Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroglej to fagocyty mózgu, które uczestniczą w homeostazie mózgu i nieustannie badają swoje otoczenie pod kątem dysfunkcji, urazów i chorób. Jako pierwsi reagujący, mikroglej pełni ważne funkcje łagodzące dysfunkcję neuronów i gleju, a w tym procesie przechodzą szeroki zakres zmian morfologicznych. Morfologie mikrogleju można kategoryzować opisowo lub, alternatywnie, można je określić ilościowo jako zmienną ciągłą dla takich parametrów, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt. Podczas gdy metody ilościowego określania mikrogleju są stosowane do pojedynczych komórek, niewiele technik ma zastosowanie do wielu mikrogleju w całej mikrofotografii. Celem tej metody jest ilościowe określenie wielu i pojedynczych komórek przy użyciu łatwo dostępnych protokołów ImageJ. Protokół ten jest podsumowaniem kroków i wtyczek ImageJ zalecanych do konwersji mikrofotografii fluorescencyjnych i jasnego pola na reprezentatywne obrazy binarne i szkieletowe oraz do ich analizy za pomocą wtyczek programowych AnalyzeSkeleton (2D/3D) i FracLac do zbierania danych morfologicznych. Dane wyjściowe tych wtyczek podsumowują morfologię komórek pod względem punktów końcowych procesu, połączeń i długości, a także deskryptorów złożoności, kształtu i rozmiaru komórki. Opisany w niniejszym dokumencie protokół analizy szkieletu doskonale nadaje się do regionalnej analizy wielu mikrogleju w obrębie całego mikrozdjęcia lub regionu zainteresowania (ROI), podczas gdy FracLac zapewnia uzupełniającą analizę pojedynczych komórek. W połączeniu protokół zapewnia obiektywne, czułe i kompleksowe narzędzie oceny, które można wykorzystać do stratyfikacji między różnymi morfologiami mikrogleju obecnymi w zdrowym i uszkodzonym mózgu.
Wprowadzenie
Mikroglej ma natychmiastową i zróżnicowaną morfologiczną reakcję na zmiany w fizjologii mózgu1 wzdłuż kontinuum możliwości, które wahają się od hiperrozgałęzienia i wysoce złożonych morfologii do morfologii rozgałęzionych i ameboidalnych2. Mikroglej może również stać się spolaryzowany i mieć kształt pręcika3. Rozgałęzienie komórek mikrogleju jest powszechnie definiowane jako złożony kształt składający się z wielu procesów i często jest podawane jako liczba punktów końcowych na komórkę i długość procesów komórkowych. Ponieważ mikroglej jest precyzyjnie dostrojony do funkcji neuronalnych i glejowych poprzez ciągły wzajemny oddziaływanie komórek i ruchliwość in vivo4,5, morfologie mikrogleju mogą służyć jako wskaźniki różnych funkcji i dysfunkcji komórek w mózgu. Podejście ilościowe jest konieczne, aby odpowiednio opisać różnorodność tych zmian morfologicznych i rozróżnić różnice między rozgałęzionymi komórkami, które występują z subtelnymi zaburzeniami fizjologicznymi (takimi jak padaczka5,6 i wstrząs mózgu7) oprócz poważnych obrażeń (takich jak udar8). Zwiększone wykorzystanie kwantyfikacji morfologii7,8,9,10,<sup class="xref">11,12,13,14 ujawni pełną różnorodność morfologii mikrogleju podczas zdrowia i choroby. Niniejsze badanie szczegółowo opisuje stopniowe zastosowanie wtyczek ImageJ niezbędnych do podsumowania morfologii mikrogleju na podstawie fluorescencyjnych lub niefluorescencyjnych fotomikrofotografii mikrogleju uzyskanych w utrwalonej tkance gryzonia po immunohistochemii (IHC).
Kluczowe dla opisanych tutaj technik analizy są wtyczki ImageJ AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, opracowane w 2010 roku do ilościowego określania dużych struktur sutkowych, oraz FracLac16, opracowane w 2014 roku do integracji ImageJ i analizy fraktalnej w celu ilościowego określenia indywidualnych kształtów mikrogleju. Wtyczki te zapewniają szybką analizę rozgałęzień mikrogleju w całych mikrofotografiach lub wielu mikrogleju o zdefiniowanym ROI w mikrofotografii fotograficznej. Analiza ta może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z analizą fraktalną. Analiza fraktalna pojedynczej komórki (FracLac) wymaga inwestycji czasu, ale dostarcza wielu danych wyjściowych morfologii dotyczących złożoności, kształtu i rozmiaru mikrogleju. Użycie obu narzędzi nie jest nadmiarowe, ponieważ rozgałęzienie komórek jest komplementarne do złożoności komórek, a kombinacja wielu parametrów może być wykorzystana do rozróżnienia różnych morfologii mikrogleju w zestawach danych12,17.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez University of Arizona Institutional Animal Care and Use Committee oraz wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Zadbano o to, aby zminimalizować ból i dyskomfort zwierząt. Metody eutanazji są zgodne z zatwierdzonym protokołem i polegają na dekapitacji szyjki macicy w znieczuleniu izofluranem.
1. Przygotowanie tkanek
UWAGA: Przeprowadź analizę morfologii mikrogleju na stałych, kriochronionych próbkach tkanek, aby zachować morfologię komórek. Poniżej znajduje się standardowy protokół przygotowania i bezpośredniego krojenia utrwalonej tkanki do fluorescencji IHC.
- Usuń mózgi myszy lub szczurów ze zwierzęcia poddanego eutanazji po pożądanym eksperymencie i zgodnie ze standardowym protokołem laboratoryjnym. Umieścić mózg w 10 ml fiolce zawierającej 5 ml 4% roztworu paraformaldehydu na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie spłukać i umieścić w 5-10 ml 30% roztworu buforowego z fosforanem sacharozy (PBS, 0,01 M) na 72 godziny w temperaturze 4 °C. Przechowywać całe mózgi w temperaturze -80 °C do czasu podziału tkanek za pomocą kriostatu lub w temperaturze 4 °C w przypadku cięcia mikrotomem.
UWAGA: Ten protokół nie został jeszcze przetestowany przy użyciu tkanki wyciętej z tkanki zatopionej w parafinie. - Tkankę mózgową należy przeciąć do żądanej grubości i orientacji przekroju za pomocą kriostatu lub mikrotomu i przechowywać swobodnie pływające skrawki w roztworze krioprotekcji (50 mM PBS, glikol etylenowy, glicerol) w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Protokół ten został z powodzeniem przeprowadzony na skrawkach tkanki koronalnej o grubości od 50 μm do 200 μm. Skrawki tkanek mniejsze niż 50 μm mogą nie uchwycić pełnego zakresu procesów mikrogleju, podczas gdy w grubych skrawkach tkanek barwienie IHC może być niedoskonałe ze względu na przenikanie przeciwciał do tkanki. Tkanka może być cięta w orientacji czołowej lub strzałkowej, a wybór ten będzie zależał od celu eksperymentalnego i obszaru (regionów) mózgu, który ma być badany.
2. Immunohistochemia
UWAGA: Metody analizy szkieletowej i fraktalnej mogą być stosowane zarówno do fluorescencji, jak i 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) IHC. Poniżej znajduje się standardowy protokół fluorescencji IHC, który w razie potrzeby może zostać zastąpiony. Fluorescencyjny IHC zapewnia lepszą wizualizację procesów komórkowych w porównaniu z DAB IHC.
- Umieścić skrawki tkanek w szklanej fiolce o pojemności 4 ml (do 15 fragmentów mózgu myszy na fiolkę) i inkubować z 1 ml roztworu zawierającego do 10% surowicy końskiej, PBS (0,01 M), 0,5% Tritonu, 0,04% NaN3 w temperaturze pokojowej (23 °C) przez 1 godzinę.
- Myć przez 5 minut z PBS (0,01 M) trzy razy w temperaturze pokojowej.
- Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (Iba1, 1:1000) w temperaturze pokojowej przez 72 godziny w 1 ml roztworu zawierającego PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3 i przykryć (w celu zachowania skuteczności NaN3).
- Myć przez 5 minut z PBS (0,01 M) trzy razy w temperaturze pokojowej.
- Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (anty-królik 488, 1:250) pokrytym w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w 1 ml roztworu zawierającego PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN3
- Myć przez 5 minut z PBS (0,01 M) trzy razy w temperaturze pokojowej.
- Zamontuj skrawki tkanki mózgowej (liczba i orientacja w zależności od preferencji) do szkiełek podstawowych, nałóż miękko osadzone medium montażowe na szkiełko i umieść szkiełko nakrywkowe na tkance. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Do obrazowania konfokalnego wymagana jest grubość szkiełka nakrywkowego 1,5 cala. Miękkie podłoże mocujące jest preferowanym środkiem mocującym, ponieważ wysoka lepkość nie kompresuje tkanki i najlepiej zachowuje morfologię w porównaniu z twardymi nośnikami mocującymi.
3. Obrazowanie
- Obraz komórek Iba1 dodatnich w sekcji tkanki mózgowej za pomocą mikroskopu jasnego pola lub mikroskopu konfokalnego, który ma zdolność akwizycji z-stack przy użyciu obiektywu 20X lub większego.
UWAGA: Parametry obrazowania i konfiguracja oprogramowania powinny być stałe dla wszystkich akwizycji mikrofotografii w eksperymencie. Doskonałe odwzorowanie szczegółów procesu uzyskuje się przy użyciu obiektywu 40X lub 63X. Możliwe jest zastosowanie opisanego w niniejszym dokumencie protokołu analizy szkieletu do całego mikrozdjęcia lub wielokomórkowego zwrotu z inwestycji w ramach większej mikrofotografii.- Obrazy 8-bitowe można uzyskiwać przy użyciu odpowiednich ustawień oprogramowania specyficznych dla oprogramowania mikroskopu.
UWAGA: Konwersja plików do formatu 8-bitowego po akwizycji może zniekształcić zbieranie danych. - Uzyskać stos z co najmniej 30 μm z odstępem nie większym niż 2 μm między obrazami, korzystając z odpowiednich ustawień oprogramowania specyficznych dla oprogramowania mikroskopu.
UWAGA: Mikroskop i oprogramowanie powinny umożliwiać akwizycję obrazu w osi X, Y i Z. Stos z może zostać zwiększony, a interwał może zostać zmniejszony, aby zapewnić dodatkowe szczegóły mikrogleju. W zamian za to wydłuży się czas obrazowania. Tam, gdzie to możliwe, należy użyć próbki Nyquista do mikroskopii fluorescencyjnej.
- Obrazy 8-bitowe można uzyskiwać przy użyciu odpowiednich ustawień oprogramowania specyficznych dla oprogramowania mikroskopu.
- Zapisz wszystkie pliki jako pliki Tif lub zgodnie z wymaganiami oprogramowania mikroskopu.
- Otwórz pliki Tif w ImageJ i użyj paska narzędzi, aby podzielić kanały, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały i ułóż obrazy w stos, klikając Obraz | Stosy | X Projekt | Projekcja maksymalnej intensywności, w stosownych przypadkach. Zapisz jako pliki .tif.
4. Analiza szkieletu
- Pobierz FIJI lub ImageJ z . Dla poszczególnych wtyczek pobierz AnalyzeSkeleton(2D/3D) z 15 i pobierz FracLac z 16.
UWAGA: Cały proces konwersji mikrofotografii do binarnego obrazu szkieletowego zajmuje mniej niż 1 minutę. - Jeśli używasz mikrofotografii fluorescencyjnej, upewnij się, że obraz jest 8-bitowy i przekonwertuj go na skalę szarości, aby jak najlepiej zobrazować wszystkie pozytywne zabarwienia. Za pomocą paska narzędzi kliknij opcję Obraz | Tabele przeglądowe | Szarości. Jeśli korzystasz ze zdjęcia DAB w jasnym polu, najpierw użyj wtyczki filtra pasmowoprzepustowego FFT (za pomocą paska narzędzi, klikając Process | Spółka FFT | filtr pasmowoprzepustowy), a następnie przekonwertuj na skalę szarości.
UWAGA: Na potrzeby tego protokołu wystarczające są domyślne ustawienia ImageJ dla filtra pasmowoprzepustowego FFT (filtr do 3 pikseli, do 40, bez tłumienia pasków). Zastosowanie filtra pasmowoprzepustowego FFT usuwa szumy (drobne elementy), zachowując jednocześnie ogólnie większe aspekty obrazu. Jest to szczególnie przydatne w przypadku obrazów w jasnym polu, gdzie pęknięcia i pęknięcia w tkance mogą pojawiać się jako tło, a tym samym komplikować analizę szkieletu18. - Dostosuj jasność i kontrast, jeśli obraz jest zbyt ciemny i nie można zobaczyć procesu mikrogleju. Za pomocą paska narzędzi kliknij opcję Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast. W razie potrzeby dostosuj suwaki minimum lub maksimum, aż do krawędzi histogramu, ale nie dalej.
UWAGA: W obrazie ImageJ jasność i kontrast są zmieniane przez aktualizację tabeli przeglądowej obrazu (LUT), dzięki czemu wartości pikseli pozostają niezmienione. Suwaki Max i Min, kontrolują dolne i górne granice zakresu wyświetlania, przy czym wartości pikseli powyżej 255 są białe, a wartości pikseli poniżej 0 są wyświetlane jako czarne18. W przypadku mikrofotografii fluorescencyjnych należy użyć suwaka maksymalnego, natomiast suwaka minimalnego należy użyć mikrofotografii mikrogleju barwionego DAB. - Uruchom filtr Maska wyostrzająca, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast za pomocą paska narzędzi, klikając kolejno opcje Proces | Filtry | Maska wyostrzająca. Na potrzeby tego protokołu używane są domyślne ustawienia ImageJ (promień piksela 3 i waga maski 0,6).
UWAGA: Maska wyostrzająca wyostrza i uwydatnia krawędzie obrazu, odejmując rozmytą wersję obrazu (maskę wyostrzającą) od oryginału, a następnie scalając wynikowy obraz z wersją oryginalnego obrazu o wysokim kontraście. W związku z tym filtr Maska wyostrzająca nie tworzy szczegółów, ale raczej rozjaśnia istniejące szczegóły obrazu. Ustawienie promienia zmienia stopień rozmycia maski wyostrzającej (a tym samym stopień rozmycia, które zostanie usunięte), a ustawienie grubości maski zmienia stopień kontrastu, z którym maska wyostrzająca zostanie scalona (a tym samym dostosowuje kontrast końcowego obrazu). - Wykonaj krok usuwania plamek, aby usunąć odgłos soli i pieprzu generowany przez maskę wyostrzającą. Użyj paska narzędzi i kliknij przycisk Proces | Hałas | Despeckle.
UWAGA: Usuwanie plamek usuwa szum soli i pieprzu, zastępując każdy piksel medianą wartości w jego sąsiedztwie 3 × 3. Efekt jest taki, że wartości odstające pod względem intensywności są zastępowane przez medianę pikseli bez wpływu na ostrość krawędzi18. - Przekonwertuj obraz na binarny za pomocą paska narzędzi, klikając Obraz | Dostosuj | Próg.
UWAGA: Progowanie warstwuje obrazy w skali szarości na interesujące cechy i tło i konwertuje obraz na binary18. - Zastosuj funkcje usuwania plamek, zamykania i usuwania wartości odstających: W wynikowym obrazie binarnym może występować jednopikselowy szum tła i przerwy między procesami.
- Zastosuj funkcję usuwania plamek za pomocą paska narzędzi, klikając kolejno opcje Proces | Hałas | Despeckle.
UWAGA: Zastosowanie usuwania plamek do obrazu binarnego usuwa pozostały szum jednopikselowy. - Zastosuj funkcję zamykania za pomocą paska narzędzi, klikając przycisk Proces | Binarny | Zamknij.
UWAGA: Ta wtyczka łączy dwa ciemne piksele, jeśli są one oddzielone od siebie maksymalnie 2 pikselami. - Zastosuj funkcję usuwania wartości odstających za pomocą paska narzędzi, klikając kolejno opcje Proces | Hałas | Usuń Outliers.
UWAGA: Na potrzeby tego protokołu jasne wartości odstające są kierowane na promień piksela 2 i próg 50. Ta wtyczka zastępuje jasny lub ciemny piksel odstający medianą pikseli w otaczającym obszarze, jeśli odchyla się o więcej niż określoną wartość (próg)18.
- Zastosuj funkcję usuwania plamek za pomocą paska narzędzi, klikając kolejno opcje Proces | Hałas | Despeckle.
- Zapisz obraz jako osobny plik do wykorzystania w przyszłości i/lub analizy fraktalnej, a następnie zszkieletuj obraz za pomocą paska narzędzi, klikając przycisk Process | Binarny | Szkieletowanie.
- Wybierz szkieletowany obraz i uruchom wtyczkę AnalyzeSkeleton(2D/3D) za pomocą paska narzędzi, klikając Wtyczki | Szkielet | Analizuj szkielet i zaznacz pole Informacje o gałęzi.
UWAGA: Jest prawdopodobne, że przetwarzanie obrazu będzie wymagało optymalizacji z dodaniem lub usunięciem powyższych sugerowanych kroków. W tym procesie szkieletowane obrazy są oceniane pod kątem dokładności poprzez utworzenie nakładki szkieletu i oryginalnego obrazu. Somy powinny być pojedynczymi punktami początkowymi z procesami emanującymi z centrum; Okrągłe somy zakłócają dane i należy ich unikać poprzez dostosowanie protokołu. Przykład pojedynczego punktu początkowego w porównaniu z okrągłymi somami jest zilustrowany na Rysunek 1.
Najczęstsze problemy skutkujące niereprezentatywnymi szkieletami i sugerowane rozwiązania:
- Obraz zbyt ciemny: konwertuj na skalę szarości, dostosuj suwaki jasności/kontrastu i/lub zastosuj maskę wyostrzającą
- Za dużo tła: dostosuj suwaki jasności/kontrastu, zastosuj usuwanie plamek i/lub usuń wartości odstające
- Okrągłe somy na obrazie szkieletowym (szczególnie w przypadku obrazów fluorescencyjnych): zastosuj filtr pasmowoprzepustowy FFT i/lub maskę wyostrzającą
- Pęknięcia w tkance (szczególnie w przypadku obrazów w jasnym polu): zastosuj filtr pasmowo-przepustowy FFT i/lub usuń plamki
- Skopiuj wszystkie dane z danych wyjściowych wyników i informacji o gałęzi i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego programu Excel.
- W programie Excel przytnij dane, aby usunąć fragmenty szkieletu, które powstają w wyniku IHC i akwizycji obrazu.
- Zduplikuj skoroszyt eksperymentu z nieprzetworzonymi danymi wyjściowymi z analizy szkieletu i dodaj TRIM do nazwy pliku. Wszystkie kolejne przycinanie danych powinno odbywać się w zduplikowanym skoroszycie, aby zachować nieprzetworzone dane do wykorzystania w przyszłości i odwołania.
- Określ, jaka długość fragmentów zostanie przycięta z zestawu danych, otwierając szkieletowany obraz w ImageJ i wybierając narzędzie Linia. Zmierz kilka fragmentów, zwracając uwagę na średnią długość, i zdecyduj o wartości odcięcia.
UWAGA: Na potrzeby prezentowanych tu danych długość graniczna dla niepożądanych fragmentów wynosi 0,5. Ta wartość powinna być spójna w całym zestawie danych. - Niestandardowe sortowanie arkusza kalkulacyjnego Excel, klikając Sortuj i filtruj | Sortowanie niestandardowe. Sortuj według "wokseli końcowych" od największego do najmniejszego i, na nowym poziomie, według "gałęzi Mx pt" od największej do najmniejszej.
- Usuń każdy wiersz zawierający 2 punkty końcowe o maksymalnej długości gałęzi mniejszej niż wartość odcięcia (tj. 0,5). Zsumuj dane w kolumnie punktów końcowych, aby obliczyć łączną liczbę punktów końcowych zebranych z obrazu.
- Powtórz te czynności dla danych informacyjnych gałęzi: posortuj według "długości gałęzi" od największej do najmniejszej. Przewiń dane i usuń każdy wiersz, którego długość gałęzi jest mniejsza niż wartość odcięcia (tj. 0,5). Zsumuj wartości w kolumnie długości gałęzi, aby obliczyć zsumowaną długość wszystkich gałęzi zebranych z obrazu.
- Powtarzaj kroki 4.11.3-4.11.5 dla każdego obrazu/arkusza, aż wszystkie dane zostaną przycięte i zsumowane.
- Podziel dane z każdego obrazu (zsumowaną liczbę punktów końcowych i zsumowaną długość gałęzi) przez liczbę somy mikrogleju na odpowiednim obrazie. Wprowadź dane końcowe (punkty końcowe/długość komórki i gałęzi/komórkę) do oprogramowania statystycznego.
UWAGA: Zsumowana długość gałęzi/dane komórki mogą wymagać konwersji z długości w pikselach na mikrony.
5. Analiza fraktalna
UWAGA: FracLac jest w stanie przeprowadzić wiele różnych analiz kształtu, które nie są objęte tym protokołem. Bardziej szczegółowe wyjaśnienie różnych funkcji FracLac można znaleźć w podręczniku FracLac na i powiązanych odnośnikach 2,16,19. Analiza fraktalna wykorzystuje kroki protokołu 4.1-4.7 opisane powyżej.
- Określ wielkość zwrotu z inwestycji, który będzie używany do wszystkich analiz fraktalnych. Użyj narzędzia prostokąta, aby narysować ROI. Upewnij się, że pole jest wystarczająco duże, aby przechwycić całą komórkę i może pozostać spójne w całym zestawie danych.
UWAGA: Użyj zaznaczenia prostokąta, a nie zaznaczenia odręcznego, aby upewnić się, że wszystkie ROI są prostokątem tego samego rozmiaru, a zatem komórki mają tę samą skalę. Nie miałoby to miejsca, gdyby użyto zaznaczenia odręcznego, ponieważ ImageJ automatycznie przeskaluje kwadratowy zwrot z inwestycji, aby dopasować go do prostokątnych okien o różnych rozmiarach, co spowoduje powstanie komórek o różnych skalach. Podczas gdy kształty fraktalne są niezależne od skali, proces analizy fraktalnej przy użyciu FracLac dla ImageJ jest zależny od scale16. W związku z tym istnieje potrzeba spójnego zwrotu z inwestycji w całym procesie gromadzenia danych. - Losowo wybierz mikroglej do analizy fraktalnej na każdym zdjęciu mikrofotografii i odpowiadającym jej obrazie binarnym. W oknie Menedżer zwrotu z inwestycji wybierz opcję Aktualizuj, aby zablokować zwrot akcji w pozycji komórki. Użyj Ctrl + Shift + D, aby zduplikować obszar w ROI jako nowe okno, a następnie zapisz przyciętą komórkę. Na odpowiednim obrazie binarnym (z analizy szkieletu) zduplikuj obszar z tą samą komórką za pomocą menedżera ROI. Powtarzaj, aż wystarczająca liczba komórek zostanie losowo wybrana do analizy fraktalnej i zapisz wszystkie pliki.
UWAGA: Generator liczb losowych i siatka numerowana mogą być używane do losowego wybierania komórek. - Otwórz obraz binarny z pojedynczą komórką. Kliknij dwukrotnie narzędzie pędzla, ustaw kolor na i dostosuj szerokość pędzla zgodnie z potrzebami. Używając pasującej mikrofotografii jako odniesienia, użyj pędzla, aby usunąć sąsiednie procesy komórkowe, połączyć pofragmentowane procesy i wyizolować komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Po odizolowaniu komórki binarnej zapisz plik binarny.
UWAGA: Przytrzymanie "alt" spowoduje przełączenie pędzla z koloru pierwszego planu () na kolor tła (biały). - Przekonwertuj komórkę binarną na kontur za pomocą paska narzędzi za pomocą opcji Proces | Binarny | konspekt.
UWAGA: FracLac dla obrazu J może być używany zarówno do brył, jak i konturów kształtów, jednak obecna konwencja to używanie konturów kształtów16. - Na pasku narzędzi otwórz FracLac za pomocą paska narzędzi, klikając Wtyczki | Analiza fraktalna | FracLac i wybierz BC (zliczanie pól). W ustawieniach projektu siatki ustaw wartość Num G na 4. W obszarze Opcje grafiki zaznacz pole Metryki, aby przeanalizować wypukłą powłokę i okrąg ograniczający komórki. Po zakończeniu wybierz przycisk OK.
UWAGA: Liczba G to liczba orientacji siatki liczenia pudełek używanych podczas skanowania, a zalecany zakres dla Num G to 4-12. Ustawienie Num G i sugerowany zakres są dokładnie sprawdzone w FracLac manual16. Zwiększenie liczby G może znacznie spowolnić czas obliczeń. Ustawienia FracLac należy skonfigurować tylko raz na sesję. Po wprowadzeniu ustawień przycisk Skanuj stanie się dostępny. - Wybierz przycisk Skanuj, aby uruchomić skanowanie zliczania pól na wybranym obrazie.
UWAGA: Skanowanie wygeneruje trzy okna z danymi wyjściowymi: Wyniki kadłuba i okręgu, plik podsumowania liczby pól i typy skanowania. Okno Typy skanowania zawiera dziennik zastosowanych ustawień, a także odchylenia standardowe dla określonych miar. Na potrzeby tego protokołu okno Typy skanowania nie jest używane i może zostać zamknięte lub zapisane do wykorzystania w przyszłości. - W oknie Wyniki kadłuba i okręgu skopiuj wszystkie żądane dane (tj. gęstość, współczynnik rozpiętości i kołowość). W oknie Podsumowanie liczby pól skopiuj żądane wyniki danych (tj. wymiaru fraktalnego i lacunarności). Przenieś skopiowane dane do pliku Excel lub programu statystycznego.
UWAGA: Pełna lista danych wyjściowych FracLac znajduje się i jest dokładnie wyjaśniona w FracLac for ImageJ manual16.
Wyniki
Opisane tutaj protokoły analizy morfologii mikrogleju podsumowują etapy pomocne w przetwarzaniu fluorescencyjnych mikrofotografii oraz mikrofotografii z barwieniem DAB w celu przeprowadzenia analizy morfometrycznej. Kroki te zostały przedstawione w formie schematu w Rysunek 2 i Rycina 3Celem tych kroków jest stworzenie reprezentatywnego obrazu binarnego i szkieletowego, który w sposób odpowiedni modeluje oryginalny mikrofotograf, tak aby zgromadzone dane były wiarygodne. Po zastosowaniu protokołu wtyczka AnalyzeSkeleton generuje oznaczony obraz szkieletowy, z którego można odczytać liczbę punktów końcowych oraz rozgałęzień (t.j.., długość procesu) można podsumować na podstawie wynikowych plików wyjściowych. Dane dotyczące punktów końcowych i długości procesów są następnie wykorzystywane do oszacowania stopnia ramifikacji mikrogleju na mikrofotografii lub w obszarze ROI. Rycina 4 podsumowuje uzyskane dane (punkty końcowe/komórkę oraz długość procesu/komórkę) zebrane z zastosowaniem i bez zastosowania protokołu. Choć występują podobne trendy, dane podsumowane w Rysunek 4F wykazują mniejszą zmienność niż te w Rysunek 4E. Dodatkowo dane te obrazują zwiększoną czułość w wykrywaniu różnic między grupami podczas stosowania protokołu. Na koniec należy zachować ostrożność w odniesieniu do zmienności międzyoperatorowej w zastosowaniu protokołu. Różnice te zostały podsumowane przez Rysunek 5 gdzie ten sam zestaw danych został przeanalizowany przez dwóch niezależnych użytkowników z zastosowaniem identycznego protokołu, opisanego powyżej.
Dodatkowe dane morfologiczne są zbierane z pojedynczych komórek wyizolowanych z obrazów binarnych utworzonych podczas stosowania protokołu. Kroki protokołu służące do analizy morfologii mikrogleju przed i z użyciem wtyczki FracLac zostały podsumowane na Ryc. 6. Przedstawiamy tę analizę zarówno dla tkanki nieuszkodzonej (Ryc. 6A), jak i uszkodzonej (Ryc. 6B). Reprezentatywne obrazy przykładów binarnych, obrysowanych, otoczek wypukłych/okręgów otaczających oraz zliczania pudełkowego dla każdej komórki analizowanej z zastosowaniem i bez zastosowania protokołu pokazano na Ryc. 6C-F. Obrazy te pomagają zilustrować źródła różnic w danych morfologicznych, które zostały podsumowane na Ryc. 6G.
Rysunek 1. Ilustracje szkieletyzowanej mikroglei z somą kołową (nieoptymalna) w porównaniu do somy o pojedynczym punkcie pochodzenia (optymalna) oraz odpowiadające im nałożenie obrazu szkieletyzowanej komórki na oryginalny mikrofotograf. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. Zastosowanie protokołu do fluorescencyjnych mikrofotografii. Ilustracje protokołu Skeleton Analysis zastosowanego do fluorescencyjnej mikrofotografii z wyciętą pojedynczą komórką w celu pokazania szczegółów. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3. Zastosowanie protokołu do mikrofotografii DAB w polu jasnym. Ilustracje protokołu analizy szkieletowej (Skeleton Analysis) zastosowanego do mikrofotografii DAB w polu jasnym, z wycinkiem pojedynczej komórki w celu pokazania szczegółów. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4. Analiza danych z zastosowaniem i bez zastosowania protokołu. (A) Przykład mikrofotografii fluorescencyjnego IHC oraz wycinek komórki odpowiadający żółtej ramce na (B). Przykładowe obrazy binarne i szkieletowe z zastosowaniem (C) oraz bez zastosowania (D) opisanego protokołu. Dane zbiorcze dotyczące liczby zakończeń wypustek mikrogleju na komórkę i długości wypustek na komórkę w nieuszkodzonej (białe) i uszkodzonej (szare) tkance kory z zastosowaniem (E) oraz bez zastosowania (F) protokołu. Analiza statystyczna z użyciem testu t Studenta i n = 3, ** oznacza p < 0.01. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5. Różnice między użytkownikami w zastosowaniu protokołu. Przykład oryginalnego obrazu oraz konwersji protokołu na obrazy binarne i szkieletowe wykonanej przez Użytkownika 1 i Użytkownika 2. Różnice między dwoma obrazami zostały zaznaczone dopasowanymi kolorowymi okręgami. Wykresy podsumowujące dane dotyczące liczby wypustek mikrogleju na komórkę oraz długości wypustek na komórkę w nieuszkodzonych i uszkodzonych obszarach mózgu, opracowane przez Użytkownika 1 i Użytkownika 2. Analiza statystyczna metodą ANOVA, wielkość próby n = 3; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 6. Analiza fraktalna z zastosowaniem i bez zastosowania protokołu. Przykład przyciętych mikrofotografii mikrogleju w nieuszkodzonej (A) i uszkodzonej (B) korze z odpowiadającymi im obrazami binarnymi (C) oraz konturowymi (D), uzyskanymi z zastosowaniem i bez zastosowania protokołu. Powiązana otoczka wypukła (niebieska) i okrąg opisujący (różowy) dla odpowiadających im kształtów konturowych (E) są wykorzystywane do obliczenia gęstości kształtu, stosunku rozpiętości oraz kolistości (G). Metoda zliczania pudełkowego (box counting) została zilustrowana w (F) i jest wykorzystywana do obliczeń wymiaru fraktalnego (DB) oraz lakunarności (λ) (G). Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Komórki mikrogleju są precyzyjnie dostrojone do fizjologii i patologii w swoich mikrodomenach i wykazują różnorodny zakres morfologii2 zarówno w przypadku subtelnych 7,14, jak i poważnych uszkodzeń8. Wykorzystanie protokołów ImageJ sprawia, że kwantyfikacja morfologii mikrogleju jest dostępna dla wszystkich laboratoriów, ponieważ platforma i wtyczki są oprogramowaniem do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym. Podczas gdy opisany protokół koncentruje się na przetwarzaniu i analizie obrazu za pomocą tego oprogramowania, spójność gromadzenia, trafność i niezawodność danych zaczyna się od doskonałego IHC i mikroskopii. Protokół ten służy do poprawy reprezentacji binarnych, szkieletowych i konturowych całych mikrofotografii i pojedynczych komórek, ale nie może zastąpić słabego barwienia IHC i mikroskopii, które skutkują niskim kontrastem, rozmytymi lub zniekształconymi obrazami. Dodatkowo należy zachować ostrożność, aby nie spłaszczyć tkanki mózgowej podczas przechowywania, przed sekcją, co nieodwracalnie zmienia morfologię mikrogleju. Wreszcie, w każdym eksperymencie mikroglej musi być obrazowany przy użyciu tej samej skali, a także tego samego mikroskopu. Oprzyrządowanie, obiektywy i oprogramowanie różnią się w zależności od mikroskopu, co skutkuje różnymi rozmiarami mikrofotografii pomimo podobnych obiektywów i zmienia szczegóły, a także liczbę komórek w każdej klatce. Na przykład akwizycja obrazu za pomocą obiektywu 40X w Leica SPII skutkuje dwukrotnie większą liczbą komórek i mniejszą szczegółowością niż akwizycja przy użyciu Zeiss 880. Jest to szczególnie ważne w przypadku danych rozgałęzień komórek zbieranych z całej ramki, a nie z pojedynczej komórki, ponieważ staje się to kwestią próbkowania danych.
Ogólnie rzecz biorąc, analiza szkieletu, która wykorzystuje cały mikrograf fotograficzny, poprzedza analizę fraktalną pojedynczej komórki z dwóch powodów. Określenie rozgałęzień wszystkich komórek na mikrofotografii jest szybkie w porównaniu z analizą fraktalną pojedynczej komórki i może być uważane za narzędzie przesiewowe, jeśli czynnikiem jest czas. Ponadto obrazy binarne uzyskane podczas analizy szkieletu są wykorzystywane do analizy fraktalnej. Po zobrazowaniu istnieje szereg krytycznych kroków, które mogą wpłynąć na wyniki analizy szkieletu i wprowadzić wpływ użytkownika. Kroki protokołu, które są najbardziej zmienne między użytkownikami, to krok 4.2 (zwiększenie jasności obrazu) i krok 4.5 (określenie progu). Tam, gdzie to możliwe, określona jest optymalna liczba zwiększająca jasność (suwak maks. lub minimalny w zakresie 0-255), która jest utrzymywana na stałym poziomie dla wszystkich obrazów i użytkowników. Tam, gdzie zmienność obrazu jest duża, użytkownik może zamiast tego wybrać jasność, która będzie się różnić między obrazami. Alternatywnie, jeśli obrazy są jasne, a kontrast jest wysoki, można pominąć zwiększanie jasności, a progowanie można ustandaryzować za pomocą specjalnego filtra progowego (np. Huang) zamiast bardziej zmiennego domyślnego. Po zoptymalizowaniu parametry powinny być przestrzegane, aby zminimalizować dodatkowy wpływ użytkownika.
Przykład zmienności użytkownika przedstawiono na rysunku 5. Wartości danych zostały zwiększone w przypadku Użytkownika 1 w porównaniu z Użytkownikiem 2, a zatem zmienność byłaby większa, gdyby zarówno Użytkownik 1, jak i Użytkownik 2 przyczynili się do gromadzenia danych. Przykładem różnic między obrazami binarnymi i szkieletowymi Użytkownik 1 i Użytkownik 2 są kolorowe kółka (Rysunek 5). W tym przypadku obaj użytkownicy byli krótko przeszkolonymi studentami studiów licencjackich z ograniczoną wiedzą specjalistyczną w zakresie mikrogleju. Regularny nadzór i mentoring ze strony eksperta w dziedzinie mikrogleju wraz ze zwiększonym szkoleniem w zakresie protokołu2 mogą zmniejszyć zmienność między użytkownikami. Chociaż nie zostało to tutaj ocenione, analiza fraktalna jest mniej podatna na zmienność między użytkownikami, ponieważ komórki binarne są ręcznie i indywidualnie izolowane z mikrofotografii fotograficznej, a nie polegają wyłącznie na progach w celu określenia kształtów mikrogleju. Jednak wszystkie metody mają pewną zmienność między użytkownikami. W związku z tym pojedynczy użytkownik (najlepiej przeszkolony w zakresie komórek mikrogleju) powinien ukończyć zbieranie danych dla całego zestawu danych.
Dodatkowe modyfikacje tego protokołu można łatwo wprowadzić i będą one zależeć od jakości obrazu oraz wysiłków podjętych w celu zmniejszenia szumów i zapewnienia łączności procesowej. Na przykład, jeśli kontrast jest odpowiedni, maska wyostrzająca nie jest konieczna i można ją pominąć. Rozsądnie jest zoptymalizować i sfinalizować protokół dla określonego zestawu obrazów, zarówno przypadków eksperymentalnych, jak i kontrolnych, przed zebraniem danych z całego zestawu. Wreszcie, dodatkowe wtyczki mogą być używane zamiast innych w celu wyjaśnienia lub wyostrzenia obrazów, które nie zostały opisane w tym protokole, takich jak rozszerzanie lub wyostrzanie.
Zaletami tego protokołu są jego uniwersalna dostępność i możliwość adaptacji. Ponadto ocena rozgałęzienia komórek za pomocą AnalyzeSkeleton jest szybka i ma zastosowanie do całego mikrozdjęcia fotograficznego. Zaletą podejścia opartego na analizie wielokomórkowej jest skupienie się na całym regionie, a nie na pojedynczych komórkach. W związku z tym możliwa jest szybka ocena średnich rozgałęzień (pod względem punktów końcowych i długości procesu) wszystkich mikrogleju w obrazie. Analiza szkieletowa zapewnia analizę wielu komórek: próbkowanie danych pod względem liczby komórek, których nie można dopasować za pomocą analizy fraktalnej ze względu na wymaganą inwestycję czasową w celu wyizolowania pojedynczych komórek z mikrofotografii. Przykładem, w którym może to być najbardziej odpowiednie, byłoby badanie przesiewowe morfologii mikrogleju w pobliżu urazu ogniskowego. Jednym z ograniczeń jest to, że renderowanie obrazu całego pola w celu stworzenia modeli szkieletowych mikrofotografii IHC jest niedoskonałe w porównaniu z bardziej czasochłonnym podejściem opartym na pojedynczej komórce. Ponadto analiza regionów nie jest odpowiednia w okolicznościach, w których morfologie mikrogleju drastycznie różnią się w tej samej dziedzinie. Wreszcie, ta metoda analizy zależy od liczby komórek, parametru, który może się różnić w zależności od warunków eksperymentalnych.
Analiza fraktalna jest przeprowadzana na pojedynczej komórce, a zatem uzupełnia średnie dane wyjściowe rozgałęzienia komórki wynikające z analizy szkieletu. Chociaż inwestycja ta jest znacznie bardziej czasochłonna, pozwala uzyskać szeroki zakres danych morfometrycznych. Na przykład dane dotyczące gęstości komórek, współczynnika rozpiętości i kołowości opisują odpowiednio rozmiar, wydłużenie i kształt konturu komórki. Wymiar fraktalny i lakunarność podsumowują odpowiednio złożoność komórki i niejednorodność kształtu. Bardziej szczegółowe podsumowanie sposobu obliczania każdego parametru i interpretacji danych znajduje się w interaktywnym podręczniku16 i takie szczegóły należy rozważyć w odniesieniu do konkretnego pytania badawczego. Opisany protokół dostarcza czułych narzędzi do ilościowego określania niewielkich zmian w morfologii 2D mikrogleju, które mogą wystąpić w stanach fizjologicznych i patologicznych. Dodatkowa analiza morfometryczna, taka jak solidność, wypukłość i współczynnik kształtu16,20, może być możliwa w przypadku generowania kształtów 3D.
Opracowywanie i adaptacja protokołów jest ciągła i sterowana przez użytkownika. Został on rozszerzony z fluorescencji8 na obrazy DAB/jasnego pola7, ale jeszcze nie na tkankę zatopioną w parafinie. Ponadto może być używany w połączeniu z zastrzeżonym oprogramowaniem, takim jak Imaris do dodatkowej analizy. Protokół ten może być stosowany do różnych rodzajów fizjologii i nie ogranicza się do mikrogleju, ale może być stosowany do dowolnej komórki lub tkanki o określonych wzorach lub kształtach, które można zidentyfikować za pomocą metod IHC. Wreszcie, przy wystarczającej wielkości próby, można zastosować analizę wielowymiarową lub skupień w celu stratyfikacji mikrogleju zgodnie z morfologią12,21; Jest to istotna informacja, ponieważ morfologia mikrogleju jest istotnym wskaźnikiem funkcji mikrogleju i jego reakcji na otoczenie. Uznanie dla różnorodności morfologicznej mikrogleju rośnie i jest ważne, aby w pełni zrozumieć interakcje neuron-glej-naczyniowy w okresie zdrowia i choroby. Wzrost w tej dziedzinie jest wzmocniony przez dobrze opracowane, łatwe w użyciu i powtarzalne protokoły do ilościowego określania i podsumowywania morfologii mikrogleju przy użyciu wielu zmiennych ciągłych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie otrzymało wsparcie finansowe od NINR (F32NR013611). Chcielibyśmy również wyrazić uznanie i podziękować twórcom AnalyzeSkeleton(2D/3D) i FracLac (odpowiednio Arganda-Carreras i in. oraz Karperien i wsp.), bez których opisana tutaj analiza nie byłaby możliwa.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| przeciwciało pierwszorzędowe anty-IBA1 | Wako | 019-19741 | królik gospodarz |
| Vectashield miękki montaż | Vector Labs | H-1000 | |
| Przeciwciało wtórne | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | gospodarz osła |
| 4 ml szklana fiolka | Wheaton | UX-08923-11 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Azydek sodu (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
| Fisher Scientific | 12-544-G |
Bibliografia
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection(2013).
- Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. Rod microglia: a morphological definition. PLoS One. 9 (5), e97096(2014).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biol. 14 (6), e1002466(2016).
- Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus. Front Neurol. 8 (700), eCollection(2017).
- Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury. Sci Rep. 7 (1), 13211(2017).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion. J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Xu, H., et al. Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers. J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).
- Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments. Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).
- Soltys, Z., et al. Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis. J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).
- Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study. Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).
- Morrison, H. W., Filosa, J. A. Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice. Neuroscience. 339, (2016).
- Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Karperien, A. FracLac for ImageJ. , Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm (2013).
- Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction. Sci Rep. 7 (1), 1576(2017).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2014).
- Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection(2015).
- Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. 3D quantitative analysis of microglial morphology. available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis. Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection(2017).
Przedruki i uprawnienia
