Method Article

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

DOI:

10.3791/57637

⸱

May 18th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ odpornościowy działa poprzez utrzymywanie ścisłej równowagi między koordynacją odpowiedzi przeciwko obcym antygenom a utrzymywaniem stanu braku reakcji na własne antygeny, jak również antygeny pochodzące z organizmów komensalnych. Zakłócenie tej homeostazy immunologicznej może prowadzić do przewlekłego stanu zapalnego i rozwoju autoimmunizacji. Komórki dendrytyczne (DC) to profesjonalne komórki wrodzonego układu odpornościowego prezentujące antygen, zaangażowane w aktywację naiwnych limfocytów T w celu zainicjowania odpowiedzi immunologicznej przeciwko obcym antygenom. Jednak DC można również różnicować w TolDC, które działają w celu utrzymania i promowania tolerancji limfocytów T oraz tłumienia komórek efektorowych, przyczyniając się do rozwoju autoimmunologicznych lub przewlekłych stanów zapalnych. Niedawny postęp w naszym zrozumieniu TolDC sugeruje, że tolerancję DC można osiągnąć poprzez modulację warunków ich różnicowania. Zjawisko to doprowadziło do ogromnego wzrostu w rozwoju terapii TolDC dla wielu zaburzeń immunologicznych spowodowanych przerwaniem tolerancji immunologicznej. Udane badania na przedklinicznych mysich modelach autoimmunologicznych dodatkowo potwierdziły immunoterapeutyczną przydatność TolDC w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Obecnie TolDC stały się obiecującym narzędziem immunoterapeutycznym w praktyce klinicznej do przywracania tolerancji immunologicznej w różnych zaburzeniach immunologicznych poprzez celowanie w patogenne odpowiedzi autoimmunologiczne przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej odporności ochronnej. Chociaż wiele laboratoriów zaproponowało szereg strategii indukcji TolDC, nie ma spójności w charakteryzowaniu komórkowego i funkcjonalnego fenotypu tych komórek. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący rozwoju DC pochodzących ze szpiku kostnego w dużych ilościach, unikalnej metody stosowanej do różnicowania ich w TolDC za pomocą syntetycznego triterpenoidu 2-cyjano-3,12-dioksooleana-1,9-dien-28-oes-difluoro-propyloamidu (CDDO-DFPA) oraz technik stosowanych do potwierdzania ich fenotypu, w tym analizy podstawowych sygnatur molekularnych TolDC. Na koniec pokazujemy metodę oceny funkcji TolDC poprzez testowanie ich odpowiedzi immunosupresyjnej in vitro i in vivo w przedklinicznym modelu stwardnienia rozsianego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są integralną częścią wrodzonego układu odpornościowego i zostały po raz pierwszy odkryte i scharakteryzowane przez Ralpha Steinmana i Zanvila Cohna w 1973 roku jako podstawowe profesjonalne komórki prezentujące antygen1. Wykazano, że DC odgrywają ważną rolę w aktywacji immunologicznej poprzez prezentowanie przetworzonych antygenów limfocytom T i limfocytom B za pośrednictwem głównych kompleksów zgodności tkankowej (MHC) w wtórnych narządach limfatycznych w celu połączenia wrodzonego i adaptacyjnego układu odpornościowego2. W układzie odpornościowym ssaków istnieją co najmniej dwie kategorie DC, które zostały opisane jako mieloidalne DC i plazmocytoidalne DC (pDCs)3. Mieloidalne DC, znane również jako konwencjonalne DC (cDC), charakteryzują się ekspresją CD11c i mogą być różnicowane jako niedojrzałe DC (iDC) in vitro z komórek progenitorowych szpiku kostnego lub monocytów krwi obwodowej przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF) i IL-4 odpowiednio u gatunków mysich lub ludzkich4.

Aktywacja sygnałów 'niebezpieczeństwa', takich jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) lub wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP), przyspieszy dojrzewanie iDC w kierunku immunogennych DC jako dojrzałych DC (mDCs) poprzez wiązanie różnych receptorów rozpoznawania wzorców na powierzchni DC5. Immunogenne DC dodatkowo inicjują proliferację i różnicowanie naiwnych limfocytów T poprzez regulację w górę MHCII2, ligandów kostymulujących (CD80, CD86 i CD40)6, cytokin i innych rozpuszczalnych mediatorów7. Kaskada produkcji mediatorów prozapalnych z immunogennych DC jest niezbędna do różnicowania limfocytów T za pośrednictwem cytokin. Na przykład zarówno IFN-γ, jak i IL-12 są niezbędne do różnicowania Th18, a IL-1, IL-6 i IL-23 są krytyczne dla naiwnej polaryzacji limfocytów T w kierunku komórek Th179. Chociaż dojrzałe DC reagują na obce antygeny, niekontrolowana aktywacja DC przez własne antygeny może powodować ablację tolerancji i sprzyjać rozwojowi chorób autoimmunologicznych poprzez generowanie autoreaktywnych limfocytów T, których aktywacja prowadzi do zniszczenia tkanek10.

Ostatnie raporty dostarczyły wyraźnych dowodów na plastyczność DC, czego przykładem jest ich zdolność do interakcji z różnymi sygnałami w mikrośrodowisku tkanek i różnicowania się na odrębne podzbiory DC efektorowe/tłumiące. Wykazano, że mediatory przeciwzapalne, takie jak IL-1011, TGF-β12 i HO-113 odgrywają ważną rolę w supresji immunologicznej poprzez indukowanie tolerogennych DC (TolDCs). Te TolDC przejmują funkcje regulacyjne i hamują proliferację limfocytów T14. Co więcej, brak kostymulacji przez DC i produkcja mediatorów przeciwzapalnych z TolDC przyczyniają się do indukcji regulatorowych limfocytów T (Treg), a także skutecznie hamują różnicowanie i ekspansję zarówno Th1, jak i Th1715. W ciągu ostatnich dwóch dekad potencjał terapeutyczny TolDC został zgłoszony przez kilku badaczy. W tych badaniach podawanie TolDC generowanych ex vivo nie tylko złagodziło objawy patologiczne w różnych przedklinicznych modelach chorób autoimmunologicznych16, ale także doprowadziło do rozwoju tolerancji immunologicznej u pacjentów17,18. Co ciekawe, obecnie terapia TolDCs została uznana za alternatywne lub wspomagające podejście do chorób autoimmunologicznych w kilku badaniach klinicznych, w tym w cukrzycy typu 119, reumatoidalne zapalenie stawów20,21, stwardnienie rozsiane (MS)22,23,24 oraz choroba Leśniowskiego-Crohna25.

Istnieje wiele protokołów, które zostały wykorzystane do opracowania TolDC, a kilka laboratoriów zgłosiło metody generowania i charakterystyki fenotypowej TolDC. Metody te mogą być wykorzystywane do powtarzalnego generowania TolDC in vitro z hematopoetycznych komórek progenitorowych i stabilnego utrzymywania ich w stanie tolerogennym in vivo26,27,28,29. iDC mogą zostać przekształcone w TolDC poprzez ekspozycję na różne immunomodulujące środki farmakologiczne lub cytokiny przeciwzapalne. Na przykład witamina D3 jest dobrze znanym środkiem farmakologicznym, o którym wiadomo, że zwiększa produkcję IL-10 i hamuje wydzielanie IL-12 z DC, a tym samym zwiększa ich funkcję immunosupresyjną30. Ponadto, gdy DC są narażone na silne bodźce zapalne, takie jak lipopolisacharydy (LPS), wykazano, że kilka środków farmakologicznych, takich jak deksametazon31, rapamycin32 i kortykosteroidy33 indukują fenotyp TolDC poprzez zmniejszenie ekspresji powierzchniowej DC CD40, CD80, CD86 i MHCII34. IL-10 i TGF-β są najczęściej badanymi cytokinami przeciwzapalnymi indukującymi tolerancję DC35, a jednoczesna ekspozycja na obie te cytokiny indukuje tolerogenny fenotyp w DCs36.

Ponieważ tolerogenne DC jest definiowane przez cechy funkcjonalne, a nie przez markery fenotypowe, istnieje wielka potrzeba opracowania spójnej metody komórkowej i funkcjonalnej charakterystyki TolDC. Co więcej, należy ustanowić rygorystyczny i spójny protokół dla spójnej oceny i charakterystyki tolerogennego fenotypu DC, jeśli mamy skutecznie i powtarzalnie porównać zdolność nowych czynników do indukowania fenotypu TolDC w laboratorium. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół z metodami krok po kroku do izolacji iDC od hematopoetycznych komórek progenitorowych myszy, a następnie do analizy skuteczności nowych czynników poddawanych ocenie pod kątem ich zdolności do przekształcania iDC w TolDC, zapewniając solidną charakterystykę funkcjonalną i fenotypową TolDC zarówno in vitro, jak i in vivo. Opis ten obejmuje rozbudowaną metodę charakteryzowania TolDC na podstawie ich ligandów powierzchniowych, profilu cytokin i funkcji immunosupresyjnych in vitro. Podajemy również przykład metody badania potencjalnego zastosowania terapeutycznego tych TolDC w przedklinicznym modelu stwardnienia rozsianego, eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego (EAE). Ten ustalony protokół pomoże badaczom ocenić zdolność nowych środków do promowania indukcji TolDC i ułatwi wysiłki na rzecz poszerzenia zakresu rozwoju terapeutycznego TolDC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Case Western Reserve University School of Medicine.

1. Przygotowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC)

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i przeprowadź eksperyment w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
  2. Eutanazja myszy C57BL/6 w wieku 8 - 10 tygodni za pomocą komory CO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Wyciąć kości piszczelowo-strzałkowe i udowe za pomocą nożyczek chirurgicznych i umieścić je z 70% etanolem w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm.
  3. Użyj ostrzy chirurgicznych i kleszczy, aby wyciąć tkankę w jak największym stopniu na pokrywie 10-centymetrowej płytki hodowlanej i odizoluj piszczele i kości udowe, aby umieścić je z 70% etanolem w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm.
  4. Użyj ostrzy chirurgicznych, aby przyciąć oba końce piszczeli i kości udowych. Użyć 3 ml PBS w strzykawce o pojemności 3 ml z igłą 23G, aby przepłukać zawartość szpiku kostnego z jednego końca kości do stożkowej probówki zawierającej 12 ml PBS. Powtórz ten krok 3 razy dla każdego końca kości.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 min.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml buforu lizującego ACK na 5 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek.
  7. Dodać 9 ml PBS do rozcieńczenia buforu lizującego ACK i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z 10 ml pożywki hodowlanej (RPMI-1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% aminokwas endogenny (100x), 10 mM HEPES, 50 nM β-merkaptoetanolu i 5% penicylina/streptomycyna).
    UWAGA: Poziom endotoksyny musi być mniejszy niż 0,1 EU/ml w FBS.
  9. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm i pobrać 20 μl zawiesiny komórek, wymieszać z 80 μl błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru.
  10. Dostosuj liczbę komórek do 1 x 106 komórek/ml z 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4.
  11. Umieścić 3 ml 1 x 106 komórek/ml w każdym dołku na płytce 6-dołkowej i inkubować komórki w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2.
    UWAGA: Komórki szpiku kostnego z jednej myszy mają około 3 - 5 x 107 komórek, co wskazuje, że można je umieścić od 2 do 3 płytek 6-dołkowych.
  12. W dniu 3 usuń wszystkie 3 ml pożywki hodowlanej z każdej studzienki, dodaj 2 ml świeżego PBS do każdej studzienki, a następnie delikatnie zakręć płytką, aby upewnić się, że usunięto wszystkie nieprzylegające komórki.
  13. Zastąp 3 ml świeżej pożywki hodowlanej 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4 w każdym dołku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2 .
  14. W dniu 5 należy bezpośrednio dodać kolejne 3 ml świeżej pożywki hodowlanej z 15 ng/ml GM-CSF i 10 ng/ml IL-4 do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2.
    UWAGA: Całkowita objętość w każdym dołku wynosi teraz 6 ml.
  15. W dniu 7 połóż cały talerz na lodzie na 10 minut. Delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w każdym dołku, aby usunąć luźno przylegające BMDC jako iDC do zawiesiny.
    UWAGA: Przylegające makrofagi są nadal przymocowane do płytki. Niska temperatura i delikatne procedury są kluczem do uniknięcia aktywacji prądu stałego, która wpływa na dalsze eksperymenty.
  16. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić ze świeżą pożywką hodowlaną do dalszych eksperymentów.
    UWAGA: BMDC można zidentyfikować za pomocą znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała CD11c za pomocą cytometrii przepływowej, a my pokazaliśmy naszą strategię bramkowania BMDC do dalszych eksperymentów w Rysunek 1.

2. Scharakteryzuj profil genu i białka TolDC

  1. Płytka 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml na basenik na płytce 6-dołkowej z pożywką w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95% w inkubatorze CO2.
    UWAGA: CDDO-DFPA, syntetyczny triterpenoid, jest induktorem czynnika jądrowego (pochodzącego z erytroidu 2)-podobnego do czynnika 2 (Nrf2) i inhibitorem czynnika jądrowego κB (NF-κB). Zastosuj inne środki do indukcji TolDC z iDC, takie jak IL-10, witamina D3, deksametazon lub BAY 11-7085 i zmodyfikuj ten krok do optymalnych warunków dla każdego środka.
  2. Dodaj 10 lub 100 ng / ml LPS do inkubacji 4-24 godzin w celu indukcji mDC (czas inkubacji jest inny ze względu na pomiar mRNA lub białka).
  3. Delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w każdym dołku i zebrać zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby zebrać odpowiednio komórki i supernatant.
  4. Analizuj ligandy powierzchniowe z osadów komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej, takie jak ligandy stymulujące: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL lub ligandy hamujące: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Wyizoluj RNA z osadów komórkowych i przeanalizuj próbki RNA i supernatantu pod kątem profilu cytokin oraz poziomów genów i białek za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i ELISA, odpowiednio.
    UWAGA: Na przykład cytokiny zapalne: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 i IL-23 lub cytokiny przeciwzapalne: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 i HO-1.

3. Oceń funkcję TolDC in vitro i in vivo

  1. Test proliferacji syngenicznej komórek T
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i przeprowadź eksperyment w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
    2. Przygotować bufor MACS przy użyciu 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA w 500 ml PBS. Wysterylizuj bufor, filtrując przez filtr 0,2 μm.
      UWAGA: Trzymaj bufor na lodzie podczas następującego eksperymentu.
    3. Aby uzyskać limfocyty T CD4 +, należy poddać eutanazji transgeniczne myszy z receptorem komórek T OT-II (TCR) w wieku 8-10 tygodni za pomocą komoryCO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
    4. Umieścić śledzionę z 2 ml PBS w naczyniu hodowlanym o średnicy 6 cm i użyć grzbietu popychacza ze strzykawki o pojemności 3 ml do rozdrobnienia śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm.
    5. Zebrać zawiesinę komórkową i wirować przy 300 x g przez 5 minut.
    6. Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu MACS.
    7. Dodaj 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał biotynowych CD4+ z limfocytów T w temperaturze 4°C przez 5 minut.
      UWAGA: Koktajl przeciwciał wiąże się z innymi typami komórek z wyjątkiem limfocytów T CD4 +, takich jak CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasa II, Ter-119 i TCRγ / δ.
    8. Dodać 300 μl buforu MACS i 200 μl kulek antybiotyny (tabela materiałów) w temperaturze 4°C przez 10 minut.
    9. Umieścić kolumnę złożoną z kulek ferromagnetycznych (tabela materiałów) i filtra do wstępnej separacji w polu magnetycznym i przepłukać ją 3 ml buforu MACS.
    10. Dodać 9 ml buforu MACS do komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    11. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml buforu MACS i nałożyć na kolumnę. Zbierz przepływowe limfocyty T CD4 +.
    12. Przepłukać kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS, a także zebrać przepływ.
    13. Aby uzyskać DC śledziony, należy poddać eutanazji myszy C57BL/6 w wieku 8-10 tygodni za pomocą komory CO2. Umieść mysz na desce sekcyjnej i spłucz 70% etanolem. Odizoluj śledzionę od lewej strony brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Umieść śledzionę w 6-milimetrowym naczyniu hodowlanym zawierającym 2 ml roztworu kolagenazy D (2 mg/ml kolagenazy D rozpuszczonej w HBSS zawierającej wapń, magnez).
    14. Wstrzyknąć 1 ml roztworu kolagenazy D do śledziony dwa razy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25G. Pokrój śledzionę na małe kawałki małymi nożyczkami.
    15. Wstrząśnij i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
    16. Dodaj 500 μl 0,5 M EDTA w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      UWAGA: Kroki z 3.1.13-3.1.14 mają kluczowe znaczenie dla zwiększenia wydajności DC.
    17. Teraz użyj tylnej części popychacza strzykawki o pojemności 3 ml, aby zmielić zawiesinę śledziony, przepuszczając sitko do komórek o wielkości 40 μm i zebrać zawiesinę komórkową przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut.
    18. Zawiesić osad komórkowy w 350 μl buforu MACS, 50 μl odczynnika blokującego FcR i 100 μl koktajlu biotyny i przeciwciał z komórek dendrytycznych Pan Dendritic w temperaturze 4°C przez 10 minut.
      UWAGA: Koktajl przeciwciał przeciwko antygenom, które nie są eksprymowane przez DC.
    19. Przemyć komórki, dodając 9 ml buforu MACS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    20. Zawiesić osad komórkowy w 800 μl buforu MACS i dodać 200 μl kulek antybiotyny w temperaturze 4°C na 10 minut.
    21. Powtórz kroki z 3.1.9-3.1.11, aby zebrać kontrolery domeny.
    22. Przemyć kolumnę kolejnymi 3 ml buforu MACS dwa razy, a także zebrać przepływ.
    23. Traktować 2 x 105 DC/ml w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Oddzielnie oznaczyć limfocyty T CD4 + (1 x 107 / ml) 1 μM CFSE w temperaturze 37 ° C przez 15 minut, przemyć PBS i ponownie dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie na poziomie 2 x 106 limfocytów T / ml.
    24. Następnie, na 96-dołkowej płytce, należy wspólnie wyhodować 100 μl traktowanych komórek dendrytycznych z tą samą objętością limfocytów T CD4 + znakowanych CFSE, oba zebrane z powyższych kroków, aby uzyskać stosunek 1:10. Teraz dodaj 100 ng / ml peptydu albuminy jaja kurzego (OVA) 323-329 na dołek i zmierz intensywność CFSE limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej po 2-3 dniach inkubacji.
      UWAGA: Liczba komórek i stosunek komórek DC i T zostały zoptymalizowane w stosunku do naszego poprzedniego work37.
  2. Indukuj pasywne EAE poprzez wstrzykiwanie BMDC pulsowanych glikoproteiną oligodendrocytów mieliny (MOG) (35-55)
    1. Płytka 2 ml 1 x 106 BMDC/ml na basenik na płytce 6-dołkowej z pożywką w obecności lub bez 100-400 nM CDDO-DFPA do inkubacji przez 1 godzinę.
    2. Dodać 10 ng/ml LPS do inkubacji przez 24 godziny.
    3. Dodać 100 μg/ml MOG (35-55) do inkubacji przez 4 godziny.
    4. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.
    5. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą PBS i policzyć komórki.
    6. Podskórnie wstrzyknąć 200 μl 2 x 106 komórek 8-10 tygodniowym samicom myszy C57BL/6 (100 μl do każdej tylnej nogi).
    7. W dniu wstrzyknięcia BMDC i 48 godzin później wstrzyknij 200 ng toksyny krztuścowej (PTX) każdej myszy.
    8. Kroki 3.2.6-3.2.7 powtarzaj raz w tygodniu przez 4 kolejne tygodnie.
    9. Oceniaj objawy kliniczne EAE codziennie, korzystając ze standardowych kryteriów37 (0,5-bezwładny koniec ogona, 1-utykający ogon, 2-umiarkowane osłabienie kończyn tylnych, 3-ciężkie osłabienie kończyn tylnych, 4-całkowity paraliż kończyn tylnych, 5-porażenie czterokończynowe lub stan agonalny, 6-śmierć).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zróżnicowanie i wybór BMDC:

Komórki progenitorowe szpiku kostnego hodowano w kompletnym pożywce RPMI w obecności GM-CSF i IL-4, aby różnicować się w iDC przez 7 dni (Rysunek 1A). W pierwszym dniu komórki były małe i wykazywały sferyczną morfologię. Mycie PBS przed wymianą świeżej pożywki w dniu 3 pomogło komórkom w tworzeniu klastrów, a także zwiększyło populację komórek CD11c+. W...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano skuteczny protokół, który może być wykorzystany do powtarzalnego generowania iDC, a następnie różnicowania ich w TolDC, i proponujemy, że można go zastosować do oceny zdolności nowych molekularnych środków docelowych do indukowania fenotypu TolDC. Jak opisano w tym raporcie, postępowaliśmy zgodnie z sekwencją, w której najpierw przeanalizowaliśmy ekspresję ligandów powierzchniowych TolDC za pomocą cytometrii przepływowej, a następnie dokonaliśmy oceny profilu cytokin DC mierzonego za pomocą qRT-PCR i E...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Reata Pharmaceuticals za dostarczenie CDDO-DFPA. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Katedry Innowacji w Nowotworach Dziecięcych im. Jane i Lee Seidmanów (John Letterio). Prace te były wspierane przez Departament Obrony [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler Inicjatywa Badań nad Rakiem Młodzieży i Młodych Dorosłych w Case Comprehensive Cancer Center; oraz Callahan Graduate Scholar Award dla Hsi-Ju Wei od Fundacji F.J. Callahana.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CDDO-DFPA (RTA-408)Reata Pharmaceuticalsdo syntezy własnejHodowla komórkowa
myszy GM-CSFPeprotech Inc.315-03różnicująca BMDC
IL-4Peprotech Inc.214-14Różnicowanie BMDC
Lipopolisacharydy (LPS)Sigma Aldrich Inc.L2880Hodowla komórkowa
i beta;-merkaptoetanolSigma Aldrich Inc.516732Hodowla komórkowa
Toksyna krztuścowa (PTX)R& Systemy D3097EAE indukcyjne
MOG (35– 55) peptyd21stCentury Biochemicalsw syntezie domowejIndukcja EAE
Trypan blueGibco, Life Technologies15250-061Hodowla komórkowa
RPMI-1640 plus L-glutaminaThermoFisher Scientific11875-093Hodowla komórkowa
Aminokwas endogenny (100X)ThermoFisher Scientific11140050Hodowla komórkowa
HEPESThermoFisher Scientific15630080Hodowla komórkowa
penicylina/streptomycynaThermoFisher Scientific15140122Hodowla komórkowa
40 μ m Sitko do komórekCorning352340Izolacja komórek
CD80 sprzężona z PEBiosciences557227Cytometria przepływowa Cytometria
PE sprzężona z CD86BD Biosciences555665Cytometria przepływowa
PD-L1 sprzężona z PEBioLegend124307Cytometria przepływowa
Sprzężona z APC MHCIIMiltenyi Biotec Inc.130-112-388Cytometria przepływowa
CD11c sprzężona z APC BDBiosciences340544Cytometria przepływowa
Dopasowany izotyp PEMiltenyi Biotec Inc.130-091-835Cytometria przepływowa
Dopasowany izotyp APCMiltenyi Biotec Inc.130-091-836Cytometria przepływowa
CFSEBioLegend423801Test proliferacji limfocytów T
Zestaw do izolacji komórek dendrytycznychMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów T
Odczynnik blokujący FcRMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów
T Koktajl biotynowo-przeciwciałowy z komórek dendrytycznychMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów T
Mikrogranulki antybiotynyMiltenyi Biotec Inc.130-100-875Test proliferacji limfocytów T
CD4 + Zestaw do izolacji limfocytówT Miltenyi Biotec Inc.130-104-454Test proliferacji limfocytów
T CD4 + Koktajl biotyny-przeciwciała z limfocytówT Miltenyi Biotec Inc.130-104-454Test proliferacji limfocytów T
Mikrogranulki antybiotynyMiltenyi Biotec Inc.130-104-454Test proliferacji limfocytów
T Bufor lizujący ACKThermoFisher ScientificA1049201Różnicowanie BMDC
1 ml strzykawkaBD Biosciences309626Test proliferacji limfocytów T
Strzykawka 3 mlBD Biosciences309588Igła różnicowania BMDC
Test proliferacji limfocytów T309626Biosciences
Igła 23GBD Biosciences309588różnicowanie BMDC,
BSASigma, Aldrich, Inc.proliferacji limfocytów TA2058
EDTAThermoFisher Scientific15575020Test proliferacji limfocytów T
Kolumna LSMiltenyi Biotec Inc.130-042-401Test proliferacji limfocytów T
Filtr wstępnej separacjiMiltenyi Biotec Inc.130-095-823Test proliferacji limfocytów T
kolagenaza DSigma Aldrich Inc.Testproliferacji limfocytów T
11088858001 HBSSThermoFisher Scientific14025076Test proliferacji limfocytów
T peptyd albuminy jaja kurzego (OVA) 323– 329Sigma Aldrich Inc.Test proliferacji limfocytów TO1641
Mysz IFN-γ Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01168134_m1mysz qRT-PCR
IL-12a Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00434165qRT-PCR
Mysz IL-12 p70 DuoSet ELISAR& Systemy DDY419-05ELISA
Mysz EDN-1 ELISARayBiotechELM-EDN1-1ELISA
TNF-&alfa; Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00443258qRT-PCR
Mysz TNF-α Zestaw Quantikine ELISA R& D systemsMTA00BELISA
IL-6 Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm00446190qRT-PCR
Mysz IL-6 Quantikine ELISA KitR& D systemsM6000BELISA
IL-23a Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01160011qRT-PCR
Mysz IL-23 DuoSet ELISAR& Systemy DDY1887-05Sonda ELISA
IL-4 TaqManThermoFisher ScientificMm99999154_m1qRT-PCR
IL-10 Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01288386_m1qRT-PCR
TGF-β Sonda TaqManThermoFisher ScientificMm01178820_m1qRT-PCR
Przeciwciało anty-hemowej oksygenazy 1Abcamab13248Western blot
Przeciwciało anty-&beta-aktynoweAbcamab8226Western blotting
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad Inc.qRT-PCR
BD FACSCalibur Analizator komórekBD BiosciencesCytometria przepływowa
Mysz BD Test

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287(2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886(2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsBone Marrow Derived DCsCDDO DFPA TreatmentFlow Cytometry AnalysisT Cell Proliferation AssayMagnetic Cell SortingCytokine Gene ExpressionPro Inflammatory ReductionAutoimmune Encephalomyelitis ModelImmunosuppressive Response Testing

Related Articles