Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Summary

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Abstract

Badanie czasoprzestrzennej dynamiki białek może ujawnić ich funkcjonalne znaczenie w różnych kontekstach. W tym artykule omówiono, w jaki sposób odzysk fluorescencyjny po fotowybielaniu (FRAP) i techniki fotoaktywacji mogą być wykorzystane do badania czasoprzestrzennej dynamiki białek w lokalizacjach subkomórkowych. Pokazujemy również, w jaki sposób techniki te umożliwiają proste określenie różnych parametrów związanych z regulacją cytoszkieletu aktyny i ruchliwością komórek. Co więcej, mikroiniekcja komórek jest dodatkowo opisywana jako alternatywne leczenie (potencjalnie poprzedzające lub uzupełniające wyżej wymienione techniki fotomanipulacji) w celu wywołania natychmiastowego wpływu translokowanych białek na morfologię i funkcję komórki. Mikromanipulacje, takie jak wstrzykiwanie białek lub miejscowe stosowanie leków przenikających błonę plazmatyczną lub inhibitorów cytoszkieletu, może służyć jako potężne narzędzie do rejestrowania natychmiastowych konsekwencji danego leczenia na zachowanie komórek na poziomie pojedynczej komórki i subkomórki. Przykładem tego jest natychmiastowa indukcja wypukłości krawędzi komórek blaszkowatych przez wstrzyknięcie rekombinowanego białka Rac1, jak ustalono ćwierć wieku temu. Ponadto udostępniamy protokół określania obrotu wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP)-VASP, polimerazy filamentu aktynowego wyraźnie gromadzącej się na blaszkowatych końcach komórek B16-F1, wykorzystując FRAP i obejmując powiązaną analizę danych i dopasowanie krzywej. Przedstawiamy również wytyczne dotyczące szacowania szybkości polimeryzacji sieci aktynowej lamellipodial, czego przykładem są komórki eksprymujące β-aktynę znakowaną EGFP. Na koniec podano instrukcje, jak badać tempo ruchliwości monomeru aktyny w cytoplazmie komórki, a następnie włączanie aktyny w miejscach szybkiego składania włókien, takich jak końcówki wystających lamellipodiów, przy użyciu podejść fotoaktywacyjnych. Żaden z tych protokołów nie jest ograniczony do składników lub regulatorów cytoszkieletu aktynowego, ale można go łatwo rozszerzyć, aby w analogiczny sposób zbadać czasoprzestrzenną dynamikę i funkcję białek w różnych strukturach subkomórkowych lub kontekstach funkcjonalnych.

Introduction

Monitorowanie czasoprzestrzennej dynamiki białek i innych cząsteczek w żywych komórkach stało się podstawowym narzędziem w wielu dziedzinach biologii komórkowej i molekularnej. Zaawansowane techniki mikroskopii fluorescencyjnej, w tym transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) i obrazowanie czasu życia fluorescencji FRET (FRET-FLIM), czyli FRAP, utrata fluorescencji w fotowybielaniu (FLIP) i fotoaktywacji oraz wiele innych, pozwalają na czasowe i przestrzenne śledzenie oddziaływań białko-białko, zmian konformacyjnych, a także określanie kinetyki dyfuzji i lokalizacji różnych białek w komórce^1,2. Techniki FRAP i fotoaktywacji, w szczególności, są szeroko stosowane do badania regulatorów cytoszkieletu aktynowego i migracji komórek. Techniki te mogą być stosowane samodzielnie lub w połączeniu z dodatkowymi technikami mikromanipulacji, takimi jak mikroiniekcja³, i obejmują ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie. Pozwalają one na oszacowanie kinetyki asocjacji białek ze strukturami bogatymi w aktynę zaangażowanymi w migrację komórek, takimi jak filopodia lub lamellipodia, obrót białek w zrostach ogniskowych⁴ lub rozgałęzione sieci aktynowe⁵. Umożliwiają również określenie szybkości polimeryzacji aktyny lamelipodialnej, ocenę dyspersji aktyny monomerycznej w cytozolu, szybkość translokacji subkomórkowego monomeru aktyny do polimeryzujących włókien aktynowych w wystających lamellipodiach⁶ i inne parametry.

FRAP to metoda wizualizacji i ilościowego określania mobilności białek w żywej komórce, pierwotnie opracowana w latach siedemdziesiątych przez Axelrod⁷. Obszar zainteresowania (ROI) w komórce, wypełniony białkami znakowanymi fluorescencyjnie, jest przejściowo wystawiony na działanie lasera o dużej intensywności, wystarczającej do spowodowania bielenia cząsteczek fluoroforu obecnych w tym regionie w określonym krótkim okresie czasu. Niebielone, znakowane fluorescencyjnie białka znajdujące się poza obszarem zwrotu z inwestycji podczas bielenia będą dyfundować i infiltrować wybielony obszar w zależności od ich dynamiki czasoprzestrzennej, powodując z czasem przemieszczenie fotobielonych cząsteczek. Szybkość odzysku fluorescencji w wybielonych obszarach zależy od różnych czynników, w tym od wielkości i szybkości dyfuzji danej cząsteczki oraz oczywiście szybkości jej obrotu w przypuszczalnie powiązanej wybielonej strukturze. W ten sposób rozpuszczalne białka będą pośredniczyć w odzyskiwaniu fluorescencji w wybielonym ROI szybko poprzez dyfuzję, podczas gdy białka ściśle związane ze strukturami, takimi jak zrosty ogniskowe, będą miały dłuższe czasy obrotu, ponieważ ich odzysk fluorescencji będzie zależał zarówno od dyfuzji rozpuszczalnej frakcji białka, jak i kinetyki dysocjacji-asocjacji frakcji związanej ze strukturą. Odzyskiwanie fluorescencji jest zwykle nabywane i oznaczane ilościowo do momentu osiągnięcia początkowego poziomu intensywności fluorescencji przed wybielaniem. Nie dzieje się tak jednak, jeśli część początkowej intensywności fluorescencji należy do tzw. frakcji nieruchomej, która nie jest w stanie zostać uzupełniona przez dyfuzję lub uzupełnia się w bardzo wolnym tempie w porównaniu z większością cząsteczek składających się na frakcję ruchomą. Aby określić tempo wymiany białek, generowane są krzywe FRAP, reprezentujące zakres odzyskiwania fluorescencji w czasie. Na podstawie tych krzywych odzysku można obliczyć średnie czasy połowicznego zaniku białka. Tworząc dopasowania krzywych średnich danych FRAP, a tym samym analiz matematycznych, można również wywnioskować, czy średnia szybkość obrotu frakcji ruchomej stanowi złożenie jednej jednorodnej populacji cząsteczek, czy też składa się z dwóch lub więcej subpopulacji cząsteczek obracających się w różnym tempie. Oprócz szacowania szybkości obrotu białek za pomocą podejść ilościowych, śledzenie odzyskiwania fotobielonych regionów w lamellipodiach może również pozwolić na dokładne ilościowe określenie parametrów ruchliwości lamelipodiów, takich jak przepływ wsteczny, wypukłość i szybkość polimeryzacji aktyny. Tym samym FRAP jest wszechstronnym narzędziem do oceny różnych parametrów w strukturach żywych komórek.

Fotoaktywacja to metoda używana do śledzenia dyfuzji i ruchliwości białek lub cząsteczek pochodzących z wyznaczonego miejsca komórkowego. Technika ta wykorzystuje na przykład wariant białka zielonej fluorescencji typu dzikiego (GFP), początkowo opracowany przez Pattersona i Lippincotta-Schwartza⁸, który jest zmutowany w sposób, który pozwala na znaczne zwiększenie jego fluorescencji po ekspozycji na światło ultrafioletowe (UV) (około 400 nm; tutaj 405 nm). Jak opisali Patterson i wsp., chromofory GFP typu dzikiego występują jako mieszana populacja obojętnych fenoli i anionowych fenolanów, które wytwarzają odpowiednio główny pik absorbancji przy około 397 nm i mniejszy przy 475 nm. Po naświetlaniu białka światłem UV populacja ulega fotokonwersji, przechodząc w kierunku formy anionowej. Po wzbudzeniu przez 488 nm, fotoprzekształcone/fotoaktywowane białko wykazuje 3-krotny wzrost fluorescencji, co w praktyce jest niewystarczające do rozróżnienia między aktywowanym i nieaktywowanym GFP ze względu na wysoką wewnętrzną fluorescencję tła. Jednak zmniejszenie intensywności tła osiągnięto poprzez wprowadzenie pojedynczej mutacji aminokwasowej do sekwencji GFP (substytucja histydyny w pozycji 203). Powstały mutant T203H, znany również jako fotoaktywowalny GFP (PA-GFP), charakteryzuje się znacznym zmniejszeniem absorbancji mniejszego piku, który po napromieniowaniu światłem UV zwiększa się prawie 100-krotnie, gdy następnie wzbudza światło o długości 488 nm. W związku z tym nadekspresja białek znakowanych PA-GFP jest szeroko stosowanym podejściem, które pozwala na określenie dyfuzji i ruchliwości cząsteczek w komórkach. Wcześniej zastosowaliśmy aktynę znakowaną PA-GFP, aby określić szybkość dyspersji monomerów aktyny z dala od regionów cytozolowych, umożliwiając nie tylko zbadanie ich ruchliwości w cytozolu, ale także szybkość ich włączenia do wystającej blaszkowatej sieci aktynowej ⁶. Nowsze piśmiennictwo opisuje również nowe, fotokonwertowalne białka, które w zasadzie mogą być stosowane w analogiczny sposób, ale mają potencjalną przewagę, ponieważ są widoczne już przed fotokonwersją. Przykładami dla tej grupy białek fluorescencyjnych są Dendra2 i mEos2^9,10,11,12.

W tym artykule wyjaśniamy metodologię mikrowstrzykiwania komórek białkami. Dalej wyjaśniamy, w jaki sposób można połączyć tę technikę z FRAP poprzez fotowybielanie białek zaangażowanych w regulację i ruchliwość cytoszkieletu aktynowego oraz jak można wyprowadzić krzywe FRAP i czas połowicznego powrotu frakcji ruchomych. Ponadto podajemy przykład, w jaki sposób technika FRAP może być wykorzystana do określenia szybkości polimeryzacji aktyny sieci lamelipodialnych. Udostępniamy również instrukcje i wskazówki, jak przeprowadzać eksperymenty fotoaktywacyjne, które można wykorzystać do określenia cytozolowej ruchliwości monomerycznej aktyny i szybkości inkorporacji aktyny do lamellipodiów. Techniki te, oczywiście, nie ograniczają się tylko do śledzenia składników cytoszkieletu aktynowego, ale po potencjalnie wymaganej umiarkowanej adaptacji lub optymalizacji mogą być szeroko stosowane do innych typów komórek lub do badania różnych białek, struktur i parametrów.

Protocol

1. Mycie i sterylizacja szkiełek nakrywkowych

1. Zanurzyć szkła nakrywkowe o średnicy 15 mm (nr 1) w kolbie o pojemności 500 ml zawierającej mieszaninę 40 ml 37% HCl i 60 ml 100% EtOH (nie więcej niż 100 szkiełek nakrywkowych na 100 ml roztworu myjącego).
   UWAGA: Nawet świeżo zakupione szkiełka nakrywkowe muszą być dokładnie oczyszczone przed wysiewem komórek na ich powierzchnię. Dzieje się tak dlatego, że mogą zawierać cienkie warstwy tłuszczu, które są makroskopowo niewidoczne, ale mogą skutecznie zakłócać adhezję i odpowiednie rozprowadzanie żywych komórek. Natomiast takie naloty można skutecznie usunąć za pomocą roztworów zawierających kwas lub zasadę (patrz Fischer i wsp.¹³), rutynowo używamy opisanej powyżej mieszaniny kwasów i alkoholi.
2. Potrząsać kolbą zawierającą okulary nakrywkowe przez 30 minut na wytrząsarce rotacyjnej. Wybierz prędkość, która pozwala na swobodne obracanie szkieł nakrywkowych, ale na tyle wolno, aby uniknąć częstego pękania. Przefiltruj roztwór, aby usunąć potłuczone kawałki szkła w przypadku ponownego użycia.
3. Przenieść szklanki nakrywkowe do kolby zawierającej co najmniej 200 ml sterylnej wody i inkubować na wytrząsarce rotacyjnej, wielokrotnie wymieniając wodę, aż do ustąpienia kwaśnego zapachu. Zaleca się wielokrotne płukanie przez kilka godzin w celu całkowitego wyeliminowania śladów HCL-EtOH.
4. Wysuszyć pojedyncze okulary nakrywkowe na arkuszu bibuły filtracyjnej.
5. Umieść szkła nakrywkowe na dnie szalki Petriego o średnicy 10 cm pokrytej bibułą filtracyjną i podgrzej na sucho. Unikaj sterylizacji w autoklawie, ponieważ spowoduje to sklejanie się okularów nakrywkowych.

2. Obróbka komórek, transfekcja i wysiewanie na szkiełka nakrywkowe

1. Hodować mysie komórki czerniaka B16-F1 zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli komórkowej w DMEM (4,5 g / L glukozy) zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C, 7% CO₂ .
2. Hodować komórki fibroblastów NIH3T3 do mikroiniekcji zgodnie ze standardowymi warunkami hodowli komórkowej (inkubator do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 7% CO_{2 )} w DMEM (4,5 g / L glukozy) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1 mM pirogronianu sodu, 1x MEM aminokwasów endogennych, 2 mM glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny.
3. W przypadku transfekcji należy wyhodować komórki B16-F1 do 100% zbiegu w 10-centymetrowym naczyniu i przejść w stosunku 1:5 do plastikowego naczynia o średnicy 3 cm.
4. Tego samego dnia, po tym, jak komórki B16-F1 pozwolono na przyleganie przez co najmniej 6 godzin, transfekować 500 ng / talerz fotoaktywowanego DNA plazmidu PA-GFP lub plazmidu β-aktyny znakowanego EGFP. W przypadku kotransfekcji aktyny PA-GFP z wektorami kodującymi mCherry, należy wymieszać łącznie 1 μg plazmidowego DNA na 3 cm naczynie.
5. Transfekcję komórek B16-F1 za pomocą odczynnika do transfekcji (tabela materiałów). Na 3 cm szalkę zmieszać 200 μl 150 mM NaCl zawierającego 500 ng konstruktu DNA z 200 μl 150 mM NaCl zawierającego 1 μl odczynnika do transfekcji (tj. zastosowano stosunek DNA (μg) do odczynnika (μL) 1:2).
6. Inkubować mieszaninę transfekcji przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) i pipetować kroplami na 3 cm szalkę zawierającą komórki. Delikatnie zamieszaj naczynie, aby wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 7% CO₂ .
7. Przygotować bufor do powlekania lamininą zawierający 50 mM Tris, pH 7,4 i 150 mM NaCl.
8. W przypadku komórek B16-F1 pokryć szkła nakrywkowe o średnicy 15 mm, rozprowadzając 150 μl lamininy (25 μg/ml w buforze powlekającym lamininę) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze suchej masy. W przypadku komórek NIH3T3 pokryć szkła nakrywkowe roztworem fibronektyny (25 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
9. Umyć szkła nakrywkowe inkubowane lamininą lub fibronektyną PBS, a następnie odessać PBS i dodać 2 ml transfekowanych komórek.
10. Wysiewać transfekowane komórki B16-F1 (w stosunku 1:30 z naczynia zlewającego się), następnego dnia po transfekcji, na szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą. Wysiewaj fibroblasty NIH3T3 (w stosunku 1:20 z naczynia zlewającego się) na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną.
11. Pozostawić komórki do rozprzestrzenienia się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą lub fibronektyną przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przed badaniem mikroskopowym. Alternatywnie, eksperymenty mikroskopowe można rozpocząć tego samego dnia, pod warunkiem, że komórki mogą się rozprzestrzeniać przez co najmniej 2-3 godziny.

3. Montaż komory obrazowania mikroskopowego

1. Użyj przewodzącej ciepło aluminiowej komory obrazowania RC-26 do mikroskopii ( Rysunek 1a). Rozsmaruj smar silikonowy wokół konturu plastikowego otworu uszczelniającego za pomocą strzykawki (Rysunek 1b).
2. Umieść szklankę nakrywkową komórkami do góry na komorze (Rysunek 1c).
3. Umieść plastikowy uszczelniacz na wierzchu szkła nakrywkowego, aby zapewnić bezpieczne uszczelnienie między szkiełkiem nakrywkowym a komorą. Zamocuj plastikowy uszczelniacz (po przekątnej, aby uniknąć pęknięcia szkiełka nakrywkowego), przykręcając zaciski przesuwne do komory, aby uniknąć wycieku medium (Rysunek 1d).
4. Odpipetować wstępnie podgrzane podłoże mikroskopowe o temperaturze 37 °C do centralnego obszaru. W przypadku pożywki o obniżonej autofluorescencji, a tym samym zoptymalizowanej pod kątem mikroskopii, należy użyć tej samej receptury, co pożywki hodowlanej opisanej powyżej, ale z F12-HAM zamiast DMEM, zawierającej dodatkowo 20 mM HEPES do hodowli komórek pod nieobecność CO₂ (Rysunek 1e).
5. Włóż czujkę ciepła do wyznaczonego miejsca w komorze i połącz elektrody komory z automatycznym regulatorem temperatury TC-324B utrzymującym stałą temperaturę 37 °C (Rysunek 1f).
6. Umieść małą kroplę olejku immersyjnego na obiektywie i umieść komorę na górze.
7. Inkubować komorę z komórkami przez co najmniej 10–30 minut, aby mogły odzyskać siły po spadku temperatury podczas montażu i przystosować się do podłoża mikroskopowego.
8. Przed rozpoczęciem mikroskopii należy wymienić pożywkę hodowlaną w centralnym zbiorniku komory (około 800 μl), aby uniknąć niewłaściwego stężenia składników pożywki i surowicy z powodu parowania pożywki. Przedłużone sesje mikroskopowe z otwartymi komorami będą wymagały rutynowej wymiany parującego medium.

4. Procedura mikroiniekcji

1. Pokryj szkiełka nakrywkowe, przygotuj komórki i zmontuj komorę obrazowania zgodnie z powyższym opisem.
2. Rozmrozić podwielokrotność oczyszczonego białka do wstrzyknięcia (zwykle 10 μl lub mniej) i rozcieńczyć odpowiednim buforem do mikroiniekcji.
   UWAGA: Skład buforu może się różnić w zależności od białka i typu komórki, ale należy uważać, aby używać pH między 6,95 a 8,00 i unikać stosowania PBS, ponieważ większość komórek nie lubi być wstrzykiwana PBS.
3. Do mikroiniekcji Rac1 należy przygotować bufor zawierający 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT. Jony^Mg2+ są niezbędne dla stabilności małych GTPazy.
   UWAGA: Stężenia białka zwykle wahają się między 0,1–1 mg / ml (maksymalnie 2 mg / ml), w zależności od białka, rodzaju eksperymentu i typu komórki.
4. W stosownych przypadkach dodać barwnik fluorescencyjny, taki jak obojętny dekstran (0,5 μg/ml, 70 kDa) do roztworu białkowego, który może potwierdzić obecność przepływu igły przed wstrzyknięciem i umożliwia dokumentację udanych wstrzyknięć po eksperymencie.
   UWAGA: Eksperyment tutaj nie ma na celu śledzenia dynamiki wstrzykniętego Rac1, co byłoby możliwe tylko po bezpośrednim znakowaniu fluorescencyjnym białka. Sprzężenie białek z barwnikami fluorescencyjnymi lub fuzja z białkiem fluorescencyjnym jest możliwe, ale unika się tego w tym przypadku, ponieważ wiąże się to z ryzykiem zakłócenia funkcji sygnalizacyjnej, w szczególności małych białek, takich jak GTPaza z rodziny Rho Rac1 (20 kDa).
5. Odwirować roztwór białkowy o stężeniu 10 000 x g przez co najmniej 30 minut, aby usunąć agregaty białkowe, które mogą prowadzić do zatkania igły, jeśli są obecne w kapilarze mikroiniekcyjnej.
6. Na igłę do mikroiniekcji (kapilar do mikroiniekcji) naładować 1 μl mieszaniny iniekcyjnej od tyłu za pomocą elastycznej końcówki do pipety/końcówki do mikrodoładowania.
7. Jeśli w końcówce igły znajdują się pęcherzyki powietrza, delikatnie postukaj w podstawę igły, aby je usunąć. Postępuj szybko, aby uniknąć wysuszenia końcówki igły, co mogłoby spowodować zatkanie igły.
8. Ostrożnie wyreguluj uchwyt igły na urządzeniu do mikromanipulacji. Jeśli używasz mikroskopu odwróconego do obrazowania z kontrastem fazowym, przed załadowaniem igły upewnij się, że jest wystarczająco dużo miejsca, aby przesuwać igłę w górę iw dół bez zasłaniania kondensora mikroskopu.
9. Po przykręceniu mikrokapilary do uchwytu igły, należy przycisnąć igłę (ciśnienie tła 20–50 hPa) za pomocą urządzenia do mikroiniekcji, a następnie przenieść końcówkę igły do pożywki do hodowli komórkowych.
   UWAGA: Aktywacja ciśnienia, gdy igła znajduje się w pożywce, spowoduje, że podłoże zostanie zassane przez siłę kapilarną, a tym samym uniemożliwi wstrzyknięcie interesującego roztworu.
10. Umieść igłę w polu widzenia (ułatwione przez użycie obiektywów o małym powiększeniu). Użyto tu suchego obiektywu 40X do eksperymentów z mikroiniekcjami.
11. Ustawić końcówkę igły makroskopowo w pozycji pionowej względem środka soczewki obiektywu (przyspieszy to znalezienie końcówki igły). Użyj mikroskopu z optyką z kontrastem fazowym, aby przesunąć końcówkę igły w płaszczyźnie poziomej względem pola widzenia, w płaszczyźnie optycznej znacznie powyżej warstwy komórek.
    UWAGA: Igła początkowo pojawi się jako cień w polu view, a płaszczyznę ostrości można następnie dostosować, aby uwidocznić końcówkę. Po znalezieniu końcówki igły stopniowo obniżaj płaszczyznę optyczną, a następnie końcówkę igły w dół do pozycji zbliżonej do warstwy komórek.
12. Sprawdź przepływ igły, przełączając się na kanał fluorescencyjny w przypadku korzystania z dekstranu fluorescencyjnego, i dostrój przepływ za pomocą urządzenia ciśnieniowego, aby uzyskać stały przepływ "tła".
    UWAGA: W tym artykule opisujemy wstrzyknięcie ręczne, w którym pośredniczy przebicie się przez błonę plazmatyczną poprzez dotknięcie powierzchni komórki i delikatny ruch końcówki igły podczas stałego przepływu igły. Należy to odróżnić od automatycznych urządzeń do wstrzykiwania, którym towarzyszy zaprogramowane obniżanie igły i zwiększanie nacisku igły podczas iniekcji, które są bardziej odpowiednie do wstrzykiwania większej liczby komórek, po którym następuje późniejsza analiza populacji komórek. Opisana tutaj metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy pojedynczych komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej przed, w trakcie i po mikroiniekcji.
13. Znajdź interesującą Cię komórkę i stopniowo opuszczaj igłę nad komórką.
14. Gdy igła jest gotowa do mikroiniekcji, stopniowo opuszczaj igłę w kierunku obszaru okołojądrowego komórki za pomocą cienkiego zębnika joysticka mikromanipulatora, utrzymując ostrość komórek.
15. W przypadku mikroiniekcji delikatnie dotknij błony plazmatycznej komórki, co może wystarczyć do przeniknięcia do komórki lub wspomóc przejściowe pęknięcie błony poprzez bardzo delikatne dotknięcie zestawu mikroskopu.
    UWAGA: Biała kropka na końcówce igły wskaże czas kontaktu z błoną plazmatyczną; Po pęknięciu błony końcówka igły ponownie się uszczelnia, czemu towarzyszy delikatny przepływ roztworu do wstrzykiwań do komórki.
16. Należy przerwać proces wstrzykiwania, gdy tylko widoczny będzie przepływ do komórki (najlepiej w ciągu 0,3 s), przesuwając końcówkę igły w górę do pożywki. W przypadku stosowania dekstranu fluorescencyjnego, udane wstrzyknięcia można natychmiast udokumentować za pomocą fluorescencji.
17. W razie potrzeby rozpocznij akwizycję obrazu poklatkowego przed lub po mikroiniekcji.
    UWAGA: Miejscowe stosowanie leków lub inhibitorów może być wykonywane na wszystkich etapach, z wyjątkiem zdarzenia mikroiniekcji jako takiego. W przypadku zastosowań lokalnych dyfuzja aktywnej cząsteczki może być kontrolowana przez ciśnienie przepływu i dokumentowana przez fluorescencję, a końcówka igły może być umieszczona na żądanej wysokości. Przykłady eksperymentów z aplikacjami lokalnymi można znaleźć np. w Small and Rottner¹⁴ lub Kaverina et al.¹⁵
18. Po mikroiniekcji należy poczekać, aż wystąpi działanie białka. W przypadku różnych białek i w zależności od oczekiwanego wyniku, czas inkubacji może się różnić. W przypadku małej GTPazy Rac1 odpowiedź na tworzenie się blaszki może być zainicjowana w ciągu 1 minuty lub krócej, ale zajmuje średnio około 10-15 minut, aby w pełni się rozwinąć (Rysunek 1g, h).
19. Oceń żywotność komórek po mikroiniekcji.
    UWAGA: Niewłaściwe lub szkodliwe zastrzyki mogą powodować uszkodzenie komórek, któremu często towarzyszy niespecyficzne cofnięcie krawędzi komórki lub pęknięcie błony plazmatycznej.
    1. Należy unikać przebijania się zarówno przez górną, jak i dolną błonę plazmatyczną, co może wystąpić w przypadku wstrzyknięć w płaskie obszary komórkowe.
       UWAGA: Objętość wstrzyknięć powinna być ograniczona do minimum (najlepiej <5% objętości komórki) i zwykle mieści się w zakresie femtolitrów. Wymagane objętości wstrzyknięć można również kontrolować poprzez zmiany stężenia, ale należy pamiętać, że w przypadku białek stężenia >2 mg/ml mogą stać się niepraktyczne z powodu częstego zatykania się igły. Zależy to jednak również od jakości i zachowania oczyszczonego białka; np. wstrzykiwanie aktyny sprzężonej fluorescencyjnie jest skomplikowane przez zależną od stężenia i nieuniknioną polimeryzację w końcówce igły, a więc jest obecnie rzadko wykonywane (patrz Small i wsp.16).
20. Przed, w trakcie lub po efekcie mikroiniekcji można wykonać FRAP lub fotoaktywację na tej samej komórce (patrz punkty 5 i 6).

5. Procedura FRAP

1. Transfekcja typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania (tutaj komórki B16-F1) za pomocą plazmidowego DNA kodującego interesujące nas białko znakowane fluorescencyjnie (w tym przypadku zastosowano wersję β-aktyny znakowaną EGFP). Wysiewać komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (krok 2.10).
2. Zmontować komorę obrazowania (rozdział 3).
3. Użyj następujących ustawień dla fotowybielania w obszarze lamelipodialnym: moc lasera 65 mW (zmienna w zależności od konfiguracji eksperymentalnej i źródła lasera); średnica wiązki laserowej 10 pikseli; czas przebywania wybielacza 1 ms/piksel; czas ekspozycji GFP 500 ms; interwał czasowy 1,500 ms. Wyniki eksperymentalne w tej pracy przeprowadzono z obiektywem apochromatycznym 100X 1,4NA.
4. Wykonaj kalibrację laserową, aby zapewnić dokładność wymiarów obszaru wybielanego fotoelektronicznie. Przed kalibracją należy przesunąć pole widzenia na obszar, w którym nie ma żadnych komórek/sygnału fluorescencji i obserwować obraz na wyświetlaczu.
5. Wybierz powiększenie obiektywu, klikając odpowiedni przycisk powiększenia i zmniejsz moc lasera (3–5 mW) w menu "Panel | Intensywność". Aby rozpocząć ręczną kalibrację w oprogramowaniu Visiview (wersja 2.1.4), wybierz opcję "Konfiguruj | FRAP" i kliknij przycisk "Kalibruj | Dostosuj ręcznie". Upewnij się, że laser można odróżnić jako ostrą kropkę. Jeśli nie, zmień ostrość lub wyreguluj osprzęt laserowy.
6. Wykonaj kalibrację, ręcznie kierując laser do wstępnie określonych współrzędnych X-Y oprogramowania. To instruuje oprogramowanie, jak dokładnie skierować laser na obszar zdefiniowany przez użytkownika dla aktualnego powiększenia.
7. Przed wyzwoleniem lasera przełącz się na kanał GFP i rozpocznij akwizycję obrazu/poklatkową.
8. Ręcznie narysuj obszar do fotowybielania na kanale GFP, podczas view wyświetlacz.
9. Rozpocznij fotowybielanie za pomocą ręcznego spustu lasera 405 nm, co najmniej 3–4 klatki po rozpoczęciu akwizycji obrazu. Pozyskanie klatek przed fotowybielaniem jest wymagane do normalizacji obrazu w późniejszej analizie danych.

6. Procedura fotoaktywacji

UWAGA: Oprogramowanie, ustawienia mikroskopu i ustawienia, z wyjątkiem mocy lasera, są podobne do tych dla FRAP. W przypadku fotoaktywacji istotną różnicą w porównaniu z FRAP jest to, że należy użyć lasera o mocy 405 nm znacznie niższej niż ta stosowana do fotowybielania, aby aktywować PA-GFP bez jednoczesnego fotowybielania.

1. Współtransfekować typ komórki będący przedmiotem zainteresowania (tutaj komórki B16-F1; patrz krok 2.5) za pomocą plazmidowego DNA kodującego PA-GFP-aktynę i innego białka znakowanego fluorescencyjnie (np. mCherry lub mCherry-Lifeact).
   UWAGA: W większości przypadków komórki mCherry-dodatnie będą również dodatnie dla wektora PA-GFP-aktyny, który zwykle nie jest widoczny w kanale GFP przed fotoaktywacją. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że komórki mCherry-dodatnie są również dodatnie dla PA-GFP, użyj stosunku transfekcji 1:2 mCherry:PA-GFP-aktyny. Zgodnie z tym protokołem ponad 90% komórek wykazujących ekspresję mCherry wykazało pomyślną aktywację PA-GFP-aktyny.
2. Wysiewać komórki B16-F1 na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (krok 2.10).
3. Zmontować komorę obrazowania (rozdział 3).
4. Przed rozpoczęciem eksperymentów fotoaktywacyjnych, jeśli to konieczne, wykonaj kalibrację lasera dla wybranego obiektywu (kroki 5.4–5.6).
5. Ustaw akwizycję obrazu GFP/488 nm na ekspozycję 500 ms i interwał czasowy 1 500 ms (w zależności od projektu eksperymentalnego).
6. Dostosuj ustawienia oprogramowania do nagrywania dwukanałowych lub trzykanałowych filmów poklatkowych, zaznaczając kwadrat "Seria długości fal" i wybierając żądaną liczbę kanałów w menu "Acquire | Długość fali". Zaleca się, aby filmy poklatkowe były rejestrowane z kanałami kontrastu fazowego i GFP.
   1. Opcjonalnie należy również uwzględnić kanał mCherry, jednak wystawienie komórek na zbyt dużą ilość światła może wywołać fotouszkodzenia. Można tego uniknąć za pomocą pochłaniaczy tlenu, takich jak Oxyrase¹⁷, chociaż skuteczne leczenie wymaga uszczelnienia komory komórkowej.
7. Znajdź transfekowane komórki na kanale mCherry.
8. Przed wyzwoleniem lasera zainicjuj akwizycję obrazu/filmu poklatkowego i ręcznie narysuj obszar, który ma być fotoaktywowany na kanale kontrastu fazowego, podczas view wyświetlacz.
9. Rozpocznij fotoaktywację za pomocą ręcznego spustu lasera 405 nm (intensywność ustawiana w zakresie 5–15 mW z menu "Panel | Intensywność"), co najmniej 3–4 klatki po rozpoczęciu akwizycji obrazu.

7. Analiza danych i prezentacja wyników FRAP

UWAGA: Przedstawiona metoda służy do badania obrotu białka gromadzącego się w miejscach dynamicznego składania aktyny, w tym przypadku VASP, które wiąże się z miejscami adhezji i końcówkami wystających blaszek. Analizujemy jego obrót na czubku blaszkowatego, ale te same zasady analizy można zastosować do badania obrotu VASP lub dowolnego innego białka i innych przedziałów subkomórkowych.

1. Otwórz filmy poklatkowe pochodzące z Visiview w oprogramowaniu Metamorph. W tym artykule użyto Metamorph v7.8.10.
2. Określ wartości intensywności dla fotobielonych obszarów, ręcznie obrysowując odpowiednie regiony w Metamorfie. Narysuj kształt na czubku blaszki, który pokrywa cały obszar fotobielony lub jego część, i w razie potrzeby ręcznie dostosuj jego położenie na kolejnych klatkach (tj. jeśli krawędź wystaje), aby śledzić zmiany intensywności blaszek odpowiedniego składnika podczas przemieszczenia końcówki.
3. Aby skorygować tło i akwizycję fotowybielania, przeanalizuj obszary wewnątrz i na zewnątrz komórki. Zobacz Rysunek 2a dla reprezentatywnych regionów mierzonych intensywności.
4. Po wybraniu ROI wyodrębnij jego wartości intensywności w Metamorph, korzystając z menu "Zmierz | Pomiary regionu". Upewnij się, że opcje "Czas, który upłynął" i "Średnia intensywność" są wybrane w menu "Konfiguruj". Kliknij "Otwórz dziennik" i wybierz "Dynamiczna wymiana danych". Kliknij "OK", aby otworzyć arkusz kalkulacyjny Excel i ponownie kliknij przycisk "Otwórz dziennik", aby wkleić wartości Metamorph do Excel.
   UWAGA: Wartości te służą do generowania krzywych odzysku fluorescencji.
5. Aby wygenerować krzywe odzyskiwania fluorescencji na końcówce blaszki obszarów fotowybielanych (znormalizowane do intensywności obszaru przed fotowybielaniem), zastosuj następujące równanie:
   Równanie 1
   gdzie: FRAP^Tn oznacza intensywność obszaru fotobielonego dla każdej klatki będącej przedmiotem zainteresowania po fotowybielaniu; Out^Tn to intensywność obszaru pobranego poza komórkę (tło) dla każdej interesującej klatki po fotowybielaniu; Ins^Tn to dwie uśrednione intensywności regionu wewnętrznego dla każdej klatki zainteresowania po fotowybielaniu (używane do normalizacji fotowybielania akwizycyjnego w czasie); FRAP^T-1 to intensywność fotobielonego obszaru przed fotowybielaniem; Out^T-1 to intensywność obszaru pobrana na zewnątrz komórki (tło) przed fotowybielaniem; a Ins^T-1 to dwie uśrednione intensywności regionu wewnętrznego dla każdej klatki zainteresowania przed fotowybielaniem.
6. Dla każdego interesującego przedziału czasowego użyj równania 1, aby uzyskać krzywą odzyskiwania fluorescencji zawierającą wszystkie ramy czasowe, które mają być zbadane. Czas ten jest ściśle zależny od badanego białka. Jeśli nie jest to znane, przeprowadź wstępne eksperymenty, aby uzyskać szybkość obrotu białka.
7. Aby obliczyć czas połowicznego powrotu do zdrowia, wklej wartości krzywej odzysku fluorescencji wraz z odpowiednim czasem (w sekundach) na wykres Sigma (v.12) i wykonaj dopasowanie krzywej za pomocą "Kreatora dynamicznego dopasowania | Wykładniczy wzrost do maksimum". Wybierz funkcje monowykładnicze (pojedyncze, 3 parametry) lub dwuwykładnicze (podwójne, 4 parametry), w zależności od najlepszego dopasowania krzywej.
8. Użyj następującego wzoru dla funkcji monowykładniczej:
   Równanie 2
9. Użyj następującego wzoru dla funkcji dwuwykładniczej:
   Równanie 3
10. Wklej parametry "b" i "d" pochodzące z wykresu Sigma (równanie 2 lub równanie 3) do programu Excel, aby obliczyć czas połowicznego powrotu do zdrowia. Zastosuj następujące równania:
    Równanie 4
    lub
    Równanie 5
11. Gdy funkcja monowykładnicza daje dokładne dopasowanie krzywej, należy zastosować tylko równanie 4.
12. Jeśli funkcja monowykładnicza nie powoduje dobrego dopasowania krzywej, zastosuj formułę dwuwykładniczą, rozwiązując zarówno równanie 4, jak i równanie 5. Rozważ, że wynikowe dwa połowiczne czasy odzysku reprezentują dwie różne frakcje białek: odpowiednio frakcję szybko i wolno wymieniającą się.

8. Określanie szybkości polimeryzacji aktyny lamellipodial za pomocą FRAP

1. Aby określić szybkość polimeryzacji aktyny lamellipodial, transfekuj komórki B16-F1 β-aktyną znakowaną EGFP i fotowybielaj obszar lamelipodialny (krok 5.9) przy użyciu odstępu czasu 1,5 s i ekspozycji na GFP 500 ms.
2. W Metamorph otwórz filmy poklatkowe uzyskane z Visiview i skalibruj stosunek pikseli do μm zgodnie z celem używanym przez "Zmierz | Kalibruj odległości".
3. Odtwórz film poklatkowy i zatrzymaj go na klatce, gdy odzysk fluorescencji blaszkowej, który płynie do tyłu w kierunku blaszki jako linia, dotrze do blaszki i nie można śledzić dalszego przepływu do tyłu.
4. Zmierz odległość w μm między końcówką blaszki a grzbietem odzyskanej fluorescencji. Odległość ta odpowiada sumie odległości przepływu wstecznego i wypukłości.
5. Alternatywnie, aby oddzielić występ od przepływu wstecznego, zaznacz końcówkę lamellipodial linią na jedną klatkę przed fotowybielaniem. Użyj linii jako punktu odniesienia w kolejnych kadrach, aby odnieść się do pierwotnego położenia końcówki blaszki w momencie fotowybielania; Punkt odniesienia można wykorzystać do pomiaru odległości występu i przepływu wstecznego.
6. Zwróć uwagę na czas (w sekundach) wymagany do odzyskania fluorescencji po fotowybielaniu. Czas może być obliczany ręcznie na podstawie liczby klatek na sekundę lub wizualizowany przez Metamorph za pomocą opcji "Zmierz | Pomiary regionów".
7. Wyprowadź szybkość polimeryzacji aktyny, korzystając z następującego równania (z niektórymi parametrami równania opartymi na pomiarach Metamorph z kroków 8.4 i 8.6):
   Równanie 6
   gdzie szybkość polimeryzacji aktyny jest w μm / min, odległość przepływu wstecznego jest w μm, odległość występu lamellipodialnego jest w μm, a czas jest w sekundach.

9. Analiza dyfuzji i ruchliwości białek po fotoaktywacji

UWAGA: Przedstawiona tutaj metoda opisuje analizę ruchliwości monomeru aktyny poprzez zastosowanie fotoaktywacji aktyny połączonej z PA-GFP, co ilustruje wizualizacja i kwantyfikacja dyfuzji białek przez cytozol

.

1. Do pomiaru dyfuzji fotoaktywowanej aktyny z dala od regionu cytozolowego, a także akumulacji w regionie lamelipodialnym, użyj Metamorph, aby określić intensywność w czasie w następujących regionach (zilustrowanych w Rysunek 3a): cytozolowy region fotoaktywowany (PA); region lamelipodialny, w którym oczekuje się, że fotoaktywowane białka będą gromadzić się w czasie (Lam); obszar poza komórką używany do normalizacji fluorescencja tła (OUT).
2. Określając ruchliwość aktyny w cytozolu, zmierz różne regiony cytozolowe (patrz Rysunek 3a, regiony R1-R5). Należy zauważyć, że akwizycja fotowybielania nie może być określona w podobny sposób jak FRAP, ze względu na wzrost ogniskowej i ostatecznie całej komórki fluorescencji po aktywacji.
3. Przenieś wartości intensywności dla wszystkich regionów z Metamorfozy do arkusza kalkulacyjnego Excel, zgodnie z opisem w kroku 7.4.
4. W celu zbadania szybkości przemieszczania się fotoaktywowanej aktyny z obszaru cytozolowego fotoaktywacji lub jej szybkości włączania w obszar blaszkowaty (oba reprezentowane jako procentowa intensywność cytozolowego obszaru fotoaktywowanego w czasie 0), wygeneruj krzywe fluorescencji na podstawie danych w kroku 9.3. Zastosuj następujące równania:
   Równanie 7
   Równanie 8
   gdzie: PA^Tn jest intensywnością cytozolowego obszaru aktywowanego światłem dla każdej klatki zainteresowania po fotoaktywacji; LAM^Tn oznacza intensywność obszaru blaszkowato-elipodialnego dla każdej klatki zainteresowania po fotoaktywacji; OUT^Tn to intensywność obszaru wykonanego poza komórką (tło) dla każdej interesującej klatki po fotoaktywacji; PA^T-1 to intensywność cytozolowego obszaru aktywowanego fotoaktywowanym przed fotoaktywacją; LAM^T-1 oznacza intensywność obszaru blaszkowatego przed fotoaktywacją; OUT^T-1 to intensywność obszaru pobranego poza komórkę (tło) przed fotoaktywacją; PA^T0 to intensywność cytozolowego obszaru aktywowanego fotoaktywem w czasie 0 (tj. pierwsza klatka po fotoaktywacji); a OUT^T0 to intensywność obszaru wykonanego poza komórką (tło) w czasie 0 (tj. pierwszej klatce po fotoaktywacji).
5. Opcjonalnie, dla lepszej wizualizacji danych, znormalizuj krzywe intensywności do 0, odejmując intensywność pierwszej klatki po fotoaktywacji od każdej kolejnej klatki.
   UWAGA: Poniższa metoda analizy (kroki 9.6–9.8) pozwala również na obliczenie cytozolowej dyspersji fotoaktywowanej aktyny w cytozolu.
6. Zmierz intensywność regionów cytozolowych, które są kolejno ustawione dystalnie od regionu aktywacji.
7. Aby przedstawić intensywność tych regionów jako procentową intensywność obszaru aktywowanego fotoaktywem w czasie 0, zastosuj równanie 8, w którym intensywności lamelipodiów są zastępowane intensywnościami dla każdego cytozolowego ROI. Rozmiar i liczba regionów może się różnić w zależności od wielkości komórki i odległości dyspersji, która ma być zmierzona.
8. Aby uzyskać wymierną wartość szybkości infiltracji białka fotoaktywowanego w każdym regionie cytozolowym, wklej czas i wartości krzywej wzrostu intensywności fluorescencji dla każdego regionu na wykres Sigma (podobnie jak w analizie FRAP w sekcji 7), użyj równania 2 i równania 4, aby wyprowadzić czas połowiczny, w którym intensywność fluorescencji osiąga plateau. Porównaj wartości t_1/2 między różnymi grupami eksperymentalnymi.

Results

Rysunek 1g, h pokazuje obrazy kontrastu fazowego komórki fibroblastu NIH3T3 przed i 10 minut po mikroiniekcji Rac1, która jest małą GTPazą z rodziny Rho zdolną do indukowania tworzenia lamellipodiów poprzez interakcję z kompleksem WAVE. Komórka jest najpierw wizualizowana przed mikroiniekcją (Ryc. 1g), aby potwierdzić jej żywotność i morfologię, np. brak blaszek. Po 10 minutach od mikroiniekcji komórka wyraźnie zmieniła swoją morfologię, co jest oczekiwane po tym zabiegu i wskazuje na udane wstrzyknięcie (Ryc. 1h).

Dla uproszczenia i jasności, następnie przedstawiamy przykładowe wyniki analizy FRAP i fotoaktywacji w komórkach, które nie zostały dodatkowo mikroiniekowane.

Analiza obrotu VASP oznaczonego EGFP na końcówce lamellipodium jest pokazana w Rysunek 2a-f. Zauważ, że VASP dodatkowo celuje w powstające i ogniskowe zrosty, małe i wydłużone kropki we wnętrzu komórki^18,19. Intensywność fluorescencji obszaru blaszkowatego z wyraźną akumulacją VASP na końcu została wybielona i zmierzona dla każdego przedziału czasowego, śledząc kontur ROI przed, w trakcie i po bieleniu, gdy blaszka wystaje do przodu. Ponieważ bielone białka EGFP-VASP są poddawane recyklingowi przez niebielone cząsteczki w tych miejscach, obserwuje się stopniowe odzyskiwanie fluorescencji (Rysunek 2b). Krzywą odzysku FRAP uzyskaną w ten sposób i znormalizowaną do intensywności przed wybielaniem (wyrażoną jako 1) można zobaczyć w Rysunek 2c. Skuteczność fotowybielania może się różnić i w tym przykładzie wynosiła około 20% wartości przed wybielaniem, jak określono na podstawie wartości t0 (pierwsza klatka po fotowybielaniu). Wzrost fluorescencji osiąga plateau w przykładzie pokazanym przy około 80% fluorescencji przed wybielaniem. W strukturze statycznej w trakcie trwania eksperymentu, takiej jak adhezja ogniskowa, różnica między intensywnością przed wybielaniem a fluorescencją plateau osiągniętą po wyzdrowieniu jest definiowana jako frakcja nieruchoma (IF, czerwona strzałka w Rysunek 2c, e), podczas gdy ilość fluorescencji odzyskanej między czasem wybielania a pełnym wyzdrowieniem jest zdefiniowana jako frakcja ruchoma (zielona strzałka z podwójnym grotem w Rysunek 2c, e). Należy zauważyć, że w dynamicznie zmieniającej się strukturze, takiej jak analizowana tutaj końcówka blaszkowate, zakres IF może nie tylko reprezentować nieruchome cząsteczki, ale także wynikać ze zmniejszenia prędkości wypukłości, ponieważ wiadomo, że intensywność EGFP-VASP zależy od tego parametru¹⁸. Aby obliczyć czas połowicznego zaniku rekonwalescencji, na wykresie Sigma utworzono krzywą dopasowania (Rysunek 2d). W tym przypadku wartość parametru "b" wyodrębnionego z rozwiązania równania 2 jest równa 0,0754, co po zastosowaniu do funkcji logarytmicznej (równanie 4) daje szacowany czas połowicznego zaniku odzyskiwania wynoszący 9,19 s (Rysunek 2d, skrajny prawy panel), który jest stosunkowo szybki w tej konkretnej komórce w porównaniu ze średnią opublikowaną wcześniej⁵. Należy zauważyć, że okresy połowicznego rozpadu mogą się czasami znacznie różnić w zależności od komórki w tej samej populacji. Dlatego, aby uzyskać reprezentatywne wyniki, zalecamy określenie tego parametru jako średniej z co najmniej 15-20 komórek. Aby zilustrować stopień wariancji, wygenerowano arytmetyczne średnie odzyskiwania EGFP-VASP uśrednione z 15 komórek dla każdego punktu czasowego (Rysunek 2e), a średnie dopasowania krzywych utworzono i wyświetlono w analogiczny sposób (Rysunek 2f).

Szybkość polimeryzacji sieci aktynowej lamellipodial stanowi sumę wysunięcia sieci do przodu i przepływu wstecznego. FRAP może być stosowany do pomiaru szybkości polimeryzacji aktyny poprzez transfekcję komórek (w tym przypadku B16-F1) za pomocą β-aktyny znakowanej EGFP i fotowybielanie wystającego obszaru blaszkowatego (Rysunek 2g). W celu analizy polimeryzacji sieci aktynowej lamelipodialnej ocenia się odzysk fluorescencji po bieleniu β-aktyny znakowanej EGFP w czasie. W miarę postępu polimeryzacji monomerów aktyny na kolczastych końcach lamelipodialnych włókien aktyny (z których wszystkie są skierowane w stronę frontu²⁰), sieć jest stale przemieszczana do tyłu i postępuje do przodu, której szybkość można łatwo uzyskać poprzez spolaryzowany odzysk fluorescencji po fotowybielaniu. Odzysk fluorescencji blaszki jest zakończony, gdy tylko wybielona strefa dotrze do strefy przejściowej między tylną częścią blaszki a blaszką, która charakteryzuje się mniejszą gęstością bardziej poziomo ułożonych wiązek włókien obracających się znacznie wolniej niż to, co obserwuje się w blaszkach. Jak pokazano na rysunku Rysunek 2g, odzyskiwanie fluorescencji można zobrazować jako linię poziomą do krawędzi i biegnącą do tyłu w kierunku blaszki, co pozwala na pomiar odległości wystających i wstecznych przepływów (indywidualnie reprezentowanych w skrajnym prawym panelu Rysunek 2g jako odpowiednio pomarańczowe i czerwone strzałki z podwójnym grotem).

Również zastosowaliśmy fotoaktywację w komórkach B16-F1 transfekowanych aktyną PA-GFP, aby śledzić ruchliwość monomerów aktyny w cytozolu i szybkość ich włączania w wystające lamellipodia. Jak pokazano w Rysunek 3a, b, region cytozolowy był fotoaktywowany przez ekspozycję na laser 405 nm, podczas gdy obrazy były rejestrowane na kanale GFP co 1,5 s w celu wizualizacji rozkładu fotoaktywowanej aktyny znakowanej GFP. Fotoaktywowaną aktynę GFP można zobaczyć dyfundującą z obszaru cytozolowego w Rysunek 3b. Szybkość spadku intensywności fluorescencji w fotoaktywowanym regionie cytozolowym jest reprezentowana jako procent początkowej intensywności przy t0 (pierwsza klatka po fotoaktywacji; Rysunek 3c). Aktyna aktywowana fotoaktywem integruje się również na końcach lamellipodiów, gdzie nowe monomery aktyny są dodawane do rosnących kolczastych końców wydłużających się włókien aktyny podczas wypukłości. Aby oszacować szybkość inkorporacji lamelipodialnej, zmierzyliśmy intensywność fluorescencji w czasie dwuwymiarowego konturu/obszaru o szerokości około 5 μm i wysokości 1 μm; Obszar ten był stale przesuwany na czubku blaszki w miarę jej wystania. Włączenie aktyny przedstawiono jako procent intensywności fluorescencji fotoaktywowanego regionu cytozolowego w t0 (Rysunek 3d). Wraz z postępem wydłużania włókien aktynowych nowe monomery aktyny zostały włączone do czoła blaszek i nóg. Frakcja tych monomerów aktyny została stochastycznie poprowadzona z puli cytozolowej, w której monomery były fotoaktywowane. Powoduje to szybki wzrost fluorescencji w lamellipodiach w ciągu pierwszych 20 s po fotoaktywacji. Gdy nowe monomery są dodawane do czoła blaszkowatego, wcześniej włączone monomery aktyny przepływają z włóknami w kierunku blaszki przez przepływ wsteczny. Z biegiem czasu ROI jest całkowicie wypełniony monomerami fluorescencyjnymi i osiągany jest plateau fluorescencji (Rysunek 3d). Stopniowy spadek fluorescencji obserwuje się następnie, gdy w wyniku dyfuzji fotoaktywowanych monomerów w komórce, nieaktywowane fotoaktywowane monomery aktyny są coraz częściej ponownie dodawane do czoła blaszkowatego. Ten spadek fluorescencji znajdzie nowy plateau, który zostanie osiągnięty, gdy tylko zostanie osiągnięta równowaga w całej komórce między fotoaktywowanymi i nieaktywowanymi monomerami (dane nie pokazane).

Ruchliwość monomerów aktyny w cytozolu została uzyskana poprzez pomiar intensywności fluorescencji w regionach o jednakowej wielkości, położonych dystalnie od obszaru aktywowanego przez zdjęcie (zilustrowane na stronie Rysunek 3a za pomocą regionów oznaczonych kolorami oznaczonych R1-R5). Jak pokazano w Rysunek 3e, intensywność fluorescencji w każdym z tych regionów stopniowo maleje od obszaru cytozolowo fotoaktywowanego, ponieważ frakcja fotoaktywowanych monomerów aktyny staje się coraz bardziej rozcieńczana nieaktywowanymi (tj. niefluorescencyjnymi) monomerami. Co więcej, szczyt fluorescencji osiągany jest później: im dalej mierzony obszar znajduje się od obszaru fotoaktywowanego, tym dłuższy czas jest potrzebny, aby monomery aktyny dyfundowały do tych regionów. Reprezentatywną wartość stopnia infiltracji monomeru aktyny do każdego regionu można wyznaczyć poprzez ilościowe określenie połowy czasu osiągnięcia plateau fluorescencji. Im bardziej odległy region, tym dłużej trwa dyfuzja fotoaktywowanej aktyny do niego, a zatem potrzeba więcej czasu, aby osiągnąć plateau fluorescencyjne, co ostatecznie prowadzi do wyższej wartości t_1/2 (Rysunek 3e).

Rysunek 1: Montaż komory obrazowania i procedura mikroiniekcji. (a) Elementy komory obrazowania. (b) Smar silikonowy jest ostrożnie rozsmarowywany wokół otworu plastikowego uszczelniacza. (c) Szkiełko nakrywkowe umieszcza się stroną z komórką skierowaną do góry do środka otworu komory obrazowania. d) Bezpieczne uszczelnienie ustala się poprzez umieszczenie plastikowego uszczelniacza na wierzchu szkiełka nakrywkowego i dokręcenie bocznych zacisków. (e) Pożywka mikroskopowa jest pipetowana do szczeliny komory. f) Komorę obrazowania umieszcza się na stoliku mikroskopu, detektor ciepła i elektrody podłącza się do urządzenia grzewczego ustawionego na temperaturę 37 °C, a komórki pozostawia się do adaptacji przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem mikroskopii. W tym przykładzie stolik mikroskopowy jest również wyposażony w mikromanipulator do wykonywania mikroiniekcji, a igła do mikroiniekcji jest zanurzana w pożywce pokrywającej warstwę komórkową w komorze obrazowania. (g) Komórka fibroblastu NIH3T3 jest wizualizowana przed mikroiniekcją za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Czerwony krzyżyk w przedziale okołojądrowym wskazuje lokalizację przyszłej mikroiniekcji, która odpowiada wysokiemu regionowi cytoplazmatycznemu ze względu na bliskie sąsiedztwo masywnego jądra. h) 10 minut po mikrowstrzyknięciu Rac1 komórka reaguje wyraźnym tworzeniem się blaszek na całym obwodzie komórki (oznaczonej zielonymi strzałkami). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: FRAP pozwala określić tempo obrotu białek lub lamelipodialnej polimeryzacji aktyny. (a) Reprezentatywny przykład komórki B16-F1 wykazującej ekspresję EGFP-VASP przed fotowybielaniem obszaru blaszkowatego, jak wskazano. Kontury/kształty o różnych kolorach są oznaczone, aby wskazać, które obszary były brane pod uwagę przy pomiarach intensywności fluorescencji w czasie. Zwróć uwagę na czerwony kontur oznaczony wykrzyknikiem, który oznacza region cytozolowy umieszczony w obszarze zawierającym wiele pęcherzyków i falban na powierzchni komórki. Dynamiczne obszary, takie jak ten, powinny być unikane przy wyborze obszarów odniesienia fluorescencji, ponieważ charakteryzują się one silnymi krótkotrwałymi wahaniami fluorescencji, co może powodować niedokładne wyniki. b) Obszar blaszkowaty komórki wykazującej ekspresję EGFP-VASP przed i po fotowybielaniu. Odzyskiwanie sygnału fluorescencyjnego po fotowybielaniu w obszarze oznaczonym kolorem fioletowym jest wizualizowane w czasie. Strzałka wskazuje końcówkę mikrokolca, wzbogaconą o VASP, prawdopodobnie ze względu na dużą gęstość polimeryzujących tam filamentów aktynowych¹⁹. c) Przykład krzywej odzysku FRAP wyznaczonej na podstawie ilościowego określenia intensywności fluorescencji blaszki fotobielonej (kontur purpurowy) w b. Czerwone i zielone linie po prawej stronie oznaczają odpowiednio frakcje nieruchome i ruchome. d) Dopasowanie krzywej odzysku FRAP w c (lewy panel) oraz przykład metody obliczeniowej zastosowanej do wyznaczenia połowicznego czasu odzysku (prawy panel). (e) Przykład krzywej odzysku FRAP uzyskanej poprzez uśrednienie krzywych odzysku fluorescencji 15 komórek, ze słupkami SEM wskazującymi stopień zmienności w populacji próbki. (f) Pasowanie krzywej uzyskane na podstawie uśrednienia dopasowań krzywej odzysku FRAP dla 15 komórek (lewy panel) oraz przykład metody obliczeniowej zastosowanej do wyznaczenia połowicznego czasu odzysku (prawy panel). (g) Panele poklatkowe wystającego blaszki komórki B16-F1 wykazującej ekspresję β-aktyny znakowanej EGFP przed i po wybielaniu obszaru blaszkowatego, jak wskazano, a następnie odzyskiwanie fluorescencji w blaszkach w czasie. Na skrajnym prawym panelu podane są wartości zmierzone dla odległości wystających i wstecznych (odpowiednio na pomarańczowo i czerwono). Obliczenia pod panelami obrazu pokazują, w jaki sposób suma odległości wypukłości i wstecznej jest wykorzystywana do wyznaczenia szybkości polimeryzacji sieci aktyny lamelipodialnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Fotoaktywacja aktyny PA-GFP do śledzenia monomeru w całej komórce. (a) Reprezentatywny przykład komórki B16-F1 wykazującej ekspresję PA-GFP-aktyny przed wywołaniem fotoaktywacji w regionie cytozolowym, jak wskazuje czerwone kółko (PA). Kontury o różnych kolorach są oznaczone, aby wskazać, które obszary były brane pod uwagę do pomiarów intensywności fluorescencji w czasie. (b) Ilustracja czasowego rozkładu aktyny PA-GFP po fotoaktywacji. Zwróć uwagę na stopniowe zmniejszanie się fluorescencji w fotoaktywowanym, cytozolowym regionie (czerwone kółko), gdy fotoaktywowana aktyna dyfunduje od niego. Ze względu na ich dyfuzję do przodu i montaż w sieci, fotoaktywowane monomery aktyny są stopniowo wzmacniane w blaszkach (region cyjanowy) i w całym cytozolu (różne regiony oznaczone kolorami) w sposób zależny od odległości i czasu. (c) Reprezentatywny, czasowy spadek fluorescencji w obrębie fotoaktywowanego obszaru cytozolowego (czerwony kontur w b). (d) Czasowe zmiany intensywności fluorescencji w obszarze blaszkowatym (kontur cyjanu w b). e) Krzywe reprezentatywne dla czasowych zmian intensywności fluorescencji regionów cytozolowych (oznaczonych kolorem b) spowodowanych umiejscowieniem w zmiennych odległościach od obszaru fotoaktywacji. Zauważ, że czas połowicznego czasu osiągnięcia plateau fluorescencji (wskazanego w legendzie po prawej) zwiększa się wraz z odległością danego obszaru od obszaru fotoaktywacji, prawdopodobnie korelując ze zwiększonym czasem potrzebnym do dyfuzji monomerów aktyny do odpowiedniego obszaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W tym miejscu omawiamy krytyczne etapy technik opisanych w tym artykule oraz sposób, w jaki można je zoptymalizować pod kątem zastosowania w różnych warunkach eksperymentalnych.

Mikroiniekcja to metoda, którą można zastosować do monitorowania w komórkach natychmiastowych efektów wprowadzenia białek egzogennych, inhibitorów lub leków. Może to być szczególnie korzystne dla określenia funkcji białek w trudnych do transfekcji typach komórek lub w sytuacjach, gdy długotrwała ekspresja nie jest pożądana. Należy zauważyć, że przeżycie niektórych typów komórek różni się w zależności od macierzy zewnątrzkomórkowej, na której są wysiane. Większość typów komórek śródbłonkowych, nabłonkowych lub podobnych do fibroblastów, nawet małych, takich jak keratocyty ryb (patrz Dang i wsp.²¹ oraz Anderson i Cross²²) mogą być z powodzeniem wstrzykiwane. Istnieją jednak wyjątki, takie jak komórki B16-F1 wysiane na lamininie, które stanowią doskonały modelowy system migracji komórek, ale z niewiadomych przyczyn są niekompatybilne z iniekcją na tego typu podłoże. W przypadku komórek fibroblastów NIH3T3 rutynowo wykonujemy iniekcje na podłożu fibronektyny, a dodatkowe techniki fotomanipulacji, takie jak FRAP (nawet z fotoaktywacją; pokazane dla komórek B16-F1 tutaj) mogą być równie dobrze wykonywane w tych fibroblastach (patrz np . Köstler i wsp.³). Należy również wziąć pod uwagę, że różne białka, zgodnie z ich właściwościami funkcjonalnymi i celami eksperymentu, mogą potrzebować różnej ilości czasu, aby wywołać zmiany, od sekund do godzin. Zaletą tej techniki jest to, że dawkowanie/stężenie czynnika egzogennego może być kontrolowane dokładniej na poziomie pojedynczej komórki niż np. w przypadku transfekcji plazmidowej. Ponadto znakowanie fluorescencyjne białka nie jest konieczne, aby zagwarantować jego obecność w komórce, co może zwiększyć elastyczność, jeśli wymagana jest jednoczesna wielokanałowa wizualizacja innych białek znakowanych fluorescencyjnie. Mikroiniekcja może być szczególnie przydatna do analizy natychmiastowego wpływu określonych białek lub mieszanin białek na dynamiczne zmiany morfologii komórek lub cytoszkieletu (np . Dang i wsp.²¹ dla przykładu natychmiastowego wpływu inhibitora kompleksu Arp2/3 na migrację Arpin). Wadą tej techniki jest jej inwazyjność, która może powodować uszkodzenie komórek lub wpływać na morfologię komórek. Dlatego ważną kwestią podczas wykonywania mikroiniekcji jest monitorowanie żywotności komórek. Wprowadzona tutaj metoda opiera się na ręcznej manipulacji. W warunkach przetestowanych pod kątem zgodności z udanymi wstrzyknięciami, takich jak fibroblasty rosnące na podłożu fibronektyny, opisany tutaj protokół ręcznego wstrzykiwania pozwala na prawie 100% skuteczność; Jest to niezbędne w przypadku połączenia tego podejścia z zaawansowanymi i czasochłonnymi eksperymentami uzupełniającymi, w tym mikroskopią wideo lub FRAP, jak opublikowano wcześniej³. Nie wyklucza to, że od czasu do czasu pojedyncze komórki mogą cierpieć z powodu zdarzenia mikroiniekcji, które można bezpiecznie rozpoznać po nagłych zmianach kontrastu zarówno jądra, jak i cytoplazmy, a następnie retrakcji krawędzi komórki. Takie rzadkie przypadki eksperymentalne są wykluczane i w związku z tym nie są brane pod uwagę do dalszych analiz.

Powszechnie stosowane jest jednak również podejście półautomatyczne, na przykład polegające na szybkim (<300 ms) sterowanym maszynowo opuszczaniu igły zbiegającym się ze wzrostem ciśnienia wtrysku, tak że igła musi być umieszczona nad każdą komórką tylko przed odpowiednim wstrzyknięciem. Wskaźnik powodzenia półautomatycznych zastrzyków jest z definicji niższy niż w przypadku podejścia ręcznego opisanego powyżej, po prostu dlatego, że jest ono zoptymalizowane pod kątem szybkości, po której następuje analiza wielu komórek, które pomyślnie przetrwały to leczenie; W związku z tym nie polega na udanym wstrzyknięciu pojedynczej komórki. Dlatego, w przeciwieństwie do analizy pojedynczych komórek, półautomatyczne iniekcje lepiej nadają się do analizy efektów iniekcji kilkuset komórek, np. za pomocą wideomikroskopii przy małym powiększeniu lub po utrwaleniu i barwieniu komórek. Niezależnie od zastosowanego podejścia szczegółowego, mikroiniekcja nie stanowi testu punktu końcowego, ale może być łączona z różnymi technikami, w tym FRAP lub fotoaktywacją³.

Określając szybkość obrotu białek za pomocą FRAP, intensywność lasera musi być zoptymalizowana, w zależności od ustawień mikroskopu i warunków obrazowania (powiększenie, obiektywy itp., a także typ komórki, struktura i białko fluorescencyjne do fotowybielania). Należy pamiętać, że przy optymalnej mocy lasera skuteczne wybielanie łączy się z najmniejszymi możliwymi fotouszkodzeniami, aby uniknąć skurczu lub całkowitego wycofania analizowanej struktury (np . lamellipodia lub filopodia), a nawet uszkodzenia na poziomie komórkowym. Idealnie byłoby, gdyby osiągnięto co najmniej 70-80% skuteczności wybielania, chociaż całkowite wybielanie może być utrudnione przez niezwykle szybką rotację białka, w którym to przypadku wszystko powyżej 50% może być również dopuszczalne. Optymalna moc bielenia dla danej struktury i barwnika fluorescencyjnego powinna być testowana doświadczalnie, zaczynając od niskiej mocy lasera, a następnie stopniowo ją zwiększając. Oczywiście, każdy barwnik fluorescencyjny może być z definicji wybielany światłem laserowym w pobliżu szczytu wzbudzenia (488 nm dla często stosowanych barwników zielonych, takich jak FITC lub EGFP). Jednak lasery o krótszych długościach fal, takie jak lasery bliskiego UV, zapewniają większe moce, a zatem mogą być również wykorzystywane do wydajnego wybielania powszechnie stosowanych barwników. Rutynowo używamy lasera diodowego o długości fali 405 nm (120 mW) do wybielania zarówno barwników EGFP, jak i czerwonych barwników fluorescencyjnych (takich jak mCherry), choć w przypadku tych ostatnich z nieco mniejszą skutecznością (dane nie pokazane). Ponieważ dioda o długości fali 405 nm może być również używana do fotoaktywacji PA-GFP (patrz poniżej), zapewnia ona temu systemowi maksymalną elastyczność.

Do fotowybielania struktur komórkowych B16-F1 i białek fluorescencyjnych zastosowano lasera o mocy 405 nm w zakresie od 65 do 100 mW. Analizując fotobielony obszar, należy wziąć pod uwagę, czy dana struktura zachowała się w swoim pierwotnym kształcie w analizowanym okresie. Na przykład, analizując obrót białek na końcach lamellipodiów, należy zwrócić uwagę, czy krzywizna lamellipodiów nie ulega znaczącym zmianom w czasie, ponieważ zmiany krzywizny mogą prowadzić do niedokładnych wyników, jeśli analizowany obszar/kontur nie obejmuje w pełni całości struktury w każdym mierzonym klatce. Ponadto należy zauważyć, że wiązki osadzone w lamellipodiach, takie jak mikrokolce, mogą powodować odchylenia w intensywności fluorescencji. Jak pokazano na rysunku 2b (biała strzałka w przedziale czasowym 9 s), struktura przypominająca mikrokolce znajduje się obok mierzonego obszaru fotowybielanego, ale pozostaje poza nim przez cały czas trwania pomiaru, a zatem nie powoduje żadnych niedokładności. Dla analizy obrotu białek ważnymi względami przy wyborze lokalizacji i wielkości analizowanych regionów jest to, że na ich fluorescencję w czasie nie powinny mieć znaczącego wpływu zmiany w morfologii komórek lub czynniki inne niż trudne do uniknięcia fotowybielanie akwizycyjne. Na przykład struktury wnoszące istotny wkład ilościowy do analizowanej struktury nie powinny wychodzić poza mierzony obszar podczas analizy; Ponadto niepowiązane, fluorescencyjne jednostki, takie jak struktury pęcherzykowe, które przyciągają białko, nie powinny wchodzić w pole zainteresowania podczas analizy. W celu określenia szybkości polimeryzacji aktyny blaszkowatej należy zwrócić uwagę, aby nie analizować lamellipodiów chowanych lub marszczonych (tj. fałdowanych do góry), ponieważ będzie to miało duży wpływ na dokładność wyników. Ponadto retrakcja obszarów blaszkowatych może wydawać się szybką translokacją do tyłu, potencjalnie prowadząc do przeszacowania szybkości polimeryzacji aktyny lamelipodialnej. Dodatkową kwestią jest odległość wewnątrzkomórkowych regionów normalizacyjnych (przyjmowanych jako pozycje referencyjne dla korekcji fotowybielania akwizycyjnego) od rzeczywistej pozycji fotowybielania, która powinna być wystarczająco duża, aby uniknąć bezpośredniego wpływu obszaru fotowybielanego.

Podczas tworzenia optymalnych warunków do fotoaktywacji konstruktów znakowanych PA-GFP należy zachować ostrożność, aby uniknąć natychmiastowego wybielania podczas fotoaktywacji. W naszej pracy najlepsze wyniki uzyskano przy mocy lasera 5-10 razy mniejszej niż normalnie stosowana do wybielania EGFP. W celu uzyskania obrazu fotoaktywowanych cząsteczek czas ekspozycji i odstęp czasu między klatkami powinny być zoptymalizowane, biorąc pod uwagę wielkość regionów i struktur, które mają być fotoaktywowane i analizowane, a także potencjalną ruchliwość fotoaktywowanych białek do innych lokalizacji subkomórkowych. Podobnie jak w przypadku wszystkich rodzajów obrazowania fluorescencyjnego, utrzymanie żywotności komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania fizjologicznie istotnych wyników.

Zasadniczo, fotokonwersja z zielonego na czerwony białek fluorescencyjnych, takich jak mEos lub warianty Dronpa¹², stanowi równie skuteczną metodę śledzenia dynamiki i obrotu struktur subkomórkowych, takich jak blaszki (patrz np. Burnette i wsp.²³). Zaletą tej drugiej metody, w przeciwieństwie do PA-GFP, byłaby możliwość śledzenia dynamiki białka przed i po konwersji z dwoma różnymi kolorami, bez konieczności koekspresji dodatkowego białka czerwonej fluorescencji. Jednak w naszych wstępnych eksperymentach zakres zmiany kontrastu i intensywność sygnału fluorescencyjnego uzyskanego po fotoaktywacji PA-GFP był większy w porównaniu z sondami fotokonwertowanymi, być może ze względu na lepsze cechy spektralne zielonych i czerwonych sond fluorescencyjnych (dane nie pokazane). W każdym razie szczegółowe badania nad obrotem włókien aktynowych w wypukłościach na krawędziach komórek, takich jak lamellipodia lub ogony aktynowe wywołane wirusem krowianki, zostały do tej pory opublikowane tylko przy użyciu pochodnych PA-GFP ^5,6,24.

Rozważając, który region komórki przeanalizować po fotoaktywacji, należy wziąć pod uwagę kilka czynników, które omówiono na konkretnym przykładzie pokazanym tutaj (włączenie monomerów aktyny na krawędzi komórki po aktywacji w cytozolu), ale z pewnością można je ekstrapolować na różne analogiczne problemy naukowe. Po pierwsze, mierząc szybkość inkorporacji lamelipodialnej cytozolowo fotoaktywowanych białek, na przykład, w różnych warunkach eksperymentalnych (jak wykazano w Dimchev i wsp.⁶), rozmiary regionów cytozolowych i ich odległości do krawędzi blaszkowatych powinny być porównywalne między grupami doświadczalnymi. Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że podczas fotoaktywacji regionów cytozolowych grubość komórki jest większa w pozycjach bliższych jądra. Aktywacja grubszych regionów komórkowych może skutkować większymi ilościami aktywowanych białek, biorąc pod uwagę, że dystrybucja białka, które ma być aktywowane, jest jednorodnie rozmieszczona w cytozolu. Wreszcie, poziomy ekspresji białka, które ma być aktywowane, mogą być z pewnością bardzo zmienne w poszczególnych komórkach. Ze względu na wszystkie te rozważania dotyczące zmienności, kluczowe jest porównanie poziomów inkorporacji cytozolowo aktywowanych białek w innych miejscach komórki w stosunku do całkowitej fluorescencji uzyskanej po aktywacji w określonych regionach.

Opisaliśmy, w jaki sposób mikroiniekcja może być wykorzystana jako narzędzie do badania wpływu białek na morfologię komórek i zilustrowaliśmy to, wykazując silną indukcję struktur lamelipodialnych w komórkach fibroblastów NIH3T3 mikrowstrzykiwanych małą GTPazą Rac1. Wcześniej zastosowaliśmy tę technikę do interferencji z funkcją Arp2 / 3 w komórkach, którym wstrzyknięto C-końcową domenę WCA Scar / WAVE³. Różne parametry w komórkach, którym podano mikroiniekcję, można analizować za pomocą innych testów, takich jak FRAP lub fotoaktywacja. Opisaliśmy, w jaki sposób FRAP i fotoaktywacja mogą być wykorzystane do badania subkomórkowej dynamiki i ruchliwości monomerów aktyny. FRAP był wcześniej używany przez naszą grupę⁵ do badania obrotu białek lokalizujących się w blaszkach, takich jak VASP, Abi, kortaktyna, kofilina i białko capping, lub do wyjaśnienia obrotu składników w zrostach ogniskowych w obecności i braku sygnalizacji Rac⁴. Co więcej, pomiar szybkości polimeryzacji aktyny można osiągnąć poprzez fotowybielanie β-aktyny⁵ znakowanej EGFP, ale istnieją alternatywne metody. Można również zastosować śledzenie niejednorodności fluorescencyjnych obserwowanych przez sondy kompatybilne z obrazowaniem żywych komórek, znakujące komórkowe filamenty aktynowe, takie jak Lifeact^{25 6,26}. Zaletą jest to, że można uniknąć nadekspresji β-aktyny, która jest w stanie zwiększyć wysunięcie krawędzi komórki i migrację, a tym samym potencjalnie zakłóca konkretny test lub pytanie eksperymentalne (patrz np. Kage i wsp.^{Rozdział 26}; Peckham i wsp.²⁷). Jednak wyraźną wadą sondy Lifeact jest jej szybka kinetyka wiązania z filamentami aktyny, tak że bielenie struktur filamentów aktynowych oznaczonych przez Lifeact w komórkach dostarcza informacji tylko o obrocie sondy, ale nie o obrocie włókien aktynowych, z którymi się wiąże²⁵. Śledzenie niejednorodności fluorescencji stosowane wcześniej ^6,26 zapewnia praktyczny kompromis, bardzo podobny do szeroko stosowanego śledzenia plamek fluorescencyjnych włączonych do nitkowatych struktur cytoszkieletu (patrz np. Salmon i Waterman²⁸), ale może nie być tak proste w użyciu i tak precyzyjne jak FRAP struktur F-aktyny znakowanych EGFP. Fotoaktywacja została przez nas zastosowana do oszacowania szybkości włączania monomerycznej aktyny do wystających lamellipodiów, a także jej ruchliwości w cytozolu, w kontekście eksperymentalnie dostrojonych poziomów cytozolowej F-aktyny⁶. Technika ta jest przydatna do badania ruchliwości i dystrybucji białek pochodzących ze stosunkowo dużych obszarów, takich jak regiony cytozolowe. Jednak badanie rozmieszczenia białek pochodzących ze stosunkowo małych struktur aktywowanych światłem; Na przykład stożki wzrostu mogą być trudne ze względu na małą liczbę aktywowanych cząsteczek fluorescencyjnych, słabe sygnały, a tym samym brak czułości. Potencjalne techniki alternatywne dla fotoaktywacji lub fotokonwersji fluorescencji (patrz wyżej) mogą obejmować odwrotny FRAP, który polega na fotowybielaniu całej komórki z wyjątkiem ROI, a następnie śledzeniu ruchliwości cząsteczek fluorescencyjnych z dala od tego obszaru. Technika ta nie wymaga nadekspresji fotoaktywowanych wersji białek, ale zawsze wiąże się z ekspozycją na niezwykle wysoką dawkę lasera, co może powodować niepożądane skutki uboczne, takie jak fotouszkodzenia.

Oczywiste jest, że fotoaktywacja i FRAP nie są w stanie rozróżnić, czy białka poruszają się jako monomery, dimery, czy nawet małe oligomery, i czy poruszają się w połączeniu z dodatkowymi partnerami wiążącymi. Informacje tego rodzaju można uzyskać za pomocą technik spektroskopii korelacji fluorescencji²⁹ lub alternatywnie FLIM-FRET³⁰. Niemniej jednak FRAP i fotoaktywacja stanowią proste podejścia do bezpośredniej oceny lokalnej i globalnej dynamiki białek w komórkach, niezależnie od białka będącego przedmiotem zainteresowania, lokalizacji subkomórkowej lub typu badanej komórki.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B16-F1 komórki czerniaka skóry myszy	Kolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, VA	CRL-6323
Komórki NIH-3T3	Kolekcja kultur typu amerykańskiego, Manassas, VA	CRL-1658
DMEM 4,5 g / L glukozy	Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Niemcy	41965-039
Ham' s F-12 medium	Sigma-Aldrich	N8641
Surowica cielęca płodu  (SKO)	PAA Laboratories, Linz, Austria	A15-102
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich, Niemcy	F7524	Lot054M3396
MEM Aminokwasy endogenne	Gibco, ThermoFisher Scientific, Niemcy	11140035
L-glumatyna 200mM (100x)	Life Technolgies	25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL	Technologie życia	15070063
Pirogronian sodu (100 mM)	Gibco, ThermoFisher Scientific, Niemcy	11360-039
Laminin	Sigma-Aldrich	L-2020
Laminin Bufor do powlekania			Własnej roboty: 50mM Tris ph7,4, 150mM NaCl
Fibronectin z ludzkiego osocza	Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy	11 051 407 001
Jetpei	Polyplus Transfection, Illkirch, Francja	101-10N
JetPei	buffer Polyplus Transfekcja, Illkirch, Francja	702-50	150mM NaCl
PA-GFP-aktynowy plazmid DNA			opisane w Koestler et al.2008
plazmid pEGFP-aktyny DNA	Clontech, Mountain View, CA, USA
Białko Rac1 do mikroiniekcji			Oczyszczone jako wersja oznaczona GST i odcięte od GST przed wstrzyknięciem
		do mikroiniekcji	Własnej produkcji: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT
Dextran, Texas Red, 70 000 MW, sondy molekularne z utrwalaną lizyną	, Thermno Fisher Scientific, Niemcy	D1864
Mikroskop okrągłe okulary nakrywkowe 15mm, nr 1	Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Niemcy	1001/15
Eppendorf Femtotips Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf, Hamburg, Niemcy	5242 956 003
Eppendorf Femtotip Końcówki kapilarne do mikroiniekcji	Eppendorf, Hamburg, Niemcy	930000035
Smar silikonowy	ACC Silicones, Bridgewater, Anglia	SGM494
Aluminiowa otwarta diamentowa komora obrazowania kąpieli	Przyrządy Warner	RC-26
Automatyczny regulator temperatury	Warner Instruments	TC-324B
Mikroskop: Axio Observer	Carl Zeiss, Jena, Niemcy
Aparat CoolSnap-HQ2	Fotometria, Tucson, źródło światła AZ
Lambda DG4	Sutter Instrucment, Novato, CA
Źródło laserowe	Mikrowtryskiwacz Visitron Systems
Eppendorf FemtoJet	Eppendorf, Hamburg, Niemcy		Z wbudowaną sprężarką do zasilania ciśnieniem
System mikromanipulatora Nikon Narishige	Nikon Instruments, Japonia
Oprogramowanie Visiview v2.1.4	Visitron Systems, Puchheim, Niemcy
Oprogramowanie Metamorph v7.8.10	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12	Systat Software Inc.