego potoku T-REx i identyfikowana jest grupa genów o zróżnicowanej ekspresji. Metoda ta jest użytecznym narzędziem ułatwiającym nowe odkrycia dotyczące genów bakteryjnych zaangażowanych w interakcje między roślinami a mikroorganizmami.

Wprowadzenie

Rośliny mogą wydzielać do 20% węgla związanego podczas fotosyntezy przez korzenie do ryzosfery¹, tj. wąska strefa gleby w pobliżu korzeni. Ze względu na większą dostępność składników odżywczych ryzosfera jest odpowiednim siedliskiem dla różnych mikroorganizmów, w tym bakterii wspomagających wzrost roślin. Wysięki korzeniowe zawierają szereg związków nieorganicznych, takich jak jony, kwasy nieorganiczne, tlen i woda. Jednak większość wysięków korzeniowych jest tworzona przez materiały organiczne, które można podzielić na związki o niskiej masie cząsteczkowej i związki o dużej masie cząsteczkowej. Związki o niskiej masie cząsteczkowej obejmują aminokwasy, kwasy organiczne, cukry, związki fenolowe, kwasy tłuszczowe i szereg metabolitów wtórnych. Związki o dużej masie cząsteczkowej składają się ze śluzu i białek^2,3. Mikroorganizmy ryzosfery mogą wykorzystywać niektóre z tych związków jako źródło energii do wzrostu i rozwoju. Wysięki korzeniowe odgrywają ważną rolę w kształtowaniu społeczności ryzobakterii, ponieważ związki wytwarzane przez rośliny w wysiękach mogą wpływać na zachowanie bakterii związanych z ryzosferą, wpływając na ekspresję określonych genów.

Zrozumienie reakcji bakterii na wysięki korzeniowe jest kluczowym krokiem w rozszyfrowaniu mechanizmów interakcji roślina-mikroorganizm. Ponieważ odpowiedź bakterii na interakcje roślina-mikroorganizm jest produktem zróżnicowanej ekspresji genów, można ją badać za pomocą analizy transkryptomu. Korzystając z tej metody, wcześniejsze badania zidentyfikowały kilka ważnych genów zaangażowanych w interakcje między roślinami a mikroorganizmami. U Pseudomonas aeruginosa wykazano, że geny zaangażowane w metabolizm, chemotaksję i wydzielanie typu II reagują na wysięki z korzenia buraka cukrowego⁴. Fan i wsp. ⁵ badał profilowanie transkryptomiczne B. amyloliquefaciens FZB42 w odpowiedzi na wysięki z korzeni kukurydzy. Ich wyniki pokazują, że spośród genów silnie indukowanych przez wysięki korzeniowe, kilka grup jest zaangażowanych w szlaki metaboliczne związane z wykorzystaniem składników odżywczych, chemotaksją, ruchliwością i nierybosomalną syntezą peptydów przeciwdrobnoustrojowych i poliketydów.

Dokładność tych badań zależy od zbioru wysięków korzeniowych. Chociaż kilka metod opisało zbieranie wysięków korzeniowych do różnych celów, albo wymagają one wyrafinowanych instrumentów, albo nie są wykonywane w dobrze kontrolowanych warunkach^6,7,8. Co więcej, mikroorganizmy hamujące ryzosferę mogą wpływać na skład wysięku korzeniowego, wpływając na przepuszczalność błony komórkowej roślin i uszkadzając tkanki korzeniowe, szczególnie w przypadku konsorcjów mikroorganizmów⁹. Badając reakcję mikrobiologiczną na wysięki korzeniowe, ważne jest, aby używać dobrze zdefiniowanych warunków, aby uniknąć zmiany związków przez inne mikroorganizmy¹⁰. Ponadto do badań transkryptomu opartych na sekwencji RNA wymagana jest wysokiej jakości RNA. Jednak w przypadku szczepów niebędących modelami bakteryjnymi, standardowe protokoły lub zestawy komercyjne zwykle mają niską skuteczność ze względu na nieznane czynniki lub specjalne właściwości wzrostu.

Opisany tutaj protokół został zweryfikowany przy użyciu B. mycoides, który jest Gram-dodatnim, tworzącym przetrwalniki bakterią z gromady Firmicute. Jest wszechobecny w ryzosferze różnych gatunków roślin. Dla tego gatunku opisano kilka właściwości wspomagających wzrost roślin, w tym indukcję systematycznej odporności (ISR) u buraka cukrowego¹¹, hamowanie patogenu Pythium dla ogórka¹², a także wiązanie azotu w ryzosferze słonecznika¹³. Jednak mechanizmy molekularne jego interakcji z rośliną żywicielską nie są dobrze zbadane.

Celem prezentowanych tutaj eksperymentów jest zbadanie transkryptomicznej odpowiedzi izolowanych przez endosferę B. mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka. Krótko mówiąc, protokół składa się z następujących kroków: najpierw zbierz wysięki z korzeni ziemniaków w sterylnych warunkach. Następnie wyekstrahuj wysokiej jakości RNA z komórek bakteryjnych potraktowanych wysiękami korzeniowymi. Ostatnim krokiem jest analiza danych przy użyciu internetowego potoku T-REx¹⁴. Protokół ten został wykorzystany do identyfikacji genów B. mycoides, które wykazują zmianę poziomów ekspresji w kontakcie z wysiękami korzeniowymi, a tym samym mogą odgrywać ważną rolę w interakcjach między roślinami a mikroorganizmami.

Protokół

1. Kiełkujący ziemniak w warunkach sterylizacji

1. Opłucz powierzchnię ziemniaka sterylną wodą. Kąpać ziemniaki w 70% etanolu, a następnie w 3% podchlorynie sodu, przez 5 minut każde. Spłucz go ponownie sterylną wodą, aby usunąć pozostały podchloryn sodu.
2. Przygotuj materiały potrzebne do kiełkowania i uprawy bulw ziemniaka; wysterylizuj plastikowe doniczki, kosze do szczepienia, wermikulit i wodę, sterylizując je w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie użyte materiały nadają się do sterylizacji w autoklawie. W przeciwnym razie użyj innych metod sterylizacji.
3. Włóż wysterylizowanego powierzchniowo ziemniaka do kosza do szczepienia i umieść go w autoklawowanym doniczce zawierającej mokry wermikulit.
4. Przechowywać garnek w komorze klimatycznej w temperaturze 24 °C przez trzy tygodnie. Ustaw go na cykle 16 godzin światła (120 μmol ^{m-2 s-1}) i 8 godzin ciemności. Aby uniknąć zanieczyszczeń mikrobiologicznych, użyj dużego pudełka z włókna szklanego do przykrycia doniczki.

2. Zbieranie wysięków z korzenia ziemniaka

1. Gdy pędy wykiełkują, przenieś kosz z całym ziemniakiem do wysterylizowanej zlewki wypełnionej 150 ml autoklawowanej wody dejonizowanej, z bulwami ziemniaka umieszczonymi tuż nad powierzchnią wody i korzeniami zanurzonymi w wodzie (patrz Rysunek 1). Trzymaj sadzonkę w komorze klimatycznej i używaj tych samych ustawień co poprzednio [24 °C; cykle po 16 godzin światła (120 μmol ^{m-2 s-1}), 8 godzin ciemności].
2. Od drugiego dnia należy zbierać wodę zawierającą wysięk i ponownie napełniać zlewkę sterylną wodą dejonizowaną. Pobieranie próbek należy wykonywać codziennie do siódmego dnia po przeniesieniu sadzonki.
3. Każdą próbkę należy przechowywać oddzielnie w temperaturze 4 °C. Dla każdej próbki rozprowadź 100 μl na płytce agarowej Luria-Bertani (LB; 1% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl), aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Wyrzucić zanieczyszczone próbki.
4. Połączyć pobrane próbki z jednej sadzonki i zagęścić je poprzez liofilizację w temperaturze -40 °C do końcowej objętości 150 ml.

3. Rozwój bakterii

1. Szczep B. mycoides należy przesiać z bulionu glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową LB i inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez noc.
2. Zaszczepić płynną pożywkę LB pojedynczą kolonią z płytki i hodować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze 30 °C.

4. Leczenie i pobieranie próbek bakterii

1. Aby porównać krzywą wzrostu bakterii traktowanych wysiękami korzeniowymi z kontrolą ujemną, należy przygotować serię kolb zawierających 50 ml płynnego podłoża LB. Dodać 0,5 ml nocnej kultury bakteryjnej do wszystkich kolb i dodać odpowiednio 0%, 5%, 10% lub 15% (v/v) wysięk z korzeni lub sterylną wodę dejonizowaną do pożywki.
2. Użyj kultury z wodą dejonizowaną zamiast wysięków korzeniowych jako kontroli. Następnie mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) co 1 godzinę. Wygeneruj krzywą wzrostu, wykreślając wartości OD₆₀₀ w funkcji czasu.
   UWAGA: Zaobserwowaliśmy, że 10% wysięków korzeniowych nie wpłynęło na wzrost B. mycoides (patrz Rysunek 2); stosunek ten został wykorzystany w eksperymentach z sekwencją RNA.
3. Rozcieńczyć nocną kulturę B. mycoides 90 ml wstępnie podgrzanej pożywki LB do początkowej OD₆₀₀ ~ 0,05 w kolbie o pojemności 300 ml. Dodać 10 ml wysięku korzeniowego do kultury i inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę.
4. Użyj 10 ml sterylnej wody dejonizowanej jako kontroli. Zebrać komórki z hodowli przez odwirowanie w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i natychmiast zamrozić osad w ciekłym azocie, a następnie przechowywać go w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

5. Izolacja RNA

UWAGA: Przed rozpoczęciem izolacji, przygotuj stół warsztatowy, stojaki i pipety, czyszcząc je roztworem do dekontaminacji RNazy (zobacz Tabelę Materiałów). Przez cały czas noś rękawiczki i upewnij się, że wszystkie rurki, końcówki i roztwory są wolne od RNaz. Jeśli to możliwe, próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.

1. Dodaj 0,1% (v/v) pirowęglanu dietylu (DEPC) do ultraczystej wody (100 μl DEPC na 100 ml roztworu), dobrze wymieszaj i przechowuj w temperaturze pokojowej przez noc. Mieszaninę należy sterylizować w autoklawie, aby dezaktywować DEPC po całonocnym leczeniu. Użyj tej ultraczystej wody uzdatnionej DEPC do przygotowania buforu TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8); 1 mM EDTA] i 10% roztworu SDS (w/v).
2. Rozmrozić granulki komórek na lodzie i zawiesić je w 400 μl buforu TE (DEPC). Przenieść zawiesiny do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml.
3. Zmieszać 300 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (24:1 v/v) i 300 μl fenolu (fenol kwasowy, klasa RNA) i odstawić mieszaninę na 5 minut. Weź 500 μl górnej fazy organicznej, aby dodać ją do zawieszonych komórek. Następnie do probówki dodaj 50 μl 10% SDS i 0,5 g kulek szklanych (0,5 μm).
4. Mocno zamknij nakrętkę i umieść probówkę w homogenizatorze z młynkiem perełkowym (patrz Tabela materiałów). Wykonaj homogenizację impulsową trwającą 3× 45 s z 1-minutowym odstępem na lodzie.
5. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 11 000 x g (4 °C) i przenieść górną fazę do nowej probówki.
6. Dodać 500 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (24:1) do górnej fazy z kroku 5.5 i odwirować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 11 000 x g (4 °C).
   UWAGA: Poniższe kroki zostały zmodyfikowane na podstawie instrukcji producenta komercyjnego zestawu do izolacji RNA na bazie filtra z włókna szklanego (patrz Tabela materiałów).
7. Przenieść 500 μl górnej fazy do świeżej probówki, dodać 2 objętości (1 ml) buforu do lizy/wiązania i wymieszać pipetując w górę i w dół.
8. Połączyć probówki filtrujące i zbiorcze (z zestawu do izolacji RNA) i odpipetować mieszaninę z kroku 5.7 do probówki filtrującej. Odwirować probówki przez 15 s przy 8 000 x g i odrzucić przepływ.
9. Przygotować probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml ze 100 μl buforu DNazy, 10 μl DNazy I i 5 μl inhibitora RNazy (patrz tabela materiałów). Dodać przygotowaną mieszaninę roztworu na filtr rurki filtracyjnej i inkubować przez 20 - 30 minut w temperaturze 15-25 °C.
10. Czynności prania należy wykonywać zgodnie z instrukcją producenta. Użyj 50 μl buforu elucyjnego do elucji RNA.
11. Zachowaj eluowany RNA w temperaturze -80 °C i umieść wokół niego plastikową folię parafinową. W tym samym czasie przenieś kilka mikrolitrów próbki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml w celu przeprowadzenia kontroli jakości.

6. Kontrola jakości RNA i sekwencjonowanie

1. Sprawdź RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
   UWAGA: Współczynniki absorbancji przy 260/280 powinny być powyżej 1,8, a proporcje przy 260/230 powinny być wyższe niż co najmniej 1,8, najlepiej powyżej 2,0.
2. Uruchom oczyszczony RNA w automatycznym przyrządzie do elektroforezy, korzystając z zalecanego zestawu do analizy RNA (patrz Tabela materiałów); liczba integralności RNA (RIN) musi być co najmniej wyższa niż 7, aby kontynuować.
3. Użyj całkowitej ilości 3 μg RNA na próbkę, aby wygenerować biblioteki z zestawem do przygotowania biblioteki RNA-Seq (patrz Tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.
   UWAGA: Przygotowania biblioteki zostały zsekwencjonowane na platformie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i wygenerowano odczyty sparowanych końców.

7. Analiza danych za pomocą internetowego potoku T-REx

1. Wykonaj filtrowanie jakości za pomocą FASTX-Toolkit w wersji 0.0.13 (wyniki jakości Phred > 20). Przytnij surowe odczyty RNA-Seq z sekwencji adaptera za pomocą narzędzia Trimmomatic.
   UWAGA: Wszystkie dalsze analizy opierały się na czystych danych o wysokiej jakości.
2. Pobierz bazę danych genomu NCBI B. mycoides ATCC 6462 (numer dostępu do NCBI: CP009692.1) i użyj jej jako genomu referencyjnego do mapowania czystych odczytów za pomocą Bowtie2/2.2.3.
3. Użyj HTSeq v0.6.1, aby policzyć liczby odczytów zmapowanych do każdego genu oraz odczyty na kilobazę transkryptu na milion zmapowanych odczytów (RPKM) każdego genu na podstawie długości genu i liczby odczytów zmapowanych na ten gen
.
4. Do analizy danych za pomocą potoku T-REx należy użyć tabeli RPKM jako danych wejściowych, a także trzech plików opisowych: (i) pliku czynników do opisania eksperymentu w czynnikach, (ii) pliku kontrastów do określenia, które czynniki będą porównywane pod kątem różnicowej ekspresji genów oraz (iii) pliku klas do opisania grup genów będących przedmiotem zainteresowania.
   UWAGA: Pliki opisowe są in.txt formatu. Przykłady można znaleźć na stronie internetowej T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Szczegółową instrukcję analizy danych za pomocą T-REx można znaleźć w poprzedniej publikacji de Jong i wsp.¹⁴.

Wyniki

Mikroorganizmy stowarzyszone z roślinami mogą pozytywnie wpływać na ich wzrost i zdrowie. Jednak mechanizmy złożonych interakcji między roślinami a ich symbiontami mikrobiologicznymi nie są w pełni zrozumiałe. Eksudaty korzeniowe odgrywają istotną rolę w regulacji aktywności i zachowania bakterii ryzosferowych; powszechnie zakłada się, że kolonizacja korzeni przez mikroby rozpoczyna się od ich przyciągania przez eksudaty. Celem niniejszej pracy było zbadanie odpowiedzi transkrypcyjnej bak...

Dyskusja

Przypuszcza się, że interakcje między roślinami a mikroorganizmami są determinowane przez precyzyjnie dostrojoną równowagę między bakteriami a roślinami. Takie interakcje są bardzo złożone i trudne do zbadania w naturalnym systemie, który obejmuje różne gatunki drobnoustrojów, potencjalnie działające jako konsorcja. W artykule opisano uproszczony protokół badania odpowiedzi bakterii na wysięki korzeniowe w dobrze kontrolowanych warunkach. Profil transkryptomu ryzobakterii, po ekspozycji na wysięki korzeniowe, dostarcza s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
podchloryn sodu	Sigma	CAS: 7681-52-9	10-15%  aktywny chlor
			Luria-Bertani (LB)
	New Brunswick Scientific	Innova 4000
spektrofotometr	Thermo Fisher Scientific	Genesys 20
kulki szklane z ciekłego azotu
	Sigma	G8893	0,5 i mikro;
m Probówka 2,0 ml z nakrętką			RNaz
1,5 ml i 2,0 ml probówka			bez RNaz
Homogenizator młynka kulkowego	Wirówka do	Mini_beadbeater	607
	Eppendorf	5430
Pirowęglan dietylu (DEPC)	sigma	CAS: 1609-47-8
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	sigma	CAS: 151-21-3	10% roztwór przygotowany z wodą MQ uzdatnioną DEPC
Bufor			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH = 8
fenol	Sigma		RNA klasy
chloroform-izoamyl alkohol			Przygotuj 24:1 chloroformu: alkohol izoamylowy, przechowywać w temperaturze pokojowej
Zestaw do izolacji RNA o wysokiej czystości Roche		11828665001
Roztwór do dekontaminacji RNazy	Invitrogen	AM9780	RNaza-Zap
Automatyczny przyrząd do elektroforezy	Bioanalizator Agilent	2100
Spektrofotometr mikroobjętościowy	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop ND-1000
	Zestaw Agilent	RNA 6000 Nano
Inhibitor RNazy	Thermo Fisher Scientific	RiboLock
Biblioteka kierunkowego RNA Zestaw przygotowawczy	NEB	Ultra	Dla Illumina

Inkubator bulionowy Bez eppendorf BioSpec TE Zestaw do analizy jakości RNA