Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie gradientowego nanowzoru za pomocą techniki nanoimprintingu termicznego i badanie przesiewowe odpowiedzi komórek tworzących kolonie śródbłonka

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57661

⸱

1 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania gradientowych płytek nanowzorcowych za pomocą termicznego nanoimprintingu oraz metodę przesiewowego wykrywania odpowiedzi ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka na nanostruktury. Dzięki zastosowaniu opisanej technologii możliwe jest wytworzenie rusztowania, które może manipulować zachowaniem komórki za pomocą bodźców fizycznych.

Streszczenie

Nanotopografię można znaleźć w różnych matrycach zewnątrzkomórkowych (ECM) wokół ciała i wiadomo, że ma ważne działanie regulujące reakcje komórkowe. Trudno jest jednak określić związek między wielkością nanostruktury a reakcjami komórek ze względu na brak odpowiednich narzędzi przesiewowych. W tym miejscu pokazujemy rozwój powtarzalnych i opłacalnych gradientowych płytek nanowzorcowych do manipulowania odpowiedziami komórkowymi. Wykorzystując anodowy tlenek glinu (AAO) jako formę wzorcową, gradientowe płytki nanowzoru z nanofilarami o rosnących zakresach średnic [120-200 nm (GP 120/200), 200-280 nm (GP 200/280) i 280-360 nm (GP 280/360)] zostały wytworzone techniką nadruku termicznego. Te gradientowe płytki nanowzorcowe zostały zaprojektowane tak, aby naśladować różne rozmiary nanotopografii w ECM i zostały wykorzystane do badania przesiewowego odpowiedzi ludzkich komórek tworzących kolonie śródbłonka (hECFC). W tym protokole opisujemy krok po kroku procedurę wytwarzania gradientowych płytek nanowzorcowych do inżynierii komórkowej, techniki hodowli hECFC z ludzkiej krwi obwodowej oraz hodowlę hECFC na płytkach nanowzorcowych.

Wprowadzenie

Ostatnio, reakcja komórek na fizyczną stymulację topografii powierzchni została zwrócona w dziedzinie inżynierii komórkowej1,2,3,4. W związku z tym więcej uwagi skupiono na trójwymiarowych nanostrukturach na powierzchni przyczepu komórek5. Doniesiono, że integryna, która jest urządzeniem rozpoznającym powierzchnię komórki, przekazuje bodziec fizyczny napędzany przez mikro-nanostruktury ECM poprzez mechano-transdukcję6. Ta mechaniczna stymulacja reguluje zachowanie komórek poprzez wskazówki kontaktowe7 i indukuje reorganizację cytoszkieletu w celu zmiany kształtu, oprócz ogniskowych zrostów i sztywności komórek8.

Ludzkie komórki progenitorowe śródbłonka (hEPC) w ciele ściśle oddziałują z mikrośrodowiskiem otaczającego ECM9. Wskazuje to, że stan fizyczny ECM działa jako ważny parametr dla tworzenia specyficznego kompleksu adhezyjnego komórka-macierz w takim samym stopniu, jak naprężenie ścinające pochodzące z przepływu krwi10. Doniesiono, że nanotopografia powierzchniowa zwiększa tworzenie in vitro rozległych sieci kapilar naczyń włosowatych hEPCs11 oraz że system łączący ECM/czynnik rozpuszczalny biologicznie umożliwia hEPC rozpoznawanie dysfunkcyjnych substratów i wspomaga gojenie się ran12,13. Niemniej jednak związek między ECM a hEPC nie jest jasno zrozumiały.

Chociaż wielu badaczy próbowało wyjaśnić związek między reakcjami komórek a fizycznymi sygnałami z różnych substratów14,15,16, badania te wykorzystywały tylko stały rozmiar nanostruktury lub nanowzorce o nieregularnym układzie, które mają ograniczenie, aby wyjaśnić związek między rozmiarem nanostruktury a zachowaniem komórki. Problemem jest tutaj brak odpowiednich narzędzi do badań przesiewowych odpowiedzi komórkowych, które mogłyby zastąpić istniejące żmudne i iteracyjne podejścia w celu znalezienia optymalnego rozmiaru nanostruktury. Dlatego wymagana jest prosta technika badania przesiewowego reakcji komórkowych na stymulacje fizyczne bez powtarzania.

Tutaj opisujemy metodę używaną w naszych poprzednich raportach17,18,19 do tworzenia gradientowego nanowzoru, w którym średnica ułożonych nanofilarów stopniowo rośnie. Ponadto opisaliśmy również, jak hodować i analizować zachowanie hECFC na gradientowych płytkach nanowzorcowych, aby określić wpływ bodźców fizycznych na komórki. Do wytworzenia gradientowej formy AAO zastosowano łagodną anodowanie, stopniowe trawienie i metodę powlekania warstwą zapobiegającą przywieraniu. Dzięki zastosowaniu techniki litografii termicznej uzyskano identyczne gradientowe nanowzory polistyrenu w opłacalny i łatwy sposób. Korzystając z gradientowych nanowzorów, możliwe jest określenie, który rozmiar nanostruktury ma duży wpływ na zachowanie komórki w jednym zestawie eksperymentów. Spodziewamy się, że ten gradientowy nanowzór będzie pomocny w zrozumieniu mechanizmów interakcji między hECFC pochodzącymi z krwi lub innymi komórkami a różnymi rozmiarami nanostruktur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board w Korea University Anam Hospital (IRB No. ED170495). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i jej późniejszymi zmianami.

1. Przygotowanie podłoża aluminiowego (Al) metodą elektropolerowania

Uwaga: Roztwór do elektropolerowania jest i toksyczny. Nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawice nitrylowe, okulary i fartuch laboratoryjny. Wykonaj ten krok w dygestorium.

  1. Przygotować roztwór do elektropolerowania, mieszając alkohol etylowy (C2H5OH, 99,9%) i kwas nadchlorowy (HClO4,60%) w zlewce z podwójnym płaszczem o pojemności 1 l (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Podłączyć zlewkę z podwójnym płaszczem do pompy cyrkulacyjnej i ustawić temperaturę na 7 °C. Umieścić zlewkę z podwójnym płaszczem na mieszadle magnetycznym. Pozostawić roztwór mieszany przez co najmniej 30 minut, aż temperatura spadnie do 7 °C.
  3. Zanurz ultraczystą płytkę Al (99,999%, 20 × 50 × 1 mm3) i przeciwelektrodę węglową w roztworze elektropolerowanym za pomocą zacisków krokodylkowych i drutu miedzianego. Dostosuj położenie płytki Al i przeciwelektrody węglowej tak, aby były zwrócone do siebie.
    nuta: Konieczne jest ostrożne zainstalowanie klipsów, aby nie dotknąć roztworu. W kontakcie z roztworem zanieczyszczenia wypływające z klipsów mogą zanieczyścić płytkę Al.
  4. Podłącz płytkę Al do zacisku dodatniego, a przeciwelektrodę węglową do bieguna ujemnego zasilacza prądu stałego (DC).
  5. Wyłącz mieszadło magnetyczne i przyłóż napięcie 20 V. Utrzymuj ten stan przez 4 minuty.
  6. Włącz mieszadło magnetyczne i pozwól prądowi płynąć przez kolejne 6 minut.
    nuta: Warunek statyczny usuwa większość zanieczyszczeń i chropowatości z płytki Al, a stan dynamiczny poprawia końcową jakość elektropolerowania.
  7. Wyłącz zasilanie i ręcznie oddziel płytkę Al od zacisku. Rygorystycznie umyj płytkę Al wodą dejonizowaną, aby usunąć cały pozostały roztwór.
  8. Wysuszyć płytkę Al azotem i przechowywać w gazie obojętnym. Przeprowadź ten proces suszenia na końcu wszystkich eksperymentów w kroku 1 i 2.
    nuta: Podczas wtryskiwania sprężonego powietrza spraw, aby powietrze przepływało z polerowanej części na przeciwną stronę. W przeciwnym przypadku zanieczyszczenia mogą wydostać się z niepolerowanej części i zanieczyścić płytę Al.

2. Produkcja gradientowej formy AAO z elektrolitem kwasu fosforowego

Uwaga: Alkohol metylowy i jego opary są toksyczne dla oczu. Ciągłe narażenie na chrom może prowadzić do poważnego zatrucia chromem. Wykonaj ten krok w dygestorium.

  1. Anodowanie pierwotne
    1. Aby przygotować 1 l elektrolitu kwasu fosforowego, załaduj 590 ml wody dejonizowanej do szklanej butelki.
    2. Dodać 400 ml alkoholu metylowego (CH3OH, 99%) i 10 ml kwasu fosforowego (H3, PO4, 85%) do szklanej butelki. Dobrze wymieszaj roztwór, wstrząsając ręcznie lub mieszając magnetycznie.
    3. Wlać 500 ml elektrolitu do zlewki z podwójnym płaszczem o pojemności 1 l. Zanurz wypolerowaną płytkę Al i przeciwelektrodę węglową w roztworze za pomocą zacisków krokodylkowych i drutu miedzianego.
    4. Wlej dodatkowy elektrolit, aby zlokalizować granicę elektropolerowania 2-3 mm nad powierzchnią roztworu.
      nuta: Jeśli anodowanie przeprowadza się z granicą elektropolerowania stykającą się z roztworem, płytka Al ma tendencję do palenia się podczas anodowania.
    5. Zamontuj pionowy wał na cokole w kształcie litery U. Przymocuj mieszadło górne i wirnik za pomocą metalowych zacisków. Umieść śmigło wirnika w pobliżu dolnego końca obu elektrod. Ustaw prędkość obrotową mieszadła górnego w zakresie od 200 do 300 obr./min.
    6. Podłączyć zlewkę z podwójnym płaszczem do pompy cyrkulacyjnej i ustawić temperaturę na -10 °C. Pozostawić system na co najmniej 1 godzinę mieszając, aż temperatura spadnie do -10 °C.
      nuta: Nie używaj wody jako płynu chłodzącego. Ponieważ woda zamarza w niskich temperaturach, cyrkulacja nie będzie działać normalnie. Jako płyn chłodzący zaleca się stosowanie mieszaniny wody i alkoholu etylowego w stosunku 1:1.
    7. Zastosuj napięcie 195 V podczas mieszania przez 16 h.
      nuta: Jeśli prąd wzrośnie o więcej niż 50 mA w ciągu 2 lub 3 godzin po przyłożeniu napięcia, prawdopodobieństwo spalenia jest bardzo wysokie. Natychmiast przerwij proces i wymień płytkę Al na nową. Jeśli ten problem występuje wielokrotnie, sprawdź, czy nie ma nieprawidłowości w regulacji temperatury cyrkulatora. Jeśli nie ma nieprawidłowości, wymień elektrolit.
    8. Zatrzymaj zasilanie i ręcznie oddziel płytkę Al od zacisku. Umyj anodowaną płytkę Al wodą dejonizowaną, aby usunąć cały pozostały roztwór.
  2. Wytrawianie tlenku glinu
    1. Przygotować roztwór do trawienia kwasem chromowym, rozpuszczając 9,0 g tlenku chromu (CrO3) i 20,3 ml kwasu fosforowego (H3PO4, 85%) w 500 ml wody dejonizowanej.
    2. Wlać roztwór do trawienia do zlewki z podwójnym płaszczem o pojemności 1 l. Ustaw temperaturę na 65 °C.
    3. Zanurzyć anodowaną płytkę Al w roztworze do trawienia na co najmniej 10 godzin podczas mieszania. Uszczelnij górną część zlewki folią aluminiową.
    4. Wytrawioną płytkę Al przepłukać kilkakrotnie wodą dejonizowaną.
  3. Anodowanie wtórne
    1. Ustawić te same warunki doświadczalne, co w krokach od 2.1.1 do 2.1.7.
    2. Załaduj wytrawioną płytkę Al do anody układu i przyłóż napięcie 195 V przez 6 godzin. Następnie wyłącz zasilanie i ręcznie oddziel płytkę Al od klipsa. Natychmiast umyj anodowaną płytkę Al wodą dejonizowaną.
      nuta: Gdy czas mycia jest opóźniony, wielkość porów AAO nieumyślnie wzrasta z powodu pozostałości kwasu fosforowego.
  4. Gradientowe poszerzenie porów
    1. Przygotuj roztwór rozszerzający pory, rozpuszczając 5,765 g kwasu fosforowego w 500 ml wody dejonizowanej. Wlać roztwór do zlewki o pojemności 1 l.
    2. Podłączyć zlewkę z podwójnym płaszczem do pompy cyrkulacyjnej i ustawić temperaturę na 30 °C. Umieścić pionowo pionowo pionowy stolik ruchomy. Przymocuj wspornik do ruchomej części stolika liniowego.
    3. Ustaw ruchomą część stolika liniowego w pozycji wyjściowej. Przymocuj zacisk do wspornika i załaduj anodowaną płytkę aluminiową.
    4. Manipuluj położeniem płytki Al ręcznie, tak aby płytka Al znalazła się tuż nad powierzchnią roztworu.
      nuta: Na tym etapie płytka Al nie powinna dotykać roztworu. Proces rozszerzania porów rozpoczyna się, gdy tylko płytka Al dotrze do roztworu.
    5. Stopniowo zanurzaj płytkę Al w roztworze z prędkością 4,86 μm/s przez 120 minut, aby uzyskać formę AAO o średnicy 35 mm i gradieniu wielkości od 120 nm do 200 nm (GP 120/200). Uruchom stoper w momencie, gdy płytka Al dotknie powierzchni roztworu.
    6. Aby wykonać formy GP 200/280 i GP 280/360, należy zanurzyć całą powierzchnię formy GP 120/200 w roztworze poszerzającym pory odpowiednio na 2 lub 4 godziny.
    7. Przepłucz kilkakrotnie płytkę gradientu Al wodą dejonizowaną.

3. Osadzanie warstwy antyadhezyjnej na gradientowej formie AAO z samodzielnie montowaną monowarstwą

Uwaga: Wykonaj kroki od 3.2.1 do 3.3.3 w schowku na rękawiczki. Podłączyć pompę próżniową i wtryskiwacz suchego azotu do schowka na rękawiczki. Umieść wszystkie próbki, odczynniki i aparaty w schowku na rękawiczki przed procesem osuszania. Powtórzyć cykl opróżniania i wstrzykiwania azotu więcej niż trzy razy, aby odpowiednio usunąć wilgoć ze schowka na rękawiczki. Pozwól, aby suchy azot przepłynął przez eksperyment.

  1. Modyfikacja hydroksylowa pleśni AAO z traktowaniem Piranha
    1. Wlać 140 ml kwasu siarkowego (H2SO4,95%) do zlewki z politetrafluoroetylenu (PTFE). Dodawać kroplami 60 ml nadtlenku wodoru (H2O2, 30%). Pozostaw na 30 minut, aż roztwór ostygnie.
      ostrożność: Zachowaj szczególną ostrożność podczas przygotowywania roztworu Piranha. Od momentu dodania nadtlenku wodoru roztwór energicznie wrze i wytwarza wysokie temperatury. Wykonaj eksperyment w dygestorium.
    2. Zanurz formę AAO w roztworze na 30 s za pomocą niemetalowej pęsety.
    3. Kilkakrotnie spłucz formę AAO wodą dejonizowaną. Namocz formę w wodzie dejonizowanej na 30 minut i umieść ją w alkoholu metylowym na kolejne 30 minut.
      ostrożność: Wyrzucając zużyty roztwór Piranha, rozcieńcz go dużą ilością wody z kranu.
    4. Całkowicie wysuszyć formę AAO w próżni przez 3 godziny.
  2. Przygotowanie 20× roztworu podstawowego HDFS
    nuta: HDFS to skrót od (heptadekafluoro-1,1,2,2, -tetrahydrodecylo)dimetylochlorosilanu
    1. Napełnij jedną trzecią butelki n-heksanu o pojemności 1 l sitami molekularnymi. Uszczelnij butelkę folią parafinową i przechowuj ją w suchym azocie przez 24 godziny.
    2. Przefiltrować 200 ml n-heksanu za pomocą szklanej strzykawki i filtra strzykawkowego z PTFE 0,2 μm.
    3. Wlej 80 ml przefiltrowanego n-heksanu do szklanej butelki o pojemności 100 ml. Dodaj 2 ml HDFS.
  3. Samodzielne osadzanie monowarstwowe
    1. Załaduj 57 ml przefiltrowanego n-heksanu do zlewki o pojemności 100 ml. Zanurz formę AAO w rozpuszczalniku.
    2. Dodaj 3 ml roztworu podstawowego HDFS do n-heksanu, aby uzyskać 2,9 mM roztworu HDFS. Odczekaj 10 minut, aby reakcja postępowała.
    3. Przenieś formę AAO na świeży n-heksan. Zamknij i uszczelnij wszystkie butelki z odczynnikami. Zamknąć zawór azotu, a następnie wyciągnąć próbki ze schowka na rękawiczki.
      nuta: System plików HDFS jest niezwykle wrażliwy na wilgoć. Przechowuj wszystkie odczynniki zawierające HDFS w eksykatorze.
    4. Namocz pleśń AAO w 60 ml metoksynonafluorobutanu (C10H6F18O2, 99%). Ultradźwiękowo czyść formę AAO w zlewce przez 10 s jednorazowo, aby usunąć fizycznie zaadsorbowane cząsteczki HDFS. Powtórz procedurę czyszczenia 10 razy.
      nuta: Wystawianie formy AAO na działanie ultradźwięków przez długi czas bez odstępów czasu spowoduje uszkodzenie warstwy tlenku.
    5. Całkowicie wysuszyć formę AAO w próżni przez 24 godziny
      nuta: Pomyślnie osadzona warstwa zapobiegająca przywieraniu jest super wodoodporna i stabilna przez wiele miesięcy, gdy jest przechowywana w eksykatorze. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Wytwarzanie płyt z gradientowymi nanowzorami metodą termicznego nadruku

Uwaga: Wykonaj kroki od 4.2 do 4.7 w czystym pomieszczeniu.

  1. Przytnij arkusz styropianu o grubości 1,1 mm do rozmiaru 2,9 mm szerokości i 3,7 mm długości za pomocą obcinaka do płytek drukowanych (PCB).
  2. Wytnij formę AAO 35 mm od dołu za pomocą szczypiec. Na odwrocie należy zaznaczyć nazwę próbki i datę produkcji.
  3. Wyczyść wafel 8.0" niewielką dawką alkoholu etylowego. Połóż arkusze styropianu na wafli, a następnie zamontuj formę AAO.
  4. Umieść dolną folię w szufladzie imprintera termicznego. Przymocuj górną folię do uszczelki.
  5. Połóż wafel na dolnej folii. Umieść uszczelkę na wafelku. Upewnij się, że na wafli nie ma kurzu.
  6. Zamknij szufladę imprintera termicznego. Stosować temperaturę 165 °C i ciśnienie 620,52 kPa przez 100 s.
  7. Schłodzić próbkę do temperatury pokojowej. Delikatnie przekręć arkusz styropianu, aby uwolnić formę AAO.

5. Sterylizacja i hydrofilowa modyfikacja gradientowych płytek nanowzorcowych

  1. Umieść płytki z nanowzorem na kwadratowym naczyniu. Wlej 100 ml 70% alkoholu etylowego i wystawij na działanie światła ultrafioletowego przez 30 minut.
  2. Wysuszyć płytki nanowzoru azotem. Przenieś płytki nanowzoru do generatora plazmy tlenowej.
  3. Opróżnij komorę, aż osiągnie 1,33 Pa. Następnie wstrzyknąć tlen z szybkością 30cm3/min. Zastosuj moc częstotliwości radiowej 60 W. Utrzymuj plazmę tlenową przez 90 s.
    nuta: Zaleca się stosowanie płytek nanowzorcowych poddanych obróbce plazmowej w ciągu 14 dni.
  4. Przymocuj płytkę z nanowzorem do dna naczynia do hodowli komórkowej za pomocą kropli toluenu.
  5. Zamknij próbki w torebce i wysterylizuj za pomocą niskotemperaturowego sterylizatora plazmowego.

6. Uprawa hECFC

Uwaga: Przeprowadzaj wszystkie procedury wirowania w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Przed wyizolowaniem jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) inkubować pokrytą kolagenem 12-dołkową szalkę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Umyj 12-dołkowe naczynie hodowlane za pomocą 1× sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Zbierz 50 ml ludzkiej krwi za pomocą probówki z inhibitorem heparyny.
  4. Umieścić 6 ml hydrofilowego roztworu polisacharydów w probówce o pojemności 15 ml i dodać 8 ml krwi do hydrofilowego roztworu polisacharydów.
    nuta: Powoli odpipetować krew do hydrofilowego roztworu polisacharydów.
  5. Odwirować probówkę o masie 1020 x g przez 20 minut, aby granulować komórki.
  6. Zbierz nieprzezroczystą warstwę komórek i przenieś do nowej probówki o pojemności 15 ml.
  7. Dodać 10% PBS zawierającego płodową surowicę bydlęcą (FBS) i odwirować probówkę o sile 1020 x g przez 10 minut, aby osadzać komórki.
  8. Usunąć supernatant i dodać bufor do lizy krwinek czerwonych. Trzymaj na lodzie przez 5 minut.
  9. Dodać 10% PBS zawartego w FBS i odwirować probówkę o sile 1020 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki.
  10. Usunąć supernatant i dodać 10% PBS zawartego w FBS. Odwirować probówkę o masie 1020 x g przez 5 minut, aby granulować komórki.
  11. Usunąć supernatant i dodać 1 ml pożywki do ekspandowania komórek śródbłonka uzupełnionej 10% FBS. Nasiona 8.0 × 106 komórek na dołek na każde naczynie pokryte kolagenem.
  12. Zmieniaj pożywkę hodowlaną codziennie przez 1 tydzień. Następnie zmieniaj pożywkę co 2 dni.
    Uwaga: hECFC można znaleźć po 10-14 dniu hodowli. hECFC wykazują typową morfologię przypominającą bruk i tworzą kolonię, którą można zaobserwować w mikroskopii z kontrastem fazowym. Barwienie immunofluorescencyjne kadheryny śródbłonka naczyniowego (CD144) i czynnika von Willebranda (vWF) można również przeprowadzić w celu scharakteryzowania hECFC po dalszej ekspansji komórek.
  13. Do hodowli hECFC należy użyć pożywki do eksplagowania komórek śródbłonka uzupełnionej 5% FBS i penicyliną/streptawidyną w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%CO2. Wymieniaj pożywkę raz dziennie.
  14. Po indukcji hECFC wyhoduj komórki do pasażu 7 w celu dalszych eksperymentów.

7. Sadzenie komórek i hodowla na płytkach gradientowych nanowzorów

Uwaga: Krok 7 opisuje hodowlę hECFC na płytce gradientowej nanowzoru, ale można również użyć innych źródeł komórek.

  1. Pokryj płytki gradientowego nanowzoru 1 ml 0,1% roztworu białkowego w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    nuta: Powłoka białkowa o stężeniu 0,1% nie pokrywa cech nanofilarów.
  2. Sporządzić zawiesinę hECFC z szalki hodowlanej za pomocą standardowej metody rozszczepiania komórek przy użyciu trypsyny.
  3. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać pożądane zbieganie. Zasiaj hECFC na gradientowych płytkach nanowzoru i płaskiej kontroli (np. 1,0 ×10 4 komórki/cm2).
    nuta: Gdy hECFC są wysiewane w ilości 1,0 ×10 4 komórek/cm2 na gradientowych płytkach nanowzorcowych, konfluencja komórek zwykle osiąga 70 - 80 % po 2 dniach.
  4. Hodować komórki na płaskich lub gradientowych płytkach z nanowzorem przez 2 dni w inkubatorze.

8. Obserwacja i analiza

  1. Obrazowanie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM)
    1. Utrwalić hECFC hodowane na płaskich lub gradientowych płytkach nanowzoru z 2,5% aldehydem glutarowym w temperaturze 4 °C na noc.
    2. Traktuj 1% tetratlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj próbki za pomocą PBS.
    3. Odwadniać próbki alkoholem etylowym od niskiego do wysokiego stężenia (50%, 70%, 80%, 90% i 100%) przez 10 minut na każdym etapie.
    4. Traktuj heksametylodilazan (HMDS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj próbki świeżym goglem HMDS i pozostaw próbki pod wyciągiem przez co najmniej 1 dzień, aż resztki HMDS całkowicie odparują.
    5. Pokryj próbki napylaczem platynowym przez 5 minut i zbadaj próbki za pomocą SEM.
  2. Obrazowanie za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)
    1. Utrwalić hECFC hodowane na płaskich lub gradientowych płytkach z nanowzorem za pomocą mieszaniny 2% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w PBS w temperaturze 4 °C na noc.
    2. Przeprowadzić utrwalanie końcowe przy użyciu 1% tetratlenku osmu i odwodnić próbki zgodnie z metodą opisaną w ppkt 8.1.3.
    3. Zanurz próbki w żywicy epoksydowej. Wykonaj sekcje o grubości 60 nm z bloków i umieść sekcję na siatce TEM.
    4. Zabarwić skrawek mieszaniną 10 mg octanu uranylu w 100 ml alkoholu metylowego i 0,1 mg cytrynianu ołowiu w 100 ml wody destylowanej. Uzyskiwanie obrazów za pomocą TEM.
  3. Barwienie fluorescencyjne
    1. Utrwal hECFC hodowane na płaskich lub gradientowych płytkach nanowzorów z 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    2. Próbki należy przepuszczać i blokować 5% surowicą kozią i 0,1% etoksylanem oktylofenolu w PBS (PBST) w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Próbki należy inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko ludzkiej winkulinie (1:500 w PBST) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Próbki należy trzykrotnie przepłukać PBST.
    4. Próbki inkubować z falloidyną sprzężoną z fluorescencją (1:1,000 w PBST), przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluorescencją (1:1,000 w PBST) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Próbki płukać trzykrotnie PBST.
    5. Próbki inkubować z 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 1:1,000 w PBST) w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    6. Upuść 10 μl podłoża montażowego na powierzchnię gradientowego nanowzoru. Umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym.
    7. Umieść próbkę do góry nogami na stoliku na próbkę i uzyskaj obrazy za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego.
  4. Analiza obrazu
    1. Przesyłanie przechwyconych obrazów hECFC do systemu analizy obrazu.
    2. Wybierz losowe pole obrazu barwienia falloidyny. Dostosuj próg i utwórz obraz binarny, w którym komórki różnią się od tła.
    3. Narysuj kontury wokół komórek, aby zmierzyć obszar i obwód komórki, a następnie ręcznie policz liczbę filopodiów na komórkę.
    4. Wybierz losowe pole obrazu barwienia winkuliny. Dostosuj próg i utwórz binarny obraz ogniskowych obszarów adhezji.
      nuta: Dostosuj odpowiednio próg obrazu, aby uniknąć sztucznego nadmiernego lub niedostatecznego wypełnienia ogniskowych obszarów adhezji.
    5. Policz liczbę ogniskowych adhezji każdej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki


Rycina 1 przedstawia obrazy SEM wykonanych form AAO o gradiencie w zależności od ich typu i położenia. Rycina 2 przedstawia obrazy SEM płytek z gradientowymi nanoprzewodami o regularnych, zaokrąglonych nanofilarach, a Rycina 3 zawiera dane ilościowe dotyczące średnicy nanofilarów. Tabela 1 wymienia charakterystykę wykonanych nanofilarów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Produkcja AAO często cierpi z powodu wad, takich jak pęknięcia, nieregularne kształty porów i przypalenie. Główną przyczyną tych wad jest tzw. przebicie elektrolityczne, na które duży wpływ ma charakter anodowanych podłoży metalowych i rezystywność elektrolitu21. Ponieważ rezystywność elektrolitu zmienia się w zależności od jego temperatury, ciągłe eliminowanie ciepła z elektrod jest punktem krytycznym dla utrzymania stabilnej temperatury lokalizacji elektrolitu w tak wysokich warunkach anodowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Program Badań Podstawowych za pośrednictwem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Technologii (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] oraz Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych NRF finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości [NRF-2017M3A9C6029563].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas nadchlorowy 60%Daejung Chemicals & Metale6512-4100
Alkohol etylowy, absolutny 99,9%Daejung Chemicals & Metale4118-4100
Kwas fosforowy 85%Daejung Chemicals & Metale6532-4400
Alkohol metylowy 99,5%Daejung Chemicals & Metale5558-4400
Tlenek chromu(VI)Daejung Chemicals & Metale2558-4400
Kwas siarkowy 95%Daejung Chemicals & Metale7781-4100
Nadtlenek wodoru 30%Daejung Chemicals & Metale4104-4400
n-heksan 95%Daejung Chemicals & Metale4081-4400
Toluen 99,5%Daejung Chemikalia i Metale8541-4400
(heptadekafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrodecylo)dimetylochlorosilanGelestSIH5840.4Wrażliwy na wilgoć
Metoksynonafluorobutan 99%Sigma aldrich464309
Roztwór kolagenuStemcell#4902
ŻelatynaSigma aldrichG1890Roztwór
do powlekania białekFicoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Hydrofilowy roztwór polisacharydowy
EGM-2MVLonzaCC-3202Pożywka do ekspansji komórek śródbłonka
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibco10010031
Płodowa surowica bydlęcaGibco12483-020
ParaformaldehydSigma aldrichP6148
Aldehyd glutarowySigma aldrichG5882-100ML
Tetroxide osmuSigma aldrich201030-1G
HeksametylodilazanSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLEtoksylat oktylofenolu 
Surowica koziaGibco26050-088
przeciwciało pierwotne przeciwko ludzkiej winkulinie Sigma aldrichV9131
Sonda F-aktynowaSondy molekularneA12379Fluorescencyjnie sprzężona falloidyna
Alexa Fluor 488-sprzężona anty-myszy  Przeciwciało IgGSondy molekularneA11001Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorescencją 
4',6-diamidyn-2-fenyloindol Sigma aldrichD9542
Podłoże montażoweDAKOS3023
Przeciwciało pierwotne anty-ludzkie vWF DAKOA0082
Anty-ludzkie  Przeciwciało pierwszorzędowe CD144 BD Biosciences#555661
Epoka 12&handel; Zestaw do zatapiania, z BDMATed Pella18012Żywica epoksydowa
Octan uranylu, 25gTed Pella19481
Cytrynian ołowiu, trójwodzian, 10gTed Pella19312
Ultra czysta płyta aluminiowaGoodfellow26050-088
Arkusz polistyrenuGoodfellowST313120
8,0-calowy wafel silikonowySiltron29-01024-03Jednostronnie polerowane, 725 &mikro; m gruby
Eksykator próżniowy, 4,4 LKartellKA.230
Pompa próżniowaVacuumerV3. VOP100
ZasilaczUnicorntechUDP-3003
Mieszadło magnetyczneDaihan scientificSL.
Mieszadło górneCyrkulator HT120DX
scientific Daihan scientificWCR-P12
Stolik ruchomyliniowy ZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Kątownik, 90 stopniZaberAB90MAkcesorium do linijnego stolika ruchomego
PMP, 145 mmVitlab67995Pęseta niemetalowa
Zlewka PTFE, 250 mlCowieCW007.25
Myjka ultradźwiękowaBransonB2510MTH
obcinarka do PCBHozan Tool PrzemysłoweK-110
Urządzenie nanoimprintNanonexNX-2000
Generator plazmy tlenowejFemto ScienceCUTE
Sterylizator niskotemperaturowyLowtemCrystal 50
CO2 InkubatorPanasonicMCO-18AC
Laserowy mikroskop skaningowy ConfoalCarl ZeissLSM700
Skaningowy mikroskop elektronowyJEOLJSM6701
Transmisyjny mikroskop elektronowyHitachiH-7500
SMS03022Daihan

Bibliografia

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101(2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394(2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632(2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466(1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126(1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Anodowy tlenek glinuwytwarzanie nanopilarzyscreening odpowiedzi kom rkowejtechnika poszerzania por wmonowarstwy samoorganizuj ce sipod o e polistyrenowewzrost filopodi w

Powiązane artykuły