Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57609

⸱

7 października 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Streszczenie

Od prawie 40 lat iniekcja projądrowego DNA stanowi standardową metodę generowania transgenicznych myszy z losową integracją transgenów. Taka rutynowa procedura jest szeroko stosowana na całym świecie, a jej głównym ograniczeniem jest słaba skuteczność integracji transgenów, co skutkuje niską wydajnością zwierząt założycielskich. Tylko kilka procent zwierząt urodzonych po implantacji zapłodnionych oocytów, którym wstrzyknięto implant, zintegrowało transgen. W przeciwieństwie do tego, wektory lentiwirusowe są potężnymi narzędziami do integracyjnego transferu genów, a ich zastosowanie do transdukcji zapłodnionych oocytów pozwala na wysoce wydajną produkcję założycielskich myszy transgenicznych ze średnią wydajnością powyżej 70%. Co więcej, każdy szczep myszy może być wykorzystany do produkcji transgenicznego zwierzęcia, a penetracja ekspresji transgenu jest niezwykle wysoka, ponad 80% w przypadku transgenezy za pośrednictwem lentiwirusa w porównaniu z mikroiniekcją DNA. Wielkość fragmentu DNA, który może być przenoszony przez wektor lentiwirusowy, jest ograniczona do 10 kb i stanowi główne ograniczenie tej metody. Stosując prostą i łatwą do wykonania procedurę iniekcji pod osłonką przejrzystą zapłodnionych oocytów, podczas jednej sesji mikroiniekcji można wyprodukować ponad 50 zwierząt założycielskich. Taka metoda jest wysoce przystosowana do przeprowadzania, bezpośrednio u zwierząt założycielskich, badań nad szybkim przyrostem i utratą funkcji lub do badań przesiewowych regionów genomowego DNA pod kątem ich zdolności do kontrolowania i regulowania ekspresji genów in vivo.

Wprowadzenie

Pionierska praca Gordona i in. z 1980 roku pokazała, że po implantacji u myszy w pseudociąży, wstrzyknięcie plazmidowego DNA do męskich przedjądrzy zapłodnionych oocytów może spowodować produkcję transgenicznych zwierząt, które zintegrowały plazmidowe DNA1. Wykazanie, że można wyhodować transgeniczne ssaki, miało ogromny wpływ na światowe nauki przyrodnicze, otwierając drogę do nowych dziedzin badań zarówno w naukach podstawowych, jak i translacyjnych naukach biomedycznych. W ciągu ostatnich czterech dekad mikroiniekcja DNA stała się rutynową praktyką. Chociaż wyprodukowano ogromną liczbę myszy transgenicznych, standardowa metoda nie jest w pełni użyteczna dla wszystkich szczepów myszy i wymaga czasochłonnych krzyżówek wstecznych2,3. Jego zastosowanie do innych gatunków pozostaje wyzwaniem4, a ogólna wydajność integracji transgenu jest ograniczona do kilku procent urodzonych zwierząt5. Ponadto skuteczność integracji transgenu stanowi czynnik ograniczający, który wyjaśnia słabą ogólną wydajność wstrzykiwania projądrkowego DNA. Pod tym względem integracyjne wektory wirusowe są najbardziej wydajnymi narzędziami do transportu i integracji transgenów, a zatem mogą zapewnić nowe środki do znacznego zwiększenia wydajności integracji, przy czym jedynym ograniczeniem jest to, że rozmiar transgenu nie może przekraczać 10 kb6.

wektory lentiwirusowe pseudo-typowane białkiem otaczającym wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) są pantropicznymi i wysoce integracyjnymi narzędziami transferu genów i mogą być używane do transdukcji zapłodnionych oocytów7. Osłonka przejrzysta otaczająca oocyty stanowi naturalną barierę wirusową i musi zostać przekroczona, aby umożliwić transdukcję z wektorami lentiwirusowymi. Zwierzęta transgeniczne zostały wygenerowane przez transdukcję zapłodnionych oocytów po mikrowierceniu lub usunięciu osłony przejrzystej8,9. Jednak wstrzyknięcie poniżej osłonki przejrzystej w przestrzeni perywitelowej wydaje się być najprostszą metodą transdukcji zapłodnionych jaj, jak początkowo opisali Lois i współpracownicy7.

Wstrzykiwanie wektorów lentiwirusowych w periwitellinie pozwala na uzyskanie wysokich plonów w produkcji zwierząt transgenicznych, które stanowią ponad 70% urodzonych zwierząt. Taki plon jest ponad 10-krotnie wyższy niż najlepszy plon, jaki można osiągnąć przy użyciu standardowej iniekcji DNA z przedjądrza7,10,11. W tym kontekście, pojedyncza sesja zastrzyków wygeneruje co najmniej 50 transgenicznych założycieli (F0). Duża liczba założycieli jest zatem zgodna z fenotypowaniem efektu transgenu wykonywanym bezpośrednio na myszach F0 bez konieczności generowania transgenicznych linii myszy. Ta zaleta pozwala na szybkie badania przesiewowe efektu transgenu i jest specjalnie przystosowana do przeprowadzania badań in vivo nad przyrostem i utratą funkcji w ciągu kilku tygodni. Ponadto regulatorowe elementy DNA mogą być również szybko badane przesiewowo w celu mapowania wzmacniaczy i motywów DNA związanych czynnikami transkrypcyjnymi11,12. W przypadku wstrzyknięć projądrkowych transgeny zwykle integrują się jako wiele kopii w unikalnym locus. W przypadku wektorów lentiwirusowych integracja zachodzi w wielu loci jako pojedyncza kopia na locus10,13. W związku z tym mnogość zintegrowanych loci jest najprawdopodobniej związana z bardzo wysoką penetracją ekspresji obserwowaną u transgenicznych założycieli, co sprawia, że nowo wygenerowany model jest bardziej odporny.

Ważne, podczas korzystania z iniekcji projądrowej DNA, wizualizacja przedjądrzy podczas procedury jest absolutnie wymagana. To ograniczenie techniczne uniemożliwia wykorzystanie zapłodnionych oocytów pochodzących z wielu różnych szczepów myszy. W związku z tym wytworzenie modelu transgenicznego w określonym szczepie, dla którego przedjądrza są niewidoczne, wymaga produkcji zwierząt w szczepie permisywnym, po którym następuje co najmniej 10 kolejnych krzyżówek wstecznych w celu przeniesienia transgenu w pożądanym szczepie myszy. W przypadku iniekcji wektora lentiwirusowego przestrzeń okołowitelowa jest zawsze widoczna, a wstrzyknięcie nie wymaga bardzo specyficznych umiejętności. Na przykład, transgeniczne myszy NOD/SCID, które nie nadają się do wstrzyknięcia przedjądrza, uzyskano za pomocą iniekcji wektora wirusowego14.

Tutaj przedstawiono kompleksowy protokół umożliwiający prostą produkcję transgenicznych myszy za pomocą iniekcji wektorów lentiwirusowych w przestrzeni periwitelinowej zarodka w jednym stadium komórkowym. Ekspresja transgenu kontrolowana za pomocą wszechobecnych lub specyficznych dla komórki promotorów jest szczegółowo opisana.

W tym badaniu użyto szkieletu lentiwirusowego pTrip ΔU315. Wektor ten pozwala na wytwarzanie wadliwych wektorów lentiwirusowych z wadą replikacji, w których sekwencja U3 została częściowo usunięta w celu usunięcia aktywności promotora U3 i wygenerowania wektora samoinaktywującego (SIN)16. Stada wektorów lentiwirusowych wyprodukowano przez przejściową transfekcję komórek HEK-293T z plazmidem enkapsulacyjnym p8.91 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G kodującym wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) glikoproteina-G17 i wektor rekombinowany pTRIP ΔU3. Szczegółowa procedura produkcji jest podana jako metody uzupełniające.

Produkcja wektorów lentiwirusowych o wysokim mianie odbywa się w warunkach bezpieczeństwa biologicznego II poziomu (BSL-2). Dotyczy to większości transgenów, z wyjątkiem onkogenów, które muszą być wytwarzane w BSL-3. Dlatego produkcja w warunkach BSL-2 w większości przypadków jest wystarczająca. Ponadto dla większości krajowych agencji regulacyjnych zajmujących się organizmami modyfikowanymi genetycznie (GMO) stosowanie i produkcja są zwykle nierozłączne. Ograniczone ilości niekompetentnych do replikacji wektorów lentiwirusowych SIN (poniżej 2 μg białka kapsydu p24) mogą być stosowane w warunkach BSL-1 opisanych przez francuską agencję ds. GMO zgodnie z zaleceniami Unii Europejskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury obejmujące pracę ze zwierzętami uzyskały aprobatę etyczną i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Badań i Edukacji pod numerem APAFIS#5094-20 16032916219274 v6 i 05311.02. Zakład hodowli zwierząt ICM PHENOPARC został akredytowany przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa pod numerem akredytacji B75 13 19. Ogólny protokół wymaga wykonania każdej procedury w precyzyjnym przedziale czasowym, który jest podsumowany w Rysunek 1.

1. Zakup i przygotowanie podstawowych związków przez zwierzęta

  1. Skup zwierząt
    1. Zamów 25 samców po wazektomii B6CBAF1/JRj, które mają 8 tygodni (pokolenie F1 z oryginalnych krzyżówek ♀C57Bl/6JRj i ♂CBA/JRj).
      UWAGA: Po przyjeździe należy odizolować samce. Samce poddane wazektomii mogą być ponownie używane przez co najmniej rok.
      Zmieniaj klatki co 3 tygodnie.
    2. Zamów 50 samic B6CBAF1/JRj, które ukończyły 10 tygodni i utrzymuj pulę co najmniej 50 zwierząt.
    3. Zamów 10-15 płodnych samców C57BL/6JRj w wieku 8 tygodni.
    4. Zamów 30 samic C57BL/6JRj w wieku 4 tygodni
      5. .
  2. Anestezjologia i eutanazja
    1. Znieczulenie wykonuje się przy użyciu objętości 300 μl mieszaniny ketaminy/ksylazyny, wstrzykiwanej dootrzewnowo (ketamina w dawce 150 μg/g m.c., ksylazyna w dawce 0,15 μg/g m.c.). Zwierzęta umieszcza się pod poduszką grzewczą w celu dostosowania temperatury ciała. Sprawdź odruchy, szczypiąc ogon zwierzęcia przed rozpoczęciem zabiegu.
    2. Eutanazji dokonywano przez zwichnięcie szyjki macicy. Dekapitacja została uwzględniona jako drugorzędna metoda potwierdzania śmierci zwierzęcia. Eutanazji embrionów dokonywano przez ścięcie.
      UWAGA: Po przyjeździe należy zapewnić zwierzętom co najmniej 1 tydzień na przyzwyczajenie się do obiektu (bez obchodzenia się z nimi i krycia). Co ważne, wszelkie szczepy myszy, w tym linie transgeniczne, mogą być wykorzystywane jako płodne samce i płodne samice do superowulacji. Wybór szczepu powinien być dokonany zgodnie z wymaganiami pytania naukowego.
  3. Przygotowanie hormonów
    1. Dodać 910 μl buforu PSMG (gonadotropina surowicy klaczy w ciąży) do 1 liofilizowanej fiolki PMSG, przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Każda porcja zawiera 55 UI dla 11 myszy. Nigdy nie przechowuj podwielokrotności PMSG dłużej niż 2 tygodnie po pierwszym użyciu.
    2. Dodaj 2730 μl buforu hCG (ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej) do 1 liofilizowanej fiolki hCG. Przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Każda porcja zawiera 55 UI dla 11 myszy.
  4. Preparat hialuronidazy
    1. Rozpuścić 1 fiolkę hialuronidazy w 3 ml pożywki M2 w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml i uzyskać 50 μl podwielokrotności. Następnie przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawu.

2. Superowulacja dawczyń płci żeńskiej

  1. W pomieszczeniu dla zwierząt stosującym 12-godzinne cykle dzień-noc wstrzyknąć PMSG o godzinie 14:00 w dniu -3. Wstrzyknij hCG o godzinie 12 w dniu -1 i kojarz się z płodnymi samcami zaraz po wstrzyknięciu hCG.
  2. W dniu -3 dodać 1 ml sterylnego 0,9% roztworu NaCl do 1 podwielokrotności 100 μl PMSG (55 UI). Wstrzyknąć 10 samic C57BL/6JRj 100 μl dootrzewnowo za pomocą strzykawki bez martwej objętości.
    UWAGA: Każda mysz otrzyma 5 UI PMSG.
  3. W dniu -1 dodać 1 ml sterylnego 0,9% roztworu NaCl do 1 podwielokrotności 100 μl hCG (55 UI). Myszy, które otrzymały wstrzyknięcie PMSG, wstrzyknąć dootrzewnowo 100 μl rozcieńczonego roztworu hCG (5UI). Użyć strzykawki bez martwej objętości. Wstrzyknięcie należy wykonywać powoli, odczekać przed wyjęciem igły, aby płyn nie wyciekł.
    UWAGA: Każda mysz otrzyma 5 UI hCG. Iniekcję hCG należy wykonać 46 godzin po PMSG.
  4. Umieść każdą samicę C57BL/6JRj w klatce samca reproduktora bezpośrednio po wstrzyknięciu hCG.
  5. Sprawdź zatyczki dopochwowe rano w dniu 0 i użyj dodatnich samic do zebrania zapłodnionych jaj.

3. Przygotuj B6CBAF1/jRj Pseudociężarne Samice

  1. Skryć jednego samca poddanego wazektomii dzień przed pobraniem komórek jajowych (dzień -1) z 2 samicami B6CBAF1/JRj o godzinie 17.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby kojarzyć się z samicami pochodzącymi z różnych klatek, aby uniknąć synchronizacji cykli samic. Zwiększy to wydajność uzyskiwania zatyczek dopochwowych. Ponadto nie należy dodawać samicy do klatki dla samców, która została zmieniona w ciągu ostatnich 2 dni. Skuteczność zachowań reprodukcyjnych u samca wzrasta, gdy klatka jest brudna.

4. Kolekcja zapłodnionych jaj

  1. preparat
    1. Dodać 1450 μl M2 do roztworu podstawowego hialuronidazy, aby przygotować roztwór roboczy hialuronidazy.
    2. Umieścić jedną kroplę 100 μl roztworu roboczego hialuronidazy na samicę użytą do produkcji zapłodnionych jaj na szalce Petriego o średnicy 100 mm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Dodać 500 μl M16 do płytek z 4 dołkami. Użyj 2 studzienek na rodzaj wektorów lentiwirusowych, które zostaną wstrzyknięte: jedna studzienka będzie zawierać wstrzyknięte jaja, a druga niewstrzyknięte. Umieścić 4 płytki dołkowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
      4. .
  2. Przygotować pipety do pobierania i obchodzenia się z zarodkami.
    1. Zmiękcz szklane kapilary hematokrytu (75 mm/60 μl), obracając środek rurki kapilarnej z twardego szkła w płomieniu.
    2. Usuń kapilary z ognia tak szybko, jak to możliwe i pociągnij, aby uzyskać rurkę o średnicy wewnętrznej około 300 μm. Pociągnij za schłodzoną rurkę, aby uzyskać zgrabną przerwę.
  3. Zbieraj jajowody.
    1. Poddać eutanazji samice C57BL/6JRj przez zwichnięcie szyjki macicy o 9 rano w dniu 0. Śmierć potwierdza się przez dekapitację.
      UWAGA: Ta metoda eutanazji została zatwierdzona przez IACUC i jest zgodna z zaleceniami europejskimi.
    2. Wykonaj duże poziome nacięcie, aby otworzyć jamę brzuszną nożyczkami. Jajowód znajduje się między macicą a jajnikiem.
    3. Usuń mezometrium i błonę niosącą wydatne naczynia krwionośne za pomocą zakrzywionych kleszczy.
    4. Oddziel jajowód od jajnika za pomocą zakrzywionych kleszczy.
    5. Użyj zakrzywionych kleszczy jako przewodnika, aby odciąć jajowód od jajnika za pomocą zakrzywionych nożyczek.
    6. Pociągnij jajowód i odetnij od macicy zakrzywionymi nożyczkami.
      Uwaga: Nie dotykaj spuchniętej bańki, w której znajdują się zapłodnione jaja. Całą procedurę należy wykonać za pomocą sterylnych narzędzi.
    7. Umieść wszystkie zebrane jajowody w pożywce M2 (naczynie hodowlane 35 mm) w temperaturze pokojowej
    8. Umieść 2 jajowody w tych samych 100 μl kropli roztworu roboczego hialuronidazy (0,3 mg/ml).
  4. Usuń komórki wzgórka z zapłodnionych jaj.
    1. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj 2 strzykawek insulinowych: pierwszej do przytrzymania jajowodu, a drugiej do rozerwania bańki i rozproszenia zapłodnionych jaj w roztworze roboczym hialuronidazy.
    2. Weź przygotowaną szklaną pipetę do zbierania jaj i podłącz ją do rurki i filtra 0,22 μm zamontowanego na ustniku, aby zassać wszystkie jaja. Zbierz wszystkie jajka i umyj je kolejno przechodząc do 6 różnych kropli po 100 μl pożywki M2.
    3. Umyte zapłodnione jaja umieścić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 w pożywce M16.

5. Produkcja pipet iniekcyjnych

  1. Użyj cienkościennej szklanej rurki kapilarnej (o długości 10-15 cm) o średnicy zewnętrznej 1 mm i zaciśnij tę kapilę w poziomym ściągaczu do mikropipet.
    UWAGA: W większości ściągaczy do pipet poziomych można regulować 3 parametry: moc cieplną, siłę ciągnięcia i opóźnienie czasowe między podgrzewaniem a wyciąganiem. Dostosuj te parametry, aby uzyskać pipety iniekcyjne, które przypominają tę przedstawioną na Rysunek 2A. W przypadku użytkowników, którzy rutynowo wykonują mikroiniekcję DNA, należy skorzystać ze standardowych ustawień i dostosować opóźnienie między podgrzewaniem a ciągnięciem, aby zmienić globalny kształt końcówki pipety.

6. Produkcja pipet do trzymania

  1. Użyj pipety do wstrzykiwań, aby przygotować pipetę podtrzymującą.
  2. Podłącz pipetę iniekcyjną do mikrokuźni. Przeciąć pipetę za pomocą mikrokuźni, aby uzyskać ostrą, symetryczną końcówkę o średnicy od 80 do 100 μm. Następnie wypoleruj końcówkę na gorąco na mikrokuźni, aby uzyskać symetryczny okrągły kształt bez ostrych żywopłotów.

7. Przygotowanie pipety iniekcyjnej zawierającej wektor lentiwirusowy

  1. Odwirować zawiesinę wektora lentiwirusowego o sile 160 x g przez 2 minuty w celu osadzenia szczątków często obecnych w zamrożonych zapasach lentiwirusa.
  2. Odzyskać supernatant i przenieść go do nowej probówki o pojemności 0,5 ml w komorze bezpieczeństwa klasy II.
  3. Przenieść 1 μl supernatantu do pipety iniekcyjnej przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 5 za pomocą mikroładowarki.
  4. Ustawić pipetę iniekcyjną na uchwycie narzędzia prawego mikromanipulatora. Podłączyć pipetę podtrzymującą do lewego mikromanipulatora.
    UWAGA: Miano transdukcji wektora lentiwirusowego będzie bezpośrednio skorelowane ze skutecznością produkcji założyciela. Aby uzyskać wysoką skuteczność (>70%), należy stosować wektory wirusowe o mianie w zakresie 100 ng białka kapsydu p24/μL. Gdy miano jest wyrażone w jednostkach transdukcji (TU), miano powinno wynosić powyżej10,9 TU/ml. Stada wektorów lentiwirusowych muszą być wytwarzane przez przejściową transfekcję komórek 293T z plazmidem enkasydacyjnym p8.91, pHCMV-G, kodującym wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) glikoproteina-G, jak opisano w metodach uzupełniających18.

8. Mikroiniekcja

  1. Dozować 8 μl podłoża M2 na środek szkiełka wgłębnego i zalać lekkim olejem parafinowym (badany na zarodkach), aby uniknąć parowania.
  2. Umieść 20 jaj w kropli tak jak najmniej rozproszonej.
    UWAGA: Nie rób bąbelków podczas deponowania zarodków.
  3. Upewnij się, że końcówka pipety iniekcyjnej jest otwarta. W przeciwnym razie postukaj w pipetę iniekcyjną pipetą przytrzymującą.
  4. Ustawić mikrowtryskiwacz na czas wstrzykiwania 20 s.
    UWAGA: Lepkość zawiesiny wirusa pozwala na wyraźną wizualizację dyspersji wektora wirusowego w przestrzeni periwiteliny. Ciśnienie iniekcji powinno być tak dostosowane, aby wypełnić całą przestrzeń w ciągu 20 s od wstrzyknięcia, co odpowiada objętości od 10 do 100 pL. Ciśnienie wtrysku nie powinno przekraczać 600 hPa.
  5. Odessać jedną zapłodnioną komórkę jajową, która zawiera 2 jądra pro i 2 ciała polarne, za pomocą pipety trzymającej pod mikroskopem stereoskopowym.
  6. Wstrzyknąć jajo za pomocą mikrowstrzykiwacza, stosując ustawienia opisane w ppkt 8.4, w przestrzeni perywitelinowej.
    UWAGA: Nie dotykać błony plazmatycznej pipetą do wstrzykiwań.
  7. Wstrzyknąć wszystkie zapłodnione jaja dostępne w partiach po 20 jaj i natychmiast umieścić wstrzyknięte jaja we wstępnie podgrzanym podłożu M16 w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2,
    UWAGA: Inkubować wstrzyknięte jaja przez co najmniej 30 minut po wstrzyknięciu przed transferem zarodków.

9. Przenoszenie zarodków do kobiet w ciąży rzekomej B6CBAF1/JRj

  1. Sprawdź korek kopulacyjny 16 godzin po kryciu samic B6CBAF1/JRj z samcami wazektomii B6CBAF1/JRj. Zrób to tuż przed rozpoczęciem zbierania jaj.
  2. Przygotować pipety implantacyjne dla wstrzykniętego zarodka.
    1. Wykonać pipety implantacyjne dla zarodków zgodnie z opisem pobierania i obchodzenia się z zarodkami (krok 4.2). Wybierać pipety o średnicy wewnętrznej około 150 μm z wąską częścią o długości około 4-5 cm.
      UWAGA: Końcówka powinna być polerowana płomieniowo, aby zmniejszyć ewentualne uszkodzenia jaj lub jajowodu.
      1. Napełnij lekkim olejem parafinowym (testowanym na zarodkach) tuż nad ramieniem pipety.
      2. Zassać mały pęcherzyk powietrza, następnie podłoże M2, a na końcu drugi pęcherzyk powietrza.
      3. Rysuj zarodki jeden za drugim, aby zminimalizować całkowitą objętość pożywki, która zostanie wstrzyknięta do jajowodu wraz z zarodkami.
      4. Na koniec nałóż bardzo małą kroplę lekkiego oleju parafinowego (testowanego na zarodkach) o szerokości około jednego zarodka.
        Przestroga: Podczas obchodzenia się z pipetą należy zachować ostrożność.
  3. Transfer zarodków.
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia.
    2. Znieczulić kobietę za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 300 μl sterylnego 0,9% roztworu NaCl zawierającego 150 μg na g masy ciała ketaminy i 0,15 μg na g masy ciała ksylazyny.
    3. Sprawdź głębokość znieczulenia, szczypiąc ogon zwierzęcia kleszczami i wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg środka przeciwbólowego (buprenorfiny) przed rozpoczęciem zabiegu.
    4. Ogolić 2 cm po obu stronach pleców wzdłuż rdzenia kręgowego na poziomie ostatniego żebra.
    5. Umieść samicę myszy na poduszce grzewczej i w sterylnym polu. Wytnij okienko o wymiarach 2 cm x 2 cm na środku pleców myszy.
    6. Nałóż roztwór antyseptyczny (10% jodku powidonu) na skórę i wykonaj 1 cm poprzeczne nacięcie nożyczkami, a następnie przesuń skórę na boki, aż jajnik (kolor pomarańczowy) będzie widoczny przez ścianę ciała.
    7. Wykonaj 5 mm nacięcie w ścianie ciała tuż nad jajnikiem cienkimi nożyczkami pod dwuokularowym mikroskopem chirurgicznym.
    8. Podnieś poduszeczkę tłuszczową za pomocą atraumatycznego zacisku buldoga i wyciągnij jajnik, jajowód i górną część macicy.
    9. Wizualizuj bańkę i wykonaj hemisekcję nożyczkami vannas na segmencie jajowodu, który łączy jajnik z bańką.
    10. Wprowadzić pipetę do transferu zarodków i wprowadzić komórki jajowe do bańki, zatrzymując się na pierwszym pęcherzyku powietrza w pipecie implantacyjnej.
    11. Powtórz procedurę na drugim jajowodzie.
    12. Zamknij skórę za pomocą klipsów do ran.
    13. Umieść zwierzę w komorze rekonwalescencji (39 °C, 30-60 min) do całkowitego wybudzenia.
    14. Powtórz wstrzyknięcie przeciwbólowe po 12 godzinach i 48 godzinach w przypadku wystąpienia objawów bólu lub niepokoju.
    15. Usuń klipsy do ran 7-10 dni po zabiegu.
    16. Sprawdzaj zagnieżdżone samice pod kątem ciąży, śledząc ich krzywą masy ciała co 3 dni po implantacji. Znaczny przyrost masy ciała można zaobserwować od 10 do 12 dni po implantacji, co wskazuje na ciążę.
      UWAGA: Wszystkie embriony, które będą się tutaj rozwijać, będą reprezentować domniemanych transgenicznych założycieli. Fenotyp tych założycieli może być analizowany na dowolnym etapie rozwoju lub po urodzeniu, zgodnie z pytaniem naukowym związanym z powstawaniem tych transgenicznych zwierząt.

10. Genotypowanie Transgeniczni założyciele

  1. Przygotować bufor genotypowy zawierający 10 mM Tris-HCl, pH 8; 5 mM EDTA, pH 8,0 z 0,2% SDS (w/v), 50 mM NaCl. Wysterylizuj bufor genotypowania przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
  2. Umieścić błony pozazarodkowe (w przypadku zarodków) lub mały kawałek ogona (w przypadku urodzonych zwierząt) w 500 μl przefiltrowanego buforu genotypującego i dodać 15 μl proteinazy K (20 mg/ml). Inkubować przez noc w temperaturze 55 °C.
  3. Odwirować lizat przy 15 000 x g przez 5 minut, a następnie użyć 1 μl supernatantu do reakcji PCR. Lizat można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  4. Przeprowadzić amplifikację PCR fragmentu transgenu w objętości reakcyjnej 20 μl zawierającej 1x bufor PCR, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,2 μM każdego startera PCR, 1 UI polimerazy DNA Taq i 1 μL każdej strawionej próbki. Jako kontrolę ujemną należy użyć 1 μlH2O. Jako kontrolę pozytywną użyj DNA z plazmidu wektora lentiwirusowego zawierającego transgen.
  5. Do wykrywania opisanego eGFP należy użyć:
    eGFP Forward Primer:5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP Podkład odwrotny: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Wykonaj amplifikację PCR w termocyklerze: 4 min w 94 °C, a następnie 35 cykli po 1 min w 94 °C, 1 min w 60 °C i 2 min w 72 °C.
  7. Załaduj produkt PCR na 2% żel agarozowy, aby uwidocznić produkt eGFP PCR o gęstości 300 pz, jak pokazano na Rysunek 2B.
    UWAGA: Wszystkie osoby wykazujące prążek PCR 300 pz mają zintegrowany transgen eGFP i mogą być uważane za transgeników.
  8. Analizuj ekspresję transgenów u zwierząt transgenicznych. Na przykład wykonaj barwienie histologiczne i immunologiczne, jak pokazano w Rysunek 3 i Rysunek 4 i opisane w metodach uzupełniających.
    UWAGA: Zarówno analiza ekspresji transgenu, jak i analiza fenotypu powinny być przeprowadzane przy użyciu odpowiednich metod zgodnie z globalnym pytaniem naukowym.

11. Kwantyfikacja liczby kopii transgenu

  1. Przygotowanie próbek DNA do ilościowego PCR.
    1. Wyodrębnij genomowe DNA (gDNA) z lizatu proteinazy K uzyskanego w kroku 10.3 za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Określić ilościowo gDNA za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 260 nm.
    3. Rozcieńczyć każdą próbkę gDNA do końcowego stężenia 10 ng/μl.
    4. Dla każdej próbki należy przygotować 5 seryjnych rozcieńczeń (1:5 ) wH2O, aby otrzymać 6 probówek o następujących stężeniach: 10 ng/μL, 2 ng/μL, 0,4 ng/μL, 0,08 ng/μL, 0,016 ng/μL i 0,0032 ng/μL
  2. Przygotować ilościową mieszaninę reakcyjną PCR (qPCR).
    1. Przygotuj mieszankę starterów do qPCR. Dla każdej pary starterów, która ma być użyta do qPCR, dodać 10 μl startera do przodu (100 μM roztworu podstawowego startera), 10 μL startera odwrotnego (100 μM) i 80 μl H2O.
      UWAGA: Aby wzmocnić eGFP, użyj starterów Forward TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA i Reverse TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG. Gen Cdx2 jest używany jako normalizator dla qPCR (2 kopie na genom). W przypadku normalizatora Cdx2 należy użyć starterów Forward GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG i Reverse GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT
    2. Przygotuj 2 mieszanki qPCR, jedną z mieszanką starterów eGFP i jedną z mieszanką starterów Cdx2. Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki qPCR, aby amplifikować 6 rozcieńczeń w duplikatach każdego gDNA. Jedna reakcja qPCR zawiera 3,8 μLH2O, 5 μL zielonej fluorescencyjnej mieszaniny reakcyjnej 2x i 0,2 μL mieszaniny starterów.
      UWAGA: Dla każdego badanego zwierzęcia transgenicznego zostaną przeprowadzone 24 reakcje qPCR. Mieszanina reakcyjna jest dostarczana dla 384-dołkowej maszyny qPCR.
    3. Dla każdego zwierzęcia do badania rozdziel: 12 dołków z 9 μl mieszanki eGFP qPCR i 12 dołków z 9 μl mieszanki Cdx2 qPCR. Dodać 1 μl każdego rozcieńczenia gDNA do 2 studzienek zawierających mieszaninę eGFP qPCR i 2 studzienek zawierających mieszaninę eGFP qPCR.
    4. Pozostaw 2 dołki dla każdej mieszaniny qPCR, w której gDNA zostało zastąpione przezH2Ojako kontrolę negatywną.
  3. Umieścić płytkę 384-dołkową w maszynie qPCR i zastosować następujący protokół działania: 10 minut w temperaturze 95 °C, następnie 50 cykli po 10 s w temperaturze 95 °C i 1 minuta w temperaturze 60 °C.
  4. Analizowanie danych. Dla każdego gDNA do przetestowania należy wykreślić wartości Ct jako funkcję logarytmu całkowitej ilości gDNA (6 punktów w duplikatach). Dopasuj krzywą za pomocą regresji liniowej metodę najmniejszych kwadratów i ekstrapoluj wartość Ct odpowiadającą przecięciu z osią y. Użyj ekstrapolowanych wartości Ct dla eGFP i znormalizowanego Cdx2, aby obliczyć liczbę kopii eGFP względem Cdx2 (2 kopie) przy użyciu standardowej metody 2ΔdCt11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zwierzęta transgeniczne wygenerowano zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem. Zilustrowano reprezentatywne wyniki zarówno dla powszechnej, jak i specyficznej dla typu komórek ekspresji transgenu.

Konstytutywna ekspresja transgenów

Promotory powszechne są podstawowymi narzędziami badawczymi służącymi do trwałej i wydajnej ekspresji transgenów. Promoto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj wstrzyknięcie wektorów lentiwirusowych do zapłodnionych oocytów spowodowało wytworzenie transgenicznych zarodków, które dały ponad 70% transgenicznych zarodków w stosunku do całkowitej liczby pobranych zarodków. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi raportami i ilustruje specyfikę procedury 2,7,10,11,12. Porównując wszystkie dane przedstawione w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Magali Dumont i Rolando Meloni za krytyczną lekturę manuskryptu oraz rdzeniom ICM iVector i Phenoparc za pomoc techniczną odpowiednio w produkcji wektorów lentiwirusowych i pomieszczeniach dla zwierząt. Prace te były wspierane przez Institut Hospitalo-Universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. otrzymała dofinansowanie dla Association de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) oraz wspólny grant JDRF / INSERM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PMSG 50UISigmaG4527
hCG 5000UISigmaCG5-1VL
NaClSigma7982
100 mm szalka PetriegoHotsher353003
4 dołki Miska NuncDutsher56469Miska IVF
M2 średniaSigmaM7167
M16 średniaSigmaM7292
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowyDutsher146611
Enzym hialuronidazy 30mgSigmaH4272testowany na zarodkach myszy
Serynge insulinowyVWR613-3867Terumo Myjector
Kleszcze zakrzywioneMoria2183
Nożyczki zakrzywioneMoriaMC26
Zestawy probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnychSigmaA5177-5EA
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoAparat HarvardaGC 100-10
Poziomy ściągacz do mikropipetNarishigePN-30
MicroforgeNarishigeMF-900
Mikroskop odwróconyNikonTransferman NK2 5188Wymagane
jest oświetlenie kontrastowe modulacji HoffmanaMikromanipulatorEppendorfCelltram air
Kontroler pipety trzymającejEppendorfFemtojet
Olej mineralnySigmaM8410badany na zarodkach myszy
MikrowstrzykiwaczEppendorfFemtojetMoże być używany do wstrzykiwania DNA lub wektorów wirusowych
Dumont # 5 kleszczeMoriaMC 40
vannas mikronożyczkiMoria9600
IsofluranecentravetISO005ISO-VET 100% 250ml
ocrygelcentravetOCR002
Povidone jodurecentravetVET001vetedine 120ml
BuprenorphinecentravetBUP002Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HClSigmaT5941Trizma chlorowodorek
EDTASigmaE9884
SDSSigma 436143
NaClSigmaS7653białkowaza w proszku
KSigmaP2308 
Zestaw oneTaqNEBM0480L
StarteryEurogentec
Pasek 8 probówek PCR4titude4ti-0781
96-dołkowy termocyklerApplied Biosystems4375786Veriti
Genomic DNA mini kitinvitrogenK1820-02
Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000C 
qPCR Master mixRoche4887352001SYBR Green 
Płytka wielodołkowa 384Przyrząd do
384 dołkowyRoche5015243001LightCycler 480
qPCR 5217555001 Roche

Bibliografia

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741(2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413(2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274(2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transgeneza lentiwirusowawstrzykni cie do przestrzeni periwitellinejzwierz ta za o ycielskiewektory lentiwirusowetechnika mikrowstrzykiwaniatransfer zarodk wsekcja jajowod wpo ywka M16po ywka M2
Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.