Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57651

⸱

13 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Streszczenie

In vivo, aktywacja, proliferacja i funkcja komórek odpornościowych zachodzą w trójwymiarowym (3D) środowisku, na przykład w węzłach chłonnych lub tkankach. Do tej pory większość systemów in vitro opiera się na dwuwymiarowych (2D) powierzchniach, takich jak płytki do hodowli komórkowych lub szkiełka nakrywkowe. Aby optymalnie naśladować warunki fizjologiczne in vitro, wykorzystujemy prostą matrycę kolagenową 3D. Kolagen jest jednym z głównych składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i jest szeroko stosowany do tworzenia matryc 3D. W przypadku obrazowania 3D niedawno opracowana technologia mikroskopii świetlnej (określana również jako mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego) charakteryzuje się wysoką szybkością akwizycji, dużą głębokością penetracji, niskim bieleniem i fotocytotoksycznością. Ponadto mikroskopia arkuszowa jest szczególnie korzystna w przypadku pomiarów długotrwałych. Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół konfiguracji i postępowania z ludzkimi komórkami odpornościowymi, np. pierwotnymi ludzkimi cytotoksycznymi limfocytami T (CTL) i komórkami NK (Natural Killer) w matrycy kolagenowej 3D do stosowania z mikroskopią świetlną do obrazowania żywych komórek i utrwalonych próbek. Przedstawiono procedurę pozyskiwania obrazów i analizy migracji komórek. Szczególny nacisk położono na podkreślenie krytycznych etapów i czynników związanych z przygotowaniem próbki i analizą danych. Protokół ten może być stosowany do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy kolagenowej 3D i nie ogranicza się do komórek odpornościowych.

Wprowadzenie

Większość wiedzy na temat migracji komórek pochodzi z eksperymentów 2D1,2,3, które zwykle przeprowadza się na szklanej lub plastikowej powierzchni naczynia do hodowli/obrazowania. Jednak scenariusz fizjologiczny wymaga w większości przypadków mikrośrodowiska 3D, w którym macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) odgrywa decydującą rolę. ECM nie tylko zapewnia strukturę 3D niezbędną do utrzymania prawidłowej morfologii komórki, ale także oferuje sygnały przetrwania lub wskazówki kierunkowe dla optymalnego funkcjonowania wielu komórek4,5 . Dlatego środowisko 3D jest wymagane, aby lepiej identyfikować funkcje i zachowanie komórek w środowisku lepiej odzwierciedlającym kontekst fizjologiczny.

W ludzkim ciele, większość komórek, zwłaszcza komórek odpornościowych, pełni swoje funkcje w scenariuszu 3D. Na przykład aktywowane limfocyty T patrolują tkanki w poszukiwaniu komórek docelowych, naiwne limfocyty T migrują przez węzły chłonne w poszukiwaniu pokrewnych komórek prezentujących antygen, podczas których tryb migracji i maszyneria są przystosowane do odpowiedniego środowiska zewnątrzkomórkowego3,6,7. Żel kolagenowy 3D jest szeroko stosowany jako dobrze znany i dobrze scharakteryzowany system hodowli komórek 3D8,9,10. Nasze poprzednie badania pokazują, że pierwotne ludzkie limfocyty są wysoce mobilne i migrują ze średnią prędkością około 4,8 μm/min w 0,25% 11. Rearanżacja cytoszkieletu odgrywa kluczową rolę w migracji komórek12. Coraz więcej dowodów wskazuje, że limfocyty nie stosują tylko jednego trybu migracji, ale mogą przełączać się między pewnymi zachowaniami migracyjnymi w zależności od lokalizacji, mikrośrodowiska, cytokin, gradientów chemotaktycznych i sygnałów zewnątrzkomórkowych, które dostrajają zachowanie migracyjne na różne sposoby 3.

Aby wiarygodnie analizować funkcje i zachowanie komórek odpornościowych, na przykład migrację, tworzenie wypukłości lub transport pęcherzykowy, bardzo korzystne jest możliwość pozyskiwania obrazów w stosunkowo dużych objętościach 3D w szybki i niezawodny sposób. W przypadku obrazowania 3D niedawno opracowana technologia mikroskopii z arkuszami świetlnymi (określana również jako mikroskopia oświetlenia jednopłaszczyznowego) oferuje zadowalające rozwiązanie13,14. Podczas akwizycji obrazowania generowany jest cienki statyczny arkusz światła w celu oświetlenia próbki. W ten sposób na płaszczyźnie ostrości duży obszar może być oświetlony jednocześnie bez wpływu na komórki poza płaszczyzną. Ta cecha umożliwia wysoką szybkość akwizycji przy drastycznie zmniejszonym wybielaniu i fotocytotoksyczności. W tym artykule opisujemy, jak wizualizować pierwotne ludzkie komórki odpornościowe za pomocą mikroskopii świetlnej oraz jak analizować migrację w scenariuszu 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania przeprowadzone na tym badaniu na materiale ludzkim (komory systemu redukcji leukocytów od ludzkich dawców krwi) są autoryzowane przez lokalną komisję etyki (oświadczenie z 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) i są zgodne z odpowiednimi wytycznymi.

1. Przygotowanie zneutralizowanego roztworu kolagenu (500 μL)

  1. Przenieść 400 μl schłodzonego roztworu podstawowego kolagenu (10,4 mg/ml) do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml pod kapturem hodowli komórkowej. Powoli dodawać 50 μL schłodzonego 10x PBS (pH 7,0 - 7,3) do 400 μL schłodzonego roztworu wyjściowego kolagenu. Wymieszaj roztwór, delikatnie układając rurkę w kafelkach.
    Uwaga: Wszystkie czynności opisane w części 1 należy wykonywać pod kapturem do hodowli komórkowych.
  2. Dodać 8 μl 0,1 M NaOH do 500 μl roztworu kolagenu z 1.1. w celu dostosowania pH do 7,2-7,6. Użyj pasków testowych pH (zakres pH: 6 - 10), aby określić wartość pH mieszaniny.
    Uwaga: Objętości mogą się różnić dla różnych partii kolagenu. Roztwór NaOH należy mieszać powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Mieszaninę należy przechowywać na lodzie, aby uniknąć żelowania kolagenu.
  3. Dodać 2 μl sterylnego ddH2O, aby uzyskać ostateczną objętość do 500 μL. Dobrze wymieszać i przechowywać ten roztwór kolagenu (8,32 mg/mL) na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
    Uwaga: W tym stanie zneutralizowany kolagen może być stosowany przez 24 godziny. Nie zaleca się stosowania podwielokrotności, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

2. Przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem kapilar

  1. Oznacz fluorescencyjnie interesujące Cię żywe komórki żądanymi pierwotnymi barwnikami fluorescencyjnymi15 lub fluorescencyjnymi białkami11, jak opisano wcześniej.
  2. Przenieś 1 × 106 komórek do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml pod kapturem do hodowli komórkowych. Odwirować probówkę o sile 200 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl pożywki hodowlanej.
    Uwaga: Gęstość komórek 5 × 106 komórek/ml jest zalecana do wizualizacji migracji ludzkich komórek odpornościowych, szczególnie dla cytotoksycznych limfocytów T (CTL) i komórek NK (NK).
  3. Dodać 85,9 μl zneutralizowanego roztworu kolagenu z 1.3. do zawiesiny komórkowej z 2.2. i odpowiednio wymieszać, aby osiągnąć stężenie kolagenu 2,5 mg/ml. Pozostaw mieszankę komórkowo-kolagenową na lodzie w kapturze.
    Uwaga: Załóżmy, że pożądane stężenie kolagenu wynosi N mg/ml, objętość zobojętnionego roztworu kolagenu (dla 200 μl zawiesiny komórek) = 200 × N/(8,32 - N)
  4. Następnie umieść pasujący tłok w kapilarze (średnica wewnętrzna ~1 mm), aż tłok znajdzie się 1 mm poza kapilara. Zwilżyć tłok, zanurzając go w pożywce hodowlanej (Rysunek 1A).
    Uwaga: Ten krok może pomóc w zapobieganiu powstawaniu pęcherzyków powietrza, gdy naczynia włosowate są zanurzone w mieszance komórkowo-kolagenowej. Kapilara i tłok nie muszą być sterylne.
  5. Zanurz naczynia włosowate w mieszance komórkowo-kolagenowej z 2.3. Powoli odciągnąć tłok na 10 - 20 mm (Rysunek 1B). Wytrzyj zewnętrzną ścianę kapilary ręcznikiem papierowym zwilżonym sprayem z 70% etanolem, aby usunąć pozostały roztwór kolagenu.
  6. Zamontuj kapilarnę z plasteliną na wewnętrznej ściance probówki o pojemności 5 ml i popchnij mieszankę komórkowo-kolagenową do krawędzi naczynia włosowatego (Rysunek 1C).
  7. Utrzymuj kapilatę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 godzinę w celu polimeryzacji kolagenu.
  8. Dodać pożywkę hodowlaną (około 1 - 2 ml) do probówki o pojemności 5 ml. Ostrożnie wciśnij spolimeryzowany pręt kolagenowy do około 3/4 kolagenu wiszącego w pożywce (Rysunek 1D).
  9. Utrzymuj kapilarę, w ten sposób, w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 30 minut, aby zrównoważyć pręcik kolagenowy z podłożem.
    Uwaga: Następnie pręt kolagenowy można wciągnąć z powrotem do naczynia włosowatego i dalej hodować przed dalszym użyciem.

3. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii arkuszowej

  1. Zmontuj komorę na próbkę zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Włączyć inkubację i mikroskop, aby podgrzać komorę próbki do 37 °C (tylko do obrazowania żywych komórek).
  3. Umieść kapilarnę w komorze na próbkę i zlokalizuj próbkę, aby znaleźć obszar zainteresowania do akwizycji obrazu.
  4. Aktywuj odpowiednie lasery. Ustaw następujące ustawienia: moc lasera, czas ekspozycji, rozmiar kroku stosu z, pozycja początkowa i końcowa stosu z oraz przedział czasu obrazowania komórek na żywo.
    Uwaga: Na przykład próbka w Rysunek 2 była obrazowana co 40 s przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z krokiem 1 μm (całkowita grubość: 538 μm). Moc lasera wynosiła 1% przy czasie naświetlania 30 ms. Rozmiar piksela w kierunku x-y wynosi 0,23 μm.
  5. Rozpocznij pobieranie obrazu.

4. Automatyczna analiza śledzenia

  1. Otwórz konwerter plików, kliknij przycisk Dodaj pliki, aby wybrać pliki obrazowania, które mają zostać przekonwertowane na format pliku oprogramowania (*.ims). Kliknij przycisk Przeglądaj i wybierz folder, w którym chcesz zapisać przekonwertowane pliki. Kliknij przycisk Rozpocznij wszystko.
  2. Otwórz oprogramowanie do analizy. Kliknij przycisk Przesuń. Przejdź do Plik i kliknij Otwórz, a następnie wybierz plik obrazowania do analizy.
    Uwaga: Jeśli rozmiar pliku jest duży, ten krok może zająć trochę czasu. Pliki większe niż 1 terabajt (TB) nie są zalecane do pojedynczego eksperymentu, ponieważ proces tak dużych plików wymaga dużej mocy obliczeniowej.
  3. Kliknij Dodaj nowe miejsca. Zaznacz pole Na koniec przetwórz cały obraz. Kliknij Dalej.
  4. Wprowadź współrzędne x i y (w pikselach), aby zdefiniować obszar zainteresowania. Wprowadź liczbę klatek (czas i pozycja z) do analizy. Kliknij Dalej.
  5. Wybierz kanał docelowy, który zawiera obiekty, które mają być śledzone, z listy rozwijanej kanału źródłowego. Wprowadź szacowaną średnicę xy (w μm). Kliknij Dalej.
    Uwaga: Szacowana średnica xy to średnia średnica w wymiarze x-y obiektów, które mają być śledzone.
  6. Kliknij opcję Jakość. Ustaw próg, w którym ma zostać uwzględniona większość komórek (obiektów). Kliknij Dalej.
  7. Wybierz żądany algorytm (zalecany jest ruch autoregresyjny). Wprowadź maksymalną odległość (zalecane 20 μm) i maksymalny rozmiar szczeliny (zalecane 3 lub 2). Kliknij Przetwarzaj cały obraz w końcu.
    Uwaga: Maksymalna odległość i maksymalny rozmiar odstępu to dwa progi przerywania ścieżek. Dokładniej mówiąc, w dwóch ciągłych klatkach, gdy odległość między tym samym obiektem przekracza odległość maksymalną, ten obiekt w późniejszej klatce będzie traktowany jako nowy obiekt. Czasami podczas akwizycji ten sam obiekt może zniknąć na kilka klatek i pojawić się ponownie. W takim przypadku tylko wtedy, gdy ten obiekt pojawi się ponownie w polu Maksymalny rozmiar odstępu, zostanie uznany za ten sam obiekt.
  8. Kliknij Typ filtru i wybierz opcję wykluczenia niepożądanych ścieżek.
    Uwaga: Ten krok jest opcjonalny.
  9. Kliknij przycisk Dalej, a następnie kliknij przycisk Zakończ.
    Uwaga: Ten krok może potrwać od kilku godzin do kilku dni, w zależności od wydajności komputera.
  10. Kliknij Edytuj ścieżki i wybierz opcję Popraw dryf. Wybierz odpowiedni algorytm (zalecany jest dryf translacyjny). Wybierz żądany rozmiar wynikowego zestawu danych (zalecany jest nowy rozmiar równy bieżącemu rozmiarowi). Kliknij przycisk OK.
    Uwaga: Ten krok jest wymagany tylko wtedy, gdy kolagen dryfował podczas akwizycji obrazu.
  11. Kliknij przycisk Statystyka i wybierz opcję Konfiguruj listę widocznych wartości statystyk. Zaznacz interesujące Cię opcje, które chcesz wyeksportować (np. współrzędne, prędkość itp.). Kliknij przycisk OK.
  12. Kliknij opcję Eksportuj wszystkie statystyki do pliku i wprowadź nazwę pliku.

5. Utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne komórek w matrycach kolagenowych

  1. Przenieś 1 000 μl 4% paraformaldehydu (PFA, w PBS) do probówki o pojemności 5 ml pod kapturem chemicznym.
    Uwaga: PFA powinien być zrównoważony do temperatury pokojowej.
  2. Zanurz kapilarnę ze spolimeryzowanym kolagenem z 2,9. w roztworze PFA (dla ~ 5 mm) i zamontuj kapilarnę na wewnętrznej ściance probówki 5 ml z plasteliną (jak pokazano na Rysunek 1C).
  3. Delikatnie naciśnij tłok, aż połowa pręta kolagenowego będzie zwisać w roztworze PFA (Rysunek 1D). Utrzymuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  4. Odciągnąć tłok, aby włożyć pręt kolagenowy do wnętrza naczynia włosowatego. Wyjmij kapilarnę i wyrzuć PFA.
  5. Zamontuj kapilar w świeżej probówce i dodaj 1 ml PBS. Upewnij się, że kapilara jest zanurzona w PBS.
  6. Delikatnie naciśnij tłok, aż połowa pręcika kolagenowego będzie zwisać w roztworze. Zamontuj kapilarnę na wewnętrznej ścianie za pomocą plasteliny.
  7. Trzymaj probówkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  8. Powtórzyć 5,4. - 5,7 przez kolejne 2 razy.
  9. Odciągnąć tłok, aby włożyć pręt kolagenowy do wnętrza naczynia włosowatego. Odrzuć PBS. Przenieść 1 - 2 ml buforu blokującego/permeabilizacyjnego (PBS + 1-% BSA + 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego) do probówki i powtórzyć 5.6.
    Uwaga: BSA (1%) można zastąpić 5% surowicą zwierzęcia, w którym hodowano wtórne Ab.
  10. Trzymaj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 - 60 minut.
  11. Odciągnąć tłok, aby włożyć pręt kolagenowy do wnętrza naczynia włosowatego. Odrzucić bufor przepuszczalności. Przenieść 200 - 500 μl przeciwciała pierwszorzędowego do buforu blokującego/permeabilizacyjnego i wydalić pręcik do roztworu.
  12. Trzymaj probówkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  13. Przemyć pałeczkę kolagenową 3 razy PBST (PBS + 0,1% niejonowy środek powierzchniowo czynny), jak opisano w 5.4. - 5.8.
  14. Inkubować pręcik w przeciwciałie drugorzędowym w buforze blokującym/permeabilizacyjnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Trzymaj go z dala od światła.
  15. Przemyć pałeczkę kolagenową 3 razy PBS, jak opisano w 5.4. - 5.8.
  16. Odciągnąć tłok, aby włożyć pręt kolagenowy do wnętrza naczynia włosowatego. Próbki należy przechowywać w PBS do czasu obrazowania.
  17. Zeskanuj próbki zgodnie z opisem w punkcie 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tworzenie wypustek podczas migracji limfocytów T jest procesem wysoce dynamicznym i zależnym od aktyny. Aby zwizualizować tworzenie wypustek w pierwotnych ludzkich CTL, przeprowadziliśmy przejściową transfekcję białka fuzyjnego mEGFP w celu oznakowania cytoszkieletu aktynowego w CTL, zgodnie z wcześniej opisaną procedurą.11Dzień po transfekcji komórki zatopiono w macierzy kolagenowej. Serie obrazów (stacki) pozyskiwano co 40 s z krokiem wynoszącym 1 µm w 37 °C z wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość testów in vitro przeprowadza się na powierzchni 2D, na przykład na płytkach do hodowli komórkowych, szalkach Petriego lub na szkiełkach nakrywkowych, podczas gdy komórki in vivo, zwłaszcza komórki odpornościowe, doświadczają głównie mikrośrodowiska 3D. Pojawiające się dowody wskazują, że wzorce migracji komórek odpornościowych różnią się między scenariuszami 2D i3D 17. Co więcej, profile ekspresji komórek nowotworowych są również różne w tkankach hodowanych w 2D i 3D 18...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak finansowego lub handlowego konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Instytutowi Hemostaseologii Klinicznej i Medycyny Transfuzjologicznej za dostarczenie krwi dawcy; Carmen Hässig i Corze Hoxha za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy Jensowi Rettigowi (Uniwersytet Kraju Saary) za zmodyfikowany wektor pMAX, Rolandowi Wedlichowi-Söldnerowi (Uniwersytet w Münster) za oryginalny konstrukt LifeAct-Ruby oraz Christianowi Junkerowi (Uniwersytet Kraju Saary) za wygenerowanie konstrukcji LifeAct-mEGFP. Projekt ten został sfinansowany przez Sonderforschungsbereich 1027 (projekt A2 do B.Q.) i 894 (projekt A1 do M.H.). Mikroskop z arkuszami świetlnymi został sfinansowany przez DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fibricol, roztwór kolagenu bydlęcegoZaawansowany Biomatrix #5133-20MLMatryca kolagenowa
0,5 M Roztwór NaOHMerck1091381000do neutralizacji roztworu Fibricol
Agaroza o ultra niskiej temperaturze topnieniaAffymetrix32821-10GMniskiej zawartości c[Col]
DynabeadsThermo Fisher11348DIzolacja pierwotnych ludzkich limfocytów T CD8+ z PBMC
Dynabeads Ludzki aktywator T CD3 / CD28 do ekspansji i aktywacji limfocytówT Thermo Fisher11132DAktywacja populacji CTL
Ludzka rekombinowana interleukina-2Thermo FisherPHC0023Stymulacja hodowanego CTL
P3 Zestaw roztworu pierwotnegoTransfekcja
Lonza V4XP-30XXPrzeciwciało α-PFN1, królik, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Pomarańczowy Barwnik błony plazmatycznejThermo FisherC10045Etykieta komórek fluorescencyjnych
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's fospsphat buforowana solą fizjologicznąThermo Fisher14190250IF
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA9418-100GIF
Koza i alfa; Królik 568, IgG, królikThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (mikroskopia z jasnym arkuszem)ZeissN.A.
Kaptur do hodowli komórkowychThermo FisherHeraSafe KS
Inkubator do hodowli komórkowych HERACell 150i Thermo FisherN.A.
Wirówki 5418 i 5452EppendorfN.A.
PippettesEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
Końcówki do pipetekVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
Probówki 15 mlSarstedt  62.554.002
Kapilary 50 &mikro; LVWR (Marka)613-3373Przygotowanie próbek Zeiss LSFM
Tłok do kapilarVWR (Marka)BRND701934"Stemple z końcówką teflonową" Przygotowanie próbki LSFM
Próbki MColorPhast Próbki pH1095430001Merckdo badania pH zneutralizowanych
strzykawek Fibricol BD Plastipak 1 mlBDZ230723  ALDRICHAlternatywne przygotowanie próbki
Plastelina (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Konwerter plików ImarisBitplanedostępny pod adresem http://www.bitplane.com Konwertuj pliki obrazowania do formatu pliku Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplanedostępny pod adresem http://www.bitplane.com Analiza danych obrazowych 3D i 4D
Przygotowanie próbki w nietkniętych ludzkich komórkach T CD8 o

Bibliografia

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357(2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689(2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Trójwymiarowa macierz kolagenowaśledzenie migracji komórekprzygotowanie próbekakwizycja obrazuobrazowanie żywych komórekanaliza próbek utrwalonychcytotoksyczne limfocyty Tkomórki NK
Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.