Artykuł metodologiczny

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57643

⸱

12 maja 2018

 , 
1Division of Molecular Cell Biology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Department of Cell Biology, Helmholtz Centre for Infection Research

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Streszczenie

Badanie czasoprzestrzennej dynamiki białek może ujawnić ich funkcjonalne znaczenie w różnych kontekstach. W tym artykule omówiono, w jaki sposób odzysk fluorescencyjny po fotowybielaniu (FRAP) i techniki fotoaktywacji mogą być wykorzystane do badania czasoprzestrzennej dynamiki białek w lokalizacjach subkomórkowych. Pokazujemy również, w jaki sposób techniki te umożliwiają proste określenie różnych parametrów związanych z regulacją cytoszkieletu aktyny i ruchliwością komórek. Co więcej, mikroiniekcja komórek jest dodatkowo opisywana jako alternatywne leczenie (potencjalnie poprzedzające lub uzupełniające wyżej wymienione techniki fotomanipulacji) w celu wywołania natychmiastowego wpływu translokowanych białek na morfologię i funkcję komórki. Mikromanipulacje, takie jak wstrzykiwanie białek lub miejscowe stosowanie leków przenikających błonę plazmatyczną lub inhibitorów cytoszkieletu, może służyć jako potężne narzędzie do rejestrowania natychmiastowych konsekwencji danego leczenia na zachowanie komórek na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki. Przykładem tego jest natychmiastowa indukcja wypukłości krawędzi komórek blaszkowatych przez wstrzyknięcie rekombinowanego białka Rac1, jak ustalono ćwierć wieku temu. Ponadto udostępniamy protokół określania obrotu wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP)-VASP, polimerazy filamentu aktynowego wyraźnie gromadzącej się na blaszkowatych końcach komórek B16-F1, wykorzystując FRAP i obejmując powiązaną analizę danych i dopasowanie krzywej. Przedstawiamy również wytyczne dotyczące szacowania szybkości polimeryzacji sieci aktynowej lamellipodial, czego przykładem są komórki eksprymujące β-aktynę znakowaną EGFP. Na koniec podano instrukcje, jak badać tempo ruchliwości monomeru aktyny w cytoplazmie komórki, a następnie włączanie aktyny w miejscach szybkiego składania włókien, takich jak końcówki wystających lamellipodiów, przy użyciu podejść fotoaktywacyjnych. Żaden z tych protokołów nie jest ograniczony do składników lub regulatorów cytoszkieletu aktynowego, ale można go łatwo rozszerzyć, aby w analogiczny sposób zbadać czasoprzestrzenną dynamikę i funkcję białek w różnych strukturach subkomórkowych lub kontekstach funkcjonalnych.

Wprowadzenie

Monitorowanie czasoprzestrzennej dynamiki białek i innych cząsteczek w żywych komórkach stało się podstawowym narzędziem w wielu dziedzinach biologii komórkowej i molekularnej. Zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej, w tym transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) i obrazowanie czasu życia fluorescencji FRET (FRET-FLIM), czyli FRAP, utrata fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP) i fotoaktywacji oraz wiele innych, pozwalają na czasowe i przestrzenne śledzenie oddziaływań białko-białko, zmian konformacyjnych, a także określanie kinetyki dyfuzji i lokalizacji różnych białek w komórce1,2. Techniki FRAP i fotoaktywacji, w szczególności, są szeroko stosowane do badania regulatorów cytoszkieletu aktynowego i migracji komórek. Techniki te mogą być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z dodatkowymi technikami mikromanipulacji, takimi jak mikroiniekcja3, i obejmują ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie. Pozwalają one na oszacowanie kinetyki asocjacji białek ze strukturami bogatymi w aktynę zaangażowanymi w migrację komórek, takimi jak filopodia lub lamellipodia, obrót białek w zrostach ogniskowych4 lub rozgałęzione sieci aktynowe5. Umożliwiają również określenie szybkości polimeryzacji aktyny lamelipodialnej, ocenę dyspersji aktyny monomerycznej w cytozolu, szybkość translokacji subkomórkowego monomeru aktyny do polimeryzujących włókien aktynowych w wystających lamellipodiach6 i inne parametry.

FRAP to metoda wizualizacji i ilościowego określania mobilności białek w żywej komórce, pierwotnie opracowana w latach siedemdziesiątych przez Axelrod7. Obszar zainteresowania (ROI) w komórce, wypełniony białkami znakowanymi fluorescencyjnie, jest przejściowo wystawiony na działanie lasera o dużej intensywności, wystarczającej do spowodowania bielenia cząsteczek fluoroforu obecnych w tym regionie w określonym krótkim okresie czasu. Niebielone, znakowane fluorescencyjnie białka znajdujące się poza obszarem zwrotu z inwestycji podczas bielenia będą dyfundować i infiltrować wybielony obszar w zależności od ich dynamiki czasoprzestrzennej, powodując z czasem przemieszczenie fotobielonych cząsteczek. Szybkość odzysku fluorescencji w wybielonych obszarach zależy od różnych czynników, w tym od wielkości i szybkości dyfuzji danej cząsteczki oraz oczywiście szybkości jej obrotu w przypuszczalnie powiązanej wybielonej strukturze. W ten sposób rozpuszczalne białka będą pośredniczyć w odzyskiwaniu fluorescencji w wybielonym ROI szybko poprzez dyfuzję, podczas gdy białka ściśle związane ze strukturami, takimi jak zrosty ogniskowe, będą miały dłuższe czasy obrotu, ponieważ ich odzysk fluorescencji będzie zależał zarówno od dyfuzji rozpuszczalnej frakcji białka, jak i kinetyki dysocjacji-asocjacji frakcji związanej ze strukturą. Odzyskiwanie fluorescencji jest zwykle nabywane i oznaczane ilościowo do momentu osiągnięcia początkowego poziomu intensywności fluorescencji przed wybielaniem. Nie dzieje się tak jednak, jeśli część początkowej intensywności fluorescencji należy do tzw. frakcji nieruchomej, która nie jest w stanie zostać uzupełniona przez dyfuzję lub uzupełnia się w bardzo wolnym tempie w porównaniu z większością cząsteczek składających się na frakcję ruchomą. Aby określić tempo wymiany białek, generowane są krzywe FRAP, reprezentujące zakres odzyskiwania fluorescencji w czasie. Na podstawie tych krzywych odzysku można obliczyć średnie czasy połowicznego zaniku białka. Tworząc dopasowania krzywych średnich danych FRAP, a tym samym analiz matematycznych, można również wywnioskować, czy średnia szybkość obrotu frakcji ruchomej stanowi złożenie jednej jednorodnej populacji cząsteczek, czy też składa się z dwóch lub więcej subpopulacji cząsteczek obracających się w różnym tempie. Oprócz szacowania szybkości obrotu białek za pomocą podejść ilościowych, śledzenie odzyskiwania fotobielonych regionów w lamellipodiach może również pozwolić na dokładne ilościowe określenie parametrów ruchliwości lamelipodiów, takich jak przepływ wsteczny, wypukłość i szybkość polimeryzacji aktyny. Tym samym FRAP jest wszechstronnym narzędziem do oceny różnych parametrów w strukturach żywych komórek.

Fotoaktywacja to metoda używana do śledzenia dyfuzji i ruchliwości białek lub cząsteczek pochodzących z wyznaczonego miejsca komórkowego. Technika ta wykorzystuje na przykład wariant białka zielonej fluorescencji typu dzikiego (GFP), początkowo opracowany przez Pattersona i Lippincotta-Schwartza8, który jest zmutowany w sposób, który pozwala na znaczne zwiększenie jego fluorescencji po ekspozycji na światło ultrafioletowe (UV) (około 400 nm; tutaj 405 nm). Jak opisali Patterson i wsp., chromofory GFP typu dzikiego występują jako mieszana populacja obojętnych fenoli i anionowych fenolanów, które wytwarzają odpowiednio główny pik absorbancji przy około 397 nm i mniejszy przy 475 nm. Po naświetlaniu białka światłem UV populacja ulega fotokonwersji, przechodząc w kierunku formy anionowej. Po wzbudzeniu przez 488 nm, fotoprzekształcone/fotoaktywowane białko wykazuje 3-krotny wzrost fluorescencji, co w praktyce jest niewystarczające do rozróżnienia między aktywowanym i nieaktywowanym GFP ze względu na wysoką wewnętrzną fluorescencję tła. Jednak zmniejszenie intensywności tła osiągnięto poprzez wprowadzenie pojedynczej mutacji aminokwasowej do sekwencji GFP (substytucja histydyny w pozycji 203). Powstały mutant T203H, znany również jako fotoaktywowalny GFP (PA-GFP), charakteryzuje się znacznym zmniejszeniem absorbancji mniejszego piku, który po napromieniowaniu światłem UV zwiększa się prawie 100-krotnie, gdy następnie wzbudza światło o długości 488 nm. W związku z tym nadekspresja białek znakowanych PA-GFP jest szeroko stosowanym podejściem, które pozwala na określenie dyfuzji i ruchliwości cząsteczek w komórkach. Wcześniej zastosowaliśmy aktynę znakowaną PA-GFP, aby określić szybkość dyspersji monomerów aktyny z dala od regionów cytozolowych, umożliwiając nie tylko zbadanie ich ruchliwości w cytozolu, ale także szybkość ich włączenia do wystającej blaszkowatej sieci aktynowej 6. Nowsze piśmiennictwo opisuje również nowe, fotokonwertowalne białka, które w zasadzie mogą być stosowane w analogiczny sposób, ale mają potencjalną przewagę, ponieważ są widoczne już przed fotokonwersją. Przykładami dla tej grupy białek fluorescencyjnych są Dendra2 i mEos29,10,11,12.

W tym artykule wyjaśniamy metodologię mikrowstrzykiwania komórek białkami. Dalej wyjaśniamy, w jaki sposób można połączyć tę technikę z FRAP poprzez fotowybielanie białek zaangażowanych w regulację i ruchliwość cytoszkieletu aktynowego oraz jak można wyprowadzić krzywe FRAP i czas połowicznego powrotu frakcji ruchomych. Ponadto podajemy przykład, w jaki sposób technika FRAP może być wykorzystana do określenia szybkości polimeryzacji aktyny sieci lamelipodialnych. Udostępniamy również instrukcje i wskazówki, jak przeprowadzać eksperymenty fotoaktywacyjne, które można wykorzystać do określenia cytozolowej ruchliwości monomerycznej aktyny i szybkości inkorporacji aktyny do lamellipodiów. Techniki te, oczywiście, nie ograniczają się tylko do śledzenia składników cytoszkieletu aktynowego, ale po potencjalnie wymaganej umiarkowanej adaptacji lub optymalizacji mogą być szeroko stosowane do innych typów komórek lub do badania różnych białek, struktur i parametrów.

Protokół

1. Mycie i sterylizacja szkiełek nakrywek

  1. Zanurzyć szkiełka nakrywki o średnicy 15 mm (nr 1) w kolbie o pojemności 500 mL zawierającej mieszaninę 40 mL 37% HCl i 60 mL 100% EtOH (nie więcej niż 100 szkiełek na 100 mL roztworu myjącego).
    UWAGA: Nawet jeśli szkiełka zostały niedawno zakupione, muszą zostać rygorystycznie oczyszczone przed wysianiem komórek na ich powierzchnię. Wynika to z faktu, że mogą one zawierać cienkie warstwy tłuszczu, które są makroskopowo niewidoczne, ale mogą skutecznie utrudniać adhezję i prawidłowe rozprzestrzenianie się żywych komórek. Podczas gdy takie warstwy można skutecznie usunąć za pomocą roztworów zawierających kwas lub zasadę (patrz Fischer et al.13), rutynowo stosujemy opisaną powyżej mieszaninę kwasu i alkoholu.
  2. Wstrząsać kolbą ze szkiełkami nakrywkami przez 30 min na wytrząsarce rotacyjnej. Należy dobrać taką prędkość, aby szkiełka swobodnie wirowały, ale była ona wystarczająco niska, by uniknąć ich częstego pękania. W przypadku ponownego użycia roztworu, należy go przefiltrować w celu usunięcia odłamków szkła.
  3. Przenieść szkiełka nakrywki do kolby zawierającej co najmniej 200 mL sterylnej wody i inkubować na wytrząsarce rotacyjnej, wielokrotnie wymieniając wodę, aż zapach kwasu całkowicie zniknie. W celu całkowitego usunięcia śladów HCl-EtOH zaleca się wielokrotne płukanie przez kilka godzin.
  4. Osuszyć poszczególne szkiełka nakrywki na arkuszu papieru filtracyjnego.
  5. Umieścić szkiełka nakrywki na dnie szalki Petriego o średnicy 10 cm wyłożonej papierem filtracyjnym i poddać sterylizacji przez suche ciepło. Należy unikać autoklawowania, ponieważ spowoduje to sklejanie się szkiełek.

2. Traktowanie komórek, transfekcja i wysiew na szkiełka podstawowe

  1. Hodować komórki czerniaka mysiego B16-F1 zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli komórkowej w DMEM (4,5 g/L glukozy) zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 7% CO2.
  2. Hodować komórki fibroblastów NIH3T3 do mikroiniekcji zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli komórkowej (inkubator do hodowli tkanek w 37 °C, 7% CO2) w DMEM (4,5 g/L glukozy) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1 mM pirogronianu sodu, 1x nieessentialnych aminokwasów MEM, 2 mM glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny.
  3. Do transfekcji hodować komórki B16-F1 do 100% konfluencji w szalce 10 cm, a następnie pasażować w stosunku 1:5 do plastikowej szalki o średnicy 3 cm.
  4. Tego samego dnia, po odczekaniu co najmniej 6 h na adhezję komórek B16-F1, przeprowadzić transfekcję za pomocą 500 ng/szalkę fotoaktywnego plazmidowego DNA PA-GFP-actin lub β-actyny z tagiem EGFP. W przypadku ko-transfekcji PA-GFP-actin z wektorami kodującymi mCherry, zmieszać łącznie 1 µg plazmidowego DNA na szalkę 3 cm.
  5. Transfekować komórki B16-F1 przy użyciu odczynnika do transfekcji (Tabela materiałów). Dla szalki 3 cm zmieszać 200 µL 150 mM NaCl zawierającego 500 ng konstruktu DNA z 200 µL 150 mM NaCl zawierającego 1 µL odczynnika do transfekcji (t.j. zastosowano stosunek DNA (µg):odczynnik (µL) wynoszący 1:2).
  6. Inkubować mieszaninę do transfekcji przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT), a następnie nanieść kroplowo na szalkę 3 cm zawierającą komórki. Delikatnie zakręcić szalką w celu wymieszania i inkubować przez noc w 37 °C i 7% CO2.
  7. Przygotować bufor do powlekania lamininą zawierający 50 mM Tris, pH 7,4 oraz 150 mM NaCl.
  8. W przypadku komórek B16-F1, pokryć szkiełka podstawowe o średnicy 15 mm, rozprowadzając 150 µL lamininy (25 µg/mL w buforze do powlekania lamininą) i inkubować przez 1 h w RT. W przypadku komórek NIH3T3, pokryć szkiełka podstawkowe roztworem fibronektyny (25 µg/mL w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS)) i inkubować przez 1 h w RT.
  9. Przemyć szkiełka podstawkowe inkubowane z lamininą lub fibronektyną za pomocą PBS, następnie odessać PBS i dodać 2 mL zawiesiny ztransfectedowanych komórek.
  10. Dzień po transfekcji wysiać transfectedowane komórki B16-F1 (w stosunku 1:30 z konfluencyjnej szalki) na szkiełka pokryte lamininą. Wysiać fibroblasty NIH3T3 (w stosunku 1:20 z konfluencyjnej szalki) na szkiełka pokryte fibronektyną.
  11. Pozostawić komórki do rozprzestrzenienia się na szkiełkach pokrytych lamininą lub fibronektyną przez noc w inkubatorze do hodowli tkanek w 37 °C przed badaniem mikroskopowym. Alternatywnie eksperymenty mikroskopowe można rozpocząć tego samego dnia, pod warunkiem, że komórkom pozwolono na rozprzestrzenienie się przez co najmniej 2–3 h.

3. Montaż komory do obrazowania mikroskopowego

  1. Do mikroskopii należy użyć przewodzącej ciepło aluminiowej komory obrazowej RC-26 (Rycina 1a). Za pomocą strzykawki nanieść smar silikonowy wokół obrysu otworu uszczelki plastikowej (Rycina 1b).
  2. Umieścić szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi do góry na komorze (Rycina 1c).
  3. Umieścić uszczelkę plastikową na szkiełku nakrywkowym, aby zapewnić szczelne połączenie między szkiełkiem a komorą. Przymocować uszczelkę plastikową (na ukos, aby uniknąć pęknięcia szkiełka), dokręcając zaciski przesuwną do komory, co zapobiegnie wyciekaniu medium (Rycina 1d).
  4. Do centralnej części nanieść pipetą podgrzane do 37 °C medium do mikroskopii. W przypadku medium o zredukowanej autofluorescencji, zoptymalizowanego do mikroskopii, należy zastosować ten sam skład co w opisanym powyżej medium hodowlanym, ale z użyciem F12-HAM zamiast DMEM, z dodatkiem 20 mM HEPES do hodowli komórek w warunkach beztlenowych (bez CO2 ) (Rycina 1e).
  5. Włożyć detektor ciepła do wyznaczonego gniazda w komorze i połączyć elektrody komory z automatycznym regulatorem temperatury TC-324B, utrzymującym stałą temperaturę 37 °C (Rycina 1f).
  6. Nanieść małą kroplę olejku imersyjnego na obiektyw, a następnie umieścić na nim komorę.
  7. Inkubować komorę z komórkami przez co najmniej 10–30 min, aby umożliwić im regenerację po spadku temperatury podczas montażu oraz adaptację do medium do mikroskopii.
  8. Przed rozpoczęciem mikroskopii wymienić medium hodowlane w centralnym zbiorniku komory (około 800 µL), aby uniknąć niewłaściwego stężenia składników medium i surowicy w wyniku odparowania. Przedłużające się sesje mikroskopowe z otwartymi komorami będą wymagać rutynowej wymiany odparowanego medium.

4. Procedura mikroiniekcji

  1. Pokryć szkiełka podstawowe, przygotować komórki i złożyć komorę obrazowania zgodnie z powyższym opisem.
  2. Rozmrozić alikvot oczyszczonego białka przeznaczonego do wstrzyknięcia (zazwyczaj 10 µL lub mniej) i rozcieńczyć go odpowiednim buforem do mikroiniekcji.
    UWAGA: Skład buforu może różnić się w zależności od rodzaju białka i komórek, jednak należy zadbać o utrzymanie pH w zakresie od 6,95 do 8,00 oraz unikać stosowania PBS, ponieważ większość komórek nie toleruje wstrzykiwania PBS.
  3. Do mikrowstrzykiwania Rac1 należy przygotować bufor zawierający 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5 oraz 5 mM MgCl2.2, 1 mM DTT. Mg2+ Jony są niezbędne dla stabilności małych GTPaz.
    UWAGA: Stężenia białek zazwyczaj wahają się w zakresie 0,1–1 mg/ml (maksymalnie 2 mg/ml), w zależności od białka, rodzaju eksperymentu i typu komórek.
  4. Jeśli dotyczy, należy dodać barwnik fluorescencyjny, taki jak obojętny dekstran (0.5 µg/mL, 70 kDa) do roztworu białka, co pozwala potwierdzić drożność igły przed iniekcjami oraz udokumentować pomyślne wykonanie iniekcji po zakończeniu eksperymentu.
    UWAGA: Niniejszy eksperyment nie ma na celu śledzenia dynamiki wstrzykniętego białka Rac1, co byłoby możliwe jedynie przy bezpośrednim znakowaniu fluorescencyjnym białka. Sprzęganie białek z barwnikami fluorescencyjnymi lub fuzja z białkiem fluorescencyjnym są możliwe, jednak w tym przypadku unikano tych metod, ponieważ wiążą się one z ryzykiem zakłócenia funkcji sygnalizacyjnej, w szczególności w przypadku małych białek, takich jak GTPaza Rac1 z rodziny Rho (20 kDa).
  5. Odwiruj roztwór białka z prędkością 10 000 x g przez co najmniej 30 min, aby usunąć agregaty białkowe, które w przypadku obecności w kapilarze do mikroiniekcji mogłyby doprowadzić do zapchania igły.
  6. Napełnić igłę do mikrowstrzykiwania (kapilarę do mikrowstrzykiwania) za pomocą 1 µL mieszaniny do iniekcji z tyłu, używając elastycznego końcówki pipety lub końcówki mikro-loadera.
  7. Jeśli w końcówce igły znajdują się pęcherzyki powietrza, należy delikatnie uderzyć w podstawę igły, aby je usunąć. Należy działać szybko, aby zapobiec wysychaniu końcówki igły, co mogłoby spowodować jej zapchanie.
  8. Ostrożnie wyreguluj uchwyt igły w urządzeniu do mikromanipulacji. W przypadku użycia mikroskopu odwróconego do obrazowania w kontraście fazowym, przed załadowaniem igły upewnij się, że istnieje wystarczająca przestrzeń do poruszania igłą w górę i w dół bez blokowania kondensora mikroskopu.
  9. Po przykręceniu mikrokapilary do uchwytu igły, przed wprowadzeniem końcówki igły do pożywki hodowlanej, należy przyłożyć do igły ciśnienie (ciśnienie tła 20–50 hPa) za pomocą urządzenia do mikroiniekcji.
    UWAGA: Aktywowanie ciśnienia w momencie, gdy igła znajduje się w medium, spowoduje zasysanie medium siłą kapilarną, co uniemożliwi wstrzyknięcie pożądanego roztworu.
  10. Ustaw igłę w polu widzenia (co jest ułatwione dzięki zastosowaniu obiektywów o małym powiększeniu). W niniejszych eksperymentach z mikroiniekcji zastosowano suchy obiektyw 40X.
  11. Ustaw makroskopowo końcówkę igły w pozycji pionowej względem środka obiektywu (przyspieszy to odnalezienie końcówki igły). Używając mikroskopu z optyką kontrastową (fazową), przesuń końcówkę igły w płaszczyźnie poziomej względem pola widzenia, w płaszczyźnie optycznej znajdującej się znacznie powyżej warstwy komórkowej.
    UWAGA: Igła będzie początkowo widoczna jako cień w polu widzenia, po czym można dostosować płaszczyznę ostrości, aby zwizualizować jej końcówkę. Po zlokalizowaniu końcówki igły należy stopniowo obniżać płaszczyznę optyczną, a następnie końcówkę igły, aż znajdą się one w pozycji blisko warstwy komórek.
  12. W przypadku użycia dekstranu fluorescencyjnego, należy sprawdzić przepływ w igle, przełączając się na kanał fluorescencyjny, a następnie dostroić przepływ za pomocą urządzenia ciśnieniowego, aby uzyskać stały przepływ „tła”.
    UWAGA: W niniejszym artykule opisujemy iniekcję manualną, która odbywa się poprzez przebicie błony plazmatycznej poprzez dotknięcie powierzchni komórki i delikatny ruch końcówki igły przy stałym przepływie cieczy. Należy ją odróżnić od automatycznych urządzeń do iniekcji, które wykorzystują zaprogramowane obniżanie igły i zwiększanie ciśnienia podczas procesu wstrzykiwania, co jest bardziej odpowiednie przy iniekcji większej liczby komórek z późniejszą analizą populacyjną. Opisana tutaj metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej przed, w trakcie i po mikroiniekcji.
  13. Znajdź interesującą komórkę i stopniowo opuść igłę nad nią.
  14. Po przygotowaniu do mikroiniekcji, powoli opuść igłę w kierunku obszaru okojądrowego komórki, korzystając z precyzyjnego pokrętła joysticka mikromanipulatora, utrzymując jednocześnie komórki w ognisku.
  15. W celu przeprowadzenia mikroiniekcji należy delikatnie dotknąć błony komórkowej komórki, co może wystarczyć do jej penetracji, lub wspomóc przejściowe przerwanie ciągłości błony poprzez bardzo delikatne stuknięcie w statyw mikroskopu.
    UWAGA: Biała kropka na czubku igły będzie wskazywać moment kontaktu z błoną plazmatyczną; po przerwieciu błony czubek igły zostanie uszczelniony, co będzie сопровождаć się łagodnym przepływem roztworu wstrzykiwanego do komórki.
  16. Przerwij proces wstrzykiwania, gdy tylko pojawi się widoczny przepływ do komórki (idealnie w czasie poniżej 0,3 s), przesuwając końcówkę igły do góry, do medium. W przypadku użycia fluorescencyjnego dekstranu, pomyślne wstrzyknięcia można natychmiast udokumentować za pomocą fluorescencji.
  17. W razie potrzeby można rozpocząć akwizycję obrazów w trybie time-lapse przed lub po mikroiniekcji.
    UWAGA: Miejscowe podawanie leków lub inhibitorów może być wykonywane na wszystkich etapach, z wyjątkiem momentu mikroiniekcji per seW przypadku aplikacji lokalnych dyfuzję cząsteczki aktywnej można kontrolować za pomocą ciśnienia przepływu i dokumentować przy użyciu fluorescencji, a końcówkę igły można ustawić na żądanej wysokości. Przykłady eksperymentów z aplikacją lokalną znajdują się w np. Small i Rottner14 lub Kaverina i wsp.15
  18. Po mikroiniekcji należy odczekać do wystąpienia efektu działania białka. W zależności od rodzaju białka i oczekiwanego rezultatu, czas inkubacji może być różny. W przypadku małej GTPazy Rac1 odpowiedź w postaci tworzenia lamellipodiów może rozpocząć się w ciągu 1 minuty lub krócej, jednak pełny rozwój tego procesu zajmuje średnio około 10–15 min (Rysunek 1g, h).
  19. Oceń żywotność komórek po mikroiniekcji.
    UWAGA: Niewłaściwe lub szkodliwe wstrzyknięcia mogą spowodować uszkodzenie komórek, któremu często towarzyszy nieswoiste wciągnięcie krawędzi komórki lub przerwanie błony plazmatycznej.
    1. Należy unikać przebijania jednocześnie górnej i dolnej błony plazmatycznej, co może wystąpić podczas iniekcji w płaskich obszarach komórki.
      UWAGA: Objętości wstrzykiwane należy ograniczyć do minimum (idealnie <5% objętości komórki) i zazwyczaj będą mieścić się w zakresie femtolitrów. Wymagane objętości wstrzykiwania można również kontrolować poprzez zmiany stężeń, należy jednak pamiętać, że w przypadku białek stężenia >stężenie 2 mg/mL może okazać się niepraktyczne ze względu na częste zapychanie się igły. Zależy to jednak również od jakości i właściwości oczyszczonego białka; np., wstrzykiwanie aktyny sprzężonej z fluorophorem jest utrudnione ze względu na zależną od stężenia i nieuniknioną polimeryzację w końcówce igły, dlatego obecnie rzadko się je wykonuje (patrz Small i wsp.16).
  20. Przed, w trakcie lub po mikroiniekcji w tej samej komórce można przeprowadzić FRAP lub fotoaktywację (patrz sekcje 5 i 6).

5. Procedura FRAP

  1. Przeprowadź transfekcję interesującego typu komórek (w tym przypadku komórek B16-F1) plazmidowym DNA kodującym białko z etykietą fluorescencyjną (tutaj zastosowano wersję β-actyny z etykietą EGFP). Wysiej komórki na szkiełka nakrywki pokryte lamininą (krok 2.10).
  2. Zmontuj komorę obrazową (Sekcja 3).
  3. W celu fotowybielania obszaru lamellipodiów zastosuj następujące ustawienia: moc lasera 65 mW (zmienna w zależności od konfiguracji eksperymentalnej i źródła lasera); średnica wiązki laserowej 10 pikseli; czas przebywania wiązki podczas wybielania 1 ms/piksel; czas ekspozycji GFP 500 ms; odstęp czasowy 1 500 ms. Wyniki eksperymentalne w niniejszej pracy uzyskano przy użyciu obiektywu apochromatycznego 100X 1.4NA.
  4. Przeprowadź kalibrację lasera, aby zapewnić dokładność wymiarów obszaru fotowybielanego. Przed kalibracją przesuń pole widzenia na obszar pozbawiony komórek/sygnału fluorescencji i obserwuj obraz na wyświetlaczu.
  5. Wybierz powiększenie obiektywu, klikając odpowiedni przycisk powiększenia, a następnie zmniejsz moc lasera (3–5 mW) w menu „Panel | Intensity”. Aby rozpocząć ręczną kalibrację w oprogramowaniu Visiview (v2.1.4), wybierz menu „Configure | FRAP” i kliknij „Calibrate | Adjust Manual”. Upewnij się, że laser jest widoczny jako ostry punkt. Jeśli nie, ponownie ustaw ostrość lub wyreguluj sprzęt laserowy.
  6. Wykonaj kalibrację, ręcznie prowadząc laser do określonych w oprogramowaniu współrzędnych X-Y. Pozwala to oprogramowaniu precyzyjnie kierować laser na zdefiniowany przez użytkownika obszar dla aktualnego powiększenia.
  7. Przed uruchomieniem lasera przełącz się na kanał GFP i rozpocznij akwizycję obrazów/time-lapse.
  8. Obserwując wyświetlacz, ręcznie zaznacz na kanale GFP obszar do fotowybielania.
  9. Rozpocznij fotowybielanie poprzez ręczne uruchomienie lasera 405 nm, co najmniej 3–4 klatki po rozpoczęciu akwizycji obrazów. Pozyskanie klatek przed fotowybielaniem jest niezbędne do normalizacji obrazu w późniejszej analizie danych.

6. Procedura fotoaktywacji

UWAGA: Oprogramowanie, konfiguracja mikroskopu oraz ustawienia, z wyjątkiem mocy lasera, są zbliżone do tych stosowanych w przypadku FRAP. W fotoaktywacji istotną różnicą w porównaniu z FRAP jest konieczność zastosowania mocy lasera 405nm znacznie niższej niż ta używana do fotobielenia, aby aktywować PA-GFP bez jednoczesnego jego fotobielenia.

  1. Wykonaj kotransfekcję odpowiedniego typu komórek (w tym przypadku komórek B16-F1; patrz krok 2.5) plazmidowym DNA kodującym PA-GFP-actin oraz innym białkiem znakowanym fluorescencyjnie (np. mCherry lub mCherry-Lifeact).
    UWAGA: W większości przypadków komórki wykazujące ekspresję mCherry będą również pozytywne pod kątem wektora PA-GFP-actin, którego zazwyczaj nie widać w kanale GFP przed fotoaktywacją. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że komórki mCherry-dodatnie są również pozytywne dla PA-GFP, zastosuj stosunek transfekcji mCherry:PA-GFP-actin wynoszący 1:2. Stosując ten protokół, ponad 90% komórek exprimujących mCherry wykazało skuteczną aktywację PA-GFP-actin.
  2. Wysiej komórki B16-F1 na szkiełka podstawowe powleczone lamininą (krok 2.10).
  3. Zmontuj komorę obrazową (Sekcja 3).
  4. Przed rozpoczęciem eksperymentów z fotoaktywacją, w razie potrzeby, przeprowadź kalibrację lasera dla wybranego obiektywu (kroki 5.4–5.6).
  5. Ustaw akwizycję obrazu GFP/488 nm na czas ekspozycji 500 ms i odstęp czasowy 1 500 ms (w zależności od projektu eksperymentu).
  6. Dostosuj ustawienia oprogramowania do akwizycji dwu- lub trójkanałowych filmów time-lapse, zaznaczając pole „Wavelength series” i wybierając żądaną liczbę kanałów w menu „Acquire | Wavelength”. Zaleca się, aby filmy time-lapse były rejestrowane z wykorzystaniem kanału kontrastu fazowego oraz kanału GFP.
    1. Opcjonalnie można dołączyć kanał mCherry; jednak narażenie komórek na zbyt dużą ilość światła może wywołać fotouszkodzenia. Można tego uniknąć stosując usuwacze tlenu, takie jak Oxyrase17, choć skuteczna terapia wymaga uszczelnienia komory z komórkami.
  7. Zlokalizuj transfektowane komórki w kanale mCherry.
  8. Przed uruchomieniem lasera rozpocznij akwizycję obrazów/time-lapse i ręcznie zaznacz obszar do fotoaktywacji w kanale kontrastu fazowego, obserwując wyświetlacz.
  9. Uruchom fotoaktywację poprzez ręczne wyzwolenie lasera 405 nm (intensywność ustawiona w zakresie 5–15 mW w menu „Panel | Intensity”), co najmniej 3–4 klatki po rozpoczęciu akwizycji obrazu.

7. Analiza danych i prezentacja wyników FRAP

UWAGA: Przedstawiona metoda służy do badania wymiany białka gromadzącego się w miejscach dynamicznego montażu aktyny, w tym przypadku VASP, który wiąże się z miejscami adhezyjnymi oraz końcami wysuwających się lamellipodiów. Analizujemy jego wymianę na końcu lamellipodium, jednak te same zasady analizy można zastosować do badania wymiany VASP lub każdego innego białka w innych przedziałach podkomórkowych.

  1. Otwórz filmy time-lapse wygenerowane w programie Visiview w oprogramowaniu Metamorph. W niniejszym artykule wykorzystano program Metamorph w wersji 7.8.10.
  2. Wyznacz wartości intensywności dla obszarów poddanych fotobleachingowi, ręcznie obrysowując odpowiednie regiony w programie Metamorph. Narysuj kształt na końcówce lamellipodium, który obejmuje cały lub część obszaru poddanego fotobleachingowi, a w razie potrzeby ręcznie dostosuj jego położenie na kolejnych klatkach (t. j. (jeśli krawędź wystaje), aby śledzić zmiany intensywności poszczególnych komponentów w lamellipodiach podczas przemieszczania się wierzchołka.
  3. W celu korekcji tła i fotoblaknięcia podczas akwizycji, należy przeanalizować obszary wewnątrz i na zewnątrz komórki. Patrz Rycina 2a dla reprezentatywnych obszarów zmierzonych intensywności.
  4. Po wybraniu ROI należy wyodrębnić wartości jego intensywności w programie Metamorph, korzystając z menu „Measure | Region Measurements”. W menu „Configure” należy upewnić się, że zaznaczone są opcje „Elapsed time” oraz „Average Intensity”. Kliknij „Open log” i wybierz „Dynamic Data Exchange”. Kliknij „OK”, aby otworzyć arkusz programu Excel, a następnie ponownie kliknij przycisk „Open log”, aby wkleić wartości z programu Metamorph do arkusza Excel.
    UWAGA: Wartości te są wykorzystywane do wygenerowania krzywych powrotu fluorescencji.
  5. W celu wygenerowania krzywych regeneracji fluorescencji w obrębie wierzchołka lamellipodium w obszarach poddanych fotobleachingowi (znormalizowanych do intensywności w danym obszarze przed fotobleachingiem), należy zastosować następujące równanie:
    Wzór równowagi statycznej; równania odzysku stosowane w analizie naukowej; model matematyczny.   Równanie 1
    gdzie: FRAP (metoda odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu)Tn intensywność regionu wyblakłego fotochemicznie dla każdej ramki zainteresowania po fotowybielaniu; WyjścieTn jest intensywnością regionu pobraną spoza komórki (tło) dla każdej ramki zainteresowania po fotoblaknięciu; InsTn uśrednione intensywności wewnątrz obszaru dla każdej ramki zainteresowania po fotoblaknięciu (stosowane do normalizacji fotoblaknięcia podczas akwizycji w czasie); FRAPT-1 intensywność obszaru wybielonego fotochemicznie przed wybielaniem fotochemicznym; OutT-1 jest intensywność obszaru pobrana poza komórką (tło) przed fotowybielaniem; a InsT-1 jest uśredniona intensywność dwóch obszarów wewnętrznych dla każdej ramki zainteresowania przed fotowyblakaniem.
  6. Dla każdego interesującego przedziału czasowego należy zastosować Równanie 1 w celu uzyskania krzywej powrotu fluorescencji obejmującej wszystkie badane ramy czasowe. Czas trwania zależy ściśle od badanego białka. W przypadku braku tej informacji należy przeprowadzić eksperymenty wstępne w celu wyznaczenia szybkości wymiany białka.
  7. Aby obliczyć czas połowy regeneracji, należy wkleić wartości krzywej regeneracji fluorescencji wraz z odpowiadającymi im czasami (w sekundach) do programu SigmaPlot (v.12), a następnie przeprowadzić dopasowanie krzywej za pomocą narzędzia „Dynamic Fit Wizard | Exponential rise to maximum”. W zależności od tego, które dopasowanie będzie lepsze, należy wybrać funkcję mono-wykładniczą (pojedynczą, 3 parametry) lub bi-wykładniczą (podwójną, 4 parametry).
  8. Użyj następującego wzoru dla funkcji monoeksponencjalnej:
    Wzór funkcji wzrostu wykładniczego \(f(x)=y0+a(1-\exp(-bx))\) w zapisie matematycznym.   Równanie 2
  9. Należy zastosować następujący wzór funkcji bieksponecyjnej:
    Równanie dopasowania nieliniowego f(x)=a(1-exp(-bx))+c(1-exp(-dx)); formuła matematyczna.   Równanie 3
  10. Wklej parametry „b” i „d” uzyskane z programu Sigma Plot (Równanie 2 lub Równanie 3) do programu Excel, aby obliczyć czas połowy regeneracji. Zastosuj następujące równania:
    Równanie okresu półtrwania, t<sub>1/2</sub>=-(1/b)ln(0,5), wzór na rozpad, zastosowanie edukacyjne.   Równanie 4
    lub
    Wzór na zanik wykładniczy, t1/2=-1/d ln(0,5), do obliczania okresu półtrwania na schemacie.   Równanie 5
  11. W przypadku gdy funkcja monoeksponencjalna pozwala na uzyskanie dokładnego dopasowania krzywej, należy zastosować wyłącznie Równanie 4.
  12. W przypadku, gdy funkcja monoeksponencjalna nie zapewnia odpowiedniego dopasowania krzywej, należy zastosować wzór bieksponencjalny, rozwiązując oba równania Równanie 4 i Równanie 5Przyjmijmy, że otrzymane dwa okresy połowicznego powrotu reprezentują dwie różne frakcje białek: odpowiednio frakcję szybko i wolno wymieniającą się.

8. Wyznaczanie szybkości polimeryzacji aktyny w lamelipodiach metodą FRAP

  1. Aby określić szybkość polimeryzacji aktyny w lamelipodiach, należy przeprowadzić transfekcję komórek B16-F1 β-aktyną znakowaną EGFP, a następnie poddać fotowybielaniu obszar lamelipodialny (krok 5.9), stosując interwał czasowy 1,5 s i czas ekspozycji GFP wynoszący 500 ms.
  2. W programie Metamorph należy otworzyć filmy time-lapse pozyskane z Visiview i skalibrować stosunek pikseli/µm zgodnie z używanym obiektywem, korzystając z narzędzia „Measure| Calibrate distances”.
  3. Należy odtworzyć film time-lapse i zatrzymać go na klatce, w której powrót fluorescencji lamelipodialnej, przesuwający się wstecz w stronę lamelli w formie linii, dotarł do lamelli i nie można już śledzić dalszego przepływu wstecznego.
  4. Należy zmierzyć odległość w µm między wierzchołkiem lamelipodium a tylną krawędzią odzyskaną fluorescencji. Odległość ta odpowiada sumie dystansu przepływu retrogradnego i dystansu protruzji.
  5. Alternatywnie, aby oddzielić protruzję od przepływu retrogradnego, należy zaznaczyć wierzchołek lamelipodium linią na jedną klatkę przed fotowybielaniem. Linię tę należy wykorzystać jako punkt odniesienia w kolejnych klatkach, aby odnieść się do pierwotnej pozycji wierzchołka lamelipodium w momencie fotowybielania; punkt odniesienia może służyć do pomiaru dystansu protruzji oraz przepływu retrogradnego.
  6. Należy odnotować czas (w sekundach) potrzebny na zajście powrotu fluorescencji po fotowybielaniu. Czas ten można obliczyć ręcznie na podstawie częstotliwości klatek lub zwizualizować w programie Metamorph za pomocą narzędzia „Measure | Region measurements”.
  7. Szybkość polimeryzacji aktyny należy wyliczyć za pomocą następującego równania (z parametrami opartymi na pomiarach z programu Metamorph z kroków 8.4 i 8.6):
    Wzór na szybkość polimeryzacji aktyny: obliczenie przepływu retrogradnego+protruzji lamelipodialnej/czas.   Równanie 6
    gdzie szybkość polimeryzacji aktyny podana jest w µm/min, dystans przepływu retrogradnego w µm, dystans protruzji lamelipodialnej w µm, a czas w sekundach.

9. Analiza dyfuzji i mobilności białek po fotoaktywacji

UWAGA: Metoda przedstawiona w niniejszym materiale opisuje analizę mobilności monomerów aktyny poprzez wykorzystanie fotoaktywacji aktyny połączonej z PA-GFP, co zostało zilustrowane za pomocą wizualizacji i kwantyfikacji dyfuzji białka w cytozolu.

  1. W celu pomiaru dyfuzji fotoaktywowalnej aktyny z obszaru cytozolowego, a także jej akumulacji w obszarze lamellipodialnym, należy użyć programu Metamorph do wyznaczenia intensywności w czasie dla następujących regionów (przedstawionych na Rysunku 3a): fotoaktywowanego regionu cytozolowego (PA); regionu lamellipodialnego, w którym oczekuje się akumulacji fotoaktywowanych białek w czasie (Lam); oraz regionu poza komórką, służącego do normalizacji fluorescencji tła (OUT).
  2. Przy określaniu mobilności aktyny w cytozolu należy mierzyć oddzielne regiony cytozolowe (patrz Rysunek 3a, regiony R1-R5). Należy pamiętać, że akwizycji fotoblankingu nie można przeprowadzić w sposób analogiczny do FRAP ze względu na wzrost fluorescencji w punkcie ogniskowym, a ostatecznie w całej komórce po aktywacji.
  3. Przenieś wartości intensywności dla wszystkich regionów z programu Metamorph do arkusza kalkulacyjnego Excel, zgodnie z opisem w kroku 7.4.
  4. W celu zbadania szybkości przemieszczania się fotoaktywowalnej aktyny z cytozolowego regionu fotoaktywacji lub szybkości jej wbudowywania w obszar lamellipodialny (oba parametry reprezentowane jako procent intensywności cytozolowego regionu fotoaktywowanego w czasie 0), wygeneruj krzywe fluorescencji z danych w kroku 9.3. Zastosuj następujące równania:
    Równanie dyfuzji, region cytozolowy, obejmujące zmianę stężenia w czasie, formuła naukowa.   Równanie 7
    Formuła wzrostu regionu lamellipodialnego; równanie matematyczne dla analizy procesów biologicznych.   Równanie 8
    gdzie: PATn to intensywność cytozolowego regionu fotoaktywowanego dla każdej analizowanej klatki po fotoaktywacji; LAMTn to intensywność regionu lamellipodialnego dla każdej analizowanej klatki po fotoaktywacji; OUTTn to intensywność regionu poza komórką (tło) dla każdej analizowanej klatki po fotoaktywacji; PAT-1 to intensywność cytozolowego regionu fotoaktywowanego przed fotoaktywacją; LAMT-1 to intensywność regionu lamellipodialnego przed fotoaktywacją; OUTT-1 to intensywność regionu poza komórką (tło) przed fotoaktywacją; PAT0 to intensywność cytozolowego regionu fotoaktywowanego w czasie 0 (t.j. pierwsza klatka po fotoaktywacji); oraz OUTT0 to intensywność regionu poza komórką (tło) w czasie 0 (t.j. pierwsza klatka po fotoaktywacji).
  5. Opcjonalnie, dla lepszej wizualizacji danych, znormalizuj krzywe intensywności do 0, odejmując intensywność pierwszej klatki po fotoaktywacji od każdej kolejnej klatki.
    UWAGA: Poniższa metoda analizy (kroki 9.6–9.8) pozwala również na obliczenie cytozolowej dyspersji fotoaktywowanej aktyny w cytozolu.
  6. Zmierz intensywności dla regionów cytozolowych, które są rozmieszczone kolejno dystalnie względem regionu aktywacji.
  7. Aby przedstawić intensywności tych regionów jako procent intensywności regionu fotoaktywowanego w czasie 0, zastosuj Równanie 8, zastępując intensywności lamellipodialne intensywnościami dla każdego cytozolowego ROI. Wielkość i liczba regionów mogą się różnić w zależności od rozmiaru komórki i mierzonego dystansu dyspersji.
  8. Aby uzyskać mierzalną wartość szybkości przenikania fotoaktywowanego białka do każdego regionu cytozolowego, wklej czas i wartości krzywej wzrostu intensywności fluorescencji dla każdego regionu do programu Sigma plot (podobnie jak w analizie FRAP w Sekcji 7), użyj Równania 2 oraz Równania 4, aby wyznaczyć czas połowiczny osiągnięcia plateau intensywności fluorescencji. Porównaj wartości t1/2 między różnymi grupami eksperymentalnymi.

Wyniki

Rysunek 1g, h przedstawia obrazy w kontraście fazowym fibroblasta NIH3T3 przed oraz 10 min po mikroiniekcji Rac1, który jest małą GTPazą z rodziny Rho zdolną do indukowania tworzenia lamellipodiów poprzez oddziaływanie z kompleksem WAVE. Komórka jest najpierw wizualizowana przed mikroiniekcją (Rysunek 1g), aby potwierdzić jej żywotność i morfologię, np. brak lamellipodiów. W 10 min po mikroiniekcji komórka wyraźnie zmieniła swoją morfologię, co jest oczekiwanym efektem tej procedury i wskazuje na prawidłowe wykonanie iniekcji (Rysunek 1h).

Dla uproszczenia i przejrzystości przedstawiamy w dalszej części przykładowe wyniki analizy FRAP oraz fotoaktywacji w komórkach, które nie zostały dodatkowo poddane mikroiniekcji.

Analiza wymiany białka VASP znakowanego EGFP na krawędzi lamellipodium została przedstawiona na Rysunku 2a-f. Należy zauważyć, że VASP lokalizuje się również w nowo powstających i dojrzałych adhezjach ogniskowych, widocznych jako małe i wydłużone kropki wewnątrz komórki18,19. Intensywność fluorescencji w obszarze lamellipodium z wyraźną akumulacją VASP na krawędzi została poddana fotowybieleniu, a następnie mierzona w każdym przedziale czasowym poprzez śledzenie konturu ROI przed, w trakcie i po wybieleniu, w miarę jak lamellipodium wysuwa się do przodu. Ponieważ wybielone białka EGFP-VASP są zastępowane przez nie wybielone cząsteczki w tych miejscach, obserwuje się stopniowy powrót fluorescencji (Rysunek 2b). Krzywa powrotu FRAP uzyskana w ten sposób i znormalizowana do intensywności sprzed wybielenia (wyrażonej jako 1) widoczna jest na Rysunku 2c. Wydajność fotowybielania może się różnić i w tym przykładzie wynosiła około 20% wartości sprzed wybielenia, co określono na podstawie wartości w t0 (pierwsza klatka po fotowybieleniu). Wzrost fluorescencji osiąga plateau w pokazanym przykładzie na poziomie około 80% fluorescencji sprzed wybielenia. W strukturze statycznej w czasie trwania eksperymentu, takiej jak adhezja ogniskowa, różnica między intensywnością przed wybieleniem a fluorescencją plateau osiągniętą po powrocie jest definiowana jako frakcja nieruchoma (IF, czerwona strzałka na Rysunku 2c, e), natomiast ilość fluorescencji odzyskanej między momentem wybielenia a pełnym powrotem jest definiowana jako frakcja ruchoma (zielona strzałka dwustronna na Rysunku 2c, e). Należy zauważyć, że w strukturze dynamicznie zmieniającej się, takiej jak analizowana tutaj krawędź lamellipodium, zakres IF może reprezentować nie tylko nieruchome cząsteczki, ale może również wynikać ze zmniejszenia prędkości wysuwania, ponieważ wiadomo, że intensywność EGFP-VASP zależy od tego parametru18. Aby obliczyć czas połowiczny powrotu, stworzono krzywą dopasowania w programie Sigma plot (Rysunek 2d). W tym przypadku wartość parametru „b” wyznaczona z Równania 2 wynosi 0,0754, co po podstawieniu do funkcji logarytmicznej (Równanie 4) daje szacowany czas połowiczny powrotu wynoszący 9,19 s (Rysunek 2d, prawy panel), co w tej konkretnej komórce jest wynikiem stosunkowo szybkim w porównaniu do średnich opublikowanych wcześniej5. Należy zaznaczyć, że czasy połowiczne powrotu mogą czasami znacznie różnić się między komórkami w obrębie tej samej populacji. Dlatego w celu uzyskania reprezentatywnych wyników zaleca się wyznaczanie tego parametru jako średniej z co najmniej 15-20 komórek. Aby zilustrować stopień wariancji, wygenerowano średnie arytmetyczne powrotu EGFP-VASP uśrednione z 15 komórek dla każdego punktu czasowego (Rysunek 2e), a średnie dopasowania krzywych utworzono i przedstawiono w analogiczny sposób (Rysunek 2f).

Szybkość polimeryzacji sieci aktynowej w lamellipodium stanowi sumę wysunięcia sieci do przodu oraz przepływu retrogradacyjnego. Metodę FRAP można zastosować do pomiaru szybkości polimeryzacji aktyny poprzez transfekcję komórek (w tym przypadku B16-F1) β-aktyną znakowaną EGFP i fotowybielenie wysuniętego obszaru lamellipodium (Rycina 2g). W celu analizy polimeryzacji sieci aktynowej w lamellipodium ocenia się w czasie odzyskiwanie fluorescencji β-aktyny znakowanej EGFP po wybieleniu. Ponieważ polimeryzacja monomerów aktyny postępuje na końcach aktywnych (barbed ends) filamentów aktynowych w lamellipodium (które wszystkie są skierowane do przodu20), sieć jest stale przemieszczana do tyłu i posuwa się do przodu; szybkości tych procesów można łatwo wyznaczyć poprzez spolaryzowany powrót fluorescencji po fotowybieleniu. Odzyskiwanie fluorescencji w lamellipodium kończy się w momencie, gdy strefa wybielona dotrze do strefy przejścia między tylną częścią lamellipodium a lamelą, która charakteryzuje się niższą gęstością wiązek filamentów ułożonych bardziej poziomo, ulegających wymianie znacznie wolniej niż w lamellipodium. Jak pokazano na Rycynie 2g, odzyskiwanie fluorescencji można wizualizować jako linię równoległą do krawędzi, przesuwającą się do tyłu w stronę lameli, co pozwala na pomiar odległości wysunięcia i przepływu retrogradacyjnego (przedstawionych oddzielnie na prawym panelu Ryciny 2g odpowiednio jako pomarańczowe i czerwone strzałki dwustronne).

Zastosowaliśmy również fotoaktywację w komórkach B16-F1 przetransfekowanych PA-GFP-actin, aby śledzić mobilność monomerów aktyny w cytozolu oraz tempo ich wbudowywania w wysuwające się lamellipodia. Jak pokazano na Rysunku 3a, b, region cytozolu został fotoaktywowany poprzez naświetlenie laserem 405 nm, podczas gdy obrazy były pozyskiwane w kanale GFP co 1,5 s w celu wizualizacji rozkładu fotoaktywowanej aktyny znakowanej GFP. Fotoaktywowaną GFP-aktynę widać dyfundującą z regionu cytozolu na Rysunku 3b. Tempo spadku intensywności fluorescencji w fotoaktywowanym regionie cytozolu przedstawiono jako procent początkowej intensywności w t0 (pierwsza klatka po fotoaktywacji; Rysunek 3c). Fotoaktywowana aktyna wbudowuje się również w końcach lamellipodiów, gdzie nowe monomery aktyny są dodawane do rosnących końców „barbed” wydłużających się filamentów aktyny podczas protruzji. Aby oszacować tempo wbudowywania w lamellipodium, mierzyliśmy w czasie intensywność fluorescencji dwuwymiarowego konturu/regionu o szerokości około 5 µm i wysokości 1 µm; region ten był stale przesuwany wraz z końcem lamellipodium w miarę jego wysuwania się. Wbudowywanie aktyny przedstawiono jako procent intensywności fluorescencji fotoaktywowanego regionu cytozolu w t0 (Rysunek 3d). W miarę postępu wydłużania filamentów aktyny, nowe monomery aktyny były wbudowywane w przednią część lamellipodium. Część tych monomerów aktyny pochodziła stochastycznie z puli cytozolowej, w której monomery zostały fotoaktywowane. Skutkuje to szybkim wzrostem fluorescencji w lamellipodiach w ciągu pierwszych 20 s po fotoaktywacji. W miarę dodawania nowych monomerów do przedniej części lamellipodium, wcześniej wbudowane monomery aktyny przemieszczają się wraz z filamentami w kierunku lamelli poprzez przepływ retrogradywny. Z czasem ROI zostaje całkowicie wypełnione fluorescencyjnymi monomerami i osiągany jest poziom plateau fluorescencji (Rysunek 3d). Następnie obserwuje się stopniowy spadek fluorescencji, gdy po dyfuzji fotoaktywowanych monomerów w całej komórce, do przedniej części lamellipodium coraz częściej dodawane są monomery aktyny niefotoaktywowane. Ten spadek fluorescencji osiągnie nowe plateau, gdy tylko w całej komórce zostanie uzyskana równowaga między monomerami fotoaktywowanymi a niefotoaktywowanymi (dane nie zostały przedstawione).

Mobilność monomerów aktyny w całej cytozolu wyznaczono poprzez pomiar intensywności fluorescencji w obszarach o jednakowej wielkości, położonych oddalenie od regionu fotoaktywnego (przedstawiono to na Rysunku 3a za pomocą regionów oznaczonych kolorami od R1 do R5). Jak pokazano na Rysunku 3e, intensywność fluorescencji w każdym z tych obszarów stopniowo maleje wraz z oddalaniem się od fotoaktywowanego regionu cytozolu, ponieważ frakcja fotoaktywowanych monomerów aktyny ulega coraz większemu rozcieńczeniu monomerami nieaktywowanymi (tj. niefluorescencyjnymi). Ponadto szczyt fluorescencji jest osiągany później: im dalej od regionu fotoaktywnego znajduje się mierzony obszar, tym więcej czasu potrzeba na dyfuzję monomerów aktyny do tych regionów. Reprezentatywną wartość stopnia infiltracji monomerów aktyny do każdego regionu można wyznaczyć poprzez ilościowe określenie czasu połowicznego osiągnięcia plateau fluorescencji. Im bardziej oddalony jest dany region, tym dłużej trwa dyfuzja fotoaktywowanej aktyny do niego, a w konsekwencji więcej czasu potrzeba na osiągnięcie plateau fluorescencyjnego, co ostatecznie prowadzi do wyższej wartości t1/2 (Rysunek 3e).

Układ i proces mikroiniekcji; wstrzykiwanie materiału do komórek; wyniki obrazowania mikroskopowego.
Rysunek 1: Montaż komory obrazowania i procedura mikroiniekcji. (a) Elementy komory obrazowania. (b) Smar silikonowy jest ostrożnie nakładany wokół otworu plastikowej uszczelki. (c) Deckel jest pozycjonowany stroną z komórkami do góry w centrum otworu komory obrazowania. (d) Szczelne zamknięcie zostaje utworzone poprzez umieszczenie plastikowej uszczelki na decklu i zaciśnięcie bocznych zacisków. (e) Medium do mikroskopii jest pipetowane do szczeliny komory. (f) Komora obrazowania jest umieszczana na stole mikroskopu, detektor ciepła i elektrody są podłączone do jednostki grzewczej ustawionej na 37 °C, a komórki adaptują się przez co najmniej 30 min przed rozpoczęciem mikroskopii. W tym przykładzie stół mikroskopu jest również wyposażony w mikromanipulator do przeprowadzania mikroiniekcji, a igła do mikroiniekcji jest zanurzana w medium pokrywającym warstwę komórek w komorze obrazowania. (g) Fibroblast NIH3T3 jest wizualizowany przed mikroiniekcją za pomocą mikroskopii fazokontrastowej. Czerwony krzyżyk w obszarze perinuklearnym wskazuje miejsce przyszłej mikroiniekcji, które odpowiada regionowi o wysokim stężeniu cytoplazmy ze względu na bliskie sąsiedztwo masywnego jądra. (h) 10 min po mikroiniekcji Rac1 komórka reaguje wyraźnym tworzeniem lamellipodiów wokół całej obwodu komórki (wskazane zielonymi strzałkami). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza FRAP szybkości polimeryzacji aktyny; wykresy powrotu fluorescencji; obrazy mikroskopowe; obliczenia.
Rysunek 2: FRAP umożliwia wyznaczenie szybkości obrotu białek lub polimeryzacji aktyny w lamelipodiach. (a) Reprezentatywny przykład komórki B16-F1 wykazującej ekspresję EGFP-VASP przed fotowybieleniem wskazanego obszaru lamelipodialnego. Różnokolorowe kontury/kształty zostały oznaczone, aby wskazać, które regiony były brane pod uwagę podczas pomiarów natężenia fluorescencji w czasie. Należy zwrócić uwagę na czerwony kontur oznaczony wykrzyknikiem, który wskazuje region cytozolu znajdujący się w obszarze zawierającym liczne pęcherzyki i fałdy powierzchni komórkowej. Dynamicznych obszarów tego typu należy unikać podczas wyboru regionów referencyjnych dla fluorescencji, ponieważ charakteryzują się one silnymi krótkoterminowymi fluktuacjami fluorescencji, co może prowadzić do niedokładnych wyników. (b) Region lamelipodialny komórki wykazującej ekspresję EGFP-VASP przed i po fotowybieleniu. Powrót sygnału fluorescencyjnego po fotowybieleniu w obrębie regionu zaznaczonego na fioletowo jest wizualizowany w czasie. Strzałka wskazuje wierzchołek mikrokolca, wzbogacony w VASP prawdopodobnie ze względu na wysoką gęstość polimeryzujących tam filamentów aktynowych19. (c) Przykład krzywej powrotu FRAP uzyskanej z kwantyfikacji natężenia fluorescencji fotowybielonego lamelipodium (fioletowy kontur) z punktu b. Czerwona i zielona linia po prawej stronie wskazują odpowiednio frakcję nieruchomą i ruchomą. (d) Dopasowanie krzywej powrotu FRAP z punktu c (panel lewy) oraz przykład metody obliczeniowej użytej do wyznaczenia czasu połownego powrotu (panel prawy). (e) Przykład krzywej powrotu FRAP uzyskanej poprzez uśrednienie krzywych powrotu fluorescencji z 15 komórek, gdzie słupki SEM wskazują stopień zmienności w populacji próbek. (f) Dopasowanie krzywej uzyskane poprzez uśrednienie dopasowań krzywych powrotu FRAP z 15 komórek (panel lewy) oraz przykład metody obliczeniowej użytej do wyznaczenia czasu połownego powrotu (panel prawy). (g) Panele time-lapse wysuwającego się lamelipodium komórki B16-F1 wykazującej ekspresję β-aktyny z tagiem EGFP przed i po wybieleniu wskazanego regionu lamelipodialnego, a następnie powrót fluorescencji w lamelipodium w czasie. Na panelu po prawej stronie podano zmierzone wartości odległości wysunięcia i odległości retrogradnej (odpowiednio na pomarańczowo i czerwono). Obliczenia pod panelami obrazów pokazują, w jaki sposób suma odległości wysunięcia i odległości retrogradnej jest wykorzystywana do wyznaczenia szybkości polimeryzacji sieci aktynowej lamelipodium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat równowagi statycznej z fotoaktywacją fluorescencyjną, układ mikroskopowy. Dane dopasowania widmowego.
Rycina 3: Fotoaktywacja PA-GFP-aktyny w celu śledzenia monomerów w całej komórce. (a) Reprezentatywny przykład komórki B16-F1 wykazującej ekspresję PA-GFP-aktyny przed wywołaniem fotoaktywacji w obszarze cytozolu wskazanym przez czerwony okrąg (PA). Kontury w różnych kolorach zostały oznaczone, aby wskazać regiony, które uwzględniono w pomiarach natężenia fluorescencji w czasie. (b) Ilustracja rozkładu czasowego PA-GFP-aktyny po fotoaktywacji. Zwraca uwagę stopniowy spadek fluorescencji w fotoaktywowanym obszarze cytozolu (czerwony okrąg), w miarę jak fotoaktywowana aktyna dyfunduje z niego na zewnątrz. Ze względu na dyfuzję do przodu i włączanie w sieć, ilość fotoaktywowanych monomerów aktyny stopniowo wzrasta w lamellipodiach (region cyjanowy) oraz w całym cytozolu (regiony oznaczone różnymi kolorami) w sposób zależny od odległości i czasu. (c) Reprezentatywny spadek czasowy fluorescencji w fotoaktywowanym obszarze cytozolu (czerwony kontur na b). (d) Zmiany czasowe natężenia fluorescencji w obszarze lamellipodialnym (cyjanowy kontur na b). (e) Krzywe reprezentujące zmiany czasowe natężenia fluorescencji w obszarach cytozolu (oznaczone kolorami na b) wynikające z ich położenia w różnych odległościach od miejsca fotoaktywacji. Zauważalne jest, że okresy połowicznego osiągnięcia plateau fluorescencji (wskazane w legendzie po prawej stronie) rosną wraz z odległością danego regionu od miejsca fotoaktywacji, co prawdopodobnie koreluje ze zwiększonym czasem potrzebnym na dyfuzję monomerów aktyny do odpowiedniego obszaru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym miejscu omawiamy krytyczne etapy technik opisanych w tym artykule oraz sposób, w jaki można je zoptymalizować pod kątem zastosowania w różnych warunkach eksperymentalnych.

Mikroiniekcja to metoda, którą można zastosować do monitorowania w komórkach natychmiastowych efektów wprowadzenia białek egzogennych, inhibitorów lub leków. Może to być szczególnie korzystne dla określenia funkcji białek w trudnych do transfekcji typach komórek lub w sytuacjach, gdy długotrwała ekspresja nie jest pożądana. Należy zauważyć, że przeżycie niektórych typów komórek różni się w zależności od macierzy zewnątrzkomórkowej, na której są wysiane. Większość typów komórek śródbłonkowych, nabłonkowych lub podobnych do fibroblastów, nawet małych, takich jak keratocyty ryb (patrz Dang i wsp.21 oraz Anderson i Cross22) mogą być z powodzeniem wstrzykiwane. Istnieją jednak wyjątki, takie jak komórki B16-F1 wysiane na lamininie, które stanowią doskonały modelowy system migracji komórek, ale z niewiadomych przyczyn są niekompatybilne z iniekcją na tego typu podłoże. W przypadku komórek fibroblastów NIH3T3 rutynowo wykonujemy iniekcje na podłożu fibronektyny, a dodatkowe techniki fotomanipulacji, takie jak FRAP (nawet z fotoaktywacją; pokazane dla komórek B16-F1 tutaj) mogą być równie dobrze wykonywane w tych fibroblastach (patrz np . Köstler i wsp.3). Należy również wziąć pod uwagę, że różne białka, zgodnie z ich właściwościami funkcjonalnymi i celami eksperymentu, mogą potrzebować różnej ilości czasu, aby wywołać zmiany, od sekund do godzin. Zaletą tej techniki jest to, że dawkowanie/stężenie czynnika egzogennego może być kontrolowane dokładniej na poziomie pojedynczej komórki niż np. w przypadku transfekcji plazmidowej. Ponadto znakowanie fluorescencyjne białka nie jest konieczne, aby zagwarantować jego obecność w komórce, co może zwiększyć elastyczność, jeśli wymagana jest jednoczesna wielokanałowa wizualizacja innych białek znakowanych fluorescencyjnie. Mikroiniekcja może być szczególnie przydatna do analizy natychmiastowego wpływu określonych białek lub mieszanin białek na dynamiczne zmiany morfologii komórek lub cytoszkieletu (np . Dang i wsp.21 dla przykładu natychmiastowego wpływu inhibitora kompleksu Arp2/3 na migrację Arpin). Wadą tej techniki jest jej inwazyjność, która może powodować uszkodzenie komórek lub wpływać na morfologię komórek. Dlatego ważną kwestią podczas wykonywania mikroiniekcji jest monitorowanie żywotności komórek. Wprowadzona tutaj metoda opiera się na ręcznej manipulacji. W warunkach przetestowanych pod kątem zgodności z udanymi wstrzyknięciami, takich jak fibroblasty rosnące na podłożu fibronektyny, opisany tutaj protokół ręcznego wstrzykiwania pozwala na prawie 100% skuteczność; Jest to niezbędne w przypadku połączenia tego podejścia z zaawansowanymi i czasochłonnymi eksperymentami uzupełniającymi, w tym mikroskopią wideo lub FRAP, jak opublikowano wcześniej3. Nie wyklucza to, że od czasu do czasu pojedyncze komórki mogą cierpieć z powodu zdarzenia mikroiniekcji, które można bezpiecznie rozpoznać po nagłych zmianach kontrastu zarówno jądra, jak i cytoplazmy, a następnie retrakcji krawędzi komórki. Takie rzadkie przypadki eksperymentalne są wykluczane i w związku z tym nie są brane pod uwagę do dalszych analiz.

Powszechnie stosowane jest jednak również podejście półautomatyczne, na przykład polegające na szybkim (<300 ms) sterowanym maszynowo opuszczaniu igły zbiegającym się ze wzrostem ciśnienia wtrysku, tak że igła musi być umieszczona nad każdą komórką tylko przed odpowiednim wstrzyknięciem. Wskaźnik powodzenia półautomatycznych zastrzyków jest z definicji niższy niż w przypadku podejścia ręcznego opisanego powyżej, po prostu dlatego, że jest ono zoptymalizowane pod kątem szybkości, po której następuje analiza wielu komórek, które pomyślnie przetrwały to leczenie; W związku z tym nie polega na udanym wstrzyknięciu pojedynczej komórki. Dlatego, w przeciwieństwie do analizy pojedynczych komórek, półautomatyczne iniekcje lepiej nadają się do analizy efektów iniekcji kilkuset komórek, np. za pomocą wideomikroskopii przy małym powiększeniu lub po utrwaleniu i barwieniu komórek. Niezależnie od zastosowanego podejścia szczegółowego, mikroiniekcja nie stanowi testu punktu końcowego, ale może być łączona z różnymi technikami, w tym FRAP lub fotoaktywacją3.

Określając szybkość obrotu białek za pomocą FRAP, intensywność lasera musi być zoptymalizowana, w zależności od ustawień mikroskopu i warunków obrazowania (powiększenie, obiektywy itp., a także typ komórki, struktura i białko fluorescencyjne do fotowybielania). Należy pamiętać, że przy optymalnej mocy lasera skuteczne wybielanie łączy się z najmniejszymi możliwymi fotouszkodzeniami, aby uniknąć skurczu lub całkowitego wycofania analizowanej struktury (np . lamellipodia lub filopodia), a nawet uszkodzenia na poziomie komórkowym. Idealnie byłoby, gdyby osiągnięto co najmniej 70-80% skuteczności wybielania, chociaż całkowite wybielanie może być utrudnione przez niezwykle szybką rotację białka, w którym to przypadku wszystko powyżej 50% może być również dopuszczalne. Optymalna moc bielenia dla danej struktury i barwnika fluorescencyjnego powinna być testowana doświadczalnie, zaczynając od niskiej mocy lasera, a następnie stopniowo ją zwiększając. Oczywiście, każdy barwnik fluorescencyjny może być z definicji wybielany światłem laserowym w pobliżu szczytu wzbudzenia (488 nm dla często stosowanych barwników zielonych, takich jak FITC lub EGFP). Jednak lasery o krótszych długościach fal, takie jak lasery bliskiego UV, zapewniają większe moce, a zatem mogą być również wykorzystywane do wydajnego wybielania powszechnie stosowanych barwników. Rutynowo używamy lasera diodowego o długości fali 405 nm (120 mW) do wybielania zarówno barwników EGFP, jak i czerwonych barwników fluorescencyjnych (takich jak mCherry), choć w przypadku tych ostatnich z nieco mniejszą skutecznością (dane nie pokazane). Ponieważ dioda o długości fali 405 nm może być również używana do fotoaktywacji PA-GFP (patrz poniżej), zapewnia ona temu systemowi maksymalną elastyczność.

Do fotowybielania struktur komórkowych B16-F1 i białek fluorescencyjnych zastosowano lasera o mocy 405 nm w zakresie od 65 do 100 mW. Analizując fotobielony obszar, należy wziąć pod uwagę, czy dana struktura zachowała się w swoim pierwotnym kształcie w analizowanym okresie. Na przykład, analizując obrót białek na końcach lamellipodiów, należy zwrócić uwagę, czy krzywizna lamellipodiów nie ulega znaczącym zmianom w czasie, ponieważ zmiany krzywizny mogą prowadzić do niedokładnych wyników, jeśli analizowany obszar/kontur nie obejmuje w pełni całości struktury w każdym mierzonym klatce. Ponadto należy zauważyć, że wiązki osadzone w lamellipodiach, takie jak mikrokolce, mogą powodować odchylenia w intensywności fluorescencji. Jak pokazano na rysunku 2b (biała strzałka w przedziale czasowym 9 s), struktura przypominająca mikrokolce znajduje się obok mierzonego obszaru fotowybielanego, ale pozostaje poza nim przez cały czas trwania pomiaru, a zatem nie powoduje żadnych niedokładności. Dla analizy obrotu białek ważnymi względami przy wyborze lokalizacji i wielkości analizowanych regionów jest to, że na ich fluorescencję w czasie nie powinny mieć znaczącego wpływu zmiany w morfologii komórek lub czynniki inne niż trudne do uniknięcia fotowybielanie akwizycyjne. Na przykład struktury wnoszące istotny wkład ilościowy do analizowanej struktury nie powinny wychodzić poza mierzony obszar podczas analizy; Ponadto niepowiązane, fluorescencyjne jednostki, takie jak struktury pęcherzykowe, które przyciągają białko, nie powinny wchodzić w pole zainteresowania podczas analizy. W celu określenia szybkości polimeryzacji aktyny blaszkowatej należy zwrócić uwagę, aby nie analizować lamellipodiów chowanych lub marszczonych (tj. fałdowanych do góry), ponieważ będzie to miało duży wpływ na dokładność wyników. Ponadto retrakcja obszarów blaszkowatych może wydawać się szybką translokacją do tyłu, potencjalnie prowadząc do przeszacowania szybkości polimeryzacji aktyny lamelipodialnej. Dodatkową kwestią jest odległość wewnątrzkomórkowych regionów normalizacyjnych (przyjmowanych jako pozycje referencyjne dla korekcji fotowybielania akwizycyjnego) od rzeczywistej pozycji fotowybielania, która powinna być wystarczająco duża, aby uniknąć bezpośredniego wpływu obszaru fotowybielanego.

Podczas tworzenia optymalnych warunków do fotoaktywacji konstruktów znakowanych PA-GFP należy zachować ostrożność, aby uniknąć natychmiastowego wybielania podczas fotoaktywacji. W naszej pracy najlepsze wyniki uzyskano przy mocy lasera 5-10 razy mniejszej niż normalnie stosowana do wybielania EGFP. W celu uzyskania obrazu fotoaktywowanych cząsteczek czas ekspozycji i odstęp czasu między klatkami powinny być zoptymalizowane, biorąc pod uwagę wielkość regionów i struktur, które mają być fotoaktywowane i analizowane, a także potencjalną ruchliwość fotoaktywowanych białek do innych lokalizacji subkomórkowych. Podobnie jak w przypadku wszystkich rodzajów obrazowania fluorescencyjnego, utrzymanie żywotności komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania fizjologicznie istotnych wyników.

Zasadniczo, fotokonwersja z zielonego na czerwony białek fluorescencyjnych, takich jak mEos lub warianty Dronpa12, stanowi równie skuteczną metodę śledzenia dynamiki i obrotu struktur subkomórkowych, takich jak blaszki (patrz np. Burnette i wsp.23). Zaletą tej drugiej metody, w przeciwieństwie do PA-GFP, byłaby możliwość śledzenia dynamiki białka przed i po konwersji z dwoma różnymi kolorami, bez konieczności koekspresji dodatkowego białka czerwonej fluorescencji. Jednak w naszych wstępnych eksperymentach zakres zmiany kontrastu i intensywność sygnału fluorescencyjnego uzyskanego po fotoaktywacji PA-GFP był większy w porównaniu z sondami fotokonwertowanymi, być może ze względu na lepsze cechy spektralne zielonych i czerwonych sond fluorescencyjnych (dane nie pokazane). W każdym razie szczegółowe badania nad obrotem włókien aktynowych w wypukłościach na krawędziach komórek, takich jak lamellipodia lub ogony aktynowe wywołane wirusem krowianki, zostały do tej pory opublikowane tylko przy użyciu pochodnych PA-GFP 5,6,24.

Rozważając, który region komórki przeanalizować po fotoaktywacji, należy wziąć pod uwagę kilka czynników, które omówiono na konkretnym przykładzie pokazanym tutaj (włączenie monomerów aktyny na krawędzi komórki po aktywacji w cytozolu), ale z pewnością można je ekstrapolować na różne analogiczne problemy naukowe. Po pierwsze, mierząc szybkość inkorporacji lamelipodialnej cytozolowo fotoaktywowanych białek, na przykład, w różnych warunkach eksperymentalnych (jak wykazano w Dimchev i wsp.6), rozmiary regionów cytozolowych i ich odległości do krawędzi blaszkowatych powinny być porównywalne między grupami doświadczalnymi. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że podczas fotoaktywacji regionów cytozolowych grubość komórki jest większa w pozycjach bliższych jądra. Aktywacja grubszych regionów komórkowych może skutkować większymi ilościami aktywowanych białek, biorąc pod uwagę, że dystrybucja białka, które ma być aktywowane, jest jednorodnie rozmieszczona w cytozolu. Wreszcie, poziomy ekspresji białka, które ma być aktywowane, mogą być z pewnością bardzo zmienne w poszczególnych komórkach. Ze względu na wszystkie te rozważania dotyczące zmienności, kluczowe jest porównanie poziomów inkorporacji cytozolowo aktywowanych białek w innych miejscach komórki w stosunku do całkowitej fluorescencji uzyskanej po aktywacji w określonych regionach.

Opisaliśmy, w jaki sposób mikroiniekcja może być wykorzystana jako narzędzie do badania wpływu białek na morfologię komórek i zilustrowaliśmy to, wykazując silną indukcję struktur lamelipodialnych w komórkach fibroblastów NIH3T3 mikrowstrzykiwanych małą GTPazą Rac1. Wcześniej zastosowaliśmy tę technikę do interferencji z funkcją Arp2 / 3 w komórkach, którym wstrzyknięto C-końcową domenę WCA Scar / WAVE3. Różne parametry w komórkach, którym podano mikroiniekcję, można analizować za pomocą innych testów, takich jak FRAP lub fotoaktywacja. Opisaliśmy, w jaki sposób FRAP i fotoaktywacja mogą być wykorzystane do badania subkomórkowej dynamiki i ruchliwości monomerów aktyny. FRAP był wcześniej używany przez naszą grupę5 do badania obrotu białek lokalizujących się w blaszkach, takich jak VASP, Abi, kortaktyna, kofilina i białko capping, lub do wyjaśnienia obrotu składników w zrostach ogniskowych w obecności i braku sygnalizacji Rac4. Co więcej, pomiar szybkości polimeryzacji aktyny można osiągnąć poprzez fotowybielanie β-aktyny5 znakowanej EGFP, ale istnieją alternatywne metody. Można również zastosować śledzenie niejednorodności fluorescencyjnych obserwowanych przez sondy kompatybilne z obrazowaniem żywych komórek, znakujące komórkowe filamenty aktynowe, takie jak Lifeact25 6,26. Zaletą jest to, że można uniknąć nadekspresji β-aktyny, która jest w stanie zwiększyć wysunięcie krawędzi komórki i migrację, a tym samym potencjalnie zakłóca konkretny test lub pytanie eksperymentalne (patrz np. Kage i wsp.Rozdział 26; Peckham i wsp.27). Jednak wyraźną wadą sondy Lifeact jest jej szybka kinetyka wiązania z filamentami aktyny, tak że bielenie struktur filamentów aktynowych oznaczonych przez Lifeact w komórkach dostarcza informacji tylko o obrocie sondy, ale nie o obrocie włókien aktynowych, z którymi się wiąże25. Śledzenie niejednorodności fluorescencji stosowane wcześniej 6,26 zapewnia praktyczny kompromis, bardzo podobny do szeroko stosowanego śledzenia plamek fluorescencyjnych włączonych do nitkowatych struktur cytoszkieletu (patrz np. Salmon i Waterman28), ale może nie być tak proste w użyciu i tak precyzyjne jak FRAP struktur F-aktyny znakowanych EGFP. Fotoaktywacja została przez nas zastosowana do oszacowania szybkości włączania monomerycznej aktyny do wystających lamellipodiów, a także jej ruchliwości w cytozolu, w kontekście eksperymentalnie dostrojonych poziomów cytozolowej F-aktyny6. Technika ta jest przydatna do badania ruchliwości i dystrybucji białek pochodzących ze stosunkowo dużych obszarów, takich jak regiony cytozolowe. Jednak badanie rozmieszczenia białek pochodzących ze stosunkowo małych struktur aktywowanych światłem; Na przykład stożki wzrostu mogą być trudne ze względu na małą liczbę aktywowanych cząsteczek fluorescencyjnych, słabe sygnały, a tym samym brak czułości. Potencjalne techniki alternatywne dla fotoaktywacji lub fotokonwersji fluorescencji (patrz wyżej) mogą obejmować odwrotny FRAP, który polega na fotowybielaniu całej komórki z wyjątkiem ROI, a następnie śledzeniu ruchliwości cząsteczek fluorescencyjnych z dala od tego obszaru. Technika ta nie wymaga nadekspresji fotoaktywowanych wersji białek, ale zawsze wiąże się z ekspozycją na niezwykle wysoką dawkę lasera, co może powodować niepożądane skutki uboczne, takie jak fotouszkodzenia.

Oczywiste jest, że fotoaktywacja i FRAP nie są w stanie rozróżnić, czy białka poruszają się jako monomery, dimery, czy nawet małe oligomery, i czy poruszają się w połączeniu z dodatkowymi partnerami wiążącymi. Informacje tego rodzaju można uzyskać za pomocą technik spektroskopii korelacji fluorescencji29 lub alternatywnie FLIM-FRET30. Niemniej jednak FRAP i fotoaktywacja stanowią proste podejścia do bezpośredniej oceny lokalnej i globalnej dynamiki białek w komórkach, niezależnie od białka będącego przedmiotem zainteresowania, lokalizacji subkomórkowej lub typu badanej komórki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za wsparcie finansowe (grant nr RO2414/5-1 dla KR).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B16-F1 komórki czerniaka skóry myszy Kolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, VACRL-6323
Komórki NIH-3T3Kolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, VACRL-1658
DMEM 4,5 g / L glukozy Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Niemcy41965-039
Ham' s F-12 mediumSigma-AldrichN8641
Surowica cielęca płodu  (SKO)PAA Laboratories, Linz, AustriaA15-102
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-Aldrich, NiemcyF7524Lot054M3396
MEM Aminokwasy endogenne Gibco, ThermoFisher Scientific, Niemcy11140035
L-glumatyna 200mM (100x)Life Technolgies25030-024
Pen-Strep 5000 U/mLTechnologie życia15070063
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco, ThermoFisher Scientific, Niemcy11360-039
LamininSigma-AldrichL-2020
Laminin Bufor do powlekania Własnej roboty: 50mM Tris ph7,4, 150mM NaCl
Fibronectin z ludzkiego osocza Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy11 051 407 001
JetpeiPolyplus Transfection, Illkirch, Francja101-10N
JetPeibuffer Polyplus Transfekcja, Illkirch, Francja702-50150mM NaCl
PA-GFP-aktynowy plazmid DNA opisane w Koestler et al.2008
plazmid pEGFP-aktyny DNAClontech, Mountain View, CA, USA
Białko Rac1 do mikroiniekcjiOczyszczone jako wersja oznaczona GST i odcięte od GST przed wstrzyknięciem
do mikroiniekcjiWłasnej produkcji: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70 000 MW, sondy molekularne z utrwalaną lizyną, Thermno Fisher Scientific, NiemcyD1864
Mikroskop okrągłe okulary nakrywkowe 15mm, nr 1 Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Niemcy1001/15
Eppendorf Femtotips Końcówki do mikroładowarekEppendorf, Hamburg, Niemcy5242 956 003
Eppendorf Femtotip Końcówki kapilarne do mikroiniekcjiEppendorf, Hamburg, Niemcy930000035
Smar silikonowy ACC Silicones, Bridgewater, AngliaSGM494
Aluminiowa otwarta diamentowa komora obrazowania kąpieliPrzyrządy WarnerRC-26
Automatyczny regulator temperaturyWarner InstrumentsTC-324B
Mikroskop: Axio Observer Carl Zeiss, Jena, Niemcy
Aparat CoolSnap-HQ2 Fotometria, Tucson, źródło światła AZ
Lambda DG4 Sutter Instrucment, Novato, CA
Źródło laserowe Mikrowtryskiwacz Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet Eppendorf, Hamburg, NiemcyZ wbudowaną sprężarką do zasilania ciśnieniem
System mikromanipulatora Nikon NarishigeNikon Instruments, Japonia
Oprogramowanie Visiview v2.1.4Visitron Systems, Puchheim, Niemcy
Oprogramowanie Metamorph v7.8.10Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12Systat Software Inc.
Bufor

Bibliografia

  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  2. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  3. Koestler, S. A., et al. Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin. Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).
  4. Steffen, A., et al. Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation. J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).
  5. Lai, F. P., et al. Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia. EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).
  6. Dimchev, G., et al. Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly. Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).
  7. Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility. Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  10. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  11. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).
  12. Kremers, G. J., Piston, D. Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells. J Vis Exp. (40), (2010).
  13. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. CSH Protoc. 2008, 4988(2008).
  14. Small, J. V., Rottner, K. Actin-based Motility. Carlier, M. F. , Springer. Dordrecht. (2010).
  15. Kaverina, I., et al. Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules. Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).
  16. Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. Visualising the actin cytoskeleton. Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).
  17. Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. Centripetal transport of microtubules in motile cells. Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).
  18. Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. VASP dynamics during lamellipodia protrusion. Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).
  19. Svitkina, T. M., et al. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).
  20. Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).
  21. Dang, I., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).
  22. Anderson, K. I., Cross, R. Contact dynamics during keratocyte motility. Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).
  23. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).
  24. Humphries, A. C., et al. Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread. Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).
  25. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  26. Kage, F., et al. FMNL formins boost lamellipodial force generation. Nat Commun. 8, 14832(2017).
  27. Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin. J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).
  28. Salmon, E. D., Waterman, C. M. How we discovered fluorescent speckle microscopy. Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).
  29. Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).
  30. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza FRAPmetody fotoaktywacjidynamika aktynymikroiniekcja bia ekwypustki lamellipodialnepowr t fluorescencjidynamika spatiotemporalnaruchliwo kom rek
Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.