Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania gradientowych płytek nanowzorcowych za pomocą termicznego nanoimprintingu oraz metodę przesiewowego wykrywania odpowiedzi ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka na nanostruktury. Dzięki zastosowaniu opisanej technologii możliwe jest wytworzenie rusztowania, które może manipulować zachowaniem komórki za pomocą bodźców fizycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie gradientowego nanowzoru za pomocą techniki nanoimprintingu termicznego i badanie przesiewowe odpowiedzi komórek tworzących kolonie śródbłonka
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nanotopografię można znaleźć w różnych matrycach zewnątrzkomórkowych (ECM) wokół ciała i wiadomo, że ma ważne działanie regulujące reakcje komórkowe. Trudno jest jednak określić związek między wielkością nanostruktury a reakcjami komórek ze względu na brak odpowiednich narzędzi przesiewowych. W tym miejscu pokazujemy rozwój powtarzalnych i opłacalnych gradientowych płytek nanowzorcowych do manipulowania odpowiedziami komórkowymi. Wykorzystując anodowy tlenek glinu (AAO) jako formę wzorcową, gradientowe płytki nanowzoru z nanofilarami o rosnących zakresach średnic [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) i 280-360 nm (GP 280/360)] zostały wytworzone techniką nadruku termicznego. Te gradientowe płytki nanowzorcowe zostały zaprojektowane tak, aby naśladować różne rozmiary nanotopografii w ECM i zostały wykorzystane do badania przesiewowego odpowiedzi ludzkich komórek tworzących kolonie śródbłonka (hECFC). W tym protokole opisujemy krok po kroku procedurę wytwarzania gradientowych płytek nanowzorcowych do inżynierii komórkowej, techniki hodowli hECFC z ludzkiej krwi obwodowej oraz hodowlę hECFC na płytkach nanowzorcowych.
Wprowadzenie
Ostatnio, reakcja komórek na fizyczną stymulację topografii powierzchni została zwrócona w dziedzinie inżynierii komórkowej1,2,3,4. W związku z tym więcej uwagi skupiono na trójwymiarowych nanostrukturach na powierzchni przyczepu komórek5. Doniesiono, że integryna, która jest urządzeniem rozpoznającym powierzchnię komórki, przekazuje bodziec fizyczny napędzany przez mikro-nanostruktury ECM poprzez mechano-transdukcję6. Ta mechaniczna stymulacja reguluje zachowanie komórek poprzez wskazówki kont....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board w Korea University Anam Hospital (IRB No. ED170495). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i jej późniejszymi zmianami.
1. Przygotowanie podłoża aluminiowego (Al) metodą elektropolerowania
Uwaga: Roztwór do elektropolerowania jest i toksyczny. Nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawice nitrylowe, okulary i fartuch laboratoryjny. Wykonaj ten krok w dygestorium.
- Przygotować roztwór do elektropolerowania, mieszając alkohol etylowy (C2H5OH, 99,9%) i kwas nadchloro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia obrazy SEM wykonanych form AAO o gradiencie w zależności od ich typu i położenia. Rycina 2 przedstawia obrazy SEM płytek z gradientowymi nanoprzewodami o regularnych, zaokrąglonych nanofilarach, a Rycina 3 zawiera dane ilościowe dotyczące średnicy nanofilarów. Tabela 1 wymienia charakterystykę wykonanych nanofilarów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Produkcja AAO często cierpi z powodu wad, takich jak pęknięcia, nieregularne kształty porów i przypalenie. Główną przyczyną tych wad jest tzw. przebicie elektrolityczne, na które duży wpływ ma charakter anodowanych podłoży metalowych i rezystywność elektrolitu21. Ponieważ rezystywność elektrolitu zmienia się w zależności od jego temperatury, ciągłe eliminowanie ciepła z elektrod jest punktem krytycznym dla utrzymania stabilnej temperatury lokalizacji elektrolitu w tak wysokich warunkach anodowania.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] oraz Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych NRF finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości [NRF-2017M3A9C6029563].
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas nadchlorowy 60% | Daejung Chemicals & Metale | 6512-4100 | |
| Alkohol etylowy, absolutny 99,9% | Daejung Chemicals & Metale | 4118-4100 | |
| Kwas fosforowy 85% | Daejung Chemicals & Metale | 6532-4400 | |
| Alkohol metylowy 99,5% | Daejung Chemicals & Metale | 5558-4400 | |
| Tlenek chromu(VI) | Daejung Chemicals & Metale | 2558-4400 | |
| Kwas siarkowy 95% | Daejung Chemicals & Metale | 7781-4100 | |
| Nadtlenek wodoru 30% | Daejung Chemicals & Metale | 4104-4400 | |
| n-heksan 95% | Daejung Chemicals & Metale | 4081-4400 | |
| Toluen 99,5% | Daejung Chemikalia i Metale | 8541-4400 | |
| (heptadekafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecylo)dimetylochlorosilan | Gelest | SIH5840.4 | Wrażliwy na wilgoć |
| Metoksynonafluorobutan 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| Roztwór kolagenu | Stemcell | #4902 | |
| Żelatyna | Sigma aldrich | G1890 | Roztwór |
| do powlekania białekFicoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Hydrofilowy roztwór polisacharydowy |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Pożywka do ekspansji komórek śródbłonka |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140-122 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Gibco | 10010031 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehyd | Sigma aldrich | P6148 | |
| Aldehyd glutarowy | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Tetroxide osmu | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Heksametylodilazan | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Etoksylat oktylofenolu |
| Surowica kozia | Gibco | 26050-088 | |
| przeciwciało pierwotne przeciwko ludzkiej winkulinie | Sigma aldrich | V9131 | |
| Sonda F-aktynowa | Sondy molekularne | A12379 | Fluorescencyjnie sprzężona falloidyna |
| Alexa Fluor 488-sprzężona anty-myszy Przeciwciało IgG | Sondy molekularne | A11001 | Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorescencją |
| 4',6-diamidyn-2-fenyloindol | Sigma aldrich | D9542 | |
| Podłoże montażowe | DAKO | S3023 | |
| Przeciwciało pierwotne anty-ludzkie vWF | DAKO | A0082 | |
| Anty-ludzkie Przeciwciało pierwszorzędowe CD144 | BD Biosciences | #555661 | |
| Epoka 12&handel; Zestaw do zatapiania, z BDMA | Ted Pella | 18012 | Żywica epoksydowa |
| Octan uranylu, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Cytrynian ołowiu, trójwodzian, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Ultra czysta płyta aluminiowa | Goodfellow | 26050-088 | |
| Arkusz polistyrenu | Goodfellow | ST313120 | |
| 8,0-calowy wafel silikonowy | Siltron | 29-01024-03 | Jednostronnie polerowane, 725 &mikro; m gruby |
| Eksykator próżniowy, 4,4 L | Kartell | KA.230 | |
| Pompa próżniowa | Vacuumer | V3. VOP100 | |
| Zasilacz | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Mieszadło magnetyczne | Daihan scientific | SL. | |
| Mieszadło górne | Cyrkulator HT120DX | ||
| scientific Daihan scientific | WCR-P12 | ||
| Stolik ruchomy | liniowy Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Kątownik, 90 stopni | Zaber | AB90M | Akcesorium do linijnego stolika ruchomego |
| PMP, 145 mm | Vitlab | 67995 | Pęseta niemetalowa |
| Zlewka PTFE, 250 ml | Cowie | CW007.25 | |
| Myjka ultradźwiękowa | Branson | B2510MTH | |
| obcinarka do PCB | Hozan Tool Przemysłowe | K-110 | |
| Urządzenie nanoimprint | Nanonex | NX-2000 | |
| Generator plazmy tlenowej | Femto Science | CUTE | |
| Sterylizator niskotemperaturowy | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Inkubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Laserowy mikroskop skaningowy Confoal | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Skaningowy mikroskop elektronowy | JEOL | JSM6701 | |
| Transmisyjny mikroskop elektronowy | Hitachi | H-7500 |
Bibliografia
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
