Artykuł metodologiczny

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

DOI:

10.3791/57637

⸱

18 maja 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ odpornościowy działa poprzez utrzymywanie ścisłej równowagi między koordynacją odpowiedzi przeciwko obcym antygenom a utrzymywaniem stanu braku reakcji na własne antygeny, jak również antygeny pochodzące z organizmów komensalnych. Zakłócenie tej homeostazy immunologicznej może prowadzić do przewlekłego stanu zapalnego i rozwoju autoimmunizacji. Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki wrodzonego układu odpornościowego prezentujące antygen, zaangażowane w aktywację naiwnych limfocytów T w celu zainicjowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko obcym antygenom. Jednak DC można również różnicować w TolDC, które działają w celu utrzymania i promowania tolerancji limfocytów T oraz tłumienia komórek efektorowych, przyczyniając się do rozwoju autoimmunologicznych lub przewlekłych stanów zapalnych. Niedawny postęp w naszym zrozumieniu TolDC sugeruje, że tolerancję DC można osiągnąć poprzez modulację warunków ich różnicowania. Zjawisko to doprowadziło do ogromnego wzrostu w rozwoju terapii TolDC dla wielu zaburzeń immunologicznych spowodowanych przerwaniem tolerancji immunologicznej. Udane badania na przedklinicznych mysich modelach autoimmunologicznych dodatkowo potwierdziły immunoterapeutyczną przydatność TolDC w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Obecnie TolDC stały się obiecującym narzędziem immunoterapeutycznym w praktyce klinicznej do przywracania tolerancji immunologicznej w różnych zaburzeniach immunologicznych poprzez celowanie w patogenne odpowiedzi autoimmunologiczne przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej odporności ochronnej. Chociaż wiele laboratoriów zaproponowało szereg strategii indukcji TolDC, nie ma spójności w charakteryzowaniu komórkowego i funkcjonalnego fenotypu tych komórek. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący rozwoju DC pochodzących ze szpiku kostnego w dużych ilościach, unikalnej metody stosowanej do różnicowania ich w TolDC za pomocą syntetycznego triterpenoidu 2-cyjano-3,12-dioksooleana-1,9-dien-28-oes-difluoro-propyloamidu (CDDO-DFPA) oraz technik stosowanych do potwierdzania ich fenotypu, w tym analizy podstawowych sygnatur molekularnych TolDC. Na koniec pokazujemy metodę oceny funkcji TolDC poprzez testowanie ich odpowiedzi immunosupresyjnej in vitro i in vivo w przedklinicznym modelu stwardnienia rozsianego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są integralną częścią wrodzonego układu odpornościowego i zostały po raz pierwszy odkryte i scharakteryzowane przez Ralpha Steinmana i Zanvila Cohna w 1973 roku jako podstawowe profesjonalne komórki prezentujące antygen1. Wykazano, że DC odgrywają ważną rolę w aktywacji immunologicznej poprzez prezentowanie przetworzonych antygenów limfocytom T i limfocytom B za pośrednictwem głównych kompleksów zgodności tkankowej (MHC) w wtórnych narządach limfatycznych w celu połączenia wrodzonego i adaptacyjnego układu odpornościowego2. W układzie odpornościowym ssaków istnieją co najmniej dwie kategorie DC, które zostały opisane jako mieloidalne DC i plazmocytoidalne DC (pDCs)3. Mieloidalne DC, znane również jako konwencjonalne DC (cDC), charakteryzują się ekspresją CD11c i mogą być różnicowane jako niedojrzałe DC (iDC) in vitro z komórek progenitorowych szpiku kostnego lub monocytów krwi obwodowej przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) i IL-4 odpowiednio u gatunków mysich lub ludzkich4.

Aktywacja sygnałów 'niebezpieczeństwa', takich jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) lub wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP), przyspieszy dojrzewanie iDC w kierunku immunogennych DC jako dojrzałych DC (mDCs) poprzez wiązanie różnych receptorów rozpoznawania wzorców na powierzchni DC5. Immunogenne DC dodatkowo inicjują proliferację i różnicowanie naiwnych limfocytów T poprzez regulację w górę MHCII2, ligandów kostymulujących (CD80, CD86 i CD40)6, cytokin i innych rozpuszczalnych mediatorów7. Kaskada produkcji mediatorów prozapalnych z immunogennych DC jest niezbędna do różnicowania limfocytów T za pośrednictwem cytokin. Na przykład zarówno IFN-γ, jak i IL-12 są niezbędne do różnicowania Th18, a IL-1, IL-6 i IL-23 są krytyczne dla naiwnej polaryzacji limfocytów T w kierunku komórek Th179. Chociaż dojrzałe DC reagują na obce antygeny, niekontrolowana aktywacja DC przez własne antygeny może powodować ablację tolerancji i sprzyjać rozwojowi chorób autoimmunologicznych poprzez generowanie autoreaktywnych limfocytów T, których aktywacja prowadzi do zniszczenia tkanek10.

Ostatnie raporty dostarczyły wyraźnych dowodów na plastyczność DC, czego przykładem jest ich zdolność do interakcji z różnymi sygnałami w mikrośrodowisku tkanek i różnicowania się na odrębne podzbiory DC efektorowe/tłumiące. Wykazano, że mediatory przeciwzapalne, takie jak IL-1011, TGF-β12 i HO-113 odgrywają ważną rolę w supresji immunologicznej poprzez indukowanie tolerogennych DC (TolDCs). Te TolDC przejmują funkcje regulacyjne i hamują proliferację limfocytów T14. Co więcej, brak kostymulacji przez DC i produkcja mediatorów przeciwzapalnych z TolDC przyczyniają się do indukcji regulatorowych limfocytów T (Treg), a także skutecznie hamują różnicowanie i ekspansję zarówno Th1, jak i Th1715. W ciągu ostatnich dwóch dekad potencjał terapeutyczny TolDC został zgłoszony przez kilku badaczy. W tych badaniach podawanie TolDC generowanych ex vivo nie tylko złagodziło objawy patologiczne w różnych przedklinicznych modelach chorób autoimmunologicznych16, ale także doprowadziło do rozwoju tolerancji immunologicznej u pacjentów17,18. Co ciekawe, obecnie terapia TolDCs została uznana za alternatywne lub wspomagające podejście do chorób autoimmunologicznych w kilku badaniach klinicznych, w tym w cukrzycy typu 119, reumatoidalne zapalenie stawów20,21, stwardnienie rozsiane (MS)22,23,24 oraz choroba Leśniowskiego-Crohna25.

Istnieje wiele protokołów, które zostały wykorzystane do opracowania TolDC, a kilka laboratoriów zgłosiło metody generowania i charakterystyki fenotypowej TolDC. Metody te mogą być wykorzystywane do powtarzalnego generowania TolDC in vitro z hematopoetycznych komórek progenitorowych i stabilnego utrzymywania ich w stanie tolerogennym in vivo26,27,28,29. iDC mogą zostać przekształcone w TolDC poprzez ekspozycję na różne immunomodulujące środki farmakologiczne lub cytokiny przeciwzapalne. Na przykład witamina D3 jest dobrze znanym środkiem farmakologicznym, o którym wiadomo, że zwiększa produkcję IL-10 i hamuje wydzielanie IL-12 z DC, a tym samym zwiększa ich funkcję immunosupresyjną30. Ponadto, gdy DC są narażone na silne bodźce zapalne, takie jak lipopolisacharydy (LPS), wykazano, że kilka środków farmakologicznych, takich jak deksametazon31, rapamycin32 i kortykosteroidy33 indukują fenotyp TolDC poprzez zmniejszenie ekspresji powierzchniowej DC CD40, CD80, CD86 i MHCII34. IL-10 i TGF-β są najczęściej badanymi cytokinami przeciwzapalnymi indukującymi tolerancję DC35, a jednoczesna ekspozycja na obie te cytokiny indukuje tolerogenny fenotyp w DCs36.

Ponieważ tolerogenne DC jest definiowane przez cechy funkcjonalne, a nie przez markery fenotypowe, istnieje wielka potrzeba opracowania spójnej metody komórkowej i funkcjonalnej charakterystyki TolDC. Co więcej, należy ustanowić rygorystyczny i spójny protokół dla spójnej oceny i charakterystyki tolerogennego fenotypu DC, jeśli mamy skutecznie i powtarzalnie porównać zdolność nowych czynników do indukowania fenotypu TolDC w laboratorium. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół z metodami krok po kroku do izolacji iDC od hematopoetycznych komórek progenitorowych myszy, a następnie do analizy skuteczności nowych czynników poddawanych ocenie pod kątem ich zdolności do przekształcania iDC w TolDC, zapewniając solidną charakterystykę funkcjonalną i fenotypową TolDC zarówno in vitro, jak i in vivo. Opis ten obejmuje rozbudowaną metodę charakteryzowania TolDC na podstawie ich ligandów powierzchniowych, profilu cytokin i funkcji immunosupresyjnych in vitro. Podajemy również przykład metody badania potencjalnego zastosowania terapeutycznego tych TolDC w przedklinicznym modelu stwardnienia rozsianego, eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (EAE). Ten ustalony protokół pomoże badaczom ocenić zdolność nowych środków do promowania indukcji TolDC i ułatwi wysiłki na rzecz poszerzenia zakresu rozwoju terapeutycznego TolDC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Case Western Reserve University School of Medicine.

1. Przygotowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC)

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i przeprowadź eksperyment w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
  2. Eutanazja myszy C57BL/6 w wieku 8 - 10 tygodni za pomocą komory CO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Wyciąć kości piszczelowo-strzałkowe i udowe za pomocą nożyczek chirurgicznych i umieścić je z 70% etanolem w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
  3. Użyj ostrzy chirurgicznych i kleszczy, aby wyciąć tkankę w jak największym stopniu na pokrywie 10-centymetrowej płytki hodowlanej i odizoluj piszczele i kości udowe, aby umieścić je z 70% etanolem w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm.
  4. Użyj ostrzy chirurgicznych, aby przyciąć oba końce piszczeli i kości udowych. Użyć 3 ml PBS w strzykawce o pojemności 3 ml z igłą 23G, aby przepłukać zawartość szpiku kostnego z jednego końca kości do stożkowej probówki zawierającej 12 ml PBS. Powtórz ten krok 3 razy dla każdego końca kości.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 min.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu lizującego ACK na 5 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek.
  7. Dodać 9 ml PBS do rozcieńczenia buforu lizującego ACK i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 10 ml pożywki hodowlanej (RPMI-1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% aminokwas endogenny (100x), 10 mM HEPES, 50 nM β-merkaptoetanolu i 5% penicylina/streptomycyna).
    UWAGA: Poziom endotoksyny musi być mniejszy niż 0,1 EU/ml w FBS.
  9. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm i pobrać 20 μl zawiesiny komórek, wymieszać z 80 μl błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru.
  10. Dostosuj liczbę komórek do 1 x 106 komórek/ml z 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.
  11. Umieścić 3 ml 1 x 106 komórek/ml w każdym dołku na płytce 6-dołkowej i inkubować komórki w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2.
    UWAGA: Komórki szpiku kostnego z jednej myszy mają około 3 - 5 x 107 komórek, co wskazuje, że można je umieścić od 2 do 3 płytek 6-dołkowych.
  12. W dniu 3 usuń wszystkie 3 ml pożywki hodowlanej z każdej studzienki, dodaj 2 ml świeżego PBS do każdej studzienki, a następnie delikatnie zakręć płytką, aby upewnić się, że usunięto wszystkie nieprzylegające komórki.
  13. Zastąp 3 ml świeżej pożywki hodowlanej 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4 w każdym dołku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2 .
  14. W dniu 5 należy bezpośrednio dodać kolejne 3 ml świeżej pożywki hodowlanej z 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4 do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2.
    UWAGA: Całkowita objętość w każdym dołku wynosi teraz 6 ml.
  15. W dniu 7 połóż cały talerz na lodzie na 10 minut. Delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w każdym dołku, aby usunąć luźno przylegające BMDC jako iDC do zawiesiny.
    UWAGA: Przylegające makrofagi są nadal przymocowane do płytki. Niska temperatura i delikatne procedury są kluczem do uniknięcia aktywacji prądu stałego, która wpływa na dalsze eksperymenty.
  16. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić ze świeżą pożywką hodowlaną do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: BMDC można zidentyfikować za pomocą znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała CD11c za pomocą cytometrii przepływowej, a my pokazaliśmy naszą strategię bramkowania BMDC do dalszych eksperymentów w Rysunek 1.

2. Scharakteryzuj profil genu i białka TolDC

  1. Płytka 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml na basenik na płytce 6-dołkowej z pożywką w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2.
    UWAGA: CDDO-DFPA, syntetyczny triterpenoid, jest induktorem czynnika jądrowego (pochodzącego z erytroidu 2)-podobnego do czynnika 2 (Nrf2) i inhibitorem czynnika jądrowego κB (NF-κB). Zastosuj inne środki do indukcji TolDC z iDC, takie jak IL-10, witamina D3, deksametazon lub BAY 11-7085 i zmodyfikuj ten krok do optymalnych warunków dla każdego środka.
  2. Dodaj 10 lub 100 ng / ml LPS do inkubacji 4-24 godzin w celu indukcji mDC (czas inkubacji jest inny ze względu na pomiar mRNA lub białka).
  3. Delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w każdym dołku i zebrać zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby zebrać odpowiednio komórki i supernatant.
  4. Analizuj ligandy powierzchniowe z osadów komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej, takie jak ligandy stymulujące: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL lub ligandy hamujące: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Wyizoluj RNA z osadów komórkowych i przeanalizuj próbki RNA i supernatantu pod kątem profilu cytokin oraz poziomów genów i białek za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i ELISA, odpowiednio.
    UWAGA: Na przykład cytokiny zapalne: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 i IL-23 lub cytokiny przeciwzapalne: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 i HO-1.

3. Oceń funkcję TolDC in vitro i in vivo

  1. Test proliferacji syngenicznej komórek T
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i przeprowadź eksperyment w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
    2. Przygotować bufor MACS przy użyciu 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA w 500 ml PBS. Wysterylizuj bufor, filtrując przez filtr 0,2 μm.
      UWAGA: Trzymaj bufor na lodzie podczas następującego eksperymentu.
    3. Aby uzyskać limfocyty T CD4 +, należy poddać eutanazji transgeniczne myszy z receptorem komórek T OT-II (TCR) w wieku 8-10 tygodni za pomocą komoryCO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
    4. Umieścić śledzionę z 2 ml PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm i użyć grzbietu popychacza ze strzykawki o pojemności 3 ml do rozdrobnienia śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm.
    5. Zebrać zawiesinę komórkową i wirować przy 300 x g przez 5 minut.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu MACS.
    7. Dodaj 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał biotynowych CD4+ z limfocytów T w temperaturze 4°C przez 5 minut.
      UWAGA: Koktajl przeciwciał wiąże się z innymi typami komórek z wyjątkiem limfocytów T CD4 +, takich jak CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasa II, Ter-119 i TCRγ / δ.
    8. Dodać 300 μl buforu MACS i 200 μl kulek antybiotyny (tabela materiałów) w temperaturze 4°C przez 10 minut.
    9. Umieścić kolumnę złożoną z kulek ferromagnetycznych (tabela materiałów) i filtra do wstępnej separacji w polu magnetycznym i przepłukać ją 3 ml buforu MACS.
    10. Dodać 9 ml buforu MACS do komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    11. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu MACS i nałożyć na kolumnę. Zbierz przepływowe limfocyty T CD4 +.
    12. Przepłukać kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS, a także zebrać przepływ.
    13. Aby uzyskać DC śledziony, należy poddać eutanazji myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni za pomocą komory CO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Umieść śledzionę w 6-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym 2 ml roztworu kolagenazy D (2 mg/ml kolagenazy D rozpuszczonej w HBSS zawierającej wapń, magnez).
    14. Wstrzyknąć 1 ml roztworu kolagenazy D do śledziony dwa razy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25G. Pokrój śledzionę na małe kawałki małymi nożyczkami.
    15. Wstrząśnij i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
    16. Dodaj 500 μl 0,5 M EDTA w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      UWAGA: Kroki z 3.1.13-3.1.14 mają kluczowe znaczenie dla zwiększenia wydajności DC.
    17. Teraz użyj tylnej części popychacza strzykawki o pojemności 3 ml, aby zmielić zawiesinę śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm i zebrać zawiesinę komórkową przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
    18. Zawiesić osad komórkowy w 350 μl buforu MACS, 50 μl odczynnika blokującego FcR i 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał z komórek dendrytycznych Pan Dendritic w temperaturze 4°C przez 10 minut.
      UWAGA: Koktajl przeciwciał przeciwko antygenom, które nie są eksprymowane przez DC.
    19. Przemyć komórki, dodając 9 ml buforu MACS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    20. Zawiesić osad komórkowy w 800 μl buforu MACS i dodać 200 μl kulek antybiotyny w temperaturze 4°C na 10 minut.
    21. Powtórz kroki z 3.1.9-3.1.11, aby zebrać kontrolery domeny.
    22. Przemyć kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS dwa razy, a także zebrać przepływ.
    23. Traktować 2 x 105 DC/ml w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Oddzielnie oznaczyć limfocyty T CD4 + (1 x 107 / ml) 1 μM CFSE w temperaturze 37 ° C przez 15 minut, przemyć PBS i ponownie dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie na poziomie 2 x 106 limfocytów T / ml.
    24. Następnie, na 96-dołkowej płytce, należy wspólnie wyhodować 100 μl traktowanych komórek dendrytycznych z tą samą objętością limfocytów T CD4 + znakowanych CFSE, oba zebrane z powyższych kroków, aby uzyskać stosunek 1:10. Teraz dodaj 100 ng / ml peptydu albuminy jaja kurzego (OVA) 323-329 na dołek i zmierz intensywność CFSE limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej po 2-3 dniach inkubacji.
      UWAGA: Liczba komórek i stosunek komórek DC i T zostały zoptymalizowane w stosunku do naszego poprzedniego work37.
  2. Indukuj pasywne EAE poprzez wstrzykiwanie BMDC pulsowanych glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) (35-55)
    1. Płytka 2 ml 1 x 106 BMDC/ml na basenik na płytce 6-dołkowej z pożywką w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA do inkubacji przez 1 godzinę.
    2. Dodać 10 ng/ml LPS do inkubacji przez 24 godziny.
    3. Dodać 100 μg/ml MOG (35-55) do inkubacji przez 4 godziny.
    4. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    5. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą PBS i policzyć komórki.
    6. Podskórnie wstrzyknąć 200 μl 2 x 106 komórek 8-10 tygodniowym samicom myszy C57BL/6 (100 μl do każdej tylnej nogi).
    7. W dniu wstrzyknięcia BMDC i 48 godzin później wstrzyknij 200 ng toksyny krztuścowej (PTX) każdej myszy.
    8. Kroki 3.2.6-3.2.7 powtarzaj raz w tygodniu przez 4 kolejne tygodnie.
    9. Oceniaj objawy kliniczne EAE codziennie, korzystając ze standardowych kryteriów37 (0,5-bezwładny koniec ogona, 1-utykający ogon, 2-umiarkowane osłabienie kończyn tylnych, 3-ciężkie osłabienie kończyn tylnych, 4-całkowity paraliż kończyn tylnych, 5-porażenie czterokończynowe lub stan agonalny, 6-śmierć).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zróżnicowanie i wybór BMDC:

Komórki progenitorowe szpiku kostnego hodowano w kompletnym pożywce RPMI w obecności GM-CSF i IL-4, aby różnicować się w iDC przez 7 dni (Rysunek 1A). W pierwszym dniu komórki były małe i wykazywały sferyczną morfologię. Mycie PBS przed wymianą świeżej pożywki w dniu 3 pomogło komórkom w tworzeniu klastrów, a także zwiększyło populację komórek CD11c+. W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano skuteczny protokół, który może być wykorzystany do powtarzalnego generowania iDC, a następnie różnicowania ich w TolDC, i proponujemy, że można go zastosować do oceny zdolności nowych molekularnych środków docelowych do indukowania fenotypu TolDC. Jak opisano w tym raporcie, postępowaliśmy zgodnie z sekwencją, w której najpierw przeanalizowaliśmy ekspresję ligandów powierzchniowych TolDC za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie dokonaliśmy oceny profilu cytokin DC mierzonego za pomocą qRT-PCR i E...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Reata Pharmaceuticals za dostarczenie CDDO-DFPA. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Katedry Innowacji w Nowotworach Dziecięcych im. Jane i Lee Seidmanów (John Letterio). Prace te były wspierane przez Departament Obrony [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler Inicjatywa Badań nad Rakiem Młodzieży i Młodych Dorosłych w Case Comprehensive Cancer Center; oraz Callahan Graduate Scholar Award dla Hsi-Ju Wei od Fundacji F.J. Callahana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsdo syntezy własnejHodowla komórkowa
myszy GM-CSFPeprotech Inc.315-03różnicująca BMDC
IL-4Peprotech Inc.214-14Różnicowanie BMDC
Lipopolisacharydy (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Hodowla komórkowa
i beta;-merkaptoetanolSigma Aldrich Inc.516732Hodowla komórkowa
Toksyna krztuścowa (PTX)R& Systemy D3097EAE indukcyjne
MOG (35– 55) peptyd21stCentury Biochemicalsw syntezie domowejIndukcja EAE
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Hodowla komórkowa
RPMI-1640 plus L-glutaminaThermoFisher Scientific11875-093Hodowla komórkowa
Aminokwas endogenny (100X)ThermoFisher Scientific11140050Hodowla komórkowa
HEPESThermoFisher Scientific15630080Hodowla komórkowa
penicylina/streptomycynaThermoFisher Scientific15140122Hodowla komórkowa
40 μ m Sitko do komórekCorning352340Izolacja komórek
CD80 sprzężona z PEBiosciences557227Cytometria przepływowa Cytometria
PE sprzężona z CD86BD Biosciences555665Cytometria przepływowa
PD-L1 sprzężona z PEBioLegend124307Cytometria przepływowa
Sprzężona z APC MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Cytometria przepływowa
CD11c sprzężona z APC BDBiosciences340544Cytometria przepływowa
Dopasowany izotyp PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Cytometria przepływowa
Dopasowany izotyp APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Cytometria przepływowa
CFSEBioLegend423801Test proliferacji limfocytów T
Zestaw do izolacji komórek dendrytycznychMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów T
Odczynnik blokujący FcRMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów
T Koktajl biotynowo-przeciwciałowy z komórek dendrytycznychMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów T
Mikrogranulki antybiotynyMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów T
CD4 + Zestaw do izolacji limfocytówT Miltenyi Biotec Inc.130-104-454Test proliferacji limfocytów
T CD4 + Koktajl biotyny-przeciwciała z limfocytówT Miltenyi Biotec Inc.130-104-454Test proliferacji limfocytów T
Mikrogranulki antybiotynyMiltenyi Biotec Inc.130-104-454Test proliferacji limfocytów
T Bufor lizujący ACKThermoFisher ScientificA1049201Różnicowanie BMDC
1 ml strzykawkaBD Biosciences309626Test proliferacji limfocytów T
Strzykawka 3 mlBD Biosciences309588Igła różnicowania BMDC
Test proliferacji limfocytów T309626Biosciences
Igła 23GBD Biosciences309588różnicowanie BMDC,
BSASigma, Aldrich, Inc.proliferacji limfocytów TA2058
EDTAThermoFisher Scientific15575020Test proliferacji limfocytów T
Kolumna LSMiltenyi Biotec Inc.130-042-401Test proliferacji limfocytów T
Filtr wstępnej separacjiMiltenyi Biotec Inc.130-095-823Test proliferacji limfocytów T
kolagenaza DSigma Aldrich Inc.Testproliferacji limfocytów T
11088858001 HBSSThermoFisher Scientific14025076Test proliferacji limfocytów
T peptyd albuminy jaja kurzego (OVA) 323– 329Sigma Aldrich Inc.Test proliferacji limfocytów TO1641
Mysz IFN-γ Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01168134_m1mysz qRT-PCR
IL-12a Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mysz IL-12 p70 DuoSet ELISAR& Systemy DDY419-05ELISA
Mysz EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-&alfa; Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mysz TNF-α Zestaw Quantikine ELISA R& D systemsMTA00BELISA
IL-6 Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mysz IL-6 Quantikine ELISA KitR& D systemsM6000BELISA
IL-23a Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mysz IL-23 DuoSet ELISAR& Systemy DDY1887-05Sonda ELISA
IL-4 TaqManThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Przeciwciało anty-hemowej oksygenazy 1Abcamab13248Western blot
Przeciwciało anty-&beta-aktynoweAbcamab8226Western blotting
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Analizator komórekBD BiosciencesCytometria przepływowa
Mysz BD Test

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki dendrytyczne pochodz ce z szpiku kostnegoleczenie CDDO DFPAanaliza cytometrycznatest proliferacji limfocyt w Tmagnetyczne sortowanie kom rekekspresja gen w cytokinredukcja stanu zapalnegomodel autoimmunizacyjnego zapalenia mielitowegobadanie odpowiedzi immunosupresyjnej

Powiązane artykuły