Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Podsumowanie

Grzyby smutku powodują wiele niszczycielskich chorób rolniczych. Są rozproszone jako uśpione teliospory, które kiełkują w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Przedstawiamy dwie metody badania zmian molekularnych podczas kiełkowania: pomiar wzrostu oddychania w celu wykrycia aktywacji metabolicznej i ocenę zmieniających się zdarzeń molekularnych poprzez izolację teliospory na różnych etapach morfologicznych.

Streszczenie

Grzyby smutku są czynnikami etiologicznymi wielu wyniszczających chorób rolniczych. Charakteryzują się wytwarzaniem teliospor, które są grubościennymi środkami dyspersyjnymi. Teliospory mogą pozostawać w stanie uśpienia przez dziesięciolecia. Stan spoczynku charakteryzuje się niskim tempem metabolizmu, wstrzymaną biosyntezą makromolekularną i znacznie obniżonym poziomem oddychania. Po otrzymaniu wymaganych sygnałów środowiskowych teliospory kiełkują, tworząc komórki haploidalne, które mogą zainicjować nowe rundy infekcji. Kiełkowanie telioporów charakteryzuje się wznowieniem biosyntezy makromolekularnej, zwiększonym oddychaniem i dramatycznymi zmianami morfologicznymi. Aby precyzyjnie zmierzyć zmiany w oddychaniu komórkowym we wczesnych stadiach kiełkowania, opracowaliśmy prosty protokół wykorzystujący respirometr typu Clarka. Późniejsze etapy kiełkowania wyróżniają się specyficznymi zmianami morfologicznymi, ale kiełkowanie jest asynchroniczne. Opracowaliśmy technikę mikrodysekcji, która umożliwia nam zbieranie teliospor na różnych etapach kiełkowania.

Wprowadzenie

Grzyby smutku (Ustilaginales) składają się z ponad 1600 gatunków, które infekują trawy, w tym ważne uprawy zbóż, takie jak kukurydza, jęczmień i pszenica, powodując miliardy dolarów strat w plonach rocznie¹. Grzyby te charakteryzują się wytwarzaniem teliopor, które mają ciemno zabarwione ściany komórkowe i są środkami dyspersyjnymi. Teliospory chronią materiał genetyczny podczas stresu związanego z rozprzestrzenianiem się między roślinami żywicielskimi i mogą utrzymywać się w stanie uśpienia przez lata². W związku z tym teliospory są istotnym składnikiem rozprzestrzeniania się choroby.

W celu zbadania biologii teliosporów, nasze laboratorium wykorzystuje model grzyba smutku Ustilago maydis (U. maydis), który jest czynnikiem wywołującym chorobę 'pospolity smutek kukurydziany'. Dojrzałe teliospory U. maydis charakteryzują się zahamowaniem wzrostu, zmniejszonym metabolizmem komórkowym i niskim poziomem oddychania komórkowego³. W sprzyjających warunkach środowiskowych (np. obecność określonych cukrów) teliospory U. maydis kiełkują i dokonują mejozy, wytwarzając bazydiospory, które mogą zainicjować nowe rundy infekcji. Kiełkowanie charakteryzuje się zwiększonym oddychaniem, powrotem do aktywności metabolicznej i przejściem przez obserwowalne morfologiczne etapy kiełkowania⁴.

Początkowy etap kiełkowania obejmuje zwiększone oddychanie i funkcje metaboliczne, jednak nie ma morfologicznych oznak zmian. Pierwotne pomiary zmian oddechowych u U. maydis zostały przeprowadzone ponad 50 lat temu, mierząc manometrycznie zużycie tlenu za pomocą aparatu z kolby Warburga⁵. Opracowaliśmy nową, prostą metodę badania precyzyjnych zmian w oddychaniu podczas kiełkowania teliopore poprzez pomiar zużycia tlenu w czasie kiełkowania za pomocą mikrorespirometru typu Clark. Wcześniej używaliśmy tej metody do badania zmian częstości oddechów między haploidalnymi komórkami U. maydis typu dzikiego a mutantami z wadliwymi mitochondriami⁶, i dostosowaliśmy protokół tutaj, aby badać zmiany w oddychaniu teliospore podczas kiełkowania. Zapewnia to sposób na dokładne zidentyfikowanie czasu zmiany oddychania, dzięki czemu możemy celować w teliospory w odpowiednim czasie po rozpoczęciu kiełkowania w celu zbadania wczesnych zdarzeń molekularnych. Postęp kiełkowania można śledzić mikroskopijnie, gdy promycelia wyłoni się z teliosporu, ale asynchroniczna natura hamowała izolację wystarczającej liczby teliospory na danym etapie do zbadania. Opracowaliśmy technikę mikrodysekcji podobną do tych stosowanych do zapłodnienia in vitro, aby fizycznie zbierać teliospory na różnych etapach morfologicznych kiełkowania.

Protokół

1. Zakażenie kolbą kukurydzy

1. Uprawiaj Zea mays (odmiana Golden Bantam), aż uformują się kolby i zaczną się jedwabić (około 60 dni).
2. Szczepy haploidalne U. maydis kompatybilne z kulturą przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano wcześniej⁷.
3. Infekuj kolby kukurydzy przy użyciu standardowych protokołów, jak opisano wcześniej⁷.

2. Zbieranie teliospore

1. Wyposażenie autoklawu (lejki Büchnera, kolby Büchnera, blendery, butelki wirówkowe o pojemności 250 ml, płaskie szpatułki i woda) przy użyciu standardowego cyklu suszenia z co najmniej 30-minutową sterylizacją w temperaturze 121 °C (standardowy cykl ciekły dla wody).
2. Usuń zainfekowane kolby z roślin (około 28-35 dni po infekcji) za pomocą brzytwy i umieść kolby na tacy pokrytej ochraniaczem ławki.
3. Usuń guzy z kolb za pomocą żyletki i zbierz w zlewce.
4. Napełnij kubek blendera laboratoryjnego o pojemności 250 ml guzami do około 1/3 wypełnienia i dodaj autoklawowany dH₂O, aż kubek blendera będzie wypełniony w około 3/4. Zakłócić guzy, pulsując blenderem na niskim poziomie, aż do homogenizacji.
5. Podłączyć pompę próżniową do syfonu, a następnie do kolby Büchnera o pojemności 1 l.
6. Włóż duży lejek Büchnera do kolby i wyłóż dno lejka Büchnera czterema warstwami gazy.
7. Włącz pompę próżniową.
8. Przelej porcję homogenizowanych guzów przez gazę i zeskrob szpatułką.
9. Wlej trochę dH₂O do gazy, aby przepłukać teliospory.
10. Powtarzaj, aż dH₂O przechodzące przez gazę będzie klarowne.
11. Wyciśnij gazę zawierającą homogenizowany materiał nowotworowy do filtra, aby zapewnić maksymalny powrót do telioporu.
12. Gdy 1-litrowa kolba Büchnera zbliża się do napełnienia, należy ją przelać do dużej kolby Erlenmeyera i odłożyć na bok.
13. Włóż nowy kawałek gazy do filtra i powtarzaj kroki (2.7–2.12), aż wszystkie guzy zostaną przerwane i przefiltrowane.
14. Przefiltrowane teliospory przelać do autoklawowanych butelek wirówkowych o pojemności 250 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut, a następnie zdekantować supernatant.
15. Powtarzać krok 2.14, aż wszystkie przefiltrowane teliospory zostaną granulowane przez odwirowanie.
16. Zawiesić granulki w niewielkiej ilości wody i przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
17. Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant.
18. Zawiesić osad w około 50 ml_dH2O, odwirować probówki o sile 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant. Delikatnie zeskrob szarą wierzchnią warstwę szpatułką i wyrzuć ją. Powtarzaj, aż na wierzchu nie będzie już szarej warstwy.
19. Próbki należy suszyć przez noc w eksykatorze próżniowym.
20. Wysuszone teliospory przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
21. W razie potrzeby potraktuj teliospory siarczanem miedzi⁸ przed wywołaniem kiełkowania. Jeśli nie zostanie poddany obróbce, należy przeprowadzić dokładną analizę mikroskopową teliospory, aby potwierdzić, że próbka reprezentuje czyste teliospory i jest pozbawiona zanieczyszczeń bakteryjnych lub innych.
    1. Odważyć około 50 mg teliospory w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać około 1,0 ml 0,75%_CuSO4 do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej zawierającej teliopory. Pipetować w górę i w dół, aby zawiesić teliospory w roztworze CuSO₄, a następnie mieszać próbkę przez 3 godziny.
    3. Odwirować próbkę o masie 2 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad teliosporu sterylną wodą, powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant.
    4. Powtórz krok 2.21.3 jeszcze dwa razy.

3. Test żywotności i kiełkowania teliosporu

1. Odważyć około 10 mg teliospory U. maydis w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby ocenić ich żywotność i czas kiełkowania.
2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotować bulion z dekstrozy ziemniaczanej (PDB, 24 g/l) uzupełniony siarczanem streptomycyny (160 μg/ml).
3. Zawiesić teliospory w 500 μl PDB. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać i rozbić wszystkie grudki teliosporów.
4. Przenieść zawiesinę telioporu do autoklawowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej 10 ml PDB.
5. Inkubować kolbę w temperaturze 28 °C, wytrząsając z prędkością 90 obr./min przez 12–16 godzin.
6. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy pobrać próbkę teliospory o objętości 20 μl indukowanych do kiełkowania i przygotować szkiełko mikroskopowe.
7. Za pomocą mikroskopu oceń wizualnie obecne etapy kiełkowania i obecność zanieczyszczenia bakteryjnego.
   1. Policz liczbę teliospor w stadiach od I do V za pomocą hemocytometru i określ procent, który wykiełkował.
   2. Jeśli obecne są tylko teliospory w stadium I, należy kontynuować inkubację kolby przez łącznie 24 godziny przed oceną kiełkowania teliopore. Kontynuować inkubację przez maksymalnie 48 godzin, zanim uzna się próbkę za niezdolną do życia.
   3. Jeśli występuje zanieczyszczenie bakteryjne, uzupełnij PDB siarczanem kanamycyny (50 μg/ml) oraz siarczanem streptomycyny (160 μg/ml), a następnie powtórz kroki od 3.1 do 3.7. Jeśli zanieczyszczenie bakteryjne utrzymuje się, potraktuj teliospory siarczanem miedzi i powtórz kroki od 3.1 do 3.7.

4. Indukcja kiełkowania w celu monitorowania oddychania

1. Zważyć równą ilość (np. 50 mg) teliospory dla każdego doświadczenia oddechowego.
2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj teliospory do autoklawizowanej komory oddechowej.
3. Napełnij komorę PDB (24 g/l) uzupełnionym siarczanem streptomycyny (160 μg/ml) i siarczanem kanamycyny (50 μg/ml).
4. Pipetować w górę i w dół, aby utworzyć zawiesinę telioporu.
5. Umieść pokrywę komory w komorze, aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie.

5. Uzyskiwanie pomiarów wskaźnika zużycia tlenu (OCR)

1. Umieścić komorę w stojaku komory w łaźni wodnej (podgrzanej do 28 °C).
2. Umieść sondę Ø2 w otworze komory.
3. Monitoruj punkty danych pojawiające się w czasie rzeczywistym w programie "SensorTrace Rate" i pozwól sondzie ustabilizować się (~3 minuty po umieszczeniu sondy w komorze).
4. Kliknij "Pomiar", aby mierzyć poziomy_O2 w sposób ciągły przez 6 godzin, z pomiarami zarejestrowanymi w odstępach 2 s.
5. Zatrzymaj pomiar i powtórz kroki 4.1–5.4 dla każdej próbki, która ma być analizowana.
6. Wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel, klikając "Plik | Eksport | Zapisz jako .xls".

6. Analiza danych

1. Obliczać OCR
   1. W wyeksportowanym pliku Excel w zakładce "Within_Rates" zapisz "Szybkość" dla każdego pomiaru komory (nmol/h).
   2. Dla każdej próbki doświadczalnej odejmij "Szybkość" ślepej komory od "Szybkości" komory próbki doświadczalnej, aby uzyskać skorygowaną wartość OCR, i weź bezwzględną wartość tej liczby.
   3. Oblicz całkowity OCR na mg teliospory, dzieląc skorygowaną bezwzględną wartość OCR przez użytą masę komórkową.
   4. Średnie wartości powtórzonej wartości "OCR na mg teliosporów" dla każdego szczepu.
2. Analizuj dane za pomocą odpowiedniej metody statystycznej (np. test t-studenta, analiza wariancji) przy użyciu programu Microsoft Excel lub innych programów statystycznych.
3. Aby narysować surowe dane na wykresie, oblicz procent tlenu pozostałego dla każdego punktu czasowego, który chcesz narysować na wykresie. Podziel pierwszy odczyt przez sam i pomnóż przez 100 (pozostało 100% tlenu), a następnie podziel każdy kolejny odczyt przez pierwszy odczyt i pomnóż przez 100, aby uzyskać procent tlenu pozostałego w komorze.

7. Indukcja kiełkowania teliosporu w celu wyizolowania teliospory na różnych etapach kiełkowania

1. Przygotować PDB (24 g/l) uzupełniony siarczanem streptomycyny (160 μg/ml) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Umieścić około 10 mg teliospory U. maydis w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
3. Zawiesić teliospory w 500 μl PDB. Delikatnie odpipetować do mieszania, aż w podłożu nie będzie grudek teliospor.
4. Przenieść zawiesinę telioporu do autoklawowanej kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml zawierającej PDB uzupełnioną siarczanem streptomycyny.
5. Inkubować kolbę przez noc w temperaturze 28 °C, wytrząsając z prędkością 90 obr./min.

8. Przygotowanie szalki Petriego i mikromanipulatora

1. Przygotować szalkę Petriego (57^cm2), pipetując rzędy kropel do przygotowania mikrokapilarnego i pobrania próbki.
   1. Odpipetować 5 μl (x4) dH₂O kropelek w poprzek górnej części szalki Petriego.
   2. Odpipetować 2 μl (x3) roztworu stabilizującego RNA na szalce Petriego, który ma być użyty do pobrania próbki.
   3. Odpipetować 5 μl (x30) kropelek kiełkujących teliospory na szalce Petriego.
2. Dodaj 15 ml oleju mineralnego na szalkę Petriego. Przed kontynuowaniem upewnij się, że wszystkie kropelki są pokryte olejem.
3. Przygotuj mikrokapilę o średnicy wewnętrznej 15 μm, kołnierzu 1 mm, długości 55 mm i kącie końcówki 20°, umieszczając ją w uchwycie mikrokapilary i zanurzając w oleju mineralnym, gdzie działanie kapilarne pozwoli olejowi mineralnemu dostać się do mikrokapilary. Zwolnij ciśnienie w mikrokapilarze przed doprowadzeniem go do kropli wody. Zassać, aby przygotować mikrokapilę wodą.

9. Izolacja specyficznych dla danego etapu kiełkujących teliospor

1. Za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora przenieś przygotowaną mikrokapilę do jednej z kropelek kiełkowania. Przeniknij do kropelki, opuść mikrokapilę i doprowadź ujście mikrokapilary do kiełkującego teliospora na etapie kiełkowania będącego przedmiotem zainteresowania.
2. Powoli aspiruj, aby uchwycić kiełkujący teliospore. Przestań zasysać, gdy teliospora dostanie się do mikrokapilary. Powtarzaj, aż w mikrokapilarze znajdzie się około pięciu teliospory.
3. Podnieś mikrokapilar za pomocą mikromanipulatora i przyłóż go do kropli zbiorczej roztworu stabilizującego RNA. Przeniknąć do kropli i wstrzyknąć teliospory do kropli.
4. Powtarzaj kroki od 8.1 do 8.3, aż zostanie przechwyconych około 1000 teliospory.

10. Odzyskiwanie kropli kolekcji

1. Odpipetować kroplę i przenieść ją do pokrywy probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml wolnej od RNaz/DNaz. Ostrożnie usuń olej mineralny za pomocą pipety, nie naruszając kropli zbierającej.
2. Teliospory można używać do dalszych zastosowań, takich jak izolacja RNA.

Wyniki

Korzystając z opartej na mikrorespirometrze metody pomiaru zmian w oddychaniu podczas spoczynku i kiełkowania teliosporu, potwierdziliśmy, że uśpione teliospory wykazują niski poziom oddychania (~1,075 μmol/h/mg) w porównaniu do kiełkujących teliospory (~2,614 μmol/h/mg; Rysunek 1A). Stanowi to ~2,4-krotną zmianę w średnim tempie oddychania między uśpionymi teliospory a teliospory, które zostały indukowane do kiełkowania. Ponadto stwierdziliśmy, że teliospory, które zo...

Dyskusja

Biotroficzne patogeny roślin podstawczaków powodują miliardy dolarów strat w uprawach rocznie. Zdecydowana większość tych patogenów wytwarza teliospory, które są integralną częścią rozprzestrzeniania się grzybów i rozmnażania płciowego. Zdobycie wiedzy na temat rozwoju i kiełkowania teliospory ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia rozprzestrzeniania się wyniszczających chorób wywoływanych przez te grzyby. W celu identyfikacji zmian molekularnych w kluczowych punktach kontrolnych opracowaliśmy metodę identyfikacji czasu z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan streptomycyny	BioShop	STP101
Siarczan kanamycyny	BioShop	KAN201
Rosół z dekstrozy ziemniaczanej	BD Difco	254920
1 l Blender laboratoryjny Waring		7011S
Gaza	VWR	470150-438
Eksykator polipropylenowy Nalgene z kranem	ThermoFisher Scientific	5310-0250
Unisense
Czujnik mikrooddychania (O2)	Unisense	OX10
MicroOptode		Unisense N/A
MR-CH Mały	Unisense	MR-CHoprogramowanie
śledzenia	Unisense	N/A
Stojak do mikrooddychania	Unisense	MR2-Rack
Mieszadło do mikrooddychania	Unisense	MR2-Co
System mikrodysekcji
Axio Vert.A1 Mikroskop światła odwróconego	Zeiss
Coarse Coarse Manipulator	Narishige	MMN-1
Trójosiowy wiszący joystick Olejowy mikromanipulator hydrauliczny	Narishige	MMO-202ND
Mikrowtryskiwacz pneumatyczny	Narishige	IM-11-2
TransferTip (ES)	Eppendorf	5175107004