Method Article

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

DOI:

10.3791/57651

⸱

June 13th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, aktywacja, proliferacja i funkcja komórek odpornościowych zachodzą w trójwymiarowym (3D) środowisku, na przykład w węzłach chłonnych lub tkankach. Do tej pory większość systemów in vitro opiera się na dwuwymiarowych (2D) powierzchniach, takich jak płytki do hodowli komórkowych lub szkiełka nakrywkowe. Aby optymalnie naśladować warunki fizjologiczne in vitro, wykorzystujemy prostą matrycę kolagenową 3D. Kolagen jest jednym z głównych składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i jest szeroko stosowany do tworzenia matryc 3D. W przypadku obrazowania 3D niedawno opracowana technologia mikroskopii świetlnej (określana również jako mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego) charakteryzuje się wysoką szybkością akwizycji, dużą głębokością penetracji, niskim bieleniem i fotocytotoksycznością. Ponadto mikroskopia arkuszowa jest szczególnie korzystna w przypadku pomiarów długotrwałych. Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół konfiguracji i postępowania z ludzkimi komórkami odpornościowymi, np. pierwotnymi ludzkimi cytotoksycznymi limfocytami T (CTL) i komórkami NK (Natural Killer) w matrycy kolagenowej 3D do stosowania z mikroskopią świetlną do obrazowania żywych komórek i utrwalonych próbek. Przedstawiono procedurę pozyskiwania obrazów i analizy migracji komórek. Szczególny nacisk położono na podkreślenie krytycznych etapów i czynników związanych z przygotowaniem próbki i analizą danych. Protokół ten może być stosowany do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy kolagenowej 3D i nie ogranicza się do komórek odpornościowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość wiedzy na temat migracji komórek pochodzi z eksperymentów 2D1,2,3, które zwykle przeprowadza się na szklanej lub plastikowej powierzchni naczynia do hodowli/obrazowania. Jednak scenariusz fizjologiczny wymaga w większości przypadków mikrośrodowiska 3D, w którym macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa decydującą rolę. ECM nie tylko zapewnia strukturę 3D niezbędną do utrzymania prawidłowej morfologii komórki, ale także oferuje sygnały przetrwania lub wskazówki kierunkowe dla optymalnego funkcjonowania wielu komórek4,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przeprowadzone na tym badaniu na materiale ludzkim (komory systemu redukcji leukocytów od ludzkich dawców krwi) są autoryzowane przez lokalną komisję etyki (oświadczenie z 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) i są zgodne z odpowiednimi wytycznymi.

1. Przygotowanie zneutralizowanego roztworu kolagenu (500 μL)

  1. Przenieść 400 μl schłodzonego roztworu podstawowego kolagenu (10,4 mg/ml) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml pod kapturem hodowli komórkowej. Powoli dodawać 50 μL schłodzonego 10x PBS (pH 7,0 - 7,3) do 400 μL schłodzonego roztworu wyjściowego kolagenu. Wymieszaj roztwór, delikatnie układając rurkę w ka....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powstawanie wypukłości podczas migracji limfocytów T jest bardzo dynamicznym procesem, który jest zależny od aktyny. Aby zobrazować powstawanie wypukłości pierwotnego ludzkiego CTL, przejściowo transfekowaliśmy skondensowane białko mEGFP, aby oznaczyć cytoszkielet aktynowy w CTL, jak opisano wcześniej11. Dzień po transfekcji komórki zostały osadzone w macierzy kolagenowej. Stosy obrazów były rejestrowane co 40 s z krokiem 1 μm w temperaturze 37 °C przy użyciu mikro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość testów in vitro przeprowadza się na powierzchni 2D, na przykład na płytkach do hodowli komórkowych, szalkach Petriego lub na szkiełkach nakrywkowych, podczas gdy komórki in vivo, zwłaszcza komórki odpornościowe, doświadczają głównie mikrośrodowiska 3D. Pojawiające się dowody wskazują, że wzorce migracji komórek odpornościowych różnią się między scenariuszami 2D i3D 17. Co więcej, profile ekspresji komórek nowotworowych są również różne w tkankach hodowanych w 2D i 3D 18.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak finansowego lub handlowego konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Instytutowi Hemostaseologii Klinicznej i Medycyny Transfuzjologicznej za dostarczenie krwi dawcy; Carmen Hässig i Corze Hoxha za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy Jensowi Rettigowi (Uniwersytet Kraju Saary) za zmodyfikowany wektor pMAX, Rolandowi Wedlichowi-Söldnerowi (Uniwersytet w Münster) za oryginalny konstrukt LifeAct-Ruby oraz Christianowi Junkerowi (Uniwersytet Kraju Saary) za wygenerowanie konstrukcji LifeAct-mEGFP. Projekt ten został sfinansowany przez Sonderforschungsbereich 1027 (projekt A2 do B.Q.) i 894 (projekt A1 do M.H.). Mikroskop z arkuszami świetlnymi został sfinansowany przez DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol, roztwór kolagenu bydlęcegoZaawansowany Biomatrix #5133-20MLMatryca kolagenowa
0,5 M Roztwór NaOHMerck1091381000do neutralizacji roztworu Fibricol
Agaroza o ultra niskiej temperaturze topnieniaAffymetrix32821-10GMniskiej zawartości c[Col]
DynabeadsThermo Fisher11348DIzolacja pierwotnych ludzkich limfocytów T CD8+ z PBMC
Dynabeads Ludzki aktywator T CD3 / CD28 do ekspansji i aktywacji limfocytówT Thermo Fisher11132DAktywacja populacji CTL
Ludzka rekombinowana interleukina-2Thermo FisherPHC0023Stymulacja hodowanego CTL
P3 Zestaw roztworu pierwotnegoTransfekcja
Lonza V4XP-30XXPrzeciwciało α-PFN1, królik, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Pomarańczowy Barwnik błony plazmatycznejThermo FisherC10045Etykieta komórek fluorescencyjnych
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's fospsphat buforowana solą fizjologicznąThermo Fisher14190250IF
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA9418-100GIF
Koza i alfa; Królik 568, IgG, królikThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (mikroskopia z jasnym arkuszem)ZeissN.A.
Kaptur do hodowli komórkowychThermo FisherHeraSafe KS
Inkubator do hodowli komórkowych HERACell 150i Thermo FisherN.A.
Wirówki 5418 i 5452EppendorfN.A.
PippettesEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
Końcówki do pipetekVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
Probówki 15 mlSarstedt  62.554.002
Kapilary 50 &mikro; LVWR (Marka)613-3373Przygotowanie próbek Zeiss LSFM
Tłok do kapilarVWR (Marka)BRND701934"Stemple z końcówką teflonową" Przygotowanie próbki LSFM
Próbki MColorPhast Próbki pH1095430001Merckdo badania pH zneutralizowanych
strzykawek Fibricol BD Plastipak 1 mlBDZ230723  ALDRICHAlternatywne przygotowanie próbki
Plastelina (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Konwerter plików ImarisBitplanedostępny pod adresem http://www.bitplane.com Konwertuj pliki obrazowania do formatu pliku Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplanedostępny pod adresem http://www.bitplane.com Analiza danych obrazowych 3D i 4D
Przygotowanie próbki w nietkniętych ludzkich komórkach T CD8 o

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Light sheet Microscopy3D Collagen MatrixHuman Immune CellsCell Migration TrackingSample PreparationImage AcquisitionLive Cell ImagingFixed Sample AnalysisCytotoxic T LymphocytesNatural Killer Cells

Related Articles