Artykuł metodologiczny

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w monokomórkach po patch-clamp

DOI:

10.3791/57627

⸱

20 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kluczowe kroki i środki ostrożności wymagane do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w pojedynczej komórce po patch-clamp. Technika ta jest prostą i skuteczną metodą analizy profilu ekspresji z góry określonego zestawu genów z pojedynczej komórki, charakteryzującego się zapisami patch-clamp.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora mózgowa składa się z wielu typów komórek wykazujących różne cechy morfologiczne, fizjologiczne i molekularne. Ta różnorodność utrudnia łatwą identyfikację i charakterystykę tych typów komórek, co jest warunkiem wstępnym do badania ich specyficznych funkcji. W artykule opisano protokół multipleksowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w multipleksie, który pozwala, po zapisie patch-clamp w plasterkach, na jednoczesne wykrycie ekspresji kilkudziesięciu genów w jednej komórce. Ta prosta metoda może być stosowana z charakterystyką morfologiczną i ma szerokie zastosowanie do określania cech fenotypowych różnych typów komórek i ich szczególnego środowiska komórkowego, np. w pobliżu naczyń krwionośnych. Zasada tego protokołu polega na zarejestrowaniu komórki za pomocą techniki patch-clamp, zebraniu i odwrotnej transkrypcji jej zawartości cytoplazmatycznej oraz jakościowym wykryciu ekspresji predefiniowanego zestawu genów za pomocą multipleksowego PCR. Wymaga starannego zaprojektowania starterów PCR i wewnątrzkomórkowego roztworu patch-clamp kompatybilnego z RT-PCR. Aby zapewnić selektywne i niezawodne wykrywanie transkryptów, technika ta wymaga również odpowiednich kontroli, od zbierania cytoplazmy po etapy amplifikacji. Chociaż omówione tutaj środki ostrożności muszą być ściśle przestrzegane, praktycznie każde laboratorium elektrofizjologiczne może korzystać z techniki multipleksowej pojedynczej komórki RT-PCR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora mózgowa składa się z wielu typów komórek zaangażowanych w różne procesy fizjologiczne. Ich identyfikacja i charakterystyka, warunek wstępny do zrozumienia ich specyficznych funkcji, może być bardzo trudna, biorąc pod uwagę dużą różnorodność morfologiczną, fizjologiczną i molekularną, która charakteryzuje typy komórek korowych1,2,3,4.

Jednokomórkowy multipleksowy RT-PCR opiera się na połączeniu technik patch-clamp i RT-PCR. Może jednocześnie badać ekspresję ponad 30 predefiniowanych genów w elektrofizjologicznie zidentyfikowanych komórkach5. Włączenie znacznika neuronalnego do pipety rejestrującej dodatkowo pozwala na morfologiczną charakterystykę zarejestrowanych komórek po odkryciu histochemicznym6,7,8,9,10. Jest to bardzo przydatna technika klasyfikacji typów neuronów na podstawie wielowymiarowej analizy ich cech fenotypowych5,9,10,<sup class="xref">11,12,13,14. Jednokomórkowy multipleksowy RT-PCR nadaje się również do charakteryzacji komórek nieneuronalnych, takich jak astrocyty15,16,17, i może być praktycznie stosowany do każdej struktury mózgu18,19,20,21,22,23 i typ komórki, zakładając, że można je zapisać w konfiguracji całej komórki.

Ta technika jest bardzo wygodna do identyfikacji źródeł komórkowych i/lub celów systemów transmisyjnych7,8,15,16,20,21,24,25,26,27,28, zwłaszcza gdy brakuje specyficznych przeciwciał. Opiera się na nagraniach patch-clamp z wizualnie zidentyfikowanych komórek29, a tym samym umożliwia również celowanie w komórki w określonym środowisku komórkowym8,15,16. Ponadto, ponieważ cytoarchitektura tkanki mózgowej jest zachowana w wycinkach mózgu, podejście to umożliwia również badanie anatomicznych relacji charakteryzowanych komórek z elementami neuronalnymi i nieneuronalnymi7,8,18.

Ponieważ ta technika jest ograniczona ilością pobranej cytoplazmy i wydajnością RT, wykrycie mRNA wyrażonego przy niskiej liczbie kopii może być trudne. Chociaż inne podejścia oparte na technologii RNaseq pozwalają na analizę całego transkryptomu pojedynczych komórek3,4,30,31, wymagają drogich sekwenatorów o wysokiej przepustowości, niekoniecznie dostępnych dla każdego laboratorium. Ponieważ technika RT-PCR z multipleksem jednokomórkowym wykorzystuje PCR w punkcie końcowym, wymaga jedynie powszechnie dostępnych termocyklerów. Można go łatwo opracować w laboratoriach wyposażonych w zestawy elektrofizjologiczne i nie wymaga drogiego sprzętu. Może dostarczyć w ciągu jednego dnia jakościową analizę ekspresji predefiniowanego zestawu genów. W ten sposób podejście to zapewnia łatwy dostęp do charakterystyki molekularnej pojedynczych komórek w szybki sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z francuskimi przepisami (Code Rural R214/87 do R214/130) i były zgodne z wytycznymi etycznymi zarówno Europejskiej Wspólnoty Gospodarczej (86/609/EWG), jak i Francuskiej Narodowej Karty Etyki Doświadczeń na Zwierzętach. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Karola Darwina i przedłożone francuskiemu Ministerstwu Edukacji i Badań Naukowych (zatwierdzenie 2015 061011367540). Zakład hodowli zwierząt IBPS jest akredytowany przez władze francuskie (A75-05-24).

1. Uwagi wstępne

Uwaga: Aby uniknąć zanieczyszczeń, postępuj zgodnie z poniższymi zaleceniami przed przystąpieniem do jednokomórkowego RT-PCR po patch-clamp.

  1. Nie należy używać plazmidów zawierających geny, które mogą być przedmiotem zainteresowania w laboratorium, ponieważ stanowią one potencjalne źródło zanieczyszczenia.
  2. Zarezerwuj stanowisko laboratoryjne z dala od pomieszczenia do elektroforezy żelowej, aby przygotować PCR.
  3. Poświęć zestaw pipet i końcówek filtrujących odpornych na aerozole do manipulowania DNA i RNA w stężeniach niższych niż 1 ng/μl. Nigdy nie używaj ich do analizy produktów PCR.
  4. Zawsze używaj produktów wolnych od RNaz i DNaz i noś rękawice.
  5. Do przygotowania wewnętrznych roztworów patch-clamp należy używać dedykowanych środków chemicznych. Nigdy nie używaj szpatułki, ale raczej papieru do ważenia proszków.
  6. Należy używać dedykowanej elektrody pH i roztworów wzorcowych pH, ponieważ mogą one być źródłem zanieczyszczeń (np. RNazy).
  7. Przechowuj kapilary ze szkła borokrzemianowego, długie, cienkie i elastyczne końcówki o długości 20 μl, mikropipetę o pojemności 20 μl, domowy wypychacz (uchwyt na pipety z zaciskiem krosowym dołączony do strzykawki o pojemności 10 ml), probówki PCR o pojemności 500 μl, końcówki filtrujące odporne na aerozol o pojemności 10 μl oraz cienkie markery permanentne w dedykowanym pudełku (Rysunek 1).

2. Projekt podkładu

Uwaga: Multiplex RT-PCR opiera się na dwóch etapach amplifikacji. Podczas pierwszego PCR wszystkie interesujące geny są koamplifikowane przez zmieszanie ze sobą wszystkich starterów PCR. Aby niezawodnie wykrywać transkrypty z pojedynczych komórek, konieczne jest zaprojektowanie wydajnych i selektywnych starterów PCR. Zastosowanie zagnieżdżonych (wewnętrznych) starterów do drugich rund PCR poprawia zarówno specyficzność, jak i skuteczność amplifikacji.

  1. Pobierz wyselekcjonowane sekwencje mRNA genów będących przedmiotem zainteresowania w NCBI Reference Sequence Database32, a także te z ich pokrewnej rodziny (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Wprowadź nazwę genu (genów) i gatunku będącego przedmiotem zainteresowania jako zapytanie i kliknij na pobraną odpowiednią sekwencję.
    2. Aby ograniczyć analizę do sekwencji kodującej gen(y), kliknij Wyślij do (prawy górny róg) i wybierz Sekwencje kodujące i Nukleotyd FASTA jako format. Następnie kliknij Utwórz plik i zapisz sekwencję FASTA z rozszerzeniem pliku ".nt".
  2. Użyj oprogramowania MACAW 33 (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench) lub dowolnego innego oprogramowania do wielokrotnego wyrównywania, aby określić obszary homologii.
    1. Kliknij Plik | Nowy projekt... i wybierz DNA jako typ sekwencji. Aby zaimportować sekwencje genów, wybierz punkt menu Sekwencja | Importuj sekwencję... i załaduj plik ".nt". Powtórz procedurę dla wszystkich powiązanych sekwencji.
    2. Kliknij i przeciągnij wszystkie sekwencje w oknie Schemat, aby zaznaczyć całe sekwencje.
    3. Wyszukaj obszary homologii, wybierając pozycję Wyrównanie | Szukaj bloków... (CTRL+S). Wybierz opcję Nakładanie się par segmentów w Metodzie wyszukiwania. Dostosuj odcięcie wyniku parami do stosunkowo wysokiej wartości (np. 1,000), a min. sekwencje na blok do całkowitej liczby sekwencji do wyrównania i kliknij Rozpocznij.
    4. W wyświetlonym oknie wyników wyszukiwania wybierz wyniki z najwyższym wynikiem MP i kliknij Połącz. Jeśli nie zostanie znaleziony żaden wynik, zmniejsz punkt odcięcia parami i/lub min. sekwencje na blok.
    5. Aby ułatwić wizualizację regionów homologicznych, wybierz Wyrównanie | Cieniowanie | Średni wynik.
    6. Wybierz niepołączone części sekwencji i powtórz kroki 2.2.3–2.2.4, aby potencjalnie określić inne regiony homologii z niższym wynikiem MP.
    7. Aby uzyskać najbardziej szczegółowe startery, wybierz regiony o najmniejszej homologii sekwencji.
  3. Pobierz sekwencje wszystkich wariantów spawów i powtórz kroki 2.2.1–2.2.6. Wybierz ich wspólne regiony, aby uzyskać ogólne wykrywanie. Rozważ alternatywne kasety do analizy dedykowanych wariantów spawów20,34,35,36.
  4. Dopasuj sekwencje mRNA w genomie modelu zwierzęcego za pomocą genomów BLAST37 (Basic Local Alignment Search Tool) w celu określenia struktury intronowo-eksonowej genów (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Wybierz genom myszy BLAST, klikając Mysz i prześlij pobraną sekwencję FASTA w sekcji Wprowadź sekwencję zapytania. W wyborze programu wybierz opcję Optymalizuj dla bardzo podobnych sekwencji (megablast), a następnie kliknij przycisk BLAST.
    2. W sekcji Opisy wybierz wyrównanie z najwyższą tożsamością (do 100%). Upewnij się, że odpowiada on interesującemu nas genowi, jak wskazano w funkcjach sekcji Wyrównania.
    3. Posortuj wyrównanie według pozycji początkowej zapytania w tej samej sekcji, aby uzyskać sekwencję eksonów sekwencji kodowania. Zwróć uwagę na pozycje początkowe i końcowe wszystkich trafień, które w przybliżeniu odpowiadają pozycji intronów w sekwencji zapytania (Rysunek 2A).
  5. Wybierz dwa różne eksony dla starterów sense i antysensownych, aby łatwo odróżnić cDNA od amplifikacji genomowego DNA (gDNA) na podstawie kryterium wielkości (Rysunek 2).
    Uwaga: Amplifikacja gDNA może zachodzić z niską częstotliwością, gdy jądro jest zbierane wraz z cytoplazmą. W związku z tym konieczne jest zaprojektowanie par starterów z nadmiernym zakresem intronów (Rysunek 2A). W przypadku genów beztronowych pobranie jądra jest problematyczne, ponieważ może prowadzić do potencjalnie mylących wyników. Aby rozwiązać ten problem, dołącz zestaw starterów mających na celu amplifikację sekwencji intronowej w celu zbadania obecności gDNA25. Jeśli kontrola genomowa jest pozytywna, wyniki dla wszystkich genów beztronowych muszą zostać odrzucone.
  6. Aby uzyskać wydajną amplifikację, wybierz startery generujące amplikony o długości idealnie składającej się z 200 do 400 par zasad (Rysunek 2).
  7. Aby jednocześnie amplifikować różne cDNA podczas etapu multipleksowej reakcji PCR, należy zaprojektować startery o długości od 18 do 24 nukleotydów i temperaturze topnienia (Tm) między 55 a 60 °C.
  8. Aby zminimalizować powstawanie struktur drugorzędowych, które zmniejszają wydajność amplifikacji, wybierz startery sense i anty-sense o minimalnych długościach spinki do włosów i dupleksu (Rysunek 2B).
  9. Zaprojektuj podkłady wewnętrzne przy użyciu tych samych kryteriów (kroki 2.5–2.8).
  10. Sprawdź specyficzność starterów PCR, wyrównując startery w referencyjnej bazie danych sekwencji RNA organizmu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą nukleotydu BLAST.
    1. W BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) kliknij nukleotyd BLAST. Wklej sekwencję startera w polu Wprowadź sekwencję zapytania.
    2. W sekcji Wybierz zestaw wyszukiwania kliknij Inne (nr itd.)), wybierz Referencyjne sekwencje RNA (refseq_rna) w opcji Baza danych i określ organizm (np. Mus musculus (taxid:10090)), aby ograniczyć analizę do pożądanego gatunku.
    3. W obszarze Wybór programu wybierz opcję Optymalizuj dla nieco podobnych sekwencji (blastn). W sekcji Parametry algorytmu zmniejsz rozmiar słowa do 7, aby zwiększyć szansę na uzyskanie trafień.
  11. Aby zaprojektować selektywne startery, zachowaj tylko te, których sekwencja ma co najmniej 3 niezgodności z niepożądanymi cDNA, jeśli to możliwe.
  12. Zamów odsolone podkłady o stosunkowo wysokim stężeniu (np. 200 μM), aby zapewnić, że wszystkie zewnętrzne podkłady można wymieszać ze sobą w końcowym stężeniu 1 μM.

3. Przygotowanie odczynników RT

  1. 5x RT-mix: Przygotować w wodzie wolnej od RNaz 400 μl roboczego roztworu mieszającego RT (5x) zawierającego losowe startery po 25 μM i dNTP po 2,5 mM każdy. Tę mieszaninę roboczą należy przechowywać w postaci 20 μl porcji w probówkach o pojemności 500 μl.
  2. 20x Ditiothreitol (DTT): Przygotuj 1 ml 0,2 M DTT w wodzie wolnej od RNaz i przechowuj ją w postaci 50 μl podwielokrotności.
  3. Przechowywać 2 500 U inhibitora RNazy (40 U/μL) i 10 000 U odwrotnej transkryptazy (RTaza, 200 U/μL) w postaci 5 μL podwielokrotności.
  4. Aby zapewnić optymalną jakość odczynników RT, należy przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Stosować je do 10 komórek i tylko przez jeden dzień.

4. Walidacja PCR

  1. Przygotuj cDNA, wykonując odwrotną transkrypcję na stosunkowo dużej ilości całkowitego RNA (zwykle 1 μg) wyekstrahowanego 38 ze struktury będącej przedmiotem zainteresowania.
    1. Do tych wstępnych etapów nie należy używać pipet przeznaczonych do jednokomórkowego RT-PCR, ale należy używać pipet wolnych od RNaz. Rozcieńczyć całkowite RNA do 1 μg/μl.
    2. W probówce PCR o pojemności 500 μl dodaj 1 μl rozcieńczonego całkowitego RNA i 8 μl wody wolnej od RNaz. Denaturację w temperaturze 95 °C przez 1 minutę i schłodzić rurkę na lodzie.
    3. Dodać 4 μl buforu RT 5x dostarczonego przez producenta, 4 μl roztworu mieszającego RT, 1 μl RTazy, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl 200 mM DTT (patrz punkt 3).
    4. Przesunąć probówkę, obrócić ją i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Przechowuj cDNA w temperaturze -80 °C przez okres do kilku lat. Przygotować podwielokrotność cDNA rozcieńczoną do 1 ng/μl całkowitych równoważników RNA.
  2. Wymieszaj i rozcieńcz każdą parę starterów w temperaturze 1 μM za pomocą pipet przeznaczonych do jednokomórkowego RT-PCR. Użyj 20 μl każdej mieszanki starterów na 100 μl PCR.
  3. Na lodzie przygotuj dla każdej pary starterów premiks zawierający: wodę (q.s., 80 μL), 10 μL buforu 10X, 1 μL 100x dNTP (po 50 μM każdy), 500–1,000 pg cDNA rozcieńczonego w 1 ng/μL i 0,5 μL (2,5 U, 5 U/μL) polimerazy Taq.
  4. Używaj probówek do PCR, które ściśle przylegają do dołków maszyny do PCR, aby uzyskać optymalną kontrolę temperatury. Dodaj 2 krople (~100 μL) oleju mineralnego do premiksu, nie dotykając ścianki ani nakrętki probówki do PCR.
  5. Aby zminimalizować powstawanie dimerów starterów, należy wykonać gorący start, umieszczając probówki PCR w termocyklerze wstępnie podgrzanym do 95 °C. Po 30 s szybko wylej 20 μl mieszanki podkładowej na wierzch oleju.
  6. Po 3 minutach w temperaturze 95 °C należy wykonać 40 cykli (95 °C, 30 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 35 s), a następnie wykonać końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
  7. Przeanalizuj 10 μl każdego produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (2%, waga/objętość)39. Jeśli niektóre produkty PCR nie mają oczekiwanego rozmiaru, należy przeprojektować inne startery (patrz punkt 2).
    Uwaga: Bromek etydyny jest interkalującą substancją chemiczną, która może indukować mutacje DNA. Przed użyciem skonsultuj się z lokalnym biurem bezpieczeństwa. Zawsze noś rękawiczki podczas manipulowania nim. Aby zminimalizować ryzyko wdychania, należy użyć dostępnego w handlu roztworu bromku etydyny (10 mg/ml) zamiast proszku. Podobnie światło UV może być szkodliwe, więc upewnij się, że nosisz okulary ochronne chroniące przed promieniowaniem UV lub maskę. Zabrudzone żele, końcówki, rękawiczki i bufor należy pobrać do pojemników przeznaczonych na odpady etydyny.
  8. Gdy wszystkie pary starterów zostaną indywidualnie zweryfikowane, przetestuj protokół multipleksu (Rysunek 3).
    1. Wymieszać i rozcieńczyć wszystkie zewnętrzne startery razem w temperaturze 1 μM. Mieszankę starterów multiplex przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do kilku tygodni.
    2. Na lodzie przygotuj premiks zawierający: wodę (q.s., 80 μL), 10 μL buforu 10X, 1 μL 100x dNTP (po 50 μM każdy), 500–1000 pg cDNA rozcieńczonych w stężeniu 1 ng/μL oraz 0,5 μL (2,5 U, 5 U/μL) polimerazy Taq.
    3. Przesuń probówkę do PCR, odkręć ją i dodaj dwie krople (~100 μL) oleju mineralnego.
    4. Wykonaj gorący start zgodnie z opisem w kroku 4.5 z 20 μl mieszanki starterów multipleksowych. Po 3 minutach w temperaturze 95 °C przeprowadzić 20 cykli PCR identycznych jak w kroku 4.6.
    5. Przygotuj liczbę probówek PCR identyczną z liczbą genów do analizy. Przygotować premiks jak w kroku 4.8.2, ale używając 1 μl pierwszego produktu PCR na gen jako matrycę. Dostosuj wszystkie objętości do liczby genów do analizy i rozważ użycie 10% dodatkowej objętości, aby skompensować błędy pipetowania.
    6. Delikatnie wstrząśnij, odkręć probówkę, wyślij 80 μl premiksu do każdej probówki PCR i dodaj dwie krople (~100 μl) oleju mineralnego na probówkę, nie dotykając ścianki ani nakrętki probówki.
    7. Wykonać gorący rozruch (patrz krok 4.5), usuwając 20 μl wewnętrznej mieszanki starterów przygotowanej w kroku 4.2. Uruchom 35 cykli PCR identycznie jak w kroku 4.6.
    8. Analizuj drugie produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Upewnij się, że co drugi PCR generuje amplikon o oczekiwanej wielkości. W przypadku nieefektywnych lub niespecyficznych amplifikacji należy przeprojektować nowe startery (kroki 2.5–2.12) i przeprowadzić ich walidację (kroki 4.2–4.8).

5. Przygotowanie i walidacja wewnątrzkomórkowego rozwiązania typu patch-clamp

Uwaga: Poniższy protokół opisuje przygotowanie i walidację wewnętrznego roztworu na bazie K+/glukonianu, ale praktycznie każdy rodzaj roztworu patch-clamp może być użyty, o ile nie ogranicza to efektywności RT-PCR. Noszenie rękawic jest obowiązkowe w celu uzyskania roztworu wewnętrznego wolnego od RNaz.

  1. Na 60 ml wewnętrznego roztworu do zapisu patch-clamp należy przygotować doraźnie 10 ml 0,1 M KOH.
  2. Rozpuścić 11,4 mg EGTA (0,5 mM wersja ostateczna) w 0,9 ml 0,1 M KOH.
  3. Dodać 40 ml wody wolnej od RNaz i rozpuścić 2,02 g K-glukonianu (144 mM wersja ostateczna), 143 mg HEPES (10 mM wersja ostateczna) i 180 μl 1 M MgCl2 (3 mM wersja ostateczna).
  4. Dostosuj pH do 7,2, dodając ~6 ml 0,1 M KOH.
  5. Dostosuj osmolarność do 295 mOsm za pomocą ~13 ml wody wolnej od RNaz.
  6. Ponieważ roztwór wewnętrzny jest również używany jako bufor do odwrotnej transkrypcji, należy dokładnie kontrolować stężenie Mg2+. Skompensować niższe stężenieMg2+ w roztworze wewnętrznym, dodając następnie MgCl2, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 mM w reakcji RT.
  7. Aby oznaczyć pobraną komórkę po zarejestrowaniu patch-clamp, dodaj 2-5 mg/ml biocytyny wolnej od RNaz do roztworu wewnętrznego opisanego powyżej (kroki 5.1-5.5).
  8. Przefiltrować (wielkość porów 0,22 μm) roztwór wewnętrzny i przechowywać go w temperaturze -80 °C w postaci 100–250 μl podwielokrotności.
  9. Aby zwalidować użycie roztworu wewnętrznego do jednokomórkowego RT-PCR, dodaj 0,5 μl całkowitego RNA rozcieńczonego w 1 ng/μl do 6 μl roztworu patch-clampu i pozostaw go na stole na około 30 minut.
  10. Za pomocą mikropipety o pojemności 2 μl dodać 2 μl 5x RT-mix, 0,5 μl 20x DDT, 0,5 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl RTazy i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  11. Zakręć rurką. Na lód dodaj wodę (q.s., 80 μL), 10 μL buforu 10X i 0,5 μL (2,5 U, 5 U/μL) polimerazy Taq.
  12. Wykonaj 40 cykli PCR, używając zestawu zwalidowanych starterów (kroki 4.4–4.6).
  13. Przeanalizować produkty PCR metodą elektroforezy w żelu agarozowym (patrz krok 4.7) i sprawdzić, czy mają oczekiwany rozmiar.
    Uwaga: Pominięcie 0,5 μl całkowitego RNA i zastąpienie go 0,5 μl wody wolnej od RNaz zapewni, że roztwór wewnętrzny będzie wolny od zanieczyszczeń RNA i/lub DNA.

6. Przygotowanie ostrego plastra

Uwaga: Ten protokół opisuje procedurę krojenia dla młodych (tj. mniej niż 28 dni po urodzeniu) samców i samic myszy. Inne rozwiązania do cięcia, takie jak sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy na bazie sacharozy (aCSF) są również użyteczne40.

  1. Przygotować 2 l płynu CSF zawierającego (w mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glukozy i 15 sacharozy. Aby zmniejszyć aktywność glutaminergiczną podczas przygotowywania plastrów, przygotuj roztwór do krojenia, dodając 1 mM kwasu kynureninowego.
  2. Przed krojeniem przygotuj zestaw do preparacji zawierający nożyczki chirurgiczne, nożyczki do cienkiej tęczówki, dwie szpatułki, kleszcze, krążek z filtrem papierowym i klej cyjanoakrylowy.
  3. Użyć lodowatego roztworu do cięcia nasyconegoO2/CO2 (95%/5%) i schłodzić komorę cięcia w temperaturze -20 °C.
  4. Znieczul mysz małym ręcznikiem papierowym nasączonym izofluranem. Po ~2 minutach upewnij się, że mysz jest pod głębokim znieczuleniem, sprawdzając brak reakcji na uszczypnięcie łapy.
  5. Szybko odetnij głowę myszy. Usuń skórę głowy i otwórz czaszkę. Ostrożnie wyekstrahować mózg i umieścić go w małej zlewce wypełnionej lodowatym (~4 °C) roztworem tnącym natlenizowanymO2/CO2 .
  6. Wyjmij komorę tnącą z warunków -20 °C i usuń wilgoć ręcznikiem papierowym.
  7. Ostrożnie wypreparuj mózg, aby wyizolować obszar zainteresowania, przyklej go do komory tnącej i dodaj lodowaty roztwór do cięcia natlenionyO2/CO2.
  8. Pokrój plastry o grubości 300 μm za pomocą wibratomu. Przenieś je w temperaturze pokojowej do komory spoczynkowej wypełnionej natlenionym roztworem tnącym i pozwól im dojść do siebie przez co najmniej 0,5 godziny.

7. Jednokomórkowy RT-PCR po nagraniu z użyciem patch-clamp

  1. Regularnie czyść system perfuzyjny ~100 ml 30% roztworu H2O2 i dokładnie spłucz ~ 500 ml wody destylowanej, aby uniknąć rozwoju bakterii, ponieważ jest to pomijane źródło zanieczyszczenia RNazą.
  2. Chloruj włókno pipetą plastrową wypełnioną skoncentrowanym wybielaczem każdego dnia zbiorów. Nie należy używać mikropipety do napełniania pipety z plastrem, ale raczej długiej, cienkiej, elastycznej końcówki o pojemności 20 μl przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml. Następnie dokładnie spłucz go wodą wolną od RNaz i osusz miotełką gazową.
  3. Przygotuj małe pudełko lodu zawierające 5x RT-mix i 20x porcje DTT. Porcje inhibitorów RTazy i RNazy należy przechowywać w temperaturze -20 °C w chłodziarce stołowej.
  4. Przenieść plasterek do komory rejestracyjnej perfundowany z prędkością 1–2 ml/min z natlenionym aCSF.
  5. Wyciągnij pipety krosowe (1–2 μm o średnicy otwartej końcówki, 3–5 MΩ) ze szkła borokrzemianowego w rękawiczkach i napełnij jedną z nich 8 μl roztworu wewnętrznego. Należy pamiętać, że pokrętła ściągacza do pipet są źródłem zanieczyszczenia RNazą.
  6. Umieść pipetę w uchwycie na pipety, zakładając nowe rękawice i nie dotykając filamentu palcami.
  7. Zbliżyć się do pipety z plastrem z dodatnim ciśnieniem i wykonać zapis całej komórki, aby scharakteryzować docelową komórkę (Rysunek 4).
  8. Aby zachować mRNA, ogranicz czas w konfiguracji całej komórki do 20 min41.
  9. Na koniec nagrania przygotuj probówkę PCR o pojemności 500 μl wypełnioną 2 μl 5x RT Mix i 0,5 μl 20x DTT, odwiruj ją i przechowuj na lodzie.
  10. Zbierz cytoplazmę komórki, stosując delikatne podciśnienie (Rysunek 4). Kontroluj wizualnie, czy zawartość kuwety dostaje się do wnętrza pipety, zachowując przy tym szczelne zamknięcie.
    1. Unikaj w jak największym stopniu zbierania jądra, jeśli rozważane są niektóre geny beztronowe. W takim przypadku zawsze dołączaj zestaw starterów mających na celu amplifikację gDNA w celu zbadania zanieczyszczenia genomu.
    2. Jeśli jądro zbliża się do końcówki pipety, zwolnij podciśnienie i odsuń pipetę od jądra. Upewnij się, że szczelne zamknięcie jest zachowane i uruchom ponownie, aby zebrać cytoplazmę w nowym miejscu pipety.
  11. Przerwij zbiory, gdy nie będzie już materiału i/lub zanim stracisz szczelne uszczelnienie.
  12. Delikatnie wyjmij pipetę, aby utworzyć łatkę na zewnątrz, aby ograniczyć zanieczyszczenie przez zanieczyszczenia zewnątrzkomórkowe (Rysunek 4) i sprzyjać zamknięciu błony komórkowej w celu późniejszej analizy histochemicznej.
  13. Należy pamiętać, że pokrętła, mikromanipulatory, klawiatura komputerowa lub mysz komputerowa są potencjalnymi źródłami zanieczyszczenia RNazą. Jeśli zostały dotknięte podczas nagrywania, zmień rękawiczki.
  14. Przymocuj pipetę do wytłoku i wyrzuć jej zawartość do probówki do PCR, przykładając nadciśnienie (Rysunek 1).
  15. Wbij końcówkę pipety do probówki PCR, aby ułatwić pobranie jej zawartości.
  16. Krótko odwirować probówkę, dodać 0,5 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl RTazy, delikatnie wymieszać, ponownie odwirować i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  17. Zakręć probówką i przechowuj ją w temperaturze -80 °C przez okres do kilku miesięcy do czasu analizy PCR.
  18. Wykonaj pierwszy etap amplifikacji bezpośrednio w probówce zawierającej ~10 μL produktów RT, dodając wodę (q.s., 80 μL), 10 μL 10x buforu i 0,5 μL (2,5 U) polimerazy Taq. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w krokach 4.8.2–4.8.8.

8. Barwienie histochemiczne zarejestrowanej komórki (opcjonalnie)

  1. Po zapisach elektrofizjologicznych utrzymuj plaster przez 20 minut w natlenionym aCSF, aby umożliwić dyfuzję biocytyny w drzewie aksonalnym i dendrytycznym.
  2. Umieścić plasterek w dołku na 24-dołkowej płytce i utrwalić go na noc w temperaturze 4 °C z 1 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym.
  3. Umyj plastry 4 razy po 5 minut każdy 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  4. W tej samej studzience przepuszczaj i nasycaj plaster przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej 1 ml PBS uzupełnionego 0,25% Triton X-100 i 0,2% żelatyny ze skóry ryb zimnowodnych (PBS-GT).
  5. Inkubować przez noc z fluorescencyjnie znakowaną awidyną rozcieńczoną w stosunku 1/400 w 250–500 μl PBS-GT.
  6. Umyj 5 razy po 5 minut 1 ml PBS i umieść plastry.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywna walidacja multipleksowego RT-PCR jest pokazana w Rysunek 3. Protokół został opracowany w celu jednoczesnego badania ekspresji 12 różnych genów. Pęcherzykowy transporter glutaminianu vGluT1 został przyjęty jako kontrola pozytywna dla neuronów glutaminergiczne42. Enzymy syntetyzujące GABA (GAD65 i 67), neuropeptyd Y (NPY) i somatostatyna (SOM) zostały użyte jako markery interneuronów GABAergicznych3

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipleksowy RT-PCR z pojedynczą komórką po patch-clampie może jednocześnie i niezawodnie badać ekspresję ponad 30 genów w elektrofizjologicznie zidentyfikowanych komórkach5. Analiza ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki wymaga wysoce wydajnych starterów PCR. Jednym z najbardziej ograniczających kroków jest zebranie zawartości komórki. Jej skuteczność zależy od średnicy końcówki pipety z plastrem, która musi być jak największa, a jednocześnie dopasowana do wielkości komórki. Udowodniono...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Alexandre Mourot za komentarze do manuskryptu. Prace te były wspierane przez dotacje z Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 i ANR-17-CE37-0010-03), BLG jest wspierany przez stypendium Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Dziękujemy ośrodku dla zwierząt IBPS (Paryż, Francja).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MACAW v.2.0.5NCBIWielokrotne wyrównanie do projektowania podkładu
DitiothreitolVWR443852ART
Losowe starterySigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT i PCR
RNasin Inhibitory rybonukleazyPromegaN2511RT
SuperScript II Odwrotna transkryptazaInvitrogen18064014RT
Taq DNA PolimerazaQiagen201205PCR
Olej mineralnySigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
StarteryPCR Sigma-Aldrich (Merck)PCR / odsolone i rozcieńczone w 200 &mikro;
M Probówki, 0,5 mL, płaska nakrętkaThermoFisher ScientificAB0350RT i PCR
BT10 Series - 10 µ L Końcówka filtraNeptune ScientificBT10RT i PCR
BT20 Series - 20 & mikro; L Końcówka filtraNeptune ScientificBT20RT i PCR
BT200 Series - 200 µ L Końcówka filtraNeptune ScientificBT200RT i PCR
BT1000 Series - 1000 µ L Końcówka filtraNeptune ScientificBT1000.96RT i PCR
DNA Thermal CylcerPerkin Elmer CetusPCR
Bromek etydynySigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLElektroforeza w żelu agarozowym
Bufor Tris-Boran-EDTASigma-Aldrich (Merck)T4415-1LElektroforeza w żelu agarozowym
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500Elektroforeza w żelu agarozowym
Φ X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SElektroforeza w żelu agarozowym
EDA 290KodakElektroforeza w żelu agarozowym
Elektroforeza Zasilanie EPS 3500Pharmacia BiotechElektroforeza w żelu agarozowym
Midi Pozioma jednostka elekroforezy Model SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Elektroforeza w żelu agarozowym
Gładki papier o satynowym wyglądzieFisherbrand1748BWewnętrzny roztwór zacisku krosowego
Hydroksyd potasuSigma-Aldrich (Merck)60377Roztwór wewnętrzny
krosowego Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowyKwas Sigma-Aldrich (Merck)E3889Wewnętrzny roztwór zacisku krosowego
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Roztwór wewnętrzny zacisku krosowego
D-glukonian potasuSigma-Aldrich (Merck)G4500Roztwór wewnętrzny zacisku krosowego
Roztwór chlorku magnezuSigma-Aldrich (Merck)M1028Roztwór wewnętrzny zacisku krosowego
5500 Osmometr ciśnienia paryWescorRoztwór wewnętrzny zacisku krosowego
BiocytynaSigma-Aldrich (Merck)B4261Wewnętrzny roztwór zacisku krosowego
SacharozaSigma-Aldrich (Merck)S5016Przygotowanie plastra
D-(+)-Glukoza jednowodnaSigma-Aldrich (Merck)49159Przygotowanie plastrów
Chlorek soduSigma-Aldrich (Merck)S6191Przygotowanie plastrów
Chlorek potasuSigma-Aldrich (Merck)60128Przygotowanie plastrów
Wodorowęglan soduSigma-Aldrich (Merck)31437-MPrzygotowanie plastrów
Fosforan sodu jednozasadowySigma-Aldrich (Merck)S5011Przygotowanie plastrów
Roztwór chlorku magnezuSigma-Aldrich (Merck)63069Przygotowanie plastrów
Roztwór chlorku wapniaSigma-Aldrich (Merck)21115Przygotowanie
Kwas kynureninowySigma-Aldrich (Merck)K3375Przygotowanie plastrów
IsofluranePiramal Healthcare UKPrzygotowanie plastrów
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Przygotowanie plastrów
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-Aldrich (Merck)H1009Czyszczenie ustawień zacisku krosowego
Cienkościenne szklane kapilary z żarnikiemWorld Precision InstrumentsTW150F-4Zacisk krosowy
PP-83Zacisk krosowyNarishige
Mikroładowarka EppendorfkrosowyEppendorf5242956003
BX51WI Mikroskop pionowykrosowyOlympus
XC-ST70/CE CCD CZARNO-BIAŁA KAMERA WIDEOkrosowySony
Axopatch 200B WzmacniaczUrządzenia molekularneZacisk krosowy
Sigma-Aldrich (Merck)S7907Rewelacja histochemiczna
Fosforan sodu jednozasadowySigma-Aldrich (Merck)S8282Rewelacja histochemiczna
ParaformaldehydSigma-Aldrich (Merck)P6148Rewelacja histochemiczna
Triton X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Objawienie histochemiczne
Żelatyna ze skóryryb zimnowodnychSigma-Aldrich (Merck)G7041Rewelacja histochemiczna
Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificS11223Objawienie histochemiczne
Płytka 24-dołkowaGreiner Bio-One662160Rewelacja histochemiczna
zaciskuplastrów Zacisk Zacisk Zacisk Digidata 1440 Urządzenia molekularne Zacisk krosowy pCLAMP 10 pakiet oprogramowania Urządzenia molekularne Patch Clamp 10 ml strzykawka Terumo SS-10ES Wydalanie serii E z prostym korpusem (uchwyt)Phymep 64-0997 Wydalanie dwuzasadowego fosforanu sodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
  2. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat.Rev.Neurosci. , (2013).
  3. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat.Neurosci. , (2016).
  4. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. , (2015).
  5. Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 97 (11), 6144-6149 (2000).
  6. Cauli, B., et al. Molecular and physiological diversity of cortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (10), 3894-3906 (1997).
  7. Férézou, I., et al. 5-HT3 receptors mediate serotonergic fast synaptic excitation of neocortical vasoactive intestinal peptide/cholecystokinin interneurons. J. Neurosci. 22 (17), 7389-7397 (2002).
  8. Cauli, B., et al. Cortical GABA interneurons in neurovascular coupling: relays for subcortical vasoactive pathways. J.Neurosci. 24 (41), 8940-8949 (2004).
  9. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex. Cereb.Cortex. 12 (4), 395-410 (2002).
  10. Wang, Y., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. J.Physiol. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  11. Karagiannis, A., et al. Classification of NPY-expressing neocortical interneurons. J.Neurosci. 29 (11), 3642-3659 (2009).
  12. Battaglia, D., Karagiannis, A., Gallopin, T., Gutch, H. W., Cauli, B. Beyond the frontiers of neuronal types. Front Neural Circuits. 7, 13(2013).
  13. Toledo-Rodriguez, M., et al. Correlation maps allow neuronal electrical properties to be predicted from single-cell gene expression profiles in rat neocortex. Cereb.Cortex. 14 (12), 1310-1327 (2004).
  14. Toledo-Rodriguez, M., Goodman, P., Illic, M., Wu, C., Markram, H. Neuropeptide and calcium binding protein gene expression profiles predict neuronal anatomical type in the juvenile rat. J.Physiol. , (2005).
  15. Lecrux, C., et al. Pyramidal neurons are "neurogenic hubs" in the neurovascular coupling response to whisker stimulation. J.Neurosci. 31 (27), 9836-9847 (2011).
  16. Lacroix, A., et al. COX-2-derived prostaglandin E2 produced by pyramidal neurons contributes to neurovascular coupling in the rodent cerebral cortex. J.Neurosci. 35 (34), 11791-11810 (2015).
  17. Matthias, K., et al. Segregated expression of AMPA-type glutamate receptors and glutamate transporters defines distinct astrocyte populations in the mouse hippocampus. J.Neurosci. 23 (5), 1750-1758 (2003).
  18. Rancillac, A., et al. Glutamatergic control of microvascular tone by distinct gaba neurons in the cerebellum. J.Neurosci. 26 (26), 6997-7006 (2006).
  19. Miki, T., et al. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nat.Neurosci. 4 (5), 507-512 (2001).
  20. Liss, B., Bruns, R., Roeper, J. Alternative sulfonylurea receptor expression defines metabolic sensitivity of K-ATP channels in dopaminergic midbrain neurons. EMBO J. 18 (4), 833-846 (1999).
  21. Gallopin, T., et al. Identification of sleep-promoting neurons in vitro. Nature. 404 (6781), 992-995 (2000).
  22. Gallopin, T., et al. The endogenous somnogen adenosine excites a subset of sleep-promoting neurons via A2A receptors in the ventrolateral preoptic nucleus. Neuroscience. 134 (4), 1377-1390 (2005).
  23. Fernandez, S. P., et al. Multiscale single-cell analysis reveals unique phenotypes of raphe 5-HT neurons projecting to the forebrain. Brain Struct.Funct. , (2015).
  24. Porter, J. T., et al. Selective excitation of subtypes of neocortical interneurons by nicotinic receptors. J.Neurosci. 19 (13), 5228-5235 (1999).
  25. Hill, E. L., et al. Functional CB1 receptors are broadly expressed in neocortical GABAergic and glutamatergic neurons. J.Neurophysiol. 97 (4), 2580-2589 (2007).
  26. Férézou, I., et al. Extensive overlap of mu-opioid and nicotinic sensitivity in cortical interneurons. Cereb.Cortex. 17 (8), 1948-1957 (2007).
  27. Hu, E., et al. PACAP act at distinct receptors to elicit different cAMP/PKA dynamics in the neocortex. Cereb.Cortex. 21 (3), 708-718 (2011).
  28. Louessard, M., et al. Tissue plasminogen activator expression is restricted to subsets of excitatory pyramidal glutamatergic neurons. Mol.Neurobiol. , (2015).
  29. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  30. Cadwell, C. R., et al. Electrophysiological, transcriptomic and morphologic profiling of single neurons using Patch-seq. Nat.Biotechnol. 34 (2), 199-203 (2016).
  31. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat.Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  32. O'Leary, N. A., et al. Reference sequence (RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 44, D733-D745 (2016).
  33. Schuler, G. D., Altschul, S. F., Lipman, D. J. A workbench for multiple alignment construction and analysis. Proteins. 9 (3), 180-190 (1991).
  34. Ruano, D., Lambolez, B., Rossier, J., Paternain, A. V., Lerma, J. Kainate receptor subunits expressed in single cultured hippocampal neurons: molecular and functional variants by RNA editing. Neuron. 14 (5), 1009-1017 (1995).
  35. Porter, J. T., et al. Properties of bipolar VIPergic interneurons and their excitation by pyramidal neurons in the rat neocortex. Eur.J.Neurosci. 10 (12), 3617-3628 (1998).
  36. Ruano, D., Perrais, D., Rossier, J., Ropert, N. Expression of GABA(A) receptor subunit mRNAs by layer V pyramidal cells of the rat primary visual cortex. Eur.J.Neurosci. 9 (4), 857-862 (1997).
  37. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J.Mol.Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  38. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate- phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).
  39. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J.Vis.Exp. (62), (2012).
  40. Liss, B., et al. K-ATP channels promote the differential degeneration of dopaminergic midbrain neurons. Nat.Neurosci. 8 (12), 1742-1751 (2005).
  41. Lambolez, B., Audinat, E., Bochet, P., Crepel, F., Rossier, J. AMPA receptor subunits expressed by single Purkinje cells. Neuron. 9 (2), 247-258 (1992).
  42. Gallopin, T., Geoffroy, H., Rossier, J., Lambolez, B. Cortical sources of CRF, NKB, and CCK and their effects on pyramidal cells in the neocortex. Cereb.Cortex. 16 (10), 1440-1452 (2006).
  43. Cunningham, M. O., et al. Neuronal metabolism governs cortical network response state. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 103 (14), 5597-5601 (2006).
  44. Tsuzuki, K., Lambolez, B., Rossier, J., Ozawa, S. Absolute quantification of AMPA receptor subunit mRNAs in single hippocampal neurons. J.Neurochem. 77 (6), 1650-1659 (2001).
  45. McCormick, D. A., Connors, B. W., Lighthall, J. W., Prince, D. A. Comparative electrophysiology of pyramidal and sparsely spiny stellate neurons of the neocortex. Journal of Neurophysiology. 54 (4), 782-806 (1985).
  46. Andjelic, S., et al. Glutamatergic nonpyramidal neurons from neocortical layer VI and their comparison with pyramidal and spiny stellate neurons. J.Neurophysiol. 101 (2), 641-654 (2009).
  47. Cauli, B., Lambolez, B. Chapter 9: Gene Analysis of Single Cells. Unravelling Single Cell Genomics: Micro and Nanotools. Bontoux, N., Potier, M. C. , RSC publishing. Cambridge. 81-92 (2010).
  48. Bontoux, N., et al. Integrating whole transcriptome assays on a lab-on-a-chip for single cell gene profiling. Lab Chip. 8 (3), 443-450 (2008).
  49. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
  50. Perrenoud, Q., Rossier, J., Geoffroy, H., Vitalis, T., Gallopin, T. Diversity of GABAergic interneurons in layer VIa and VIb of mouse barrel cortex. Cereb.Cortex. , (2012).
  51. Tricoire, L., et al. Common origins of hippocampal ivy and nitric oxide synthase expressing neurogliaform cells. J.Neurosci. 30 (6), 2165-2176 (2010).
  52. Cea-del Rio, C. A., et al. M3 muscarinic acetylcholine receptor expression confers differential cholinergic modulation to neurochemically distinct hippocampal basket cell subtypes. J.Neurosci. 30 (17), 6011-6024 (2010).
  53. Tricoire, L., et al. A blueprint for the spatiotemporal origins of mouse hippocampal interneuron diversity. J.Neurosci. 31 (30), 10948-10970 (2011).
  54. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur.J.Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  55. Szabo, A., et al. Calcium-permeable AMPA receptors provide a common mechanism for LTP in glutamatergic synapses of distinct hippocampal interneuron types. J.Neurosci. 32 (19), 6511-6516 (2012).
  56. Hodne, K., Weltzien, F. A. Single-Cell Isolation and Gene Analysis: Pitfalls and Possibilities. Int.J.Mol.Sci. 16 (11), 26832-26849 (2015).
  57. Li, H. H., et al. Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature. 335 (6189), 414-417 (1988).
  58. Bochet, P., et al. Subunit composition at the single-cell level explains functional properties of a glutamate-gated channel. Neuron. 12 (2), 383-388 (1994).
  59. Audinat, E., Lambolez, B., Rossier, J., Crepel, F. Activity-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptor subunit expression in rat cerebellar granule cells. Eur.J.Neurosci. 6 (12), 1792-1800 (1994).
  60. Jonas, P., Racca, C., Sakmann, B., Seeburg, P. H., Monyer, H. Differences in Ca2+ permeability of AMPA-type glutamate receptor channels in neocortical neurons caused by differential GluR-B subunit expression. Neuron. 12 (6), 1281-1289 (1994).
  61. Geiger, J. R., et al. Relative abundance of subunit mRNAs determines gating and Ca2+ permeability of AMPA receptors in principal neurons and interneurons in rat CNS. Neuron. 15 (1), 193-204 (1995).
  62. Flint, A. C., Maisch, U. S., Weishaupt, J. H., Kriegstein, A. R., Monyer, H. NR2A subunit expression shortens NMDA receptor synaptic currents in developing neocortex. J.Neurosci. 17 (7), 2469-2476 (1997).
  63. Angulo, M. C., Lambolez, B., Audinat, E., Hestrin, S., Rossier, J. Subunit composition, kinetic, and permeation properties of AMPA receptors in single neocortical nonpyramidal cells. J.Neurosci. 17 (17), 6685-6696 (1997).
  64. Lambolez, B., Ropert, N., Perrais, D., Rossier, J., Hestrin, S. Correlation between kinetics and RNA splicing of alpha-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptors in neocortical neurons. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93 (5), 1797-1802 (1996).
  65. Liss, B., et al. Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and KChip3.1 transcription. EMBO J. 20 (20), 5715-5724 (2001).
  66. Aponte, Y., Lien, C. C., Reisinger, E., Jonas, P. Hyperpolarization-activated cation channels in fast-spiking interneurons of rat hippocampus. J.Physiol. 574, 229-243 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RT PCR pojedynczej kom rkirejestracja patch clampPCR multipleksowyizolacja cytoplazmyanaliza ekspresji gen wPCR z gor cym startemelektroforeza w elu agarozowymprzygotowanie skrawk w m zgurejestracja elektrofizjologiczna

Powiązane artykuły