Ten protokół umożliwi czytelnikom pomyślne stworzenie świńskiego modelu segmentowego niedokrwienia jelit, a następnie izolację i hodowlę jelitowych komórek macierzystych do badania naprawy nabłonka po urazie.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i hodowla jelitowych komórek macierzystych w świńskim modelu segmentowego niedokrwienia jelita cienkiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedokrwienie jelit pozostaje główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów ludzkich i weterynaryjnych. Wiele procesów chorobowych prowadzi do niedokrwienia jelit, kiedy dopływ krwi, a tym samym tlenu do jelita, jest zmniejszony. Prowadzi to do utraty bariery jelitowej i uszkodzenia leżącej pod nią tkanki. Jelitowe komórki macierzyste znajdują się u podstawy krypt Lieberkühna i są odpowiedzialne za odnowę jelit podczas homeostazy i po urazie. Techniki hodowli komórkowych ex vivo pozwoliły na udane badanie interakcji nabłonkowych komórek macierzystych poprzez ustalenie warunków hodowli, które wspierają wzrost trójwymiarowych nabłonkowych układów podobnych do narządów (określanych odpowiednio jako "enteroidy" i "kolonoidy" z jelita cienkiego i grubego). Te enteroidy składają się z domen kryptowych i kosmków i dojrzewają, aby zawierać wszystkie typy komórek znajdujących się w nabłonku. Historycznie rzecz biorąc, modele mysie były wykorzystywane do badania uszkodzeń jelit. Jednak model świni ma kilka zalet, w tym podobieństwo wielkości, a także anatomii i fizjologii przewodu pokarmowego do ludzi. Wykorzystując model świni, ustalamy protokół, w którym segmentowe pętle niedokrwienia jelit mogą być tworzone w obrębie jednego zwierzęcia, umożliwiając badanie różnych punktów czasowych uszkodzenia niedokrwiennego i naprawy in vivo. Dodatkowo opisano metodę izolacji i hodowli jelitowych komórek macierzystych z pętli niedokrwiennych jelita, co pozwala na kontynuowanie badań nad naprawą nabłonka, modulowaną przez komórki macierzyste, ex vivo.
Wprowadzenie
Niedokrwienne uszkodzenie jelit, będące wynikiem zmniejszonej dostępności tlenu z powodu zmniejszenia lub całkowitego zamknięcia przepływu krwi do jelita, pozostaje istotną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u pacjentów ludzkich i zwierzęcych1,2. Uszkodzenie niedokrwienne, wraz z późniejszym stanem zapalnym i infiltracją komórkową, prowadzi do naruszenia bariery śluzówkowej. Bariera śluzówkowa ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania translokacji bakterii i związanych z nią toksyn do krążenia ogólnoustrojowego3,4. Późniejsza reperfuzja niedokrwionych tkanek może powodować powstawanie szkodliwych reaktywnych form tlenu, które mogą nasilać obrażenia5. Ponieważ niedokrwieniu jelit rzadko można zapobiec, większość obecnych badań koncentruje się na rozwoju technik wczesnego wykrywania niedokrwienia i opracowywaniu nowatorskich podejść terapeutycznych, które zmniejszają uszkodzenie reperfuzyjne lub celują w naprawę błony śluzowej.
Modele zwierzęce były szeroko wykorzystywane do poszerzania naszej podstawowej wiedzy naukowej na temat uszkodzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych i pozostają niezbędne do badań translacyjnych. Modele gryzoni są najczęściej używane ze względu na ich zdolność do manipulacji genetycznej6. Ostatnio jednak użycie dużych modeli zwierzęcych, w szczególności świni, zostało zaproponowane w przyszłych badaniach translacyjnych ze względu na szereg zalet, w tym anatomiczne i fizjologiczne podobieństwa świń do ludzi7,8. Opracowano różne modele urazów w celu zbadania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego i obejmują całkowitą niedrożność naczyń krwionośnych, niedokrwienie niskiego przepływu i segmentową niedrożność naczyń krezkowych. Pełna recenzja tych modeli wykracza poza zakres tego artykułu, jednak autorzy kierują czytelników do niedawnej recenzji3.
Oprócz modeli in vivo, wykorzystanie systemów hodowli komórkowych ex vivo oferuje obiecujące narzędzie do badania homeostazy jelit i naprawy po urazie. Jelitowe komórki macierzyste są odpowiedzialne za proliferację komórkową i obrót błony śluzowej nabłonka jelitowego. Po wyizolowaniu z normalnego lub uszkodzonego jelita jelitowe komórki macierzyste mogą być utrzymywane w hodowli i służyć jako narzędzie lub model do badania biologii komórek macierzystych i komórek nabłonka. Metody izolacji i ustanowienia tych trójwymiarowych systemów hodowli (określanych jako enteroidy i kolonoidy, gdy pochodzą odpowiednio z jelita cienkiego i grubego) zostały opisane dla różnych gatunków i układów narządów9,10,11,12,13. W szczególności w przewodzie pokarmowym te systemy hodowli zostały wykorzystane do modelowania chorób przewodu pokarmowego, w tym raka, infekcji patogenami i nieswoistych zapaleń jelit14. W chwili obecnej nie ma doniesień opisujących izolację i utrzymanie jelitowych komórek macierzystych z niechemicznie uszkodzonego jelita cienkiego u żadnego gatunku. Dlatego tutaj opisujemy proces niedokrwienia jelit w nowatorskim, dużym modelu świni zwierzęcej, który skutkuje powtarzalnym urazem i zdolnością do wyizolowania jelitowych komórek macierzystych z normalnego i niedokrwiennie uszkodzonego jelita w celu dodatkowego badania powrotu do zdrowia ex vivo.
Protokół
Dla tych eksperymentów, wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Karoliny Północnej.
1. Przygotowanie do kultury
UWAGA: Wszystkie odczynniki są wymienione w Tabeli Materiałów. Stężenia specyficznych czynników wzrostu podano w tabeli 1.
- Przygotować 0,5 M roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w destylowanej wodzie dejonizowanej (ddH2O). Odpowiednio wymieszać i dostosować pH do 7,4 za pomocą roztworów NaOH i/lub HCl.
UWAGA: Uzupełnij roztwór podstawowy EDTA na świeżo przed każdym eksperymentem. - Przygotować odczynnik dysocjacyjny #1 (DR #1) w następujący sposób i umieścić na lodzie: Połączyć sól fizjologiczną buforowaną fosforanami bez Ca2+ i Mg2+ (PBS), 0,5 M EDTA, 1M 1,4-Ditiothreitol (DTT), 10 μM Y27632 i 1X Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (Anti-Anti) zawierający penicylinę, streptomycynę i amfoterycynę B.
UWAGA: Dodaj Y27632 bezpośrednio przed pobraniem tkanki. - Przygotować odczynnik dysocjacyjny #2 (DR #2) w następujący sposób i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C: Połączyć PBS bez Ca2+ i Mg2+, 0,5 M EDTA, 10 μM Y27632 i 1X Anti-Anti. UWAGA: Dodaj Y27632 bezpośrednio przed pobraniem tkanki.
- Przygotuj pożywkę z komórek macierzystych nabłonka jelitowego (IESC) w następujący sposób: Wymieszaj 25 ml zaawansowanego podłoża DMEM/F12 z 1X suplementem N2, 1X suplementem B-27, 10mM HEPES, 2mM Glutamax i 1X Anti-Anti. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Przygotować główną mieszankę matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (matrycy) i uzupełniających czynników wzrostu w następujący sposób: Rozmrozić matrycę na lodzie. W probówce do mikrowirówki dodać 100 ng/ml rekombinowanego ludzkiego Noggin, 500 ng/ml rekombinowanej ludzkiej R-Spondyny 1, 50 ng/ml rekombinowanego ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 100 ng/ml rekombinowanego ludzkiego Wnt3a, 10 mM nikotynamidu, 10 nM gastryny, 500 nM A-83-01, 10 μM Y-27632, 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 i inhibitora kinazy syntazy glikogenu 3 2,5 μM (GSK3i, CHIR99021). Po rozmrożeniu matrycy uzupełnij ją mieszanką czynników wzrostu (tworząc mieszankę wzorcową) i przechowuj na lodzie.
UWAGA: Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza, ponieważ spowoduje to powstanie artefaktu w paszteciku matrycy podczas galwanizacji. - Przed rozpoczęciem procedur izolacji komórek należy wstępnie ogrzać 24-dołkowe naczynie do hodowli tkankowej w inkubatorze o temperaturze 37°C.
2. Chirurgiczny model niedokrwienia i pobieranie tkanek
- Używaj ośmio- do dziesięciotygodniowych mieszańców świń Yorkshire dowolnej płci (zalecane). Usuń całą paszę 16-18 godzin przed zabiegiem. Zapewnij świniom dostęp do wody przez cały czas.
- Zaplanuj przybycie świń co najmniej 48 godzin przed eksperymentami, aby umożliwić aklimatyzację w środowisku.
UWAGA: Przeszkoleni technicy weterynaryjni i/lub laboratoryjni nadzorowani przez licencjonowanego lekarza weterynarii zapewniają rutynową opiekę nad zwierzętami i pomoc w zabiegach anestezjologicznych. - Premedykacja świni ksylazyną (1,5 mg/kg domięśniowo (IM)) i ketaminą (11-20 mg/kg (IM))15. Po ustabilizowaniu zaintubuj świnię ustnie i tchawiczo.
- Utrzymuj świnie w znieczuleniu ogólnym izofluranem (2-5%) odparowanym w 100%O2 do czasu eutanazji.
- Umieścić cewnik dożylny (IV) (zalecana żyła uszna) i podać płyn zastępczy, taki jak roztwór dzwonka z mleczanem, w dawce podtrzymującej 15 ml/kg/h.
- Wykonuj rutynowe monitorowanie anestezjologiczne, w tym pulsoksymetrię, elektrokardiografię i pośrednie pomiary ciśnienia krwi15. Monitoruj częstość oddechów i wysiłek świni i wentyluj ręcznie lub mechanicznie w razie potrzeby, jeśli końcowe stężenie CO2 w oddychaniu wzrośnie, powyżej 55-60 mmHg.
UWAGA: Odpowiednie znieczulenie potwierdza ciągłe monitorowanie trendów częstości akcji serca (zakres 80-130 uderzeń/min), nieinwazyjnego ciśnienia krwi (średnie ciśnienie tętnicze 75-100 mmHg) i częstości oddechów (10-25 oddechów/min)16 oraz okresowe sprawdzanie pod kątem braku tonu żuchwy i odbytu. Głębokość znieczulenia można również ocenić na podstawie stopnia rozluźnienia mięśni i fascykulacji mięśni po bodźcu chirurgicznym. Odruchy oczne zwykle nie mają żadnej wartości16. Analgezja może być zapewniona zgodnie z zaleceniami instytucji IACUC. W takim przypadku opioid, taki jak buprenorfina, może być podawany podczas operacji. - Umieść świnię na poduszce grzewczej i utrzymaj się w pozycji grzbietowej do zabiegu chirurgicznego.
- Ogolić brzuszną część brzucha i przygotować się za pomocą peelingu chirurgicznego (roztwór chlorheksydyny) i alkoholu izopropylowego.
- Wykonaj 8-10-centymetrowe brzuszne nacięcie linii środkowej za pomocą ostrza skalpela wyśrodkowanego na pępku, aby uzyskać dostęp do brzucha.
- Zidentyfikuj jelito cienkie (jelito czcze) około 40 cm ustnie do połączenia krętniczo-kątniczego. Wyznacz dziesięciocentymetrowe pętle jelita czczego, podwiązując jelito obwodowo dwukrotnie, jeden cm między każdą ligaturą, przed utworzeniem kolejnych pętli o długości 10 cm zlokalizowanych ustnie (Rysunek 1).
- Utwórz dwie pętle na każdy punkt czasowy niedokrwienia sąsiadujące ze sobą, jedną dla niedokrwienia i jedną dla niedokrwienia z dodatkową 1 godziną reperfuzji, jeśli to konieczne. Aby uzyskać całkowite niedokrwienie (brak przepływu tętnic lub żył), zaciśnij lub podwiąż naczynie krezkowe za pomocą zacisków naczyniowych buldoga, zakrzywionych hemostatów komarów Halstead lub niewchłanialnego jedwabiu 2-0 przez 1, 2, 3 i 4 godziny, a następnie usuń zaciski na 1 godzinę reperfuzji, jeśli to konieczne.
UWAGA: Autorzy stworzyli wszystkie pętle niedokrwienia w kolejności, zaczynając od 4-godzinnej pętli niedokrwiennej i postępowali, poruszając się proksymalnie (aby zminimalizować całkowity czas operacji). Aby wykluczyć możliwość, że sąsiednie niedokrwienne segmenty jelita mogą uszkodzić sąsiednie pętle, kolejność pętli niedokrwiennych może być zmieniona. Może to zmienić całkowity czas operacji.
UWAGA: Ramy czasowe reperfuzji mogą być zmieniane w zależności od interesującego pytania badawczego lub tego, czy terapie chcą być testowane w okresie reperfuzji. Jednakże, ponieważ uszkodzenie tkanek staje się poważniejsze w wyniku wydłużania czasu trwania samego niedokrwienia, uszkodzenie reperfuzyjne prawdopodobnie nie przyczynia się do dalszego uszkodzenia nabłonka. Reperfuzja prawdopodobnie odgrywa rolę po łagodnych okresach uszkodzenia niedokrwiennego. - Pomiędzy punktami czasowymi niedokrwienia utrzymuj brzuch zakryty lub zamknięty za pomocą sterylnego ręcznika i/lub zacisku do ręczników.
UWAGA: W obrębie jednego zwierzęcia w tym eksperymencie można utworzyć osiem segmentów niedokrwiennych. Zidentyfikuj dodatkowy segment jelita czczego, co najmniej 5-10 cm proksymalnie do ostatniej pętli niedokrwiennej, który będzie służył jako wewnętrzna normalna kontrola. - Zatkać około trzech naczyń krezkowych na zacisk naczyniowy buldoga lub zakrzywiony hemostat komara Halsteada. Należy zachować ostrożność podczas aplikacji hemostatu, ponieważ naczynia łatwo ulegają urazom. Spróbuj ułożyć naczynia w szczękach zacisków.
- Na zakończenie eksperymentu, po eutanazji pentobarbitalem w dawce 85-100 mg/kg dożylnie, należy pobrać wszystkie pętle tkanek za pomocą nożyczek Metzenbauma, po stwierdzeniu zgonu bez osłuchiwania serca i utracie odruchu rogówkowego. Zacznij od pobrania kontrolnego fragmentu normalnego jelita czczego co najmniej 5-10 cm proksymalnie do ostatniej pętli niedokrwiennej.
- Oddziel i przechowuj pętle z każdego punktu czasu uszkodzenia w małych pojemnikach lodowatego PBS, aż będą gotowe do izolacji krypty.
UWAGA: W razie potrzeby wykonaj pętle niedokrwienne wystarczająco długie, aby podzielić się na oddzielne próbki do histologii i hodowli jelitowych komórek macierzystych; Autorzy odkryli jednak, że pętle o długości większej niż około 10 cm najprawdopodobniej ulegną krwotokowi.
3. Izolacja krypty (komórki macierzystej) od pętli niedokrwiennej i kontrolnej
- Odwróć każdą pętlę jelita cienkiego za pomocą drutu o średnicy 20 i kleszczyków do tkanek, aby odsłonić powierzchnię błony śluzowej. Przywiąż górną i dolną część pętli do drutu za pomocą szwu (2-0 niewchłanialny jedwab lub odpowiednik).
- Po odwróceniu przepłucz każdą pętlę w lodowatym PBS, aby usunąć zanieczyszczenia świetlne.
- Próbki należy natychmiast umieścić w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających DR #1 na lodzie na 30 minut.
- Zbieraj pętle zaczynając od kontroli, a następnie podążaj za pętlami stopniowo wydłużającego się czasu trwania niedokrwienia. Pętle z mniej uszkodzonej tkanki (tj. tkanki kontrolnej i 1 godziny niedokrwiennej) można mocno potrząsnąć, pstrykając nadgarstek w celu uzyskania najlepszych rezultatów. Tkanki z mocno uszkodzonych tkanek (3 i 4 godziny niedokrwienia) powinny być delikatnie kołysane lub odwracane tylko dlatego, że zbyt duże potrząsanie spowoduje przerwanie krypty i dodatkowe zniszczenie tkanek. Probówki należy wstrząsać lub odwracać co 5 minut na lodzie.
- Przenieś próbki do DR #2 na 10 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Wstrząsaj lub odwracaj probówki co 5 minut.
- Po przeniesieniu tkanek odwirować stożkowe probówki zawierające DR #1 z uszkodzonych 2-4 h pętli w celu usunięcia supernatantu EDTA (200 x g przez 5 min). Ponieważ tkanki te są bardzo uszkodzone, możliwe jest, że krypty zostały już zdysocjowane. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z małą objętością PBS (5 ml) i przejść do kroku 3.9.
- Usuń próbki z DR #2 i umieść próbki tkanek bezpośrednio w 25 ml zimnego PBS na lodzie (oznaczone jako Wash #1). Umieścić próbki na wytrząsarce orbitalnej na lodzie z prędkością 60 obr./min. Kontynuuj potrząsanie lub odwracanie każdej probówki przez 30 sekund co 2 do 5 minut.
- Po przeniesieniu tkanek należy odkręcić stożkowe probówki zawierające DR #2 z uszkodzonych pętli po 2-4 godzinach, aby usunąć supernatant EDTA (200 x g przez 5 min). Ponieważ tkanki te są bardzo uszkodzone, możliwe jest, że krypty uległy dysocjacji. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z małą objętością PBS (5 ml) i przejść do kroku 3.9.
- Usuń 50 μl podwielokrotności z Wash #1 (lub z DR), aby sprawdzić stopień dysocjacji krypty i ilość zanieczyszczeń. Umieść tkankę w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml (Wash #2, #3 itp.) wypełnionej 25 ml zimnego PBS i potrząsaj, aż nienaruszone krypty zostaną odizolowane z minimalnymi zanieczyszczeniami i kosmkami.
UWAGA: Celem jest możliwość odizolowania czystej frakcji z nienaruszonymi kryptami i minimalną ilością gruzu. Każde dodatkowe płukanie oczyści komórki, jednak zbyt duże potrząsanie zacznie powodować wtórne uszkodzenie tkanki/komórek. Co więcej, najlepsze wyniki przy najmniejszym zanieczyszczeniu zostaną osiągnięte, jeśli krypty zostaną posiane na etapie mycia, a nie na etapie odczynnika dysocjacyjnego. - Usunąć pozostałą tkankę i odwirować stożkowe probówki o pojemności 50 ml o pojemności 200 x g przez 5 minut w celu usunięcia supernatantu, a następnie ponownie zawiesić pozostały osad krypty w mniejszej objętości PBS (5 ml).
- Za pomocą odwróconego mikroskopu zbadaj 50 μl podwielokrotności każdej próbki, aby określić liczbę krypt/frakcji. Celem jest 50-100 krypt/50 μL, ponieważ będzie to rozmiar końcowego pasztecika matrycowego.
UWAGA: Jeśli próbka jest zbyt skoncentrowana, kontynuuj dodawanie zimnego PBS, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia. Jeśli próbka jest zbyt rozcieńczona, określ liczbę podwielokrotności potrzebnych do osiągnięcia pożądanej wydajności kryptografii i dostosuj. - Podwielokrotność odpowiedniej objętości krypt (określonych na podstawie obserwacji podwielokrotności) do probówki mikrowirówkowej. Na przykład, jeśli próbka zawiera 50 krypt/50 μL, to podwielokrotność 50 μL na pasztecik X 3 powtórzenia = 150 μL/ probówkę mikrowirówkową. Jeśli próbka zawiera tylko 25 krypt/50 μl, potrzebne są 2 porcje/pasztecik X 3 powtórzenia = 300 μl/probówkę.
- Krypty na pelety w 200 x g przez 5 min w temperaturze 4°C.
- Delikatnie zawiesić granulowane krypty odpowiednią ilością mieszanki wzorcowej (50 μl na studzienkę). Dokładnie wymieszać, pipetując szybko 15 razy, nie tworząc pęcherzyków powietrza.
UWAGA: Przed zasysaniem mieszanki wzorcowej należy wstępnie schłodzić końcówkę pipety zimnym, sterylnym PBS. Pomoże to zapobiec rozprzestrzenianiu się mieszanki głównej. Końcówki można również przechowywać w lodówce i umieszczać w okapie bezpośrednio przed użyciem. - Dozować 50 μl mieszanki głównej plus kroplę krypty do środka każdej studzienki wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki.
- Inkubować płytkę hodowlaną przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Na każdy kotlet z matrycą należy zalać 500 μl/studzienkę pożywki IESC (w dniu 0 nie są potrzebne dodatkowe czynniki wzrostu, ponieważ są one zawarte w mieszance wzorcowej).
- Dodaj 500 μl sterylnego PBS do wszystkich niewykorzystanych studzienek pozostawionych na płytce, aby utrzymać wilgotność.
- Policz liczbę platerowanych krypt w dniu 0.
UWAGA: Pomocne jest wstępne ułożenie każdej płytki do hodowli komórkowej w ćwiartki, aby zapewnić dokładniejsze liczenie. - Policz liczbę enterosfer co 24 godziny i codziennie monitoruj rozwój enteroidów.
- Dodawać czynniki wzrostu do każdej studzienki co 48 godzin. Usuwać pożywkę IESC co 96 godzin i zastąpić 500 μl świeżej pożywki (następnie należy dodać czynniki wzrostu do pożywki).
Wyniki
Całkowite niedokrwienie jelit wywołano w pętlach jelita cienkiego poprzez zastosowanie okluzji naczyniowej za pomocą szwów lub klamer, zgodnie z Rysunkiem 1. Poprzez zwolnienie klamer można przeprowadzić kontrolowany okres reperfuzji, co w razie potrzeby pozwala na dodatkowe badanie następującego po niej uszkodzenia reperfuzyjnego. Wszystkie zwierzęta przeżyły zabieg przy minimalnych powikłaniach aż do momentu eutanazji. Najczęstszym powikłaniem chirurgicznym była hipotensja, która ustąpiła po podaniu leku inotropowego dodatniego, takiego jak dobutamina.
Przy prawidłowym wykonaniu uszkodzenie niedokrwienne rozpocznie się w wierzchołku kosmków jelitowych i będzie przemieszczać się w dół w kierunku krypt wraz z wydłużaniem czasu trwania niedokrwienia (Rycina 2). Powszechnym błędem w technice chirurgicznej może być nierównomierne podwiązanie lub zaklemowanie naczyń krwionośnych. Skutkuje to niedokrwieniem krwotocznym (Rycina 3), w którym cienkościenna żyła zapada się przed tętnicą, co umożliwia dalsze naciekanie tkanek przez krew. Makroskopowo objawia się to ciemnofioletową powierzchnią błony surowiczej (Rycina 3, lewo) w porównaniu do bledszej powierzchni podczas całkowitego niedokrwienia (Rycina 3, prawo).
Po usunięciu niedokrwiennych pętli jelita pomyślnie wyizolowano krypt jelitowe zgodnie z protokołem dysocjacji (Rycina 4). Zgodnie z oczekiwaniami, krypty z punktów czasowych o większym stopniu uszkodzenia były często połamane (f; fragment), a frakcje krypt zawierały więcej komórkowych resztek tła w porównaniu do tych, które nie uległy uszkodzeniu lub były uszkodzone w stopniu niewielkim. Podczas realizacji protokołu, silnie uszkodzone jelito należy wstrząsać delikatnie, aby uniknąć dodatkowych obrażeń tkanki podścielnej. Zbyt gwałtowne wstrząsanie może doprowadzić do dalszego uszkodzenia krypt i spowodować, że większość z nich trafi do roztworów DR zawierających EDTA, co skutkuje dodatkową degradacją.
Po wysianiu krypty z wszystkich punktów czasowych niedokrwienia przeżywają i są w stanie ustabilizować się w hodowli (Rycina 5). W przypadku wysiania w hodowli krypt jelitowych prawidłowych oraz lekko uszkodzonych, enterosfery tworzą się w ciągu 24-48 h. Przy ciężkim uszkodzeniu niedokrwiennym (3 i 4 h) krypty jelitowe przeżywają, lecz są uszkodzone, co początkowo skutkuje powstaniem znacznie mniejszych sfer. W czasie 72-120 h enteroidy stają się bardziej złożone, z widocznymi centralnymi światami i strukturami pączkującymi. Ogólnie obserwuje się obniżoną wydajność wzrostu krypt, a także mniejszy rozmiar enteroidów pochodzących z ciężko uszkodzonej tkanki jelita (Gonzalez, L.M., Unpublished Data, 2017).
Rycina 1Model chirurgiczny całkowitego niedokrwienia jelit w modelu świńskim. A) Zewnątrznie wyprowadzony normalny odcinek jelita czczego świni. B) Naczynia krezkowe zostały podwiązane szwem, co wywołało niedokrwienie jelita. C) Niedokrwienie wywołane za pomocą kleszczyków naczyniowych typu bulldog, aby umożliwić reperfuzję tkanki w razie potrzeby. D) Unaczynienie jelita bezpośrednio po zdjęciu kleszczyków naczyniowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2Dowody histologiczne (hematoksylina i eozyna (H&E) barwienie) wykazujące narastające uszkodzenie nabłonka po dłuższym czasie całkowitego niedokrwienia jelit. Uszkodzenia rozpoczynają się w obrębie wierzchołka kosmka, przechodząc w stopniową utratę jednowarstwowego nabłonka, stępienie kosmków oraz uszkodzenia komórkowe rozprzestrzeniające się w dół aż do podstawy krypt w przypadku ciężkich obrażeń (czas trwania do 4 h). 100 µm skala. I = niedokrwienie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina 3Makroskopowe i histologiczne dowody niedokrwienia krwotocznego. A) Fotografia makroskopowa porównująca niedokrwienie krwotoczne (pętla lewa) i całkowite niedokrwienie (pętla prawa). Gdy naczynia nie zostaną równomiernie podwiązane lub zaklemowane, krew może nadal naciekać do tkanek, co prowadzi do dodatkowego stanu zapalnego i uszkodzeń. B) H&Obrazy E przedstawiają niedokrwienie krwotoczne o czasie trwania zwiększającym się od 1 do 4 h. Oprócz uszkodzeń komórkowych widocznych przy całkowitym niedokrwieniu, stwierdzono obecność nacieku erytrocytów w otaczającej błonie własnej. 100 µm pasek skali. I = niedokrwienie. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4Aliquoty krypt jelitowych wyizolowanych z pętli niedokrwionego i prawidłowego jelita. Z każdego odcinka jelita pomyślnie wyizolowano kompletne, nienaruszone krypty jelitowe (gwiazdki). Zgodnie z oczekiwaniami, krypty z punktów czasowych o większym stopniu uszkodzenia były często połamane (f; fragment), a frakcje krypt zawierały więcej komórkowych zanieczyszczeń w porównaniu z próbkami, które nie uległy uszkodzeniu lub uległy mu w stopniu niewielkim. 100 µm skala. I = niedokrwienie. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5Przebieg czasowy wzrostu komórek macierzystych jelita po izolacji z niedokrwiennych pętli jelita cienkiego. Po wysianiu prawidłowych krypt jelitowych w hodowli, w ciągu 24–48 h uformowały się enterosfery. W przypadku ciężkiego uszkodzenia niedokrwiennego (3 i 4 h) krypty przeżywają, lecz początkowo tworzą znacznie mniejsze sfery. W czasie od 72 do 120 h enteroidy stają się bardziej złożone, z wyraźnymi światłami centralnymi oraz strukturami pączkującymi. 20 µm pasek skali, chyba że zaznaczono inaczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Czynnik wzrostu | Rozcieńczalnik | Stężenie roztworu macierzystego | Rozcieńczanie roztworu zapasowego | Rozcieńczenie robocze |
| R-Spondina | PBS | 10X | 100 µg/ml | 1 µg/ml |
| Noggin | SW/0,1% BSA | 10X | 100 µg/ml | 10 ng/ml |
| EGF | 10 mM kwas octowy | 10 0X | 500 µg/ml | 50 ng/ml |
| A-83-01 | DMSO | 10X | 500 µM | 50 nM |
| SB202190 | DMSO | 30X | 30 mM | 10 µM |
| Nikotynamid | SW | 10X | 1 M | 1 mM |
| Gastryna | PBS | 10 00X | 100 µM | 10 nM |
| Y-27632 | PBS | 10X | 10 mM | 10 µM |
| LY215729 | DMSO | 10 00X | 5 mM | 0.5 µM |
| CHIR9021 | PBS | 10X | 2,5 mM | 2.5 µM |
| Wnt3a | PBS | 20X | 200 µg/ml | 10 ng/ml |
Tabela 1: Tabela odczynników czynników wzrostu. Podsumowanie roztworów zapasowych i roztworów roboczych czynników wzrostu wykorzystanych w niniejszym protokole.
Dyskusja
Opracowanie świńskiego modelu segmentowego niedokrwienia jelit rozszerza poprzednie modele mysie, umożliwiając badanie wielu punktów czasowych uszkodzenia tkanek u tego samego zwierzęcia. Istnieje kilka krytycznych punktów dyskusji na temat tego protokołu, w tym prawidłowe podwiązanie naczyń, reperfuzja tkanek i udana hodowla komórek kryptowych.
Prawidłowe podwiązanie naczyń jest niezbędne do stworzenia modelu całkowitego niedokrwienia. Jeśli szew jest zawiązany nierówno lub zacisk nie jest całkowicie zaciśnięty, krew z grubościennej tętnicy może nadal wdzierać się do tkanki i nie może wydostać się z powodu zapadnięcia się cienkościennej żyły. Powoduje to wynaczynienie krwi do blaszki właściwej, powodując dodatkowe uszkodzenie tkanek. Jednak w zależności od rodzaju badanego urazu niedokrwiennego może być pożądane całkowite lub krwotoczne niedokrwienie. Na przykład w procesie przeszczepu jelita jelito jest całkowicie oddzielone od zaopatrzenia naczyniowego (tętnicy i żyły) podczas fazy resekcji zabiegu, co skutkuje całkowitym niedokrwieniem jelit. Alternatywnie jednak, gdy krezka jest skręcona podczas zdarzenia, takiego jak skręt jelit, powrót żylny jest często najpierw zablokowany, co prowadzi do dodatkowej krwi w tkance przed zablokowaniem dopływu tętnicy, powodując w ten sposób niedokrwienie krwotoczne.
Uraz niedokrwienny powoduje uszkodzenie tkanki, zaczynając od końca kosmków i rozciągając się w dół do podstawy krypty3. Podczas niedokrwienia energia w postaci adenozynotrójfosforanu jest nadal wykorzystywana i generuje metabolit hipoksantynę. Kiedy tkanka jest reperfuzjowana tlenem, hipoksantyna jest metabolizowana przez oksydazę ksantynową i wytwarza wolne rodniki ponadtlenkowe, co prowadzi do uszkodzenia błony śluzowej i przyciągania tkanki uszkadzając neutrofile17,18. Różnice gatunkowe w architekturze naczyniowej błony śluzowej, a także różna ekspresja oksydazy ksantynowej skutkują różnym stopniem uszkodzenia reperfuzyjnego3. Modele niedokrwienia-reperfuzji u kotów i gryzoni są bardziej podatne na uszkodzenia reperfuzyjne spowodowane reaktywnymi metabolitami tlenu19,20. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że świnie mają mniej oksydazy ksantynowej, a tym samym mniej uszkodzeń reperfuzyjnych, co czyni ten model bardziej porównywalnym z niedokrwieniem jelit u ludzi21. W chwili obecnej nie opisano zastosowania nokautujących lub transgenicznych modeli świń do badania uszkodzeń jelit, co czyni to głównym ograniczeniem tego modelu. Wybór odpowiedniego modelu zwierzęcego zależy od procesu chorobowego lub konkretnego stanu, który badacz chce badać. Na przykład opisano modele urazu niedokrwiennego u świń trwające do 6 godzin22, podczas gdy większość zabiegów niedokrwiennych w modelach mysich trwa 45-60 minut23.
Udana izolacja krypt jelitowych z jelita normalnego i uszkodzonego chemicznie pozwala na badanie regeneracji nabłonka w hodowli. System ten pozwala badaczowi skupić się wyłącznie na nabłonku, ponieważ nie ma potrzeby uwzględniania zaopatrzenia w naczynia krwionośne ani składnika komórek odpornościowych. Daje to możliwość zbadania interakcji komórek nabłonkowych i regeneracji po urazie, a także odpowiedzi na różne czynniki wzrostu lub leczenia podawanego podczas operacji lub po izolacji krypty poprzez uzupełnienie pożywek hodowlanych. Ten etap pozostaje najtrudniejszy, ponieważ izolacja od poważnie uszkodzonych pętli wymaga delikatnego potrząsania i szybkiego usunięcia roztworów zawierających EDTA w przypadku, gdy krypty uległy przedwczesnej dysocjacji. Jeśli te pętle jelita nie zostaną dokładnie umyte, krypty mogą zostać skażone w kulturze. W rezultacie, oprócz pożywek IESC, do obu roztworów DR dodano roztwór antybiotykowo-grzybiczy. Kolejny punkt dyskusji skupia się na jelicie pobranym jako normalna kontrola. Ponieważ zwierzęta poddawane są znieczuleniu z możliwymi zmianami w ogólnoustrojowej perfuzji tkanek, wraz z możliwością krążących mediatorów stanu zapalnego wtórnych do niedokrwienia, nawet "normalna" tkanka kontrolna może nie reprezentować prawdziwej kontroli. W tych eksperymentach warto zauważyć, że tkanka kontrolna wydawała się rażąco i histologicznie porównywalna z tkanką pochodzącą od zwierząt, które nie przeszły niedokrwienia w innych eksperymentach (Gonzalez, L.M., Dane niepublikowane, 2017).
Podsumowując, metoda ta opisuje powtarzalny model niedokrwienia jelit świń, który ściśle odwzorowuje to, co dzieje się w urazie niedokrwiennym u ludzi. Dodatkowo opisano izolację jelitowych komórek macierzystych z pętli niedokrwiennych, co służy do badania naprawy nabłonka i możliwej odpowiedzi na leczenie w hodowli.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt był wspierany przez NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 oraz Dept. of Clinical Sciences Dissemination Funds
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez Ca2+, Mg 2+ | Fisher Scientific | BP-399 | Rozcieńczony 1:10 |
| Destylowana, dejonizowana woda (ddH2O) | Służy do przygotowania EDTA i PBS | ||
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
| Kwas etylenodiamennotetraoctowy (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Przygotuj świeże przed każdym eksperymentem; pH 7,4 |
| 1,4-Ditiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zaawansowane technologie życia DMEM/F12 | 12634-010 | ||
| Suplement N2 Technologie | życia | 17502-048 | |
| B-27 Suplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| HEPES | Technologie życia | 15630-106 | |
| Technologie | życia Glutamax35050-061 | ||
| Penicylina/Streptomycyna/Amfoterycyna B | Gibco | 15240-096 | Roztwór anty-anty-anty |
| Rekombinowany ludzki Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
| Rekombinowana ludzka Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
| Rekombinowany ludzki Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
| Rekombinowany ludzki EGF | R & D Systems | 236-EG | |
| LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| Human [leu]15-gastryna 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
| SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Nikotynamid | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Kwas octowy | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Woda, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Określany jako sterylna woda (SW); dla zapasów czynników wzrostu |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Bez czerwieni fenolowej |
| 24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
| Rurka stożkowa, 50 ml | Corning, Inc. | ||
| 430828 Rękojeść skalpela Światowe | instrumenty precyzyjne | 500236 | |
| Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej, nr 10 | Światowe instrumenty precyzyjne | 504169 | |
| Kleszczyki do tkanek | Świat Instrumenty precyzyjne | 15918 | |
| Kleszczyki do tkanek Debakey | Świat Instrumenty precyzyjne | 501239 | |
| Świat nożyczek Mayo | Instrumenty precyzyjne | 501752 | Zakrzywione lub proste |
| Nożyczki Metzenbaum | World Precision Instruments | 501739 | |
| Kleszcze do komarów, zakrzywione | instrumenty precyzyjne World | 503724-12 | Zakrzywione lub proste (503728-12) |
| Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | |
| Prosty jedwab, 2-0 | Henry Schein | 685S-ALE | Każda podobna marka jest dopuszczalna |
| Zaciski do ręczników | World Precision Instruments | 501700 | |
| Uchwyt na igłę | World Precision Instruments | V503382 | |
| Szew druciany, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Wytnij i wyprostuj przed użyciem. |
| Ręczniki chirurgiczne | Henry Schein | ST1833 | Każdy podobny produkt jest dopuszczalny |
| Roztwór Ringera z mleczanami | Henry Schein | 9851 | |
| Peeling antyseptyczny Chlorhex (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Każda podobna marka jest dopuszczalna |
| Alkohol izopropylowy 70% | Henry Schein | MS071HS | Każda podobna marka jest dopuszczalna |
| Cewnik dożylny, rozmiar 22 Henry | Schein | 2225PUR | Może potrzebować 20 g lub 24 g w zależności od wielkości żyły |
| Ksylazyna (100 mg / ml) | Henry Schein | 33198 | |
| Ketamina (100 mg / ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Kontrolowane leki |
| Roztwór izofluranu | Henry Schein | 10015516 | |
| Pentobarbital (Śmiertelny plus roztwór do eutanazji (390 mg / ml)) | Vortech Pharm. | Dostępnych jest wiele marek pentobarbitalu sodu. | |
| Poduszka grzewcza | System ocieplania rdzenia Gaymar | ||
| Monitor Mindray Datascope | Mindray Ameryka | Dopuszczalne dowolne równoważne urządzenie monitorujące | |
| Waporyzator | Vetland Medical | Zaleca się stosowanie systemu Circle z elementem Y; dostępnych jest wielu dostawców. | |
| Pompa płynu | Abbott Hospira | Plum A+; Zalecany jest każdy podobny producent. |
Bibliografia
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
- Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
- Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31(2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).
- Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).
- Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
- Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
- Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
- Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
- Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).
Przedruki i uprawnienia
