Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Streszczenie

Embrionalny kurczak jest powszechnie używany jako niezawodny organizm modelowy do rozwoju kręgowców. Jego dostępność i krótki okres inkubacji sprawiają, że idealnie nadaje się do eksperymentów. Obecnie badania nad tymi szlakami rozwojowymi w zarodku kurczaka prowadzone są poprzez stosowanie inhibitorów i leków w zlokalizowanych miejscach i w niskich stężeniach przy użyciu różnych metod. Hodowla tkanek in vitro jest techniką, która umożliwia badanie tkanek oddzielonych od organizmu gospodarza, przy jednoczesnym ominięciu wielu fizycznych ograniczeń występujących podczas pracy z całymi zarodkami, takich jak podatność zarodków na wysokie dawki potencjalnie śmiertelnych substancji chemicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli organotypowej do hodowli zarodkowej połowy głowy kurczaka in vitro, który stwarza nowe możliwości badania procesów rozwojowych wykraczające poza obecnie stosowane metody.

Wprowadzenie

Embrionalny kurczak (Gallus gallus) jest doskonałym organizmem modelowym, powszechnie używanym w dziedzinie biologii. Jego okres inkubacji wynosi około 21 dni, a wiele jaj może być inkubowanych jednocześnie, dzięki czemu eksperymenty są szybkie i skuteczne. Być może najważniejsze jest to, że zarodek jest również łatwy do manipulowania, co umożliwia szeroko zakrojone badania kluczowych procesów rozwojowych oraz genów i białek, które napędzają te procesy.

Embrionalne oko kurczaka to złożony narząd, który rozwija się poprzez interakcję wielu różnych tkanek, podobnych do wielu innych układów ciała. Metoda ta umożliwia badanie rozwoju tych tkanek, szczególnie w zaawansowanych stadiach rozwoju. Na przykład wielowarstwowa siatkówka może być szczególnie interesująca dla osób zajmujących się rozwojem układu nerwowego. Alternatywne metody, które umożliwiają badanie innych tkanek oka, takich jak rogówka, ciało szkliste, soczewka, twardówka i powieki, są korzystne dla naukowców. Oko zarodkowe kurczaka zawiera również szereg płaskich kości, kosteczek twardówkowych, które mogą być wykorzystane jako model do badania indukcji i kostnienia kości śródbłoniastej u kręgowców¹.

Obecnie istnieje wiele metod wykorzystywanych do badania rozwoju embrionalnego. Mikroiniekcje przeciwciał hamujących lub innych cząsteczek hamujących^2,3, chirurgicznie wszczepione mikrogranulki nasączone inhibitorem⁴, oraz elektroporacja⁵ to metody, które mogą być użyte do obniżenia poziomu genów lub białek będących przedmiotem zainteresowania w zarodku. Podobne metody stosuje się do zwiększania regulacji białek. Metody te nie są pozbawione ograniczeń. Na przykład, w przypadku stosowania substancji chemicznych w celu zmiany rozwoju embrionalnego, należy ocenić śmiertelny wpływ na zarodek, a to ogranicza stosowanie wyżej wymienionych metod do miejscowych miejsc stosowania w dawkach wystarczająco niskich, aby zapewnić przeżywalność zarodka.

Hodowla tkanek in vitro była stosowana w szerokim zakresie organizmów do badania rozwoju i może być wykorzystana do ominięcia niektórych z wyżej wymienionych ograniczeń. Na przykład, femora⁶, feather buds^7,8 i limbs⁹ kurczaka zostały przebadane przy użyciu metod hodowli tkankowej, podobnie jak jądra mouse¹⁰ oraz korzenie i łodygi roślin¹¹. Metody te zapewniają naukowcom wysoki stopień kontroli nad rozwojem tkanek, takich jak zdolność do wahań temperatury i zmiany dostępności składników odżywczych. Izolacja tkanki z całego zarodka sprawia również, że jest on znacznie mniej podatny na śmiertelne działanie chemikaliów, umożliwiając w ten sposób badania manipulacyjne na skalę globalną przy wyższych stężeniach. Kolejną godną uwagi zaletą hodowli in vitro jest zachowanie środowiska komórkowego tkanki; Układ tkanek pozostaje względnie niezmieniony, co umożliwia badanie interakcji między różnymi typami tkanek⁹. W związku z tym hodowla in vitro otwiera drzwi do dodatkowych podejść eksperymentalnych, które nie są dostępne w modelach in vivo lub in ovo.

Obecnie badanie rozwoju embrionalnego oka kurczaka za pomocą chemikaliów jest szczególnie trudne. Zarodek jest pokryty wieloma błonami pozazarodkowymi, co utrudnia stosowanie mikrogranulek lub chemikaliów; Zarodek jest również bardzo aktywny w jaju wraz z wiekiem, co jeszcze bardziej komplikuje i tak już trudną metodę. Protokół ten umożliwia łatwy dostęp do oka i otaczających go tkanek, eliminując te bariery, a jednocześnie dając nowe możliwości badania procesów rozwojowych w obrębie oka. Protokół ten został opracowany w celu zbadania indukcji kosteczek twardówkowych w obrębie oka zarodkowego.

Protokół

UWAGA: Dla stadiów zarodkowych użyj tabeli inscenizacji Hamburger and Hamilton¹² (HH).

1. Inkubacja zarodków

1. Inkubować zapłodnione jaja kurze w sterylnym inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 37 °C ± 1 °C i wilgotności ~40%.
2. Obracaj jaja 1 raz dziennie i pozwól im wysiadywać do HH34 (8 dni po zapłodnieniu).

2. Przygotowanie i sterylizacja materiałów

1. W przypadku 12 zarodków należy przelać w autoklawie 2 litry wody destylowanej, 1 l 0,85% soli fizjologicznej dla kurcząt, 12 szklanych pipet, 1 pudełko chusteczek papierowych, 24 kwadraty półporowatej bibuły filtracyjnej o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm i 24 kwadraty stalowej siatki drucianej o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm z krawędziami zakrzywionymi w dół. Aby wysterylizować materiały, należy je sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 15 minut.
   UWAGA: Autoklawowanie materiałów można wykonać z wyprzedzeniem.
2. Wysterylizuj inkubator 70% etanolem, wycierając boki, półki i drzwi. Umieść 2 plastikowe pojemniki zawierające autoklawowaną wodę destylowaną w inkubatorze, aby utrzymać wilgotność. Rozgrzej inkubator do hodowli do 37 °C ± 1 °C i wilgotności ~40%. Upewnij się, że inkubator jest całkowicie ciemny; Jeśli drzwi są przezroczyste, przykryj je folią aluminiową.
3. Podgrzej 100 ml pożywki i 1 ml penicyliny, umieszczając je w inkubatorze hodowli.
4. Przykryj miejsce pracy ręcznikiem papierowym i wysterylizuj ławkę, spryskując ją 70% etanolem. W podobny sposób wysterylizuj 2 pary kleszczy, nożyczki do wypreparowania, żyletkę i plastikową łyżkę z 70% etanolem.
5. Umieść na stole 12 sterylnych szalek Petriego o średnicy 100 mm i 24 sterylne szalki Petriego o średnicy 35 mm i 24 sterylne szalki Petriego o średnicy 35 mm. Upewnij się, że naczynia pozostają w sterylnej torbie do czasu użycia.

3. Przygotowanie zarodków

UWAGA: Od tego momentu noś ochronną maskę przeciwpyłową, aby uniknąć skażenia kultur. Infekcja bakteryjna lub grzybicza zrujnuje kulturę i istnieje ryzyko jej szybkiego rozprzestrzenienia się na wszystkie kultury w inkubatorze.

1. Rozbij jajo i przenieś zarodek na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 0,85% soli fizjologicznej dla kurcząt. Uporządkuj zarodek zgodnie z cechami anatomicznymi opisanymi w wytycznych dotyczących oceny stopnia zarodka Hamburgera i Hamiltona¹² i potwierdź, że zarodek ma HH34.
2. Przetnij szyję, a następnie przetnij głowę zarodka na pół w linii środkowej za pomocą wysterylizowanej żyletki. Za pomocą sterylnych kleszczy usuń mózg. Pozostaw dziób nienaruszony.

4. Konfiguracja kultury

1. Umieść 2 szalki Petriego o średnicy 35 mm wewnątrz jednej szalki Petriego o średnicy 100 mm.
2. Umieść stalową siatkę drucianą wewnątrz każdej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
3. Za pomocą kleszczy przenieś 1 z przeciętych na pół głów na kawałek półporowatej bibuły filtracyjnej o wymiarach 2,5 cm x 2,5 cm z okiem skierowanym do góry. Upewnij się, że chusteczka jest bezpieczna i nie zsuwa się po lekkim przechyleniu.
4. Za pomocą kleszczy ostrożnie umieść tkankę oka i bibułę filtracyjną na stalowej siatce drucianej na 1 z 35-milimetrowych szalek Petriego, tworząc podniesiony etap z tkanką oka na górze.
5. Powtórz kroki 4.3 i 4.4 z drugą połową głowy.
6. Za pomocą sterylnej szklanej pipety ostrożnie dodaj pożywkę bezpośrednio do każdej płytki Petriego o średnicy 35 mm, aż osiągnie poziom bibuły filtracyjnej. Nie zanurzaj połowy głowy w pożywce.
7. Dodać 50 μl 10 000 U/ml penicyliny-streptomycyny do pożywki na każdej szalce Petriego.
8. Złóż kawałek bibuły w mały kwadrat i umieść go w szalce Petriego o średnicy 100 mm. Zwilż go autoklawowaną wodą destylowaną.
9. Umieść naczynie hodowlane w sterylnym, ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 °C ± 1 °C i wilgotności ~40% przez okres do 4 dni.
10. Powtórz kroki 3 i 4 dla każdego zarodka.
    UWAGA: Liczba potrzebnych zarodków będzie zależeć od konkretnego eksperymentu; Tutaj opisujemy protokół dla 12 zarodków.

5. Utrzymanie kultury

1. Raz dziennie należy uzupełnić plastikowe pojemniki w inkubatorze świeżą, autoklawowaną wodą destylowaną.
2. Codziennie sprawdzaj wszystkie kultury pod kątem infekcji bakteryjnych lub grzybiczych. Kultury, które uległy rozpadowi lub w których podłoże zmieniło kolor, są zakażone. Wyrzuć wszystkie zainfekowane kultury.

6. Fiksacja

1. Po przeprowadzeniu hodowli wyjmij wszystkie szalki z inkubatora.
2. Za pomocą kleszczy delikatnie zdejmij oko z bibuły filtracyjnej, uważając, aby nie rozerwać tkanki.
3. Utrwalić tkankę oka w 4% paraformaldehydzie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez noc w temperaturze 4 °C lub w 10% neutralnie buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej.
4. Przechowywać tkankę w temperaturze 4 °C w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

Wyniki

Stosując tę metodę, embrionalne oko kurczaka można hodować in vitro przez 4 dni, począwszy od 8. dnia rozwoju (HH34). Cztery dni rozwoju in ovo odpowiadają stanowi HH38.

Ta metoda hodowli wspiera rozwój zawiązków piór wokół oka i na powiekach (Rycina 1B). Zawiązki piór te nie występują in ovo w stadium HH34 przed rozpoczęciem hodowli (Rycina 1A

Dyskusja

Protokół ten wykorzystuje uznane techniki hodowli tkankowej w celu osiągnięcia wzrostu oka kurczaka od 8 dnia embrionalnego (HH34) in vitro przez 4 dni. Ta metoda hodowli siatkowej została pierwotnie opisana przez^{Trowella 15}. Zoptymalizowaliśmy protokół z badania Pinto i Halla z 1991 roku¹⁶, wykorzystując półporowatą membranę z siatką do badania sygnałów indukcyjnych między oddzielonymi warstwami tkanek embrionalnego oka kurczaka¹⁵. Stosując...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego do hodowli komórkowych 35 mm	Corning	353001	łatwe do uchwycenia naczynie do hodowli tkankowych, polistyren, niepirogenne
Szalki Petriego 100 mm do hodowli komórkowych	Corning	353003	naczynie do hodowli tkankowych, polistyren, niepirogenna
bibułka papierowa	Kimtech	34155	Wycieraczki Kimtech Science Brand, 280 w kartonie
siatki drucianej	nie	dotyczy	siatka druciana ze stali nierdzewnej (rozmiar siatki 0,7 mm)
jednorazowe pipety szklane	VWR	14673-010	ze szkła borokrzemianowego 5 3/4 "
	Gibco	12591-038	Modyfikacja Fitton-Jackson, [+] L-glutamina z czerwienią fenolową (BGJB)
penicylina-streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4458	10000 jednostek/ml penicyliny filtr stabilizowany roztworem streptomycyny
papier	Whatman	1454 090	półporowata bibuła filtracyjna 90 mm
zapłodnione jaja	kurze Dalhousie University Agricultural College	n/a	można uzyskać z lokalnych gospodarstw
chlorek sodu (NaCl)	EMD	SX0420-3	kryształy chlorku sodu, odczynnik klasy
1 L szklana butelka	VWR	89000-240	1 L pirex autoklawowalna szklana butelka
etanol	Fisher Scientific	BP82011	70% pojemniki tupperware klasy biologii molekularnej
	n/a	nie dotyczy	kupione w sklepie i wysterylizowane
jednorazowymi żyletkami EtOH Przemysłowe żyletki	VWR	55411-050	z pojedynczą krawędzią (chirurgiczna stal węglowa)
plastikowe łyżki	nie		w sklepie i sterylizowane za pomocą
maski przeciwpyłowej	3M	nie dotyczy	3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	paraformaldehyd, klasa odczynnika, krystaliczna
formalina buforowana obojętnie	Fisher Scientific	72210	10% neutralna buforowana sól fizjologiczna buforowana fosforanem formaliny
(PBS)	n/a	nie dotyczy	10X sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (137mM NaCl, 2,5mM KCl, 4,3mM Na2HPO4, 1,4mM KH2PO4)
15 ml probówki falcon	VWR	21008-216	wstępnie sterylizowane probówki wirówkowe
kleszcze	FST	brak	drobnych kleszczyków
fizjologiczna dla piskląt	Nie	dotyczy n/a	0,85% NaCl
Folia aluminiowa	Nie dotyczy		papierowy kupiony w sklepie
Nie			Kupiony w sklepie

z Jednorazowe pożywki dotyczy nie dotyczy EtOH sól Ręcznik dotyczy