Kwantyfikacja morfologii mikrogleju na podstawie mikrofotografii immunohistochemicznej tkanki przygotowanej za pomocą ImageJ

Podsumowanie

Mikroglej to komórki odpornościowe mózgu, które badają i reagują na zmienione fizjologie mózgu poprzez zmiany morfologiczne, które mogą być oceniane ilościowo. Protokół ten przedstawia protokół analizy oparty na ImageJ, aby przedstawić morfologię mikrogleju jako ciągłe dane zgodnie z takimi wskaźnikami, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt.

Streszczenie

Mikroglej to fagocyty mózgu, które uczestniczą w homeostazie mózgu i nieustannie badają swoje otoczenie pod kątem dysfunkcji, urazów i chorób. Jako pierwsi reagujący, mikroglej pełni ważne funkcje łagodzące dysfunkcję neuronów i gleju, a w tym procesie przechodzą szeroki zakres zmian morfologicznych. Morfologie mikrogleju można kategoryzować opisowo lub, alternatywnie, można je określić ilościowo jako zmienną ciągłą dla takich parametrów, jak rozgałęzienie komórki, złożoność i kształt. Podczas gdy metody ilościowego określania mikrogleju są stosowane do pojedynczych komórek, niewiele technik ma zastosowanie do wielu mikrogleju w całej mikrofotografii. Celem tej metody jest ilościowe określenie wielu i pojedynczych komórek przy użyciu łatwo dostępnych protokołów ImageJ. Protokół ten jest podsumowaniem kroków i wtyczek ImageJ zalecanych do konwersji mikrofotografii fluorescencyjnych i jasnego pola na reprezentatywne obrazy binarne i szkieletowe oraz do ich analizy za pomocą wtyczek programowych AnalyzeSkeleton (2D/3D) i FracLac do zbierania danych morfologicznych. Dane wyjściowe tych wtyczek podsumowują morfologię komórek pod względem punktów końcowych procesu, połączeń i długości, a także deskryptorów złożoności, kształtu i rozmiaru komórki. Opisany w niniejszym dokumencie protokół analizy szkieletu doskonale nadaje się do regionalnej analizy wielu mikrogleju w obrębie całego mikrozdjęcia lub regionu zainteresowania (ROI), podczas gdy FracLac zapewnia uzupełniającą analizę pojedynczych komórek. W połączeniu protokół zapewnia obiektywne, czułe i kompleksowe narzędzie oceny, które można wykorzystać do stratyfikacji między różnymi morfologiami mikrogleju obecnymi w zdrowym i uszkodzonym mózgu.

Wprowadzenie

Mikroglej ma natychmiastową i zróżnicowaną morfologiczną reakcję na zmiany w fizjologii mózgu¹ wzdłuż kontinuum możliwości, które wahają się od hiperrozgałęzienia i wysoce złożonych morfologii do morfologii rozgałęzionych i ameboidalnych². Mikroglej może również stać się spolaryzowany i mieć kształt pręcika³. Rozgałęzienie komórek mikrogleju jest powszechnie definiowane jako złożony kształt składający się z wielu procesów i często jest podawane jako liczba punktów końcowych na komórkę i długość procesów komórkowych. Ponieważ mikroglej jest precyzyjnie dostrojony do funkcji neuronalnych i glejowych poprzez ciągły wzajemny oddziaływanie komórek i ruchliwość in vivo^4,5, morfologie mikrogleju mogą służyć jako wskaźniki różnych funkcji i dysfunkcji komórek w mózgu. Podejście ilościowe jest konieczne, aby odpowiednio opisać różnorodność tych zmian morfologicznych i rozróżnić różnice między rozgałęzionymi komórkami, które występują z subtelnymi zaburzeniami fizjologicznymi (takimi jak padaczka5^,6 i wstrząs mózgu⁷) oprócz poważnych obrażeń (takich jak udar⁸). Zwiększone wykorzystanie kwantyfikacji morfologii^7,8,9,10,<sup class="xref">11^,12,13,14 ujawni pełną różnorodność morfologii mikrogleju podczas zdrowia i choroby. Niniejsze badanie szczegółowo opisuje stopniowe zastosowanie wtyczek ImageJ niezbędnych do podsumowania morfologii mikrogleju na podstawie fluorescencyjnych lub niefluorescencyjnych fotomikrofotografii mikrogleju uzyskanych w utrwalonej tkance gryzonia po immunohistochemii (IHC).

Kluczowe dla opisanych tutaj technik analizy są wtyczki ImageJ AnalyzeSkeleton (2D/3D)¹⁵, opracowane w 2010 roku do ilościowego określania dużych struktur sutkowych, oraz FracLac¹⁶, opracowane w 2014 roku do integracji ImageJ i analizy fraktalnej w celu ilościowego określenia indywidualnych kształtów mikrogleju. Wtyczki te zapewniają szybką analizę rozgałęzień mikrogleju w całych mikrofotografiach lub wielu mikrogleju o zdefiniowanym ROI w mikrofotografii fotograficznej. Analiza ta może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z analizą fraktalną. Analiza fraktalna pojedynczej komórki (FracLac) wymaga inwestycji czasu, ale dostarcza wielu danych wyjściowych morfologii dotyczących złożoności, kształtu i rozmiaru mikrogleju. Użycie obu narzędzi nie jest nadmiarowe, ponieważ rozgałęzienie komórek jest komplementarne do złożoności komórek, a kombinacja wielu parametrów może być wykorzystana do rozróżnienia różnych morfologii mikrogleju w zestawach danych^12,17.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez University of Arizona Institutional Animal Care and Use Committee oraz wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Zadbano o to, aby zminimalizować ból i dyskomfort zwierząt. Metody eutanazji są zgodne z zatwierdzonym protokołem i polegają na dekapitacji szyjki macicy w znieczuleniu izofluranem.

1. Przygotowanie tkanek

UWAGA: Przeprowadź analizę morfologii mikrogleju na stałych, kriochronionych próbkach tkanek, aby zachować morfologię komórek. Poniżej znajduje się standardowy protokół przygotowania i bezpośredniego krojenia utrwalonej tkanki do fluorescencji IHC.

1. Usuń mózgi myszy lub szczurów ze zwierzęcia poddanego eutanazji po pożądanym eksperymencie i zgodnie ze standardowym protokołem laboratoryjnym. Umieścić mózg w 10 ml fiolce zawierającej 5 ml 4% roztworu paraformaldehydu na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Następnie spłukać i umieścić w 5-10 ml 30% roztworu buforowego z fosforanem sacharozy (PBS, 0,01 M) na 72 godziny w temperaturze 4 °C. Przechowywać całe mózgi w temperaturze -80 °C do czasu podziału tkanek za pomocą kriostatu lub w temperaturze 4 °C w przypadku cięcia mikrotomem.
   UWAGA: Ten protokół nie został jeszcze przetestowany przy użyciu tkanki wyciętej z tkanki zatopionej w parafinie.
2. Tkankę mózgową należy przeciąć do żądanej grubości i orientacji przekroju za pomocą kriostatu lub mikrotomu i przechowywać swobodnie pływające skrawki w roztworze krioprotekcji (50 mM PBS, glikol etylenowy, glicerol) w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: Protokół ten został z powodzeniem przeprowadzony na skrawkach tkanki koronalnej o grubości od 50 μm do 200 μm. Skrawki tkanek mniejsze niż 50 μm mogą nie uchwycić pełnego zakresu procesów mikrogleju, podczas gdy w grubych skrawkach tkanek barwienie IHC może być niedoskonałe ze względu na przenikanie przeciwciał do tkanki. Tkanka może być cięta w orientacji czołowej lub strzałkowej, a wybór ten będzie zależał od celu eksperymentalnego i obszaru (regionów) mózgu, który ma być badany.

2. Immunohistochemia

UWAGA: Metody analizy szkieletowej i fraktalnej mogą być stosowane zarówno do fluorescencji, jak i 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) IHC. Poniżej znajduje się standardowy protokół fluorescencji IHC, który w razie potrzeby może zostać zastąpiony. Fluorescencyjny IHC zapewnia lepszą wizualizację procesów komórkowych w porównaniu z DAB IHC.

1. Umieścić skrawki tkanek w szklanej fiolce o pojemności 4 ml (do 15 fragmentów mózgu myszy na fiolkę) i inkubować z 1 ml roztworu zawierającego do 10% surowicy końskiej, PBS (0,01 M), 0,5% Tritonu, 0,04% NaN₃ w temperaturze pokojowej (23 °C) przez 1 godzinę.
2. Myć przez 5 minut z PBS (0,01 M) trzy razy w temperaturze pokojowej.
3. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (Iba1, 1:1000) w temperaturze pokojowej przez 72 godziny w 1 ml roztworu zawierającego PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN₃ i przykryć (w celu zachowania skuteczności NaN₃).
4. Myć przez 5 minut z PBS (0,01 M) trzy razy w temperaturze pokojowej.
5. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (anty-królik 488, 1:250) pokrytym w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w 1 ml roztworu zawierającego PBS (0,01 M), 0,5% Triton, 0,04% NaN₃
6. Myć przez 5 minut z PBS (0,01 M) trzy razy w temperaturze pokojowej.
7. Zamontuj skrawki tkanki mózgowej (liczba i orientacja w zależności od preferencji) do szkiełek podstawowych, nałóż miękko osadzone medium montażowe na szkiełko i umieść szkiełko nakrywkowe na tkance. Przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Do obrazowania konfokalnego wymagana jest grubość szkiełka nakrywkowego 1,5 cala. Miękkie podłoże mocujące jest preferowanym środkiem mocującym, ponieważ wysoka lepkość nie kompresuje tkanki i najlepiej zachowuje morfologię w porównaniu z twardymi nośnikami mocującymi.

3. Obrazowanie

1. Obraz komórek Iba1 dodatnich w sekcji tkanki mózgowej za pomocą mikroskopu jasnego pola lub mikroskopu konfokalnego, który ma zdolność akwizycji z-stack przy użyciu obiektywu 20X lub większego.
   UWAGA: Parametry obrazowania i konfiguracja oprogramowania powinny być stałe dla wszystkich akwizycji mikrofotografii w eksperymencie. Doskonałe odwzorowanie szczegółów procesu uzyskuje się przy użyciu obiektywu 40X lub 63X. Możliwe jest zastosowanie opisanego w niniejszym dokumencie protokołu analizy szkieletu do całego mikrozdjęcia lub wielokomórkowego zwrotu z inwestycji w ramach większej mikrofotografii.
   1. Obrazy 8-bitowe można uzyskiwać przy użyciu odpowiednich ustawień oprogramowania specyficznych dla oprogramowania mikroskopu.
      UWAGA: Konwersja plików do formatu 8-bitowego po akwizycji może zniekształcić zbieranie danych.
   2. Uzyskać stos z co najmniej 30 μm z odstępem nie większym niż 2 μm między obrazami, korzystając z odpowiednich ustawień oprogramowania specyficznych dla oprogramowania mikroskopu.
      UWAGA: Mikroskop i oprogramowanie powinny umożliwiać akwizycję obrazu w osi X, Y i Z. Stos z może zostać zwiększony, a interwał może zostać zmniejszony, aby zapewnić dodatkowe szczegóły mikrogleju. W zamian za to wydłuży się czas obrazowania. Tam, gdzie to możliwe, należy użyć próbki Nyquista do mikroskopii fluorescencyjnej.
2. Zapisz wszystkie pliki jako pliki Tif lub zgodnie z wymaganiami oprogramowania mikroskopu.
3. Otwórz pliki Tif w ImageJ i użyj paska narzędzi, aby podzielić kanały, klikając Obraz | Kolor | Podziel kanały i ułóż obrazy w stos, klikając Obraz | Stosy | X Projekt | Projekcja maksymalnej intensywności, w stosownych przypadkach. Zapisz jako pliki .tif.

4. Analiza szkieletu

1. Pobierz FIJI lub ImageJ z . Dla poszczególnych wtyczek pobierz AnalyzeSkeleton(2D/3D) z ¹⁵ i pobierz FracLac z ¹⁶.
   UWAGA: Cały proces konwersji mikrofotografii do binarnego obrazu szkieletowego zajmuje mniej niż 1 minutę.
2. Jeśli używasz mikrofotografii fluorescencyjnej, upewnij się, że obraz jest 8-bitowy i przekonwertuj go na skalę szarości, aby jak najlepiej zobrazować wszystkie pozytywne zabarwienia. Za pomocą paska narzędzi kliknij opcję Obraz | Tabele przeglądowe | Szarości. Jeśli korzystasz ze zdjęcia DAB w jasnym polu, najpierw użyj wtyczki filtra pasmowoprzepustowego FFT (za pomocą paska narzędzi, klikając Process | Spółka FFT | filtr pasmowoprzepustowy), a następnie przekonwertuj na skalę szarości.
   UWAGA: Na potrzeby tego protokołu wystarczające są domyślne ustawienia ImageJ dla filtra pasmowoprzepustowego FFT (filtr do 3 pikseli, do 40, bez tłumienia pasków). Zastosowanie filtra pasmowoprzepustowego FFT usuwa szumy (drobne elementy), zachowując jednocześnie ogólnie większe aspekty obrazu. Jest to szczególnie przydatne w przypadku obrazów w jasnym polu, gdzie pęknięcia i pęknięcia w tkance mogą pojawiać się jako tło, a tym samym komplikować analizę szkieletu¹⁸.
3. Dostosuj jasność i kontrast, jeśli obraz jest zbyt ciemny i nie można zobaczyć procesu mikrogleju. Za pomocą paska narzędzi kliknij opcję Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast. W razie potrzeby dostosuj suwaki minimum lub maksimum, aż do krawędzi histogramu, ale nie dalej.
   UWAGA: W obrazie ImageJ jasność i kontrast są zmieniane przez aktualizację tabeli przeglądowej obrazu (LUT), dzięki czemu wartości pikseli pozostają niezmienione. Suwaki Max i Min, kontrolują dolne i górne granice zakresu wyświetlania, przy czym wartości pikseli powyżej 255 są białe, a wartości pikseli poniżej 0 są wyświetlane jako czarne¹⁸. W przypadku mikrofotografii fluorescencyjnych należy użyć suwaka maksymalnego, natomiast suwaka minimalnego należy użyć mikrofotografii mikrogleju barwionego DAB.
4. Uruchom filtr Maska wyostrzająca, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast za pomocą paska narzędzi, klikając kolejno opcje Proces | Filtry | Maska wyostrzająca. Na potrzeby tego protokołu używane są domyślne ustawienia ImageJ (promień piksela 3 i waga maski 0,6).
   UWAGA: Maska wyostrzająca wyostrza i uwydatnia krawędzie obrazu, odejmując rozmytą wersję obrazu (maskę wyostrzającą) od oryginału, a następnie scalając wynikowy obraz z wersją oryginalnego obrazu o wysokim kontraście. W związku z tym filtr Maska wyostrzająca nie tworzy szczegółów, ale raczej rozjaśnia istniejące szczegóły obrazu. Ustawienie promienia zmienia stopień rozmycia maski wyostrzającej (a tym samym stopień rozmycia, które zostanie usunięte), a ustawienie grubości maski zmienia stopień kontrastu, z którym maska wyostrzająca zostanie scalona (a tym samym dostosowuje kontrast końcowego obrazu).
5. Wykonaj krok usuwania plamek, aby usunąć odgłos soli i pieprzu generowany przez maskę wyostrzającą. Użyj paska narzędzi i kliknij przycisk Proces | Hałas | Despeckle.
   UWAGA: Usuwanie plamek usuwa szum soli i pieprzu, zastępując każdy piksel medianą wartości w jego sąsiedztwie 3 × 3. Efekt jest taki, że wartości odstające pod względem intensywności są zastępowane przez medianę pikseli bez wpływu na ostrość krawędzi¹⁸.
6. Przekonwertuj obraz na binarny za pomocą paska narzędzi, klikając Obraz | Dostosuj | Próg.
   UWAGA: Progowanie warstwuje obrazy w skali szarości na interesujące cechy i tło i konwertuje obraz na binary¹⁸.
7. Zastosuj funkcje usuwania plamek, zamykania i usuwania wartości odstających: W wynikowym obrazie binarnym może występować jednopikselowy szum tła i przerwy między procesami.
   1. Zastosuj funkcję usuwania plamek za pomocą paska narzędzi, klikając kolejno opcje Proces | Hałas | Despeckle.
      UWAGA: Zastosowanie usuwania plamek do obrazu binarnego usuwa pozostały szum jednopikselowy.
   2. Zastosuj funkcję zamykania za pomocą paska narzędzi, klikając przycisk Proces | Binarny | Zamknij.
      UWAGA: Ta wtyczka łączy dwa ciemne piksele, jeśli są one oddzielone od siebie maksymalnie 2 pikselami.
   3. Zastosuj funkcję usuwania wartości odstających za pomocą paska narzędzi, klikając kolejno opcje Proces | Hałas | Usuń Outliers.
      UWAGA: Na potrzeby tego protokołu jasne wartości odstające są kierowane na promień piksela 2 i próg 50. Ta wtyczka zastępuje jasny lub ciemny piksel odstający medianą pikseli w otaczającym obszarze, jeśli odchyla się o więcej niż określoną wartość (próg)¹⁸.
8. Zapisz obraz jako osobny plik do wykorzystania w przyszłości i/lub analizy fraktalnej, a następnie zszkieletuj obraz za pomocą paska narzędzi, klikając przycisk Process | Binarny | Szkieletowanie.
9. Wybierz szkieletowany obraz i uruchom wtyczkę AnalyzeSkeleton(2D/3D) za pomocą paska narzędzi, klikając Wtyczki | Szkielet | Analizuj szkielet i zaznacz pole Informacje o gałęzi.
   UWAGA: Jest prawdopodobne, że przetwarzanie obrazu będzie wymagało optymalizacji z dodaniem lub usunięciem powyższych sugerowanych kroków. W tym procesie szkieletowane obrazy są oceniane pod kątem dokładności poprzez utworzenie nakładki szkieletu i oryginalnego obrazu. Somy powinny być pojedynczymi punktami początkowymi z procesami emanującymi z centrum; Okrągłe somy zakłócają dane i należy ich unikać poprzez dostosowanie protokołu. Przykład pojedynczego punktu początkowego w porównaniu z okrągłymi somami jest zilustrowany na Rysunek 1.

Najczęstsze problemy skutkujące niereprezentatywnymi szkieletami i sugerowane rozwiązania:

• Obraz zbyt ciemny: konwertuj na skalę szarości, dostosuj suwaki jasności/kontrastu i/lub zastosuj maskę wyostrzającą
• Za dużo tła: dostosuj suwaki jasności/kontrastu, zastosuj usuwanie plamek i/lub usuń wartości odstające
• Okrągłe somy na obrazie szkieletowym (szczególnie w przypadku obrazów fluorescencyjnych): zastosuj filtr pasmowoprzepustowy FFT i/lub maskę wyostrzającą
• Pęknięcia w tkance (szczególnie w przypadku obrazów w jasnym polu): zastosuj filtr pasmowo-przepustowy FFT i/lub usuń plamki

10. Skopiuj wszystkie dane z danych wyjściowych wyników i informacji o gałęzi i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego programu Excel.
11. W programie Excel przytnij dane, aby usunąć fragmenty szkieletu, które powstają w wyniku IHC i akwizycji obrazu.
    1. Zduplikuj skoroszyt eksperymentu z nieprzetworzonymi danymi wyjściowymi z analizy szkieletu i dodaj TRIM do nazwy pliku. Wszystkie kolejne przycinanie danych powinno odbywać się w zduplikowanym skoroszycie, aby zachować nieprzetworzone dane do wykorzystania w przyszłości i odwołania.
    2. Określ, jaka długość fragmentów zostanie przycięta z zestawu danych, otwierając szkieletowany obraz w ImageJ i wybierając narzędzie Linia. Zmierz kilka fragmentów, zwracając uwagę na średnią długość, i zdecyduj o wartości odcięcia.
       UWAGA: Na potrzeby prezentowanych tu danych długość graniczna dla niepożądanych fragmentów wynosi 0,5. Ta wartość powinna być spójna w całym zestawie danych.
    3. Niestandardowe sortowanie arkusza kalkulacyjnego Excel, klikając Sortuj i filtruj | Sortowanie niestandardowe. Sortuj według "wokseli końcowych" od największego do najmniejszego i, na nowym poziomie, według "gałęzi Mx pt" od największej do najmniejszej.
    4. Usuń każdy wiersz zawierający 2 punkty końcowe o maksymalnej długości gałęzi mniejszej niż wartość odcięcia (tj. 0,5). Zsumuj dane w kolumnie punktów końcowych, aby obliczyć łączną liczbę punktów końcowych zebranych z obrazu.
    5. Powtórz te czynności dla danych informacyjnych gałęzi: posortuj według "długości gałęzi" od największej do najmniejszej. Przewiń dane i usuń każdy wiersz, którego długość gałęzi jest mniejsza niż wartość odcięcia (tj. 0,5). Zsumuj wartości w kolumnie długości gałęzi, aby obliczyć zsumowaną długość wszystkich gałęzi zebranych z obrazu.
    6. Powtarzaj kroki 4.11.3-4.11.5 dla każdego obrazu/arkusza, aż wszystkie dane zostaną przycięte i zsumowane.
    7. Podziel dane z każdego obrazu (zsumowaną liczbę punktów końcowych i zsumowaną długość gałęzi) przez liczbę somy mikrogleju na odpowiednim obrazie. Wprowadź dane końcowe (punkty końcowe/długość komórki i gałęzi/komórkę) do oprogramowania statystycznego.
       UWAGA: Zsumowana długość gałęzi/dane komórki mogą wymagać konwersji z długości w pikselach na mikrony.

5. Analiza fraktalna

UWAGA: FracLac jest w stanie przeprowadzić wiele różnych analiz kształtu, które nie są objęte tym protokołem. Bardziej szczegółowe wyjaśnienie różnych funkcji FracLac można znaleźć w podręczniku FracLac na i powiązanych odnośnikach ^2,16,19. Analiza fraktalna wykorzystuje kroki protokołu 4.1-4.7 opisane powyżej.

1. Określ wielkość zwrotu z inwestycji, który będzie używany do wszystkich analiz fraktalnych. Użyj narzędzia prostokąta, aby narysować ROI. Upewnij się, że pole jest wystarczająco duże, aby przechwycić całą komórkę i może pozostać spójne w całym zestawie danych.
   UWAGA: Użyj zaznaczenia prostokąta, a nie zaznaczenia odręcznego, aby upewnić się, że wszystkie ROI są prostokątem tego samego rozmiaru, a zatem komórki mają tę samą skalę. Nie miałoby to miejsca, gdyby użyto zaznaczenia odręcznego, ponieważ ImageJ automatycznie przeskaluje kwadratowy zwrot z inwestycji, aby dopasować go do prostokątnych okien o różnych rozmiarach, co spowoduje powstanie komórek o różnych skalach. Podczas gdy kształty fraktalne są niezależne od skali, proces analizy fraktalnej przy użyciu FracLac dla ImageJ jest zależny od scale¹⁶. W związku z tym istnieje potrzeba spójnego zwrotu z inwestycji w całym procesie gromadzenia danych.
2. Losowo wybierz mikroglej do analizy fraktalnej na każdym zdjęciu mikrofotografii i odpowiadającym jej obrazie binarnym. W oknie Menedżer zwrotu z inwestycji wybierz opcję Aktualizuj, aby zablokować zwrot akcji w pozycji komórki. Użyj Ctrl + Shift + D, aby zduplikować obszar w ROI jako nowe okno, a następnie zapisz przyciętą komórkę. Na odpowiednim obrazie binarnym (z analizy szkieletu) zduplikuj obszar z tą samą komórką za pomocą menedżera ROI. Powtarzaj, aż wystarczająca liczba komórek zostanie losowo wybrana do analizy fraktalnej i zapisz wszystkie pliki.
   UWAGA: Generator liczb losowych i siatka numerowana mogą być używane do losowego wybierania komórek.
3. Otwórz obraz binarny z pojedynczą komórką. Kliknij dwukrotnie narzędzie pędzla, ustaw kolor na i dostosuj szerokość pędzla zgodnie z potrzebami. Używając pasującej mikrofotografii jako odniesienia, użyj pędzla, aby usunąć sąsiednie procesy komórkowe, połączyć pofragmentowane procesy i wyizolować komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Po odizolowaniu komórki binarnej zapisz plik binarny.
   UWAGA: Przytrzymanie "alt" spowoduje przełączenie pędzla z koloru pierwszego planu () na kolor tła (biały).
4. Przekonwertuj komórkę binarną na kontur za pomocą paska narzędzi za pomocą opcji Proces | Binarny | konspekt.
   UWAGA: FracLac dla obrazu J może być używany zarówno do brył, jak i konturów kształtów, jednak obecna konwencja to używanie konturów kształtów¹⁶.
5. Na pasku narzędzi otwórz FracLac za pomocą paska narzędzi, klikając Wtyczki | Analiza fraktalna | FracLac i wybierz BC (zliczanie pól). W ustawieniach projektu siatki ustaw wartość Num G na 4. W obszarze Opcje grafiki zaznacz pole Metryki, aby przeanalizować wypukłą powłokę i okrąg ograniczający komórki. Po zakończeniu wybierz przycisk OK.
   UWAGA: Liczba G to liczba orientacji siatki liczenia pudełek używanych podczas skanowania, a zalecany zakres dla Num G to 4-12. Ustawienie Num G i sugerowany zakres są dokładnie sprawdzone w FracLac manual¹⁶. Zwiększenie liczby G może znacznie spowolnić czas obliczeń. Ustawienia FracLac należy skonfigurować tylko raz na sesję. Po wprowadzeniu ustawień przycisk Skanuj stanie się dostępny.
6. Wybierz przycisk Skanuj, aby uruchomić skanowanie zliczania pól na wybranym obrazie.
   UWAGA: Skanowanie wygeneruje trzy okna z danymi wyjściowymi: Wyniki kadłuba i okręgu, plik podsumowania liczby pól i typy skanowania. Okno Typy skanowania zawiera dziennik zastosowanych ustawień, a także odchylenia standardowe dla określonych miar. Na potrzeby tego protokołu okno Typy skanowania nie jest używane i może zostać zamknięte lub zapisane do wykorzystania w przyszłości.
7. W oknie Wyniki kadłuba i okręgu skopiuj wszystkie żądane dane (tj. gęstość, współczynnik rozpiętości i kołowość). W oknie Podsumowanie liczby pól skopiuj żądane wyniki danych (tj. wymiaru fraktalnego i lacunarności). Przenieś skopiowane dane do pliku Excel lub programu statystycznego.
   UWAGA: Pełna lista danych wyjściowych FracLac znajduje się i jest dokładnie wyjaśniona w FracLac for ImageJ manual¹⁶.

Wyniki

Opisane tutaj protokoły analizy morfologii mikrogleju podsumowują kroki pomocne w przetwarzaniu mikrofotografii fluorescencyjnych i DAB do analizy morfometrycznej. Kroki te są wizualnie podsumowane w Rysunek 2 i Rysunek 3. Celem tych etapów jest stworzenie reprezentatywnego obrazu binarnego i szkieletowego, który odpowiednio modeluje oryginalną mikrofotografię, tak aby zgromadzone dane były prawidłowe. Po zastosowaniu protokołu wtyczka AnalyzeSkeleton powoduje utworzenie oznaczonego obrazu szkieletu, z którego można podsumować liczbę punktów końcowych i długość gałęzi (tj. procesu) z wynikowych plików wyjściowych. Dane dotyczące punktów końcowych i długości procesu są następnie wykorzystywane do oszacowania zakresu rozgałęzień mikrogleju na mikrofotografii lub ROI. Rysunek 4 podsumowuje dane wynikowe (punkty końcowe/długość komórki i procesu/komórka) zebrane za pomocą i bez aplikacji protokołu. Chociaż istnieją podobne trendy, dane podsumowane w Rysunek 4F są mniej zmienne niż te w Rysunek 4E. Ponadto dane te ilustrują zwiększoną czułość wykrywania różnic między grupami po zastosowaniu protokołu. Wreszcie, należy zwrócić uwagę na zmienność między użytkownikami w stosowaniu protokołu. Takie różnice są podsumowane przez Rysunek 5, gdzie ten sam zestaw danych został przeanalizowany przez dwóch niezależnych użytkowników stosujących identyczny protokół, jak podsumowano powyżej.

Dodatkowe dane morfologiczne są zbierane z pojedynczych komórek wyizolowanych z binarnych obrazów utworzonych podczas aplikacji protokołu. Kroki protokołu analizy morfologii mikrogleju przed i przy użyciu wtyczki FracLac są podsumowane w Rysunek 6. Ilustrujemy tę analizę zarówno w tkance nieuszkodzonej (Rysunek 6A), jak i uszkodzonej (Rysunek 6B). Reprezentatywne obrazy binarnej, zarysowanej, wypukłej powłoki/okręgu hermetyzującego i przykładów zliczania pól dla każdej komórki analizowanej z aplikacją protokołu i bez niej są pokazane w Rysunek 6C-F. Obrazy te pomagają zilustrować pochodzenie różnic w danych morfologicznych, które są podsumowane w Rysunek 6G.

Rysunek 1. Ilustracje szkieletowego mikrogleju z okrągłą somą (suboptymalną) w porównaniu z somą pojedynczego pochodzenia (optymalna) i odpowiednią nakładką między szkieletowaną komórką a oryginalną mikrofotografią. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Zastosowanie protokołu do mikrofotografii fluorescencyjnych. Ilustracje protokołu Analizy Szkieletu zastosowanego do fluorescencyjnego mikrofotografii z pojedynczą komórką przyciętą w celu pokazania szczegółów. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Zastosowanie protokołu do mikrofotografii DAB w jasnym polu. Ilustracje protokołu analizy szkieletu zastosowanego do mikrofotografii DAB w jasnym polu z pojedynczą komórką przyciętą w celu pokazania szczegółów. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Analiza danych z aplikacją protokołu i bez niej. (A) Przykładowa mikrofotografia fluorescencyjnego IHC i przyciętej komórki odpowiadającej żółtej ramce w (B). Przykładowe obrazy binarne i szkieletowe z (C) i bez (D) zastosowanym protokołem zgodnie z opisem. Zbiorcze dane dotyczące punktów końcowych mikrogleju/długość komórki i procesu/komórki w nieuszkodzonej (białej) i uszkodzonej (szarej) tkance korowej z (E) i bez (F) zastosowanym protokołem. Analiza statystyczna z wykorzystaniem testu t-Studenta i n = 3, ** oznacza p < 0,01. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Różnice między użytkownikami a zastosowaniem protokołu. Przykład oryginalnej konwersji obrazu i protokołu na obrazy binarne i szkieletowe przez Użytkownika 1 i Użytkownika 2. Różnice między tymi dwoma obrazami są wyróżnione pasującymi kolorowymi kółkami. Wykresy podsumowujące punkty końcowe mikrogleju/długość komórki i procesu/dane dotyczące komórek w nieuszkodzonych i uszkodzonych obszarach mózgu według Użytkownika 1 i Użytkownika 2. Analiza statystyczna z ANOVA i wielkością próby wynosi n = 3; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Podziałka liniowa = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Analiza fraktalna z aplikacją protokołu i bez niej. Przykład przyciętych mikrofotografii mikrogleju w nieuszkodzonej (A) i uszkodzonej (B) korze z odpowiadającymi im obrazami binarnymi (C) i konturowymi (D), które powstają z zastosowanym protokołem i bez niego. Skojarzona wypukła powłoka (niebieska) i otaczający okrąg (różowy) dla odpowiadających im kształtów konturu (E) są używane do obliczania gęstości kształtu, współczynnika rozpiętości i kołowości (G). Metoda liczenia pudełek jest zilustrowana w (F) i używana do obliczeń wymiaru fraktalnego (D_B) i lakunarności (λ) (G). Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Komórki mikrogleju są precyzyjnie dostrojone do fizjologii i patologii w swoich mikrodomenach i wykazują różnorodny zakres morfologii² zarówno w przypadku subtelnych ^7,14, jak i poważnych uszkodzeń⁸. Wykorzystanie protokołów ImageJ sprawia, że kwantyfikacja morfologii mikrogleju jest dostępna dla wszystkich laboratoriów, ponieważ platforma i wtyczki są oprogramowaniem do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym. Podczas gdy opisany protokół koncentruje się na przetwarzaniu i analizie obrazu za pomocą tego oprogramowania, spójność gromadzenia, trafność i niezawodność danych zaczyna się od doskonałego IHC i mikroskopii. Protokół ten służy do poprawy reprezentacji binarnych, szkieletowych i konturowych całych mikrofotografii i pojedynczych komórek, ale nie może zastąpić słabego barwienia IHC i mikroskopii, które skutkują niskim kontrastem, rozmytymi lub zniekształconymi obrazami. Dodatkowo należy zachować ostrożność, aby nie spłaszczyć tkanki mózgowej podczas przechowywania, przed sekcją, co nieodwracalnie zmienia morfologię mikrogleju. Wreszcie, w każdym eksperymencie mikroglej musi być obrazowany przy użyciu tej samej skali, a także tego samego mikroskopu. Oprzyrządowanie, obiektywy i oprogramowanie różnią się w zależności od mikroskopu, co skutkuje różnymi rozmiarami mikrofotografii pomimo podobnych obiektywów i zmienia szczegóły, a także liczbę komórek w każdej klatce. Na przykład akwizycja obrazu za pomocą obiektywu 40X w Leica SPII skutkuje dwukrotnie większą liczbą komórek i mniejszą szczegółowością niż akwizycja przy użyciu Zeiss 880. Jest to szczególnie ważne w przypadku danych rozgałęzień komórek zbieranych z całej ramki, a nie z pojedynczej komórki, ponieważ staje się to kwestią próbkowania danych.

Ogólnie rzecz biorąc, analiza szkieletu, która wykorzystuje cały mikrograf fotograficzny, poprzedza analizę fraktalną pojedynczej komórki z dwóch powodów. Określenie rozgałęzień wszystkich komórek na mikrofotografii jest szybkie w porównaniu z analizą fraktalną pojedynczej komórki i może być uważane za narzędzie przesiewowe, jeśli czynnikiem jest czas. Ponadto obrazy binarne uzyskane podczas analizy szkieletu są wykorzystywane do analizy fraktalnej. Po zobrazowaniu istnieje szereg krytycznych kroków, które mogą wpłynąć na wyniki analizy szkieletu i wprowadzić wpływ użytkownika. Kroki protokołu, które są najbardziej zmienne między użytkownikami, to krok 4.2 (zwiększenie jasności obrazu) i krok 4.5 (określenie progu). Tam, gdzie to możliwe, określona jest optymalna liczba zwiększająca jasność (suwak maks. lub minimalny w zakresie 0-255), która jest utrzymywana na stałym poziomie dla wszystkich obrazów i użytkowników. Tam, gdzie zmienność obrazu jest duża, użytkownik może zamiast tego wybrać jasność, która będzie się różnić między obrazami. Alternatywnie, jeśli obrazy są jasne, a kontrast jest wysoki, można pominąć zwiększanie jasności, a progowanie można ustandaryzować za pomocą specjalnego filtra progowego (np. Huang) zamiast bardziej zmiennego domyślnego. Po zoptymalizowaniu parametry powinny być przestrzegane, aby zminimalizować dodatkowy wpływ użytkownika.

Przykład zmienności użytkownika przedstawiono na rysunku 5. Wartości danych zostały zwiększone w przypadku Użytkownika 1 w porównaniu z Użytkownikiem 2, a zatem zmienność byłaby większa, gdyby zarówno Użytkownik 1, jak i Użytkownik 2 przyczynili się do gromadzenia danych. Przykładem różnic między obrazami binarnymi i szkieletowymi Użytkownik 1 i Użytkownik 2 są kolorowe kółka (Rysunek 5). W tym przypadku obaj użytkownicy byli krótko przeszkolonymi studentami studiów licencjackich z ograniczoną wiedzą specjalistyczną w zakresie mikrogleju. Regularny nadzór i mentoring ze strony eksperta w dziedzinie mikrogleju wraz ze zwiększonym szkoleniem w zakresie protokołu² mogą zmniejszyć zmienność między użytkownikami. Chociaż nie zostało to tutaj ocenione, analiza fraktalna jest mniej podatna na zmienność między użytkownikami, ponieważ komórki binarne są ręcznie i indywidualnie izolowane z mikrofotografii fotograficznej, a nie polegają wyłącznie na progach w celu określenia kształtów mikrogleju. Jednak wszystkie metody mają pewną zmienność między użytkownikami. W związku z tym pojedynczy użytkownik (najlepiej przeszkolony w zakresie komórek mikrogleju) powinien ukończyć zbieranie danych dla całego zestawu danych.

Dodatkowe modyfikacje tego protokołu można łatwo wprowadzić i będą one zależeć od jakości obrazu oraz wysiłków podjętych w celu zmniejszenia szumów i zapewnienia łączności procesowej. Na przykład, jeśli kontrast jest odpowiedni, maska wyostrzająca nie jest konieczna i można ją pominąć. Rozsądnie jest zoptymalizować i sfinalizować protokół dla określonego zestawu obrazów, zarówno przypadków eksperymentalnych, jak i kontrolnych, przed zebraniem danych z całego zestawu. Wreszcie, dodatkowe wtyczki mogą być używane zamiast innych w celu wyjaśnienia lub wyostrzenia obrazów, które nie zostały opisane w tym protokole, takich jak rozszerzanie lub wyostrzanie.

Zaletami tego protokołu są jego uniwersalna dostępność i możliwość adaptacji. Ponadto ocena rozgałęzienia komórek za pomocą AnalyzeSkeleton jest szybka i ma zastosowanie do całego mikrozdjęcia fotograficznego. Zaletą podejścia opartego na analizie wielokomórkowej jest skupienie się na całym regionie, a nie na pojedynczych komórkach. W związku z tym możliwa jest szybka ocena średnich rozgałęzień (pod względem punktów końcowych i długości procesu) wszystkich mikrogleju w obrazie. Analiza szkieletowa zapewnia analizę wielu komórek: próbkowanie danych pod względem liczby komórek, których nie można dopasować za pomocą analizy fraktalnej ze względu na wymaganą inwestycję czasową w celu wyizolowania pojedynczych komórek z mikrofotografii. Przykładem, w którym może to być najbardziej odpowiednie, byłoby badanie przesiewowe morfologii mikrogleju w pobliżu urazu ogniskowego. Jednym z ograniczeń jest to, że renderowanie obrazu całego pola w celu stworzenia modeli szkieletowych mikrofotografii IHC jest niedoskonałe w porównaniu z bardziej czasochłonnym podejściem opartym na pojedynczej komórce. Ponadto analiza regionów nie jest odpowiednia w okolicznościach, w których morfologie mikrogleju drastycznie różnią się w tej samej dziedzinie. Wreszcie, ta metoda analizy zależy od liczby komórek, parametru, który może się różnić w zależności od warunków eksperymentalnych.

Analiza fraktalna jest przeprowadzana na pojedynczej komórce, a zatem uzupełnia średnie dane wyjściowe rozgałęzienia komórki wynikające z analizy szkieletu. Chociaż inwestycja ta jest znacznie bardziej czasochłonna, pozwala uzyskać szeroki zakres danych morfometrycznych. Na przykład dane dotyczące gęstości komórek, współczynnika rozpiętości i kołowości opisują odpowiednio rozmiar, wydłużenie i kształt konturu komórki. Wymiar fraktalny i lakunarność podsumowują odpowiednio złożoność komórki i niejednorodność kształtu. Bardziej szczegółowe podsumowanie sposobu obliczania każdego parametru i interpretacji danych znajduje się w interaktywnym podręczniku¹⁶ i takie szczegóły należy rozważyć w odniesieniu do konkretnego pytania badawczego. Opisany protokół dostarcza czułych narzędzi do ilościowego określania niewielkich zmian w morfologii 2D mikrogleju, które mogą wystąpić w stanach fizjologicznych i patologicznych. Dodatkowa analiza morfometryczna, taka jak solidność, wypukłość i współczynnik kształtu^16,20, może być możliwa w przypadku generowania kształtów 3D.

Opracowywanie i adaptacja protokołów jest ciągła i sterowana przez użytkownika. Został on rozszerzony z fluorescencji⁸ na obrazy DAB/jasnego pola⁷, ale jeszcze nie na tkankę zatopioną w parafinie. Ponadto może być używany w połączeniu z zastrzeżonym oprogramowaniem, takim jak Imaris do dodatkowej analizy. Protokół ten może być stosowany do różnych rodzajów fizjologii i nie ogranicza się do mikrogleju, ale może być stosowany do dowolnej komórki lub tkanki o określonych wzorach lub kształtach, które można zidentyfikować za pomocą metod IHC. Wreszcie, przy wystarczającej wielkości próby, można zastosować analizę wielowymiarową lub skupień w celu stratyfikacji mikrogleju zgodnie z morfologią^12,21; Jest to istotna informacja, ponieważ morfologia mikrogleju jest istotnym wskaźnikiem funkcji mikrogleju i jego reakcji na otoczenie. Uznanie dla różnorodności morfologicznej mikrogleju rośnie i jest ważne, aby w pełni zrozumieć interakcje neuron-glej-naczyniowy w okresie zdrowia i choroby. Wzrost w tej dziedzinie jest wzmocniony przez dobrze opracowane, łatwe w użyciu i powtarzalne protokoły do ilościowego określania i podsumowywania morfologii mikrogleju przy użyciu wielu zmiennych ciągłych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
przeciwciało pierwszorzędowe anty-IBA1	Wako	019-19741	królik gospodarz
Vectashield miękki montaż	Vector Labs	H-1000
Przeciwciało wtórne	Jackson ImmunorResearch	711-545-152	gospodarz osła
4 ml szklana fiolka	Wheaton	UX-08923-11
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Azydek sodu (NaN3)	Sigma	S-8032
	Fisher Scientific	12-544-G